JP7731596B2

JP7731596B2 - Ｇｌｐ－１受容体アゴニスト及び抗オスカー抗体を含む融合タンパク質及びその用途

Info

Publication number: JP7731596B2
Application number: JP2023534099A
Authority: JP
Inventors: チェ、ヒョジョン; クォン、ヒョンジン; アン、ソンミン; チャン、キホ
Original assignee: イムノフォージカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2021-07-29
Publication date: 2025-09-01
Anticipated expiration: 2041-07-29
Also published as: CN116670171A; WO2022119076A1; KR102828488B1; KR20220079415A; EP4257598A1; EP4257598A4; JP2023551970A; US20240018209A1

Description

特許法第３０条第２項適用２０２０年（令和２年）８月２８日ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓ４１４６７－０２０－１８２０８－ｙ及びｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１８２０８－ｙを通じて発表

本発明は、ＧＬＰ－１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト及び抗オスカー（Osteoclast-associated receptor, OSCAR）抗体を含む融合タンパク質、前記融合タンパク質を含む、関節炎の予防又は治療用薬学的組成物、食品組成物、機能性食品組成物、並びに前記薬学的組成物を投与するステップを含む、関節炎の予防又は治療方法に関する。

骨関節炎（osteoarthritis）は、通常、加齢により炎症性変化を伴うことなく軟骨が消失し、関節が変形して局所的に退行性変化が現れる疾患であり、このような特性から退行性関節炎ともいう。過去には、年を取って身体のあらゆる機能が低下するにつれて軟骨が摩耗することにより生じる自然現象であると思われていたが、最近は、このような機構的な要因と共に様々な生物学的な要因により、軟骨が変化して破壊されることが知られている。現在、骨関節炎の治療は、関節リウマチとは異なり、炎症性変化を伴うことなく軟骨の消失と関節の変形がもたらされるので、軟骨の変性が進行しないように原因的要因を最大限抑制することにより、関節の疼痛を緩和し、機能を回復させることを目標としている。

骨関節炎の治療において、患者の疼痛の軽減及び炎症の調節のために普遍的に処方される薬物は非ステロイド性消炎鎮痛剤（NSAIDs）である。骨関節炎の薬物治療としては、通常の鎮痛剤、非ステロイド性抗炎鎮痛剤、選択的ＣＯＸ－２阻害剤、麻薬性及び非麻薬性鎮痛剤、関節腔内ステロイド注射、ＤＭＯＡＲＤ（disease modifying osteoarthritis drug）などが挙げられる。長期間のＮＳＡＩＤ治療による副作用のうち、最も多く、時に緊急事態を引き起こす副作用は胃腸の副作用であるが、軽い消化不良から、潰瘍、出血、穿孔に至る様々な副作用が知られている（非特許文献１）。骨関節炎の治療に最も多く用いられる非ステロイド性抗炎鎮痛剤は心血管系の副作用が重篤であり、甚だしくは５～１０％に達する死亡率が示すように危険性が高く、特に骨関節炎患者のほとんどが高齢者であるので、ＮＳＡＩＤを用いた骨関節炎治療はリスクを伴う。よって、このような骨関連疾患治療剤の問題を解決するために、治療効果に優れ、かつ安全な治療剤の迅速な開発が求められている。

Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 24 (2010) 121-132

こうした背景の下、本発明者らは、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び抗オスカー抗体を含む融合タンパク質が関節炎治療効果に優れることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明は、ＧＬＰ－１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト及び抗オスカー（Osteoclast-associated receptor, OSCAR）抗体を含む融合タンパク質を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は改善用食品組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は改善用機能性食品組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、関節炎の予防又は治療方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記融合タンパク質の関節炎予防、改善又は治療用途を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記融合タンパク質を含む薬学的組成物の関節炎予防又は治療用途を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記融合タンパク質を含む食品組成物の関節炎予防又は改善用途を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記融合タンパク質を含む機能性食品組成物の関節炎予防又は改善用途を提供することを目的とする。

