JP7690166B2 - Material estimation device, total internal reflection illumination microscope, material estimation method and program - Google Patents
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Description
本発明は、物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムに関する。 The present invention relates to a material estimation device, a total internal reflection microscope, a material estimation method, and a program.
従来においては、可溶性タンパク質（例えばサイトカイン）の授受による細胞間相互作用を直接観察する方法が無かった。
本発明者等は、マイクロウェル中の１細胞からのサイトカイン分泌計測をリアルタイムに行う系（１細胞分泌リアルタイム計測法）の開発に成功した（非特許文献１参照）。この方法では、蛍光イムノアッセイに基づき、全反射による近接場を用いた照明法が利用される。
本発明者等は、１細胞分泌リアルタイム計測法を更に発展させた方法も確立した。この方法では、マイクロウェル中で培養している細胞から分泌されたサイトカインが、ガラス製ウェル底面上の捕捉抗体で捕捉される。培養液中には蛍光検出抗体が含まれており、蛍光検出抗体は、捕捉されたサイトカインに結合してサンドイッチ免疫複合体を形成する。
この方法では、溶液中のフリーの蛍光抗体を検出せずに、底面に固定された蛍光複合体だけを検出する。詳細には、全反射照明顕微鏡を用いて固層表面のみを近接場で照明し、固層上の捕捉抗体、抗原（サイトカイン）、蛍光検出抗体からなるサンドイッチ免疫複合体のみを光らせることによって、リアルタイムに分泌されたサイトカインを検出している。
Conventionally, there has been no method for directly observing cell-cell interactions based on the transfer of soluble proteins (eg, cytokines).
The present inventors have succeeded in developing a system for measuring cytokine secretion from a single cell in a microwell in real time (single-cell secretion real-time measurement method) (see Non-Patent Document 1). This method is based on a fluorescent immunoassay and utilizes an illumination method using a near-field due to total internal reflection.
The present inventors have also established a method that further develops the single-cell secretion real-time measurement method. In this method, cytokines secreted from cells cultured in microwells are captured by capture antibodies on the bottom of the glass wells. A fluorescent detection antibody is contained in the culture medium, and the fluorescent detection antibody binds to the captured cytokine to form a sandwich immune complex.
This method does not detect free fluorescent antibodies in the solution, but only detects the fluorescent complex immobilized on the bottom surface. In detail, a total internal reflection microscope is used to illuminate only the solid layer surface in the near field, and only the sandwich immune complex consisting of the capture antibody, antigen (cytokine), and fluorescent detection antibody on the solid layer is illuminated, thereby detecting secreted cytokines in real time.
ところで、上述した方法では、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（つまり、サンドイッチ免疫複合体になる前の段階のサイトカイン）は光らないため、全反射照明顕微鏡によって検出することができない。
つまり、上述した方法では、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（つまり、サンドイッチ免疫複合体になる前の段階のサイトカイン）の画像を得ることができない。
However, in the above-mentioned method, cytokines captured by the capture antibody (i.e., cytokines at a stage before they become sandwich immune complexes) do not emit light and therefore cannot be detected by a total internal reflection microscope.
In other words, the above-mentioned method cannot obtain an image of the cytokine captured by the capture antibody (i.e., the cytokine at the stage before it becomes a sandwich immune complex).
マイクロウェル中で培養している細胞から分泌されたサイトカインが、ガラス製ウェル底面上の捕捉抗体によって捕捉される時刻（捕捉時刻）から、培養液中に含まれる蛍光検出抗体が、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカインに結合してサンドイッチ免疫複合体を形成し、そのサンドイッチ免疫複合体が光ることによって全反射照明顕微鏡に検出される時刻（検出時刻）までには、所定の時間遅れが存在する。
本発明者等は、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）とサンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって検出できるもの）との関係が、コンボリューションが実行される前のものとコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当すると仮定した。
すなわち、本発明者等は、サンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって実際に検出されたもの）と捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）との関係が、デコンボリューションが実行される前のものとデコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当すると仮定した。
更に、本発明者等は、鋭意研究において、サンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって実際に検出されたもの）と捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）との関係が、デコンボリューションが実行される前のものとデコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当することを見い出した。
つまり、本発明者等は、鋭意研究において、顕微鏡によって得られたサンドイッチ免疫複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、顕微鏡によっては得ることができない、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカインの画像を高精度に推定できることを見い出したのである。
すなわち、本発明は、従来の撮像装置（例えば全反射照明顕微鏡など）によっては可視化することができなかった、例えば捕捉抗体などの捕捉体によって捕捉された例えばサイトカインなどの物質の画像（つまり、例えばサンドイッチ免疫複合体などの複合体になる前の段階の物質の画像）を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することを目的とする。
換言すれば、本発明は、捕捉体によって捕捉された物質の画像（つまり、複合体になる前の段階の物質の画像）を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することを目的とする。
There is a certain time delay between the time when the cytokines secreted from the cells cultured in the microwells are captured by the capture antibodies on the bottom of the glass wells (capture time) and the time when the fluorescent detection antibodies contained in the culture medium bind to the cytokines captured by the capture antibodies to form a sandwich immune complex, and the sandwich immune complex emits light that is detected by the total internal reflection microscope (detection time).
The inventors hypothesized that the relationship between the cytokines captured by the capture antibody (not detectable by microscope) and the sandwich immune complexes (detectable by microscope) corresponds to the relationship between those before convolution is performed and those after convolution is performed.
That is, the inventors hypothesized that the relationship between the sandwich immune complexes (those actually detected by the microscope) and the cytokines captured by the capture antibodies (those not detectable by the microscope) corresponds to the relationship between those before deconvolution is performed and those after deconvolution is performed.
Furthermore, the inventors have found in their extensive research that the relationship between the sandwich immune complexes (actually detected by microscopy) and the cytokines captured by the capture antibodies (not detectable by microscopy) corresponds to the relationship between those before deconvolution is performed and those after deconvolution is performed.
In other words, through extensive research, the inventors have discovered that by performing deconvolution on images of sandwich immune complexes obtained by a microscope, it is possible to estimate with high accuracy images of cytokines captured by capture antibodies, which cannot be obtained by a microscope.
In other words, the present invention aims to provide a substance estimation device, a total internal reflection microscope, a substance estimation method, and a program that can estimate with high accuracy an image of a substance, such as a cytokine, captured by a capture body such as a capture antibody (i.e., an image of a substance at a stage before it becomes a complex, such as a sandwich immune complex), which could not be visualized by conventional imaging devices (e.g. a total internal reflection microscope).
