JP7744004B2 - Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、糖鎖構造のうちフコースがＮ－アセチルグルコサミンにα１，３結合したＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物及び方法に関し、特にレクチンを用いたＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物及び方法に関する。

細胞表面や体液中に存在する糖タンパク質や糖脂質等の複合糖質の糖鎖は、一種の情報素子として機能し、発生、免疫、がん、感染等の重要な生命現象に深く関わっている。一方、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンは、海藻類又は藻類（淡水産藍藻）等から多くの種類が単離されており、糖鎖認識分子として機能し、糖鎖と同様に生物学的に重要な役割を担っている。レクチンは、その種類によって認識する糖鎖が異なることが知られており、例えば特許文献１には、Ｎ－結合型糖鎖（アスパラギン結合型糖鎖）の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにα１，６結合したフコース（α１，６フコース）と強く相互作用するレクチンとして、紅藻カギイバラノリ（Hypnea japonica）から単離されたＨｙｐｎｉｎ Ａが開示されている。また、特許文献１には、このＨｙｐｎｉｎ Ａを用いたα１，６フコース糖鎖の検出方法も開示されている。

また、レクチンの一部は、種々のウイルスやがん細胞の表面の糖鎖を認識して結合することが知られており、このため、レクチンをウイルス等の検出のために応用することも考えられている（特許文献２及び３等を参照。）。

特許第５１０９００１号公報 特開２０２０－１１７４４５号公報 特開２０２１－０１３３７５号公報

しかしながら、現在のところ種々のウイルスやがん細胞等の表面に存在する糖鎖に特異的に結合し、それらを特異的に検出できる物質はまだ十分に知られているとは言いがたく、その数は限られているため、上記物質が十分に供給できる状況にはなっていない。従って、特定の糖鎖を特異的に認識する物質がさらに多く見出され、その特性が明らかにされることが必要である。

本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、レクチンを用いて特定の糖鎖構造を特異的に検出できるようにすることにある。

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、緑藻ヒラミル（Codium latum）から単離されたＣＬＡレクチンが、糖鎖構造のうちフコースがＮ－アセチルグルコサミンにα１，３結合したＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を特異的に認識することを見出して、本発明を完成した。

具体的に、本発明に係る組成物は、ＣＬＡレクチンを含むことを特徴とするＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物である。上述の通り、ＣＬＡレクチンはＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を特異的に認識できるため、ＣＬＡレクチンを含む本発明に係る組成物は、所定の試料中の糖鎖におけるＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するのに有用である。従って、例えば細胞表面にＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖を発現するがん細胞やウイルスを検出するのに応用できる。

本発明に係る組成物において、ＣＬＡレクチンには、標識分子が結合されていてもよい。この場合、例えばＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンを定量又は検出するために、標識分子を認識して結合する結合分子を利用することが可能となり、その定量及び検出を簡便に行うことができる。

本発明に係る試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出する方法は、試料に対してＣＬＡレクチンを接触させるステップと、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンを定量するステップと、前記Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンの量が所定の閾値以上である場合に、試料中にＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造が存在すると判定するステップとを含むことを特徴とする。上述の通り、ＣＬＡレクチンはＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を特異的に認識できるため、上記本発明に係る方法によると、試料に対してＣＬＡレクチンを接触させて、試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に対するＣＬＡレクチンの結合量や結合の有無を評価して、試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出することができる。

本発明に係る試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出する方法においても、上述の通り、ＣＬＡレクチンには、標識分子が結合されていてもよい。

本発明に係る方法において、前記定量するステップは、前記ＣＬＡレクチン又は前記標識分子に結合する結合分子と、前記Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンとを接触するステップを含むことができる。また、本発明に係る方法において、前記定量するステップは、前記結合分子を定量することによりＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンを定量するステップを含むことができる。

Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物及び方法によると、糖鎖構造のうちＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を特異的に検出することができて、極めて有用である。