本発明のＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び抗オスカー抗体を含む融合タンパク質は、優れた軟骨保護及び疼痛緩和効果を有するので、関節炎の効果的な治療に広く活用することができる。

融合タンパク質であるＰＦ１８０３の構造を示す模式図である。ＰＦ１８０３タンパク質の確認のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔを行った結果を示す図である。ＰＦ１８０３タンパク質の構造確認のためにＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。細胞死が誘導された軟骨細胞におけるＰＦ１８０３の細胞死阻害効果を示す図である。細胞死が誘導された軟骨細胞においてＰＦ１８０３がｃａｓｐａｓｅ３及びｃａｓｐａｓｅ８の発現を減少させることを示す図である。細胞死が誘導された軟骨細胞においてＰＦ１８０３がＭＭＰ３発現レベルを低下させ、Ａｇｇｒｅｃａｎの発現レベルを上昇させることを示す図である。関節炎動物モデルにおけるＰＦ１８０３の軟骨保護効果を確認する組織学的分析を示す図である。関節炎動物モデルにおけるＰＦ１８０３の疼痛緩和効果を確認する体重負荷を示す図である。

以下、これらを具体的に説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本発明に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。

上記目的を達成するための本発明の一態様は、ＧＬＰ－１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト及び抗オスカー（Osteoclast-associated receptor, OSCAR）抗体を含む融合タンパク質を提供する。

本発明における「ＧＬＰ－１受容体アゴニスト」とは、グルカゴン遺伝子の転写産物から誘導された胃腸由来ホルモンの一種であるＧＬＰ－１（Glucagon-like peptide-1）の受容体に結合するタンパク質を意味し、血糖レベルを低下させる役割を果たす。前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体を選択的に刺激し、ＧＬＰ－１に類似するシグナル伝達経路を有するものであれば、特定物質に限定されるものではないが、具体例として、ＧＬＰ－１やその誘導体などが挙げられる。前記ＧＬＰ－１誘導体は、ＧＬＰ－１から一部のアミノ酸の置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法又はそれらの組み合わせにより作製することができる。このようなＧＬＰ－１誘導体は、当該技術分野において周知の物質であり、例えばリラグルチド（liraglutide）、エキセンジン－４（exendin-4）、リキシセナチド（lixisenatide）、デュラグルチド（Dulaglutide）、アルビグルチド（albiglutide）などが挙げられる。

本発明における「オスカー（Osteoclast-associated receptor, OSCAR）」とは、白血球（leukocyte）受容体複合体に属し、２つの免疫グロブリン（immunoglobulin; Ig）ドメインを有する細胞表面受容体を意味する。本発明の前記オスカータンパク質又はその断片は、ヒト又はマウス由来のものであってもよい。前記ヒト又はマウス由来オスカータンパク質のアミノ酸配列、それをコードする塩基配列などの遺伝的情報は、公知のデータベースから得られ、例えば米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information; NCBI）のＧｅｎＢａｎｋなどから得られるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「抗体」とは、タンパク質又はペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合するタンパク質性分子を意味するが、このような抗体は、各遺伝子を通常の方法により発現ベクターにクローニングし、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を得て、得られたタンパク質から通常の方法により作製することができる。前記抗体は、軽鎖（light chain）と重鎖（heavy chain）が２つずつ集まって構成され、それぞれの鎖はアミノ酸配列が可変である可変領域（variable domain）と、一定の配列を有する定常領域（constant domain）とからなる。前記抗体は、可変領域の３次元構造の末端に抗原結合部位が位置し、その部位は、軽鎖と重鎖にそれぞれ３つずつ存在する相補性決定領域（complementarity determining region）が集まって形成される。前記相補性決定領域は、可変領域の中でもアミノ酸配列の可変性が特に高い部分であり、その高い可変性により様々な抗原に対する特異的抗体が得られる。本発明には、完全な抗体の形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