In other words, the present invention aims to provide a substance estimation device, a total internal reflection microscope, a substance estimation method, and a program that can estimate with high accuracy an image of a substance captured by a capture body (i.e., an image of the substance at a stage before it becomes a complex).
本発明の一態様は、複合体の撮像画像を取得する取得部と、前記取得部によって取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算部とを備え、前記演算部は、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出し、前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、物質推定装置である。
本発明の物質推定装置によれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
One aspect of the present invention is a substance estimation device that includes an acquisition unit that acquires an image of a complex, and a calculation unit that calculates an estimated image of a substance, which is any one of a transfer factor, a transfer substance, a transfer carrier, and an antigen, captured by a capture body based on the image of the complex acquired by the acquisition unit, wherein the calculation unit calculates an estimated image of the substance captured by the capture body by performing deconvolution on the image of the complex, and the substance captured by the capture body is a substance released from a substance release source in a solution containing a fluorescent substance and captured by a capture body placed at the bottom of the solution, and the complex is formed by the substance captured by the capture body binding to the fluorescent substance in the solution.
According to the substance estimation device of the present invention, by performing deconvolution on the captured image of the complex, it is possible to estimate with high accuracy the image of the substance captured by the capturer.
本発明者等は、鋭意研究において、物質の画像の推定に用いられる複合体の撮像画像のサンプリング間隔を増加させるに従って、捕捉体によって捕捉された物質の画像の推定精度が高くなる（つまり、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比が高くなる）ことを見い出した。
そこで、本発明の一態様の物質推定装置は、前記取得部によって取得される前記複合体の撮像画像のサンプリング間隔を設定するサンプリング間隔設定部を備え、前記演算部によって算出される前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、前記サンプリング間隔設定部は、前記複合体の撮像画像のサンプリング間隔を増加させてもよい。
そのように構成される場合には、捕捉体によって捕捉された物質の画像の推定精度を高い値に維持することができる（つまり、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比を第１閾値以上に維持することができる）。
Through extensive research, the inventors have found that increasing the sampling interval of the captured images of the complex used to estimate the image of the substance increases the accuracy of estimating the image of the substance captured by the capture body (i.e., the S/N ratio of the estimated image of the substance captured by the capture body increases).
Therefore, a substance estimation device of one embodiment of the present invention includes a sampling interval setting unit that sets a sampling interval for the image of the complex acquired by the acquisition unit, and when the S/N ratio of the estimated image of the substance captured by the capture body calculated by the calculation unit is lower than a first threshold value, the sampling interval setting unit may increase the sampling interval for the image of the complex.
When configured in this manner, the estimation accuracy of the image of the substance captured by the capture body can be maintained at a high value (i.e., the S/N ratio of the estimated image of the substance captured by the capture body can be maintained at or above the first threshold value).
複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られる値は、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像の画像信号強度に相当し、負の値になることはあり得ない。
つまり、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られる値が、負の値になる場合には、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた物質の推定画像に含まれるノイズが大きいと考えることができる。
そこで、本発明の一態様の物質推定装置では、前記演算部は、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正してもよい。
そのように構成される場合には、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値（演算部によって推定された、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像の画像信号強度）をゼロに補正することによって、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に含まれるノイズを低減することができる。
The value obtained by performing deconvolution on the captured image of the complex corresponds to the image signal intensity of the estimated image of the substance captured by the capture body, and cannot be a negative value.
In other words, if the value obtained by performing deconvolution on the captured image of the complex is a negative value, it can be considered that the noise contained in the estimated image of the substance obtained by performing deconvolution on the captured image of the complex is large.
Therefore, in the substance estimation device of one aspect of the present invention, the calculation unit may correct the value obtained by performing deconvolution on the captured image of the complex to zero when the value obtained by performing deconvolution on the captured image of the complex is less than zero.
When configured in this manner, the value obtained by performing deconvolution on the captured image of the complex (the image signal intensity of the estimated image of the substance captured by the capture body, estimated by the calculation unit) can be corrected to zero, thereby reducing noise contained in the estimated image of the substance captured by the capture body.
ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する場合、その時刻（第１時刻）との時間差が大きい時刻（第２時刻）に撮像された複合体の撮像画像が、ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に与える影響は殆ど無いと考えられる。
にもかかわらず、仮に、第２時刻に撮像された複合体の撮像画像が、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に影響を与えてしまう演算が演算部によって行われる場合には、演算部が、実質的に、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に対してノイズを加算してしまうことになる。
上述した点に鑑み、本発明の一態様の物質推定装置では、前記演算部は、第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する場合に、前記第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された前記複合体の撮像画像に基づくことなく、前記第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出してもよい。
そのように構成される場合には、演算部が、実質的に、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に対してノイズを加算してしまうおそれを抑制することができ、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に含まれるノイズを低減することができる。
When calculating an estimated image of a substance captured by the capture body at a certain time (first time), it is considered that an image of the complex captured at a time (second time) that has a large time difference from that time (first time) has almost no effect on the estimated image of the substance captured by the capture body at the certain time (first time).
Nevertheless, if the calculation unit performs a calculation in which the image of the complex taken at the second time affects the estimated image of the substance captured by the capture body at the first time, the calculation unit will essentially add noise to the estimated image of the substance captured by the capture body.
In consideration of the above-mentioned points, in a substance estimation device of one embodiment of the present invention, when calculating an estimated image of the substance captured by the capture body at a first time, the calculation unit may calculate the estimated image of the substance captured by the capture body at the first time without basing it on an image of the complex captured at a second time whose time difference from the first time is greater than a second threshold value.
When configured in this manner, the calculation unit can effectively suppress the risk of adding noise to the estimated image of the substance captured by the capture body, thereby reducing the noise contained in the estimated image of the substance captured by the capture body.
本発明の一態様は、前記物質推定装置を備える全反射照明顕微鏡である。
本発明の全反射照明顕微鏡によれば、従来の全反射照明顕微鏡によっては得ることができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を得ることができる。
One aspect of the present invention is a total internal reflection illumination microscope including the material estimation device.
According to the total internal reflection illumination microscope of the present invention, it is possible to obtain an image of a substance captured by a capture body, which cannot be obtained by a conventional total internal reflection illumination microscope.