糖鎖構造としてのルイスＸ構造及びシアリルルイスＸ構造を示す図である。 実施例におけるＣＬＡの遠心限外ろ過－ＨＰＬＣ法による糖鎖結合特異性解析の結果を示す図である。 実施例におけるＣＬＡの遠心限外ろ過－ＨＰＬＣ法による糖鎖結合特異性解析の結果を示す図である。 実施例におけるグリカンアレイで用いたＮ－結合型糖鎖を示す図である。 実施例におけるグリカンアレイで用いたＮ－結合型糖鎖を示す図である。 実施例におけるグリカンアレイで用いたＮ－結合型糖鎖を示す図である。 実施例におけるグリカンアレイで用いたＯ－結合型糖鎖を示す図である。 実施例におけるグリカンアレイで用いたＯ－結合型糖鎖を示す図である。 実施例におけるグリカンアレイで用いたスフィンゴ糖脂質糖鎖を示す図である。 実施例におけるＮ－結合型糖鎖を対象としたグリカンアレイの結果を示すグラフである。 実施例におけるＯ－結合型糖鎖を対象としたグリカンアレイの結果を示すグラフである。 実施例におけるスフィンゴ糖脂質糖鎖を対象としたグリカンアレイの結果を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

本発明の一実施形態は、ＣＬＡレクチン（以下、ＣＬＡと呼ぶ。）を含むＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物である。後の実施例にて詳説するが、今般、ＣＬＡがＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に特異的に結合できることが本発明者らによって見出された。ＣＬＡは、緑藻ヒラミル（Codium latum）に由来する糖鎖結合タンパク質の一種であり、配列番号１のアミノ酸配列を有する約１６ｋＤａのタンパク質である。特に、ＣＬＡは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましく、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。最も好ましくは、ＣＬＡは配列番号１のアミノ酸配列からなる。

本実施形態におけるＣＬＡは、上記の通り緑藻ヒラミル（Codium latum）に由来するが、天然の精製産物の他に、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物としての組換え型ＣＬＡも含む。

本実施形態において、「糖鎖」とは、直鎖又は分岐したオリゴ糖又は多糖を意味する。また上記糖鎖は、タンパク質との結合様式によって、アスパラギンと結合するＮ－グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｎ型糖鎖」、「Ｎ－グリカン」という）及びセリン、スレオニンなどと結合するＯ－グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｏ型糖鎖」、「Ｏ－グリカン」という）等に大別され、Ｎ型糖鎖には高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖及び混成型糖鎖がある。

なお、オリゴ糖とは、単糖又は単糖の置換誘導体が２～１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。多糖は、構成糖の種類によって異なるが、ウロン酸やエステル硫酸を多く含む糖質を酸性多糖、中性糖のみのものを中性多糖という。多糖のうち、ムコ多糖とよばれる一群の多糖は、ほとんどがタンパク質と結合しており、プロテオグリカンという。単糖とは、糖鎖の構成単位となるもので、加水分解によってそれ以上簡単な分子にならない基本的物質である。

さらに、単糖は、カルボキシル基などの酸性側鎖を有する酸性糖、ヒドロキシル基がアミノ基で置換されたアミノ糖、それ以外の中性糖の３つに大別される。生体内に存在する単糖としては、酸性糖はＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）やＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）等のシアル酸や、ウロン酸等があり、アミノ糖としてはＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）やＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等があり、中性糖としてはグルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、フコース（Ｆｕｃ）等が挙げられる。

Ｎ型糖鎖は全て、「トリマンノシルコア」と呼ばれる〔Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ〕からなる共通母核構造を持っている。高マンノース型糖鎖は、トリマンノシルコアに加え、分岐構造部分にα－マンノース残基のみを含む。この糖鎖には〔Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ〕という七糖が共通の母核として含まれている。また混成型糖鎖は、複合型と高マンノース型の両方の特徴を併せ持っていることからそう呼ばれている。１つ又は２つのα－マンノシル基が、高マンノース型の場合と同様に、トリマンノシルコアのＭａｎα１－６腕と結合し、複合型糖鎖の側鎖と同じものがコアのＭａｎα１－３腕に結合している。

トリマンノシルコアの還元末端に位置するＧｌｃＮＡｃのＣ－６位へのフコースの結合の有無、またβ－マンノシル残基のＣ－４位へのβ－ＧｌｃＮＡｃの結合（バイセクテイングＧｌｃＮＡｃと呼ばれる）の有無は、複合型や混成型糖鎖の構造の多様性に寄与している。３つのＮ型糖鎖の間で、複合型が最も多様な構造を含んでいる。