本発明における「抗体断片」とは、抗体の任意の一部分を意味し、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｄＡｂ、ナノボディ（nanobody）など、及びそれらの組み合わせが抗体断片に該当し、前記抗体断片は、抗原認識部位を含むものであるが、これらに限定されるものではない。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、並びに重鎖の第１定常領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であり、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合して生成される。Ｆｖ（variable fragment）とは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体断片を意味する。ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合により重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合により連結されている。このような抗体断片は、プロテアーゼを用いることにより得てもよく、遺伝子組換え技術により作製してもよい。また、前記ｓｄＡｂ及びナノボディは、単一可変ドメイン抗体断片であり、例えば自然発生する単一可変ドメイン（ＶＨ）と、２つの不変ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）とを含む重鎖抗体のうち、その可変ドメインにおけるタンパク質加水分解又は遺伝子組換え技術により作製した抗体断片、及び抗体軽鎖又は重鎖可変ドメインを人工的に改変して作製した単一ドメイン抗体断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の抗オスカー抗体は、オスカータンパク質に作用する抗体であり、オスカーとコラーゲンの結合を阻害する抗体が含まれる。

本発明の一実施例においては、前記抗オスカー抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むものであって、１）配列番号１で表される重鎖可変領域、及び配列番号２で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその断片、２）配列番号３で表される重鎖可変領域、及び配列番号４で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその断片、並びに３）配列番号５で表される重鎖可変領域、及び配列番号６で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその断片からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。

本発明の融合タンパク質は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストと抗オスカー抗体が結合されるように人工的に合成したタンパク質であるが、これに限定されるものではない。

本発明の融合タンパク質は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び抗オスカー抗体が直接連結されるか、リンカーを介して連結されるか、又は他のタンパク質部分（moiety）をさらに含むが、これらに限定されるものではない。本発明の融合タンパク質の連結方法は、連結されるタンパク質の構造や活性を変更させないものであれば、当該技術分野で行われるいかなる方法を用いてもよい。前記リンカーは、１～２０個のアミノ酸からなるペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーであるが、これらに限定されるものではない。

本発明の融合タンパク質は、タンパク質（例えば、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び／又は抗オスカー抗体）の半減期を延長させる物質の結合や、体内での分解を防止するための変異の導入などの方法で製造することができ、タンパク質に作用して持続性を向上させるものであれば、当該技術分野で公知のいかなる方法を用いてもよい。半減期を延長させる物質は、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン及びエラスチンからなる群から選択されることを特徴とする。前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域であるが、特にこれに限定されるものではない。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、前記タンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本発明に用いられることは言うまでもない。

前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ～４つのドメインからなるものであってもよく、ヒンジ（hinge）部分を含むこともある。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの組み合わせ（combination）及びそれらのハイブリッド（hybrid）からなる群から選択されるものであるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体（mutant）も含まれる。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。

具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むものであり、単量体又は二量体であるが、これらに限定されるものではない。あるいは、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号８）の２９７番目のアミノ酸がアスパラギン（Asparagine）からアラニン（Alanine）に置換されたもの（配列番号９）であるが、これに限定されるものではない。一実施例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

具体的な態様として、本発明の融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなるものであり、ＰＦ１８０３と混用されるが、これに限定されるものではない。

本発明の融合タンパク質は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び抗オスカー抗体を含むことにより、ＧＬＰ－１受容体と抗オスカー抗体が同時に作用することを特徴とする。さらに、半減期延長物質を含むことにより、体内で長期間持続する薬効を示す。よって、本発明の融合タンパク質は、ＧＬＰ－１受容体と抗オスカー抗体の同時作用、及び延長された半減期に基づいて、ターゲット疾患、特に関節炎に対する優れた治療剤となる。