本発明の一態様は、複合体の撮像画像を取得する取得ステップと、前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップとを備え、前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、物質推定方法である。
本発明の物質推定方法によれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、撮像装置によっては可視化することができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
One aspect of the present invention is a substance estimation method comprising an acquisition step of acquiring an image of a complex, and a calculation step of calculating an estimated image of a substance, which is any one of a transfer factor, a transfer substance, a transfer carrier, and an antigen, captured by a capture body based on the image of the complex acquired in the acquisition step, wherein in the calculation step, an estimated image of the substance captured by the capture body is calculated by performing deconvolution on the image of the complex, the substance captured by the capture body is a substance released from a substance release source in a solution containing a fluorescent substance and captured by a capture body placed at the bottom of the solution, and the complex is formed by binding of the substance captured by the capture body and the fluorescent substance in the solution.
According to the substance estimation method of the present invention, by performing deconvolution on the captured image of the complex, it is possible to estimate with high accuracy the image of the substance captured by the capture body, which cannot be visualized by the imaging device.
本発明の一態様は、コンピュータに、複合体の撮像画像を取得する取得ステップと、前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップとを実行させるためのプログラムであって、前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、プログラムである。
本発明のプログラムによれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、撮像装置によっては可視化することができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
One aspect of the present invention is a program for causing a computer to execute an acquisition step of acquiring an image of a complex, and an operation step of calculating an estimated image of a substance, which is any one of a transfer factor, a transfer substance, a transfer carrier, and an antigen, captured by a capture body based on the image of the complex acquired in the acquisition step, wherein in the operation step, an estimated image of the substance captured by the capture body is calculated by performing deconvolution on the image of the complex, the substance captured by the capture body is a substance released from a substance release source in a solution containing a fluorescent substance and captured by a capture body placed at the bottom of the solution, and the complex is formed by binding of the substance captured by the capture body and the fluorescent substance in the solution.
According to the program of the present invention, by performing deconvolution on the captured image of the complex, it is possible to estimate with high accuracy the image of the substance captured by the capture body, which cannot be visualized by the imaging device.
本発明によれば、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することができる。 The present invention provides a substance estimation device, a total internal reflection microscope, a substance estimation method, and a program that can estimate with high accuracy an image of a substance captured by a capture body.
以下、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムの実施形態について説明する。 The following describes embodiments of the substance estimation device, total internal reflection microscope, substance estimation method, and program of the present invention.
＜第１実施形態＞
図１は第１実施形態の物質推定装置１の機能ブロックの一例を示す図である。
図１に示す例では、物質推定装置１が、従来の撮像装置によっては可視化することができなかった、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の画像を可視化する。物質推定装置１は、取得部１Ａと、演算部１Ｂと、サンプリング間隔設定部１Ｃとを備えている。
取得部１Ａは、顕微鏡によって撮像された複合体（例えばサンドイッチ免疫複合体など）の撮像画像ＭＹを取得する。
演算部１Ｂは、取得部１Ａによって取得された複合体の撮像画像ＭＹに基づいて、捕捉体（例えば捕捉抗体など）によって捕捉された物質（例えばサイトカインなど）の推定画像ＭＡを算出する。詳細には、演算部１Ｂは、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する。
第１実施形態の物質推定装置１の適用対象である捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体（例えば蛍光検出抗体など）を含む溶液（例えば培養液など）中において物質放出源（例えば細胞など）から放出された物質が、溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものである。
また、第１実施形態の物質推定装置１の適用対象である複合体は、捕捉体によって捕捉された物質と、溶液中の蛍光体とが結合して形成されたものである。
First Embodiment
FIG. 1 is a diagram showing an example of a functional block of a
In the example shown in Fig. 1, a
The
The calculation unit 1B calculates an estimated image MA of a substance (e.g., a cytokine) captured by a capture body (e.g., a capture antibody) based on the captured image MY of the complex acquired by the
The substance captured by the capture body to which the
Moreover, the complex to which the
図１に示す例では、サンプリング間隔設定部１Ｃが、取得部１Ａによって取得される複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔを設定する。
複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔによっては、演算部１Ｂによって算出される捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡのＳ／Ｎ比が低くなることがある。
そこで、図１に示す例では、演算部１Ｂによって算出される捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡのＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、サンプリング間隔設定部１Ｃが、複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔを増加させる。
In the example shown in FIG. 1, the sampling
Depending on the sampling interval Δt of the captured image MY of the complex, the S/N ratio of the estimated image MA of the substance captured by the capture body calculated by the calculation unit 1B may become low.
Therefore, in the example shown in Figure 1, when the S/N ratio of the estimated image MA of the substance captured by the capture body calculated by the calculation unit 1B is lower than a first threshold value, the sampling
場合によっては、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られる値（物質の推定画像ＭＡの画像信号強度（signal intensity））がゼロ未満になることもある。
そこで、図１に示す例では、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、演算部１Ｂは、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正する。
In some cases, the value obtained by performing deconvolution on the captured image MY of the complex (the image signal intensity of the estimated image MA of the substance) may be less than zero.
Therefore, in the example shown in FIG. 1, when the value obtained by performing deconvolution on the image MY of the complex is less than zero, the calculation unit 1B corrects the value obtained by performing deconvolution on the image MY of the complex to zero.
ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する場合には、その時刻（第１時刻）との時間差が大きい時刻（第２時刻）に撮像された複合体の撮像画像ＭＹが、ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡに与える影響は殆ど無いと考えられる。
そこで、図１に示す例では、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する場合に、演算部１Ｂは、第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された複合体の撮像画像ＭＹに基づくことなく（つまり、第２時刻に撮像された複合体の撮像画像ＭＹを利用することなく）、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する。
When calculating an estimated image MA of a substance captured by the capture body at a certain time (first time), it is considered that an image MY of the complex captured at a time (second time) that has a large time difference from that time (first time) has almost no effect on the estimated image MA of the substance captured by the capture body at the certain time (first time).
Therefore, in the example shown in Figure 1, when calculating an estimated image MA of a substance captured by the capturing body at a first time, the calculation unit 1B calculates the estimated image MA of the substance captured by the capturing body at the first time without basing it on the image MY of the complex captured at a second time whose time difference from the first time is greater than a second threshold value (i.e., without using the image MY of the complex captured at the second time).