この多様性は、主に２つの要素で作り出され、トリマンノシルコアに１個から５個の側鎖がそれぞれ異なる結合位置で結合しており、一、二、三、四、又は五本側鎖糖鎖を形成している。三本側鎖の複合型糖鎖には、〔ＧｌｃＮＡｃβ１－４（ＧｌｃＮＡｃβ１－２）Ｍａｎα１－３〕あるいは〔ＧｌｃＮＡｃβ１－６（ＧｌｃＮＡｃβ１－２）Ｍａｎα１－６〕のどちらかを含む２つの異性体が見つかっている。

本実施形態に係るＣＬＡが特異的に結合するＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造は、糖鎖構造のうち特にＦｕｃがＧｌｃＮＡｃにα１，３結合したものであり、このような構造をもつ代表的な構造として、図１に示すルイスＸやシアリルルイスＸが知られている。図１に示すように、ルイスＸは、Ｆｕｃとα１，３結合したＧｌｃＮＡｃにＧａｌがβ１－４結合した構造であり、シアリルルイスＸは、当該ＧａｌにＮｅｕＡｃがα１－３結合した構造である。なお、図１において四角で囲った部分がＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造である。ルイスＸ及びシアリルルイスＸは、種々のがん細胞の表面に発現していることが知られており、具体的に、ルイスＸは大腸がん及び血液がん等のがん細胞表面に発現し、シアリルルイスＸは肺がん、乳がん及び膵臓がん等のがん細胞表面に発現している。従って、本実施形態に係るＣＬＡを含む組成物は、上記のようながん細胞に特異的に結合できて、それらのがん細胞を検出するのに応用できる可能性がある。

ＣＬＡが糖鎖と結合するか否かは、例えば標的となる糖鎖、又は糖鎖が結合した糖タンパク質等を固定化したカラムに、試験対象であるＣＬＡを通し、当該カラムにＣＬＡが結合したか否かをその通過液に含まれるＣＬＡの量、又は特異的溶出剤でカラムから溶出したＣＬＡの量により評価することができる。また標的となる糖鎖が結合した糖タンパク質をメンブレン等に固定化し、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ等で標識したＣＬＡを用いて検出するウエスタンブロット法（法医学の実際と研究、37, 155, 1994 参照）、ドットブロット法（Analytical Biochemistry, 204(1), 198, 1992 参照）を用いて評価することができる。

また標的となる糖鎖、又は糖鎖が結合した糖タンパク質等を固定化したチップと、試験対象であるＣＬＡとの親和性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて測定すればよい。上記方法によれば、その親和性の有無のみならず、その強度まで測定できるために好ましい方法であるといえる。このとき得られる結合定数（親和定数）（Ｋ_Ａ）が、１０（Ｍ^－１）以上、より好ましくは１０^３（Ｍ^－１）以上、最も好ましくは１０^４（Ｍ^－１）以上であればＣＬＡと糖鎖とが結合していると判断できる。

本実施形態におけるＣＬＡには、標識分子が結合されていてもよい。標識分子は、ＣＬＡの検出を容易にするためにＣＬＡを標識できるものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等が挙げられる。このような標的分子がＣＬＡに結合されていることにより、ＣＬＡの存否を簡便に評価することができて有利である。

本実施形態に係る組成物は、ＣＬＡと溶媒とを含み、その他に溶媒中において例えばＣＬＡの安定性を向上させるための添加剤等を含んでいてもよい。

本発明に係る他の実施形態は、試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出する方法である。当該方法は、試料に対してＣＬＡを接触させるステップと、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡを定量するステップと、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡの量が所定の閾値以上である場合に、試料中にＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造が存在すると判定するステップとを含むものである。

本実施形態において、試料は、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖の存否を評価される対象であり、例えば人工的に調製された所定の糖鎖を含む溶液や、体液、細胞及び組織等の生体試料であってもよい。