本発明の他の態様は、前記融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

前記融合タンパク質については前述した通りである。

本発明における「関節炎」とは、関節を保護している軟骨の損傷や退行性変化により関節を形成する骨や靭帯などに損傷が生じて炎症や疼痛が発生する疾患を意味し、骨関節炎（osteoarthritis）ともいう。本発明の関節炎には、退行性関節炎、剥離性骨軟骨炎、関節靭帯損傷、半月板損傷、関節の不整列、無血性壊死、関節リウマチ、小児特発性関節炎、外傷、炎症性関節炎又は感染による関節炎が含まれ、具体的には退行性関節炎又は関節リウマチであるが、これらに限定されるものではない。本発明の前記薬学的組成物は、軟骨破壊の遅延又は疼痛の軽減という効果を発揮し、関節炎の予防又は治療効果を有するものであるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「予防」とは、本発明の組成物の投与により関節炎を防止又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、本発明の組成物の投与により関節炎の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。このような薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤は、非自然発生のものであってもよい。具体的には、前記組成物は、それぞれ通常の方法で散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エアゾール剤などの経口剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いられる。本発明において、前記薬学的組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口用固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、これらの固形製剤は、前記抽出物とその分画物に少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム（calcium carbonate）、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられる。経口用液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられる。非経口用製剤としては、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラテンなどが用いられる。

本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は改善用食品組成物を提供する。

本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は改善用機能性食品組成物を提供する。

前記融合タンパク質、関節炎及び予防については前述した通りである。

本発明における「改善」とは、前記組成物を用いて疾患の発症個体及びその疑いのある個体の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

本発明における「食品」は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類をはじめとする乳製品、各種スープ、清涼飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、機能性食品などの通常の意味の食品であればいかなるものでもよく、本発明の融合タンパク質を含むものであればいかなるものでもよい。前記食品組成物の製造時には、当該技術分野において通常添加する原料及び成分を添加して製造することができ、その種類は特に限定されるものではない。例えば、通常の食品と同様に様々な生薬抽出物、食品学的に許容される食品補助添加剤、天然炭水化物などを追加成分として含んでもよいが、これらに限定されるものではない。有効成分の混合量は、使用目的に応じて適宜決定される。

本発明における「機能性食品」とは、特定保健用食品（food for special health use, FoSHU）と同義であり、健康補助を目的として特定成分を原料とするか、食品原料に入っている特定成分を抽出、濃縮、精製、混合などの方法で製造、加工した食品であって、前記成分により生体防御、生体リズムの調節、疾病の防止及び回復などの生体調節機能が生体において十分に発揮されるように設計、加工された食品を意味する。前記機能性食品組成物は、疾病の予防、疾病の回復などに関する機能を有する。本発明の機能性食品は、健康機能食品などの当該技術分野で公知の用語と混用される。

本発明のさらに他の態様は、前記薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、関節炎の予防又は治療方法を提供する。

本発明における「個体」は、関節炎を発症したか、発症するリスクのある、マウス、家畜、ヒトなどが含まれる哺乳動物、養殖魚類などであればいかなるものでもよい。

本発明の薬学的組成物は、当該技術分野で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、関節、局所、舌下、膣内もしくは直腸経路が含まれる非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の薬学的組成物の好適な投与量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間などに応じて異なる量であることが好ましい。

本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質の関節炎予防、改善又は治療用途を提供する。

本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質を含む薬学的組成物の関節炎予防又は治療用途を提供する。

本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質を含む食品組成物の関節炎予防又は改善用途を提供する。

本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質を含む機能性食品組成物の関節炎予防又は改善用途を提供する。

前記融合タンパク質、薬学的組成物、食品組成物、機能性食品組成物、関節炎、予防、改善、治療などについては前述した通りである。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

融合タンパク質の製造及び検証
ＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び抗オスカー抗体を含む融合タンパク質（ＰＦ１８０３；配列番号７）は、ＧＬＰ－１－Ｆｃ－ＶＨ－ＶＬとなるように合成した（図１）。合成した前記ＰＦ１８０３は、Ｎｈｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩサイトを用いてｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。クローニングしたベクターをＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクションし、３日目に上清を回収し、遠心分離と０．２２μｍフィルターを用いて細胞と浮遊物を除去し、その後ｐｒｏｔｅｉｎＡｂｅａｄ（Cytiva, Hitrap Preotain A）により精製した。