＜適用例＞
図２は第１実施形態の物質推定装置１が適用された全反射照明顕微鏡Ａの機能ブロックの一例を示す図である。
図２に示す例では、全反射照明顕微鏡Ａが、図１に示す物質推定装置１と、全反射照明顕微鏡本体Ａ１とを備えている。
つまり、図２に示す例では、全反射照明顕微鏡本体Ａ１によって撮像された複合体の撮像画像ＭＹが、物質推定装置１の取得部Ａ１によって取得される。更に、物質推定装置１の演算部１Ｂにおいて、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡが、取得部Ａ１によって取得された複合体の撮像画像ＭＹに基づいて算出される。
<Application Examples>
FIG. 2 is a diagram showing an example of a functional block of a total internal reflection illumination microscope A to which the
In the example shown in FIG. 2, a total internal reflection illumination microscope A includes the
2, an image MY of the complex captured by the total internal reflection microscope main body A1 is acquired by the acquisition unit A1 of the
＜第２実施形態＞
以下、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムの第２実施形態について説明する。
第２実施形態の物質推定装置１は、後述する点を除き、上述した第１実施形態の物質推定装置１と同様に構成されている。従って、第２実施形態の物質推定装置１によれば、後述する点を除き、上述した第１実施形態の物質推定装置１と同様の効果を奏することができる。
第２実施形態の物質推定装置１では、細胞以外のものから放出され、捕捉体によって捕捉された物質（つまり、サイトカイン以外の物質）の推定画像が算出される。
Second Embodiment
A second embodiment of the material estimation apparatus, the total internal reflection microscope, the material estimation method, and the program of the present invention will be described below.
Except for the points described below, the
In the
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実施することができる。 The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples and can be modified as appropriate without departing from the spirit of the invention.
［実施例］
本発明者等は、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムをイムノアッセイに適用した。
図３はイムノアッセイのためのデコンボリューションの数理シミュレーションを説明するための図である。
詳細には、図３（Ａ）において、中段のグラフは、抗原のスパイク増加（上段のグラフ）と検出抗体の染色ダイナミクスのコンボリューションを示しており、ＬＣＩ－Ｓ実験では実際このようなイムノアッセイシグナルが得られる。下段のグラフは、イムノアッセイシグナルから５フレームごとの移動デコンボリューションによって得られた推定抗原量を示す。
図３（Ｂ）は、ノイズ低減処理サンプリング間隔がデコンボリューションに与える影響を示している。ホワイトノイズを含むコンボリューションイムノアッセイシグナルを、１、３、５、１０間隔でサンプリングすることでデコンボリューションを行った。
図３（Ｃ）は、サンプリング間隔とＳ／Ｎ比の相関を示している。シグナルのデコンボリューションの数理シミュレーションを各間隔ごとに１００回繰り返した。Ｓ／Ｎ比は、デコンボリューションされたシグナルのピークの高さと背景データの標準偏差を用いて算出した。サンプリング間隔が長くなるほど、時間的な再現精度は悪くなるが、Ｓ／Ｎ比は向上し、サンプリング間隔とＳ／Ｎ比の関係は正の比例関係にあった（Ｒ２＞０．９９９）。
図３（Ｄ）は、抗原を分泌する細胞の約５００ステップのランダムウォークのシミュレーション例を示している。各ステップで分泌される抗原の量は対数正規分布に沿ってランダムに与えた。細い折れ線は細胞の重心の軌跡を、丸印は再現されたシグナル増分の極大値点を示している。丸印のグレースケールの塗りつぶしは時間経過を表す。
図３（Ｅ）は、４つの異なるサンプリング間隔での抗体結合の基準曲線を示している。
図３（Ｆ）は、ある時点における細胞重心位置から各相対時点（－１２～＋１２時間、横軸）で再現された捕捉抗原増分分布の極大値点までの変位のアンサンブル平均を示している。シミュレーションは、各間隔時間で１００回繰り返した。
[Example]
The present inventors applied the substance estimation apparatus, the total internal reflection microscope, the substance estimation method and the program of the present invention to immunoassay.
FIG. 3 is a diagram for explaining a mathematical simulation of deconvolution for immunoassay.
In detail, in Fig. 3(A), the middle graph shows the convolution of the antigen spike (top graph) and the staining dynamics of the detection antibody, which is the immunoassay signal actually obtained in the LCI-S experiment. The bottom graph shows the estimated antigen amount obtained by moving deconvolution of the immunoassay signal every 5 frames.
Figure 3(B) shows the effect of noise reduction sampling intervals on deconvolution. Convolution immunoassay signals containing white noise were deconvoluted by sampling at intervals of 1, 3, 5, and 10.
Figure 3(C) shows the correlation between the sampling interval and the S/N ratio. The mathematical simulation of the signal deconvolution was repeated 100 times for each interval. The S/N ratio was calculated using the peak height of the deconvoluted signal and the standard deviation of the background data. The longer the sampling interval, the worse the temporal reproducibility, but the better the S/N ratio, and the relationship between the sampling interval and the S/N ratio was directly proportional (R2>0.999).
Figure 3(D) shows an example of a simulation of approximately 500 steps of random walk of an antigen-secreting cell. The amount of antigen secreted at each step was randomly given along a log-normal distribution. The thin broken line shows the trajectory of the center of mass of the cell, and the circles show the maximum points of the reproduced signal increment. The grayscale fill of the circles indicates the time course.
FIG. 3(E) shows the baseline curves of antibody binding at four different sampling intervals.
Figure 3(F) shows the ensemble average of the displacement from the cell centroid position at a certain time point to the local maximum point of the captured antigen increment distribution reproduced at each relative time point (-12 to +12 hours, horizontal axis). The simulation was repeated 100 times at each interval time.
図４は移動デコンボリューションによって抗体結合動態を差し引いた後の各時点での分泌物質増分の空間的位置を示す画像である。
累積分泌シグナル画像（中）から、イムノアッセイの抗体結合動態を差し引くために移動デコンボリューションを行い、特定の時点での捕捉抗原の増分分布画像（下：分泌活性画像）を算出した。分泌活性の中心は、NIS-elements画像ソフトウェア上のスポット検出アルゴリズムにより、分泌活性画像から検出した。各時点での細胞位置は、明視野画像（上）から画像解析によって得られる細胞体の重心として定義した。明視野画像より得た細胞体の輪郭（白線）を、それぞれの対応する分泌活性画像上に重ね合わせている。ナノリットルウェルの大きさは一辺が８０μｍの立方体である。
FIG. 4 is an image showing the spatial location of the secreted material increment at each time point after subtraction of antibody binding kinetics by transfer deconvolution.