本実施形態において、試料に対してＣＬＡを接触させるステップは、例えば試料としての上記溶液や体液にＣＬＡを含む溶液を添加及び混合することで行われる。組織を試料とする場合、その一部を生体外に取り出したものを試料として用いてもよく、また、生体内において組織に対してＣＬＡを処理して、内視鏡等を利用して生体内でＣＬＡに結合されたＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造の検出を行ってもよい。

本実施形態において、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡを定量するステップは、例えば下記実施例で用いた遠心限外ろ過－ＨＰＬＣ法を用いることができ、また、ＣＬＡ又はそれに結合する標識分子に特異的に結合する抗体や結合分子を用いた本技術分野で用いられる常法を利用することができる。例えば、これに限られないが、ＣＬＡに標識分子としてタグペプチドが結合されている場合、当該タグペプチドを標的とする抗体を用いてＣＬＡを検出し、当該抗体を蛍光分子等で標識することで、蛍光強度によってＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡ量を定量できる。このような方法によっても、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出及び定量することができる。

本実施形態において、試料中にＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造が存在すると判定するステップでは予め閾値（基準値）を設定する。このような基準値は、以下のものに限られないが、例えばＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を含まない試料を参照として、上記ＣＬＡを定量するステップと同様のステップで当該参照から得られるＣＬＡの定量値を基準値とすることができる。この場合、判定対象の試料から得られたＣＬＡの定量値が基準値よりも大きい場合に試料中にＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造が存在すると判定することができる。

以上のように、本実施形態に係る方法によると、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に特異的に結合できるＣＬＡを利用して試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖を簡便に検出することができる。このため、当該方法は、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖を細胞表面に発現するがん細胞を検出するのに応用できる可能性がある。

以下に、本発明に係るＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物及び方法について詳細に説明するための実施例を示す。

［実施例１：Ｈｉｓタグ融合組換え型ＣＬＡの調製］
（Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡ発現用大腸菌株の作製）
ＣＬＡ ｃＤＮＡがコードする翻訳領域の配列情報（配列番号２を参照）をもとにＣＬＡコード合成ＤＮＡを設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に依頼して作製した。制限酵素認識部位を５’末端に付加したプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＮｈｅＩ付加、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＸｈｏＩ付加）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲによりＣＬＡコードＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、同じく両制限酵素で処理したベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社）にサブクローニングし、ＣＬＡ発現用プラスミドｐＥＴ２８ａ－ｒＣＬＡを得た。さらにこのｐＥＴ２８ａ－ｒＣＬＡを用いて発現用大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を形質転換し、Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡ発現株ｐＥＴ２８ａ－ｒＣＬＡ／ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓを得た。

（Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡの発現）
上記のようにして得られたＨｉｓタグ融合組換えＣＬＡ（Ｈｉｓ－ｒＣＬＡ）発現用大腸菌株（ｐＥＴ２８ａ－ＣＬＡ／ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を３ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。その後、培養液を２５０ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に加え、３７℃で対数増殖期中期になるまで振盪培養した。ＯＤ６００が０．５に達したところで、終濃度が０．５ｍＭとなるようにイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで発現誘導を開始し、２０℃で１６時間振盪培養した。これを遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により集菌し、培養液に対し１／２０容の超音波破砕用緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）を添加及び懸濁した後、氷上で冷却しながら超音波破砕を行った。超音波破砕時の条件は「超音波破砕１分－休止１分」のセットを７回行った。破砕処理後、遠心分離（１００００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上清を可溶性画分とした。

（Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡの精製）
ニッケルキレートカラム（Ｖｔ＝１ｍＬ、Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ、ＧＥヘルスケア）を同緩衝液１０ｍＬで平衡化後、可溶性画分をカラムに添加し、Ｈｉｓタグ融合組換えレクチンを吸着させた。カラムに非特異的に吸着した夾雑成分を洗浄するため、イミダゾールを１５０ｍＭ含有する緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ）を用いてカラムを洗浄した。その後、溶出用緩衝液（２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）を３ｍＬ、２ｍＬの順に添加して回収して、精製Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡを得た。以下の試験では、ＣＬＡとして当該精製Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡを用いて行った。