非還元及び還元条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥｇｅｌとＡｎｔｉ－ＧＬＰ１Ａｂ（Abcam）を用いたｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔによりＰＦ１８０３が製造されることが確認された（図２）。

ＨｕｍａｎＯＳＣＡＲタンパク質をコーティングバッファーにより１ｗｅｌｌ当たり３００ｎｇずつｉｍｍｕｎｏ－９６ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｐｌａｔｅに分注し、４℃で一晩表面固定した。５％ｓｋｉｍｍｉｌｋを含むＰＢＳＴを１ｗｅｌｌ当たり２０μｌずつ入れ、その後３７℃で１時間反応させて非特異的結合を阻害した。その後、ＰＦ１８０３を最高濃度１０００ｎＭから０．０１７ｎＭまで３倍希釈して各ｗｅｌｌに１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、その後ｍｏｕｓｅａｎｔｉ－ＧＬＰ１ａｎｔｉｂｏｄｙ（abcam）を１：２０００に希釈して各ｗｅｌｌに１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴでさらに３回洗浄し、その後１：３０００に希釈したａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ－ＨＲＰ（Millipore）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ入れ、３７℃で１時間反応させ、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＴＭＢ（ＢＤ）溶液を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ入れ、５分間常温で反応させ、次いで１００μｌの１ＮＨＣｌで反応を停止した。最終的に、分光光度計（Spectrmax iD3, Molecular devices）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果、７．４９４ｎＭのＥＣ_５０値が確認されたので（図３）、生産されたＰＦ１８０３タンパク質がＯＳＣＡＲとＧＬＰ－１抗体の両方に結合していることが確認された。

ＭＩＡ誘導関節炎モデル
本発明に用いられる関節炎動物モデルは、ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ（ＭＩＡ）を関節腔内に注入して骨関節炎を誘導したモデルであり、ＭＩＡは、ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）の活性化を引き起こし、軟骨におけるｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ合成を阻害し、軟骨細胞の壊死をもたらすので、患者の退行性関節炎の症状に類似した動物モデルである。

具体的には、Ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ（MIA, I2512, Sigma, Poole, UK）を注射用ｓａｌｉｎｅに２０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、実験開始当日（day 0）に調製した。群分離し、実験開始日に動物を麻酔チャンバーに入れ、ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅを用いて吸入麻酔し、その後２６．５ｇａｕｇｅ１ｃｃ注射器により右膝関節内にｉｎｆｒａｐａｔｅｌｌａｒｌｉｇａｍｅｎｔを介してＭＩＡ５０μＬ（ＭＩＡ１，３ｍｇ／ｂｏｄｙ）を注射した。実験群及び投与物質を表１に示す。

ＭＩＡで骨関節炎を誘導し、その後試験物質投与群（Ｇ３～Ｇ６群）は、試験物質を所定の用量でｖｅｈｉｃｌｅに均質化し、次いで１ｍｌの投与ボリュームで膝関節投与を７日に１回行った。正常対照群及び賦形剤対照群は、同量のｖｅｈｉｃｌｅのみの膝関節投与を試験物質投与と同じ日程で７日に１回行い、陽性対照群は、Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂを所定の用量でｖｅｈｉｃｌｅに均質化し、その後１日に１回経口投与した。

軟骨細胞（chondrocyte）の細胞死阻害効果
実施例３－１．軟骨細胞死の阻害
軟骨細胞死を誘導するために、マウスの軟骨から軟骨細胞を分離して用いた。マウス軟骨細胞をＩＬ－１β １０ｎｇ／ｍｌで処理し、抗ＯＳＣＡＲ抗体に対する効果を評価するために、ＯＳＣＡＲを発現するｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌからのシグナルを誘導するＯＳＣ（Oscar-binding triple-helical peptide）（配列番号１０）で処理した。