From the cumulative secretion signal image (middle), a shift deconvolution was performed to subtract the antibody binding kinetics of the immunoassay, and the incremental distribution image of the captured antigen at a specific time point (bottom: secretion activity image) was calculated. The center of secretion activity was detected from the secretion activity image by a spot detection algorithm in the NIS-elements image software. The cell position at each time point was defined as the center of gravity of the cell body obtained by image analysis from the bright-field image (top). The outline (white line) of the cell body obtained from the bright-field image was superimposed on each corresponding secretion activity image. The size of the nanoliter well was a cube with one side of 80 μm.
図５は細胞の移動と分泌活性の追跡を示す図である。
詳細には、図５の左側のグラフにおいて、細い折れ線は細胞の重心の軌跡を、丸印は再現されたシグナル増分の中心を示している。丸印のグレースケールの塗りつぶしは時間経過を表す。図５の右側上段のグラフは、分泌活性の強度の変化を示している。図５の右側の下段のグラフは各時点での細胞からの分泌活性中心までの変位を示している。特に分泌活性強度の大きい時間帯は中心の検出精度が高くなるために、細胞からの変位が安定的に低く抑えられていると考えられる。変位距離は実質的に１０μｍ以下、平均では約５μｍであった。
FIG. 5 shows the tracking of cell migration and secretory activity.
In detail, in the graph on the left side of Fig. 5, the thin broken line indicates the trajectory of the center of gravity of the cell, and the circle indicates the center of the reproduced signal increment. The grayscale fill of the circle indicates the time course. The graph on the upper right side of Fig. 5 shows the change in the intensity of secretory activity. The graph on the lower right side of Fig. 5 shows the displacement from the cell to the center of secretory activity at each time point. It is considered that the displacement from the cell is stably suppressed to a low level, especially during the time period when the intensity of secretory activity is high, because the detection accuracy of the center is high. The displacement distance was substantially less than 10 μm, and about 5 μm on average.
図６は細胞重心と分泌活性中心の検出同時性の評価を示している。
図６の左側のグラフは、ある時点においてデコンボリューション演算により再現された捕捉抗原増分分布の極大点から各相対時点（－１５～＋１５分、横軸）における細胞重心位置までの変位のアンサンブル平均を示している。変位は－２分で最小化され、細胞が実際に存在し分泌活性を発揮していた時点から２分後に分泌活性が検出されたことを示す。図６の右側のグラフは、細胞から分泌活性極大点までの変位を最小化する時間差の頻度分布を示している。細胞が存在した場所と同一点における分泌活性の検出は多くの場合２分の遅れを持つことを示している。
FIG. 6 shows the evaluation of the simultaneity of detection of the cell center of gravity and the secretory activity center.
The graph on the left side of Fig. 6 shows the ensemble average of the displacement from the maximum point of the capture antigen increment distribution reproduced by the deconvolution calculation at a certain time point to the cell center of gravity position at each relative time point (-15 to +15 minutes, horizontal axis). The displacement was minimized at -2 minutes, indicating that secretory activity was detected 2 minutes after the time point when the cell was actually present and exhibiting secretory activity. The graph on the right side of Fig. 6 shows the frequency distribution of the time difference that minimizes the displacement from the cell to the maximum point of secretory activity. It shows that the detection of secretory activity at the same point where the cell was present often has a delay of 2 minutes.
図７は組み換えタンパク質のマイクロインジェクションによって実測した抗体結合標準曲線を示す図である。
１０ｎＭ、３０ｎＭ、９０ｎＭの濃度で蛍光検出抗体存在下の細胞分泌計測と同一の条件において、抗原標準タンパク質として組み換えタンパク質をマイクロインジェクションし、蛍光検出抗体の結合標準曲線を得た。
FIG. 7 shows the antibody binding standard curve measured by microinjection of recombinant proteins.
The recombinant protein was microinjected as an antigen standard protein at concentrations of 10 nM, 30 nM, and 90 nM under the same conditions as those for measuring cell secretion in the presence of the fluorescent detection antibody, and a binding standard curve for the fluorescent detection antibody was obtained.
ガラス底表面に捕捉された抗原分子の数は時間の経過とともに増加し、解離することなく単純に蓄積されると仮定する。抗原分子がｔ＝０において底面上のある一点に捕捉されると、質量作用の法則に従って検出抗体が抗原に結合する。この場合、ごく短い時間△ｔにおける抗体-抗原複合体の増分△Ｘは下記の（１）式のように表される。 We assume that the number of antigen molecules captured on the glass bottom surface increases over time and simply accumulates without dissociation. When an antigen molecule is captured at a point on the bottom surface at t = 0, the detection antibody binds to the antigen according to the law of mass action. In this case, the increment △X of the antibody-antigen complex in a very short time △t is expressed as the following equation (1).
（１）式において、Ｘ、Ａｇ、Ａｂはそれぞれ抗体－抗原複合体、抗原分子、抗体の濃度を表し、ｋｏｎ、ｋｏｆｆは結合速度定数、解離速度定数である。ＬＣＩ－Ｓ条件下では、ナノリットルウェル内の検出抗体溶液はその上部の多量なプールと連続しているため、未結合抗体濃度の変動は無視できる。 In equation (1), X, Ag, and Ab represent the concentrations of the antibody-antigen complex, antigen molecule, and antibody, respectively, and k on and k off are the binding rate constant and the dissociation rate constant. Under LCI-S conditions, the detection antibody solution in the nanoliter well is continuous with the large pool above it, so fluctuations in the concentration of unbound antibody can be ignored.
（２）を代入して（１）式を解くと、（３）式～（５）式のようになる。 Substituting (2) and solving equation (1), we get equations (3) to (5).
各時刻のＡｇ（ｔ）における捕捉抗原の増分は、各時間においてそれぞれ独立に検出抗体で染色される。したがって、その時点での複合体濃度Ｙ（τ）は、Ａｇ（ｔ）を用いた（６）式のコンボリューションで与えられる（ただしｔ≦τ）。 The increment of the captured antigen at each time Ag(t) is stained with the detection antibody independently at each time. Therefore, the complex concentration Y(τ) at that time is given by the convolution of equation (6) with Ag(t) (where t≦τ).
△ｔ間隔でｎ回計測した場合、各回の複合体濃度Ｙｎは（７）式、（８）式で与えられる。 When measurements are taken n times at intervals of Δt, the complex concentration Y n for each measurement is given by equations (7) and (8).
一方、捕捉抗原Ａｇｎの増分は、（９）式のように記述することができる。 On the other hand, the increment of the captured antigen Ag n can be expressed as in equation (9).
上記の（９）式は、ある時点における捕捉抗原の増分が、次の時点での複合体濃度Ｙｎ＋１から直前の以前の全ての時点において導出された複合体濃度ＡｇｉＺｎ＋１－ｉの総和を差し引いた差分と初期染色量Ｚ１との比として与えられることを示している。 The above formula (9) shows that the increment of captured antigen at a certain time point is given as the ratio of the difference obtained by subtracting the sum of the complex concentrations Ag i Z n+1-i derived at all the immediately preceding time points from the complex concentration Y n+1 at the next time point to the initial staining amount Z 1 .
（抗原結合動態と検出抗体結合動態の分離の数理シミュレーション）
上述した図３（Ａ）は、Ａｇ２０＝１が与えられた場合の抗体染色動態のコンボリューション結果を示している。サンプリング間隔５で移動デコンボリューションを行った場合、図３（Ａ）に示すように、捕捉抗原Ａｇｎの増分が再現されている。実際の測定では、検出されるシグナルはノイズを含んでいる。Ａｇｎの再現に対するノイズの影響をシミュレーションによって評価するために、コンボリューションシグナル生成に際しホワイトノイズを加えた（図３（Ｂ））。サンプリング間隔を１、３、５、１０とした移動デコンボリューションを行った結果、サンプリング間隔の違いが捕捉抗原増分の再現における時間分解能とシグナル／ノイズ比の向上の両者に対する効果に違いを与えることを示した（図３（Ｂ）、図３（Ｃ））。十分に検出可能かつできるだけ高い時間分解能で再現シグナルを得るため、サンプリング間隔を５として、２つの時間点のすべてについて移動デコンボリューションを行った。
次に、遊走しながら分泌する細胞を二次元ランダムウォーク的に移動するものとして分泌動態シミュレーションを行った。分泌活性は対数分布に従って変動するランダム事象として与えた。図３（Ｄ）は、各時点における細胞の位置と、再現された捕捉抗原増分の空間分布の極大値を持つ位置を示している。但し、分泌された分子は拡散せずにすぐにガラス表面上のキャプチャー抗体によって捕捉されたと仮定し、時点ｎで与えられる抗原はその場で捕捉されて捕捉抗原Ａｇｎを与えている。再現された分泌シグナルの極大値点は、細胞が存在していた点からずれて観察された。この変位は、サンプリング時間間隔に依存するデコンボリューションによるテーリングが発生したことに起因する。この現象は、以下の例で説明できる。５００ステップのランダムウォークの１００回の試行について１、３、５、１０のサンプリング間隔において各時点で再現した分泌シグナル極大値点の場所と同時あるいは前後の相対時間（－１２から＋１２の２５点）にある細胞存在場所の二点間の平均化された変位を計算した（図３（Ｅ）、図３（Ｆ））。その結果、分泌極大点と同一時刻にある細胞の場所との比較において変位が最小となり、サンプリング時間の増加に伴って極小変位の谷の幅が広がることがわかった。これらの結果は、デコンボリューションされた分泌活性とその時点での個々の細胞の他の動態との時空間的な相関解析が可能であることを示している。
(Mathematical simulation of separation of antigen-binding kinetics and detection antibody-binding kinetics)
FIG. 3(A) above shows the convolution results of antibody staining kinetics when Ag 20 =1 is given. When moving deconvolution is performed with a sampling interval of 5, the increment of the captured antigen Ag n is reproduced as shown in FIG. 3(A). In actual measurements, the detected signal contains noise. In order to evaluate the effect of noise on the reproduction of Ag n by simulation, white noise was added when generating the convolution signal (FIG. 3(B)). As a result of performing moving deconvolution with sampling intervals of 1, 3, 5, and 10, it was shown that the difference in sampling interval gives different effects on both the time resolution and the improvement of the signal/noise ratio in the reproduction of the captured antigen increment (FIG. 3(B), FIG. 3(C)). In order to obtain a reproduced signal that is sufficiently detectable and has the highest possible time resolution, moving deconvolution was performed for all two time points with a sampling interval of 5.
Next, a secretion dynamics simulation was performed assuming that migrating secretory cells move in a two-dimensional random walk manner. The secretion activity was given as a random event that fluctuates according to a logarithmic distribution. Figure 3(D) shows the position of the cell at each time point and the position with the maximum value of the spatial distribution of the reproduced captured antigen increment. However, it is assumed that the secreted molecules are not diffused but are immediately captured by the capture antibody on the glass surface, and the antigen given at time point n is captured in situ to give the captured antigen Ag n . The maximum point of the reproduced secretion signal was observed to be shifted from the point where the cell was present. This displacement is due to the occurrence of tailing due to deconvolution depending on the sampling time interval. This phenomenon can be explained by the following example. For 100 trials of a 500-step random walk, the average displacement between two points of the cell presence locations at the same time or before and after the location of the secretion signal maximum point reproduced at each time point at sampling intervals of 1, 3, 5, and 10 was calculated (Figure 3(E), Figure 3(F)). As a result, we found that the displacement was minimal when comparing the secretory maximum with the location of the cell at the same time, and the width of the valley of the displacement became wider with increasing sampling time. These results indicate that it is possible to perform spatiotemporal correlation analysis between the deconvoluted secretory activity and other dynamics of individual cells at that time.