ＩＬ－１β及びＯＳＣ処理後に、ＧＬＰ１－Ｆｃ（ＧＬＰ－１と抗体のＦｃ領域を融合した融合タンパク質）、抗ＯＳＣＡＲ抗体又はＰＦ１８０３で処理した各軟骨細胞の生存率（cell viability）を測定した。

その結果、ａｎｔｉ－ＯＳＣＡＲ抗体投与群及びＧＬＰ－１投与群に比べて、ＰＦ１８０３ＰＦ１８０３で処理した軟骨細胞の死滅が濃度依存的に著しく阻害されることが確認された（図４）。

実施例３－２．細胞死伝達経路（ｃａｓｐａｓｅ３及びｃａｓｐａｓｅ８の活性低下）
実施例３－１でＩＬ－１β及びＯＳＣ処理後にＧＬＰ１－Ｆｃ、抗ＯＳＣＡＲ抗体又はＰＦ１８０３で処理した各軟骨細胞のｃａｓｐａｓｅ３及びｃａｓｐａｓｅ８の活性を測定した。ｃａｓｐａｓｅ３及びｃａｓｐａｓｅ８は細胞死を示すタンパク質であるので、それらのレベルを測定して比較した。

ｃａｓｐａｓｅ３及びｃａｓｐａｓｅ８のｃｌｅａｖａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙを測定する方法として、ｃａｓｐａｓｅ３又はｃａｓｐａｓｅ８のｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙｋｉｔを用いた（caspase 3 kit (Biovision K106), caspase 8 kit (Biovision K113))。

その結果、ａｎｔｉ－ＯＳＣＡＲ抗体投与群及びＧＬＰ－１投与群に比べて、ＰＦ１８０３で処理した軟骨細胞において、ｃａｓｐａｓｅ３及びｃａｓｐａｓｅ８の活性が大幅に低下することが確認された（図５）。これは、ＰＦ１８０３が軟骨破壊遅延及び再生効果に優れることを示唆するものである。

実施例３－３．細胞死伝達経路（ＭＭＰ３の発現減少及びＡｇｇｒｅｃａｎの発現増加）
実施例３－１でＩＬ－１β及びＯＳＣ処理後にＧＬＰ１－Ｆｃ、抗ＯＳＣＡＲ抗体又はＰＦ１８０３で処理した各軟骨細胞のＭＭＰ３及びＡｇｇｒｅｃａｎの発現レベルをウェスタンブロットにより測定した。

具体的には、ＭＭＰ３（matrix metalloproteinase-3）はｃａｔａｂｏｌｉｃｍａｒｋｅｒであり、ＭＭＰ３の増加は軟骨細胞破壊の指標となり、Ａｇｇｒｅｃａｎはａｎａｂｏｌｉｃｍａｒｋｅｒであり、Ａｇｇｒｅｃａｎの増加は軟骨細胞再生の指標となるので、ＭＭＰ３及びＡｇｇｒｅｃａｎの発現レベルを測定した。

その結果、ａｎｔｉ－ＯＳＣＡＲ抗体投与群及びＧＬＰ－１投与群に比べて、ＰＦ１８０３で処理した軟骨細胞において、ＭＭＰ３の発現レベルは大幅に低下し、Ａｇｇｒｅｃａｎの発現レベルは大幅に増加した（図６）。これは、ＰＦ１８０３が軟骨破壊遅延及び再生効果に優れることを示唆するものである。

ＰＦ１８０３の軟骨破壊遅延効果
各群の動物モデルの関節を採取してｐａｒａｆｆｉｎｂｌｏｃｋを作製した。軟骨組織の破壊と炎症細胞の増殖の程度を観察するために、Ｈ＆ＥとＳａｆｒａｎｉｎＯを全数に対して行い、ＳａｆｒａｎｉｎＯｓｔａｉｎの結果に応じてＯＡＲＳＩ及びＭａｎｋｉｎｓｃｏｒｅをつけ、対照群との差を統計的に分析した。