（実際に分泌する細胞を使用したデータでの実施例）
マウスの腸間膜に存在するリンパ球集積であるFat associated lymphoid clusterから得た２型自然リンパ球（ILC2s）をIL-2添加培養で増殖させて実験に使用した。IL-2/IL-33で刺激してILC2sからのIL-5分泌活性を誘導し、１分毎にＬＣＩ－Ｓで可視化した。検出抗体の濃度は、バックグラウンドノイズと区別するのに十分なシグナルの強度を得るために、比較的高い濃度（９０ｎＭ）に設定した。細胞の位置は、明視野画像から抽出した輪郭の面積重心として定義した。捕捉された抗原の増分分布は、同じ実験条件において組換えIL-5タンパク質を用いたマイクロインジェクションを用いた注入実験で経験的に得られた抗体結合標準曲線（図７）に基づいて再現した。再現のための画像演算は、NIS-elementsソフトウェアを用いて行った。簡単に説明すると、まず、画像取得時の不安定性に起因する時間依存性の空間ドリフトを補正し、その後、時間軸に沿った５フレーム移動メディアンフィルタを用いた平滑化により散発的なノイズを除去した。次いで、画像に５×５ピクセルのビニング処理を施し、上述のようにサンプリング間隔５で移動デコンボリューションを実行した。図４に示すように、累積分泌シグナル量から各時点での捕捉抗原増加量の分布を再現することに成功した。捕捉抗原増加量の極大点位置をNIS-elements 上の粒子検出アルゴリズムで決定し、捕捉抗原増加量の分布の中心を決定した。複数の中心が検出された場合は、強度の高いものを採用した（図５左）。細胞の重心と捕捉抗原増加量の中心を比較したとこと、各時点において、捕捉抗原増加量分布の中心は細胞位置からほぼ５μｍ以内にあることがわかった。しかし、シミュレーション（図３）において時間方向の同期性が担保されているにも関わらず、シグナル増分の出現タイミングが約２分遅れていることがわかった（図６）。この現象の原因について、いくつかの可能性が考えられる。まず、細胞から分泌された分子が底面の捕捉抗体に捕捉されるまで拡散によって移動するために要する時間から、一定の遅延が想定される。実際には、シグナルの増加分は最大で数十μｍの直径を持つ分布として観察されるが、培地中で約３０ｋＤａの分子量を持つ当該分子の拡散速度は少なくとも１００μｍ２／秒であることを考慮すると、分泌された分子の大部分が捕捉されるためには数秒しか要さないことを踏まえると、拡散に要する遅延は主原因ではなかったことを示唆している。もう一つの可能性として、分泌中の細胞自体が捕捉抗体の固定化底面を覆っているため、捕捉された分子への検出抗体によるアクセスを著しく阻害することが考えられる。
(Example using data from actual secreting cells)
Type 2 innate lymphoid cells (ILC2s) obtained from fat associated lymphoid clusters, which are lymphocyte accumulations present in mouse mesentery, were grown in IL-2-supplemented culture and used in the experiment. IL-5 secretion activity from ILC2s was induced by stimulation with IL-2/IL-33 and visualized every minute with LCI-S. The concentration of the detection antibody was set relatively high (90 nM) to obtain a signal intensity sufficient to distinguish it from background noise. The position of the cell was defined as the area centroid of the contour extracted from the bright-field image. The incremental distribution of the captured antigen was reproduced based on the antibody binding standard curve (Figure 7) empirically obtained in an injection experiment using microinjection with recombinant IL-5 protein under the same experimental conditions. Image calculation for reproduction was performed using NIS-elements software. Briefly, first, the time-dependent spatial drift caused by instability during image acquisition was corrected, and then sporadic noise was removed by smoothing using a 5-frame moving median filter along the time axis. The images were then binned to 5 × 5 pixels, and moving deconvolution was performed with a sampling interval of 5 as described above. As shown in Figure 4, we were able to successfully reproduce the distribution of the increase in the captured antigen at each time point from the cumulative secretion signal amount. The position of the maximum point of the increase in the captured antigen was determined using a particle detection algorithm on NIS-elements, and the center of the distribution of the increase in the captured antigen was determined. When multiple centers were detected, the one with the highest intensity was used (Figure 5, left). By comparing the center of gravity of the cell with the center of the increase in the captured antigen, it was found that the center of the distribution of the increase in the captured antigen was within approximately 5 μm of the cell position at each time point. However, despite the fact that the synchronization in the time direction was guaranteed in the simulation (Figure 3), it was found that the timing of the appearance of the signal increment was delayed by about 2 minutes (Figure 6). There are several possible reasons for this phenomenon. First, a certain delay is assumed based on the time it takes for the molecules secreted from the cell to move by diffusion until they are captured by the capture antibody on the bottom surface. In fact, the signal increase was observed as a distribution with a diameter of up to several tens of μm, but considering that the diffusion rate of the molecule in question with a molecular weight of about 30 kDa in the medium is at least 100 μm 2 /sec, it would take only a few seconds for most of the secreted molecules to be captured, suggesting that the delay required for diffusion was not the main cause. Another possibility is that the secreting cells themselves cover the bottom surface where the capture antibody is immobilized, significantly inhibiting the access of the detection antibody to the captured molecules.
以上、本発明を実施するための形態について実施形態を用いて説明したが、本発明はこうした実施形態に何等限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形及び置換を加えることができる。上述した各実施形態および各例に記載の構成を組み合わせてもよい。 Although the above describes the form for carrying out the present invention using the embodiments, the present invention is not limited to these embodiments in any way, and various modifications and substitutions can be made without departing from the scope of the present invention. The configurations described in the above-mentioned embodiments and examples may be combined.
なお、上述した実施形態における物質推定装置１および全反射照明顕微鏡Ａが備える各部の機能全体あるいはその一部は、これらの機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現しても良い。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶部のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでも良い。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。
The entire or part of the functions of each unit of the
Furthermore, "computer-readable recording medium" refers to portable media such as flexible disks, optical magnetic disks, ROMs, and CD-ROMs, and storage units such as hard disks built into computer systems. Furthermore, "computer-readable recording medium" may also include those that dynamically hold a program for a short period of time, such as a communication line when transmitting a program via a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line, and those that hold a program for a certain period of time, such as volatile memory inside a computer system that serves as a server or client in such cases. Furthermore, the above program may be one that realizes part of the above-mentioned functions, or may be one that can realize the above-mentioned functions in combination with a program already recorded in the computer system.
１…物質推定装置、１Ａ…取得部、１Ｂ…演算部、１Ｃ…サンプリング間隔設定部、Ａ…全反射照明顕微鏡、Ａ１…全反射照明顕微鏡本体 1...Material estimation device, 1A...Acquisition unit, 1B...Calculation unit, 1C...Sampling interval setting unit, A...Total internal reflection illumination microscope, A1...Total internal reflection illumination microscope body
Claims (7)
前記取得部によって取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算部とを備え、
前記演算部は、前記複合体の撮像画像から得られる、捕捉体によって捕捉された物質の増加と蛍光体の染色状態の時間変化とのコンボリューションによって示される蛍光シグナルに対して、式（Ａ）に示す関係を用いた所定フレームごとの時間軸方向のデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出し、
前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、
前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、
物質推定装置。
ただし、式（Ａ）におけるＸは前記複合体の濃度、Ａｇは前記物質の濃度、Ａｂは前記捕捉体の濃度、ｋｏｎは結合速度定数、ｋｏｆｆは解離速度定数である。
a calculation unit that calculates an estimated image of a substance that is any one of a transfer factor, a transfer substance, a transfer carrier, and an antigen captured by the capture body based on the captured image of the complex acquired by the acquisition unit,
the calculation unit calculates an estimated image of the substance captured by the capture body by performing deconvolution in the time axis direction for each predetermined frame using the relationship shown in formula (A) on a fluorescent signal obtained from a captured image of the complex, the fluorescent signal being obtained by convolution of an increase in the substance captured by the capture body and a change over time in the staining state of the fluorescent substance;
the substance captured by the capture body is a substance released from a substance release source in a solution containing a fluorescent substance and captured by a capture body disposed at the bottom of the solution;
The complex is formed by binding the substance captured by the capture body to the fluorescent substance in the solution.