その結果、陽性対照群を投与した動物の軟骨は完全に破壊された。ａｎｔｉ－ＯＳＣＡＲ抗体及びＧＬＰ－１併用投与群に比べて、ＰＦ１８０３を投与した動物において、軟骨破壊遅延効果に優れることが確認された（図７）。

ＰＦ１８０３の疼痛緩和効果
体重負荷（weight bearing）測定試験は、一方の脚に関節炎を誘導した後脚膝の疼痛により発生する、正常後脚（左）と関節炎誘導後脚（右）の体重負荷（又は体重分布）の変化を測定する実験である。体重負荷を測定する装置であるｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅｍｅｔｅｒ（Model 600, IITC, USA）を用いて両側の後脚の荷重をそれぞれ測定した。動物の脚を着く姿勢により荷重が変化するので、動物がホルダー内に正確に位置して両脚を対称に着くようにし、固定担当者は１人にして可能な限り誤差を少なくした。各動物がホルダー内に正確に位置するときに機械を作動させ、５秒の測定時間で計２回ずつ測定し、その平均値を各脚のｗｅｉｇｈｔｂｅａｒｉｎｇ（ｇ）数値とした。測定時期に関しては、賦形剤対照群、実験群及び陽性対照群において、ＭＩＡ投与による関節炎誘導前（day 0）に測定してｂａｓｅｌｉｎｅ値を求め、その後試験物質投与前（day 3）に測定して群分離し、次いで週２回所定時間に測定した。体重負荷測定試験の結果は、次の計算式によりｗｅｉｇｈｔｂｅａｒｉｎｇｒａｔｉｏに変換して分析した。

その結果、陽性対照群、又はａｎｔｉ－ＯＳＣＡＲ抗体及びＧＬＰ－１併用投与群に比べて、ＰＦ１８０３投与群は疼痛軽減効果に優れることが確認された（図８）。

すなわち、本発明のＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び抗オスカー抗体を含む融合タンパク質は、関節炎の予防又は治療用途に有用であることが示唆された。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims

ＧＬＰ－１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト及び抗オスカー（Osteoclast-associated receptor, OSCAR）抗体を含む融合タンパク質であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む前記抗オスカー抗体が：
１）配列番号１で表される重鎖可変領域、及び配列番号２で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその抗原結合断片、
２）配列番号３で表される重鎖可変領域、及び配列番号４で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその抗原結合断片、並びに
３）配列番号５で表される重鎖可変領域、及び配列番号６で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその抗原結合断片
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、融合タンパク質。
前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１又はその誘導体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記融合タンパク質は、半減期延長物質をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記半減期延長物質は免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項３に記載の融合タンパク質。
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、２９７番目のアミノ酸がアスパラギンからアラニンに置換されたものである、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記融合タンパク質は、配列番号７で表されるものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
請求項１～６のいずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は治療用薬学的組成物。
前記関節炎は、退行性関節炎又は関節リウマチである、請求項７に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、軟骨破壊を遅延させるか、又は疼痛を軽減することを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
請求項１～６のいずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は改善用食品組成物。
請求項１～６のいずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含む、関節炎の予防又は改善用機能性食品組成物。
請求項７に記載の薬学的組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、関節炎の予防又は治療方法。
１）配列番号１で表される重鎖可変領域、及び配列番号２で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその抗原結合断片、
２）配列番号３で表される重鎖可変領域、及び配列番号４で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその抗原結合断片、並びに
３）配列番号５で表される重鎖可変領域、及び配列番号６で表される軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体又はその抗原結合断片
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗オスカー抗体。
請求項１３に記載の抗オスカー抗体を有効成分として含む、関節炎の予防又は治療用薬学的組成物。