Material estimation device.
In the formula (A), X is the concentration of the complex, Ag is the concentration of the substance, Ab is the concentration of the capture body, kon is the binding rate constant, and koff is the dissociation rate constant.
前記演算部によって算出される前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、
前記サンプリング間隔設定部は、前記複合体の撮像画像の前記サンプリング時間間隔を増加させる、
請求項１に記載の物質推定装置。 a sampling interval setting unit that sets the sampling time interval of the captured image of the complex acquired by the acquisition unit,
When the S/N ratio of the estimated image of the substance captured by the capture body calculated by the calculation unit is lower than a first threshold value,
The sampling interval setting unit increases the sampling time interval of the captured image of the complex.
The material estimation device according to claim 1 .
前記複合体の撮像画像に対して前記デコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、
前記複合体の撮像画像に対して前記デコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正する、
請求項１に記載の物質推定装置。 The calculation unit is
When the value obtained by performing the deconvolution on the captured image of the complex is less than zero,
Correcting the value obtained by performing the deconvolution on the captured image of the complex to zero;
The material estimation device according to claim 1 .
第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する場合に、
前記第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された前記複合体の撮像画像に基づくことなく、前記第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する、
請求項１に記載の物質推定装置。 The calculation unit is
When calculating an estimated image of a substance captured by the capture body at a first time,
calculating an estimated image of the substance captured by the capture body at the first time without using an image of the complex captured at a second time whose time difference from the first time is greater than a second threshold value;
The material estimation device according to claim 1 .
前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップとを備え、
前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像から得られる、捕捉体によって捕捉された物質の増加と蛍光体の染色状態の時間変化のコンボリューションによって示される蛍光シグナルに対して、式（Ａ）に示す関係を用いた所定フレームごとの時間軸方向のデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、
前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、
前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、
物質推定方法。
ただし、式（Ａ）におけるＸは前記複合体の濃度、Ａｇは前記物質の濃度、Ａｂは前記捕捉体の濃度、ｋｏｎは結合速度定数、ｋｏｆｆは解離速度定数である。
and a calculation step of calculating an estimated image of a substance, which is any one of a transfer factor, a transfer substance, a transfer carrier, and an antigen, captured by the capture body based on the captured image of the complex acquired in the acquisition step,
In the calculation step, a fluorescent signal obtained from a captured image of the complex and shown by a convolution of an increase in the substance captured by the capture body and a time change in the staining state of the fluorescent substance is deconvoluted in the time axis direction for each predetermined frame using the relationship shown in formula (A) , thereby calculating an estimated image of the substance captured by the capture body;
the substance captured by the capture body is a substance released from a substance release source in a solution containing a fluorescent substance and captured by a capture body disposed at the bottom of the solution;
The complex is formed by binding the substance captured by the capture body to the fluorescent substance in the solution.
Material estimation method.
In the formula (A), X is the concentration of the complex, Ag is the concentration of the substance, Ab is the concentration of the capture body, kon is the binding rate constant, and koff is the dissociation rate constant.
所定のサンプリング時間間隔による複合体の撮像画像を取得する取得ステップと、
前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップと
を実行させるためのプログラムであって、
前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像から得られる、捕捉体によって捕捉された物質の増加と蛍光体の染色状態の時間変化とのコンボリューションによって示される蛍光シグナルに対して、式（Ａ）に示す関係を用いた所定フレームごとの時間軸方向のデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、
前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放
出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、
前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、
プログラム。
ただし、式（Ａ）におけるＸは前記複合体の濃度、Ａｇは前記物質の濃度、Ａｂは前記捕捉体の濃度、ｋｏｎは結合速度定数、ｋｏｆｆは解離速度定数である。
An acquisition step of acquiring an image of the complex at a predetermined sampling time interval;
and a calculation step of calculating an estimated image of a substance that is any one of a transfer factor, a transfer substance, a transfer carrier, and an antigen captured by a capture body based on the captured image of the complex acquired in the acquisition step,
In the calculation step, a fluorescent signal obtained from a captured image of the complex and shown by a convolution between an increase in the substance captured by the capture body and a time change in the staining state of the fluorescent substance is deconvoluted in the time axis direction for each predetermined frame using the relationship shown in formula (A) , thereby calculating an estimated image of the substance captured by the capture body;
the substance captured by the capture body is a substance released from a substance release source in a solution containing a fluorescent substance and captured by a capture body disposed at the bottom of the solution;
The complex is formed by binding the substance captured by the capture body to the fluorescent substance in the solution.
program.
In the formula (A), X is the concentration of the complex, Ag is the concentration of the substance, Ab is the concentration of the capture body, kon is the binding rate constant, and koff is the dissociation rate constant.
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-
2020
- 2020-11-26 JP JP2020196355A patent/JP7690166B2/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110304687A1 (en) | 2010-06-14 | 2011-12-15 | Microsoft Corporation | Generating sharp images, panoramas, and videos from motion-blurred videos |
| US20140228674A1 (en) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System and Method for Temporal Fidelity Enhanced Medical Imaging Using Temporal Deconvolution |
| JP2014164004A (en) | 2013-02-22 | 2014-09-08 | Hitachi High-Technologies Corp | Fluorescence microscope |
| WO2017126615A1 (en) | 2016-01-19 | 2017-07-27 | 国立大学法人 東京大学 | Method and system for cell collection based on information regarding change over time |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yoshitaka Shirasaki，Real-time single-cell imaging of protein secretion，Scientific Reports，2014年，Vol.4 No.4736，pp.4736-1～4736-8，DOI: 10.1038/srep04736 |
Also Published As
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