［実施例２：ＣＬＡの糖鎖結合特異性］
（遠心限外ろ過－ＨＰＬＣ法による糖鎖結合特異性解析）
ＣＬＡの糖鎖結合特異性について遠心限外ろ過－ＨＰＬＣ法によって測定した。遠心限外ろ過－ＨＰＬＣ法は、レクチンや糖鎖の固定化を必要とせず、簡便にレクチンと糖鎖間の相互作用を分析可能な手法である。この手法では、レクチンをバッファー中で蛍光標識糖鎖と混合し、遠心限外ろ過によって回収された非結合糖鎖をＨＰＬＣによって分離及び定量する。結合活性は、結合糖鎖量と添加糖鎖量の比率で表し、結合糖鎖量は添加糖鎖量から非結合糖鎖量を差し引くことで求められる。レクチンの糖鎖結合特異性は、複数の糖鎖の結合活性を比較することで決定する。以下に具体的な方法及び結果について説明する。

まず、９０μＬの５μＭ Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡと１０μＬの３００ｎＭピリジルアミノ化（ＰＡ）－オリゴ糖（タカラバイオ製）とを５０ｍＭトリス－塩酸（ｐＨ７．０）に混合し、室温で１時間インキュベートした。続いて、その混合液に対して、遠心限外ろ過器（分画分子量１０ｋＤａ、ＰＡＬＬ， ＮＹ， ＵＳＡ）を用いて室温で１００００×ｇの遠心分離を３０秒間行った。２０μＬのろ液を、１５％メタノール含有０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－８０ＴＭカラム（４．６×１５０ｍｍ）（東ソー製）に注入し、同一の溶液を用いて溶出した。このＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ））は流速１ｍＬ／ｍｉｎ、４０℃で行った。溶出液は、励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍでモニターし、糖鎖のピークをＥｍｐｏｗｅｒ３（Ｗａｔｅｒｓ）で解析、定量した。一方、Ｈｉｓタグ融合組換えＣＬＡを含まない９０μＬの５０ｍＭトリス－塩酸（ｐＨ７．０）を上記ＰＡ－オリゴ糖と混合し、上記遠心限外ろ過を行い、ろ液をブランクとして用いた。ＣＬＡと結合したＰＡ－オリゴ糖の量［Ｏ_{ｂｏｕｎｄ}］は、加えられたＰＡ－オリゴ糖の量［Ｏ_{ａｄｄｅｄ}］から未結合のＰＡ－オリゴ糖の量［Ｏ_{ｕｎｂｏｕｎｄ}］を引くことにより得た。［Ｏ_{ａｄｄｅｄ}］に対する［Ｏ_{ｂｏｕｎｄ}］の比率を結合活性（％）として定義した。用いた３２種のＰＡ－オリゴ糖及び結合活性を図２及び図３に示す。

図２及び図３に示すように、高い結合活性を示した糖鎖は、Ｎｏ．１０（８９．２％）、Ｎｏ．７（７７．７％）及びＮｏ．２２（４５．１％）であった。これらの糖鎖は共通してＧａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃの構造を持ち、この構造を持つ糖鎖としてルイスＸ抗原及びシアリルルイスＸ抗原がある。また、Ｎｏ．２０、２８、３０、３１及び３２が持つＦｕｃα１－２ＧａｌやＮｏ．２１、２８及び３０が持つＦｕｃα１－４ＧｌｃＮＡｃ、並びに高マンノース型糖鎖のＮｏ．１４が持つＦｕｃα１－６ＧｌｃＮＡｃには結合を示さず、複合型糖鎖のＮｏ．４、６及び９が持つＦｕｃα１－６ＧｌｃＮＡｃに対しては、約１０％前後の極めて弱い結合活性を示した。このことから、ＣＬＡはフコースを含む糖鎖の中でも特にＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃに対して強く結合することが示された。さらに、糖鎖のアンテナ数（非還元末端分岐数）が多いほど、糖鎖に強く結合する傾向がみられた。

（グリカンアレイによる糖鎖結合特異性解析）
さらに、種々の糖鎖に対するＣＬＡの結合特異性について評価するために、グリカンアレイを行った。グリカンアレイは、糖鎖と生体分子間の相互作用を調べるためのツールであり、一度の試験で複数の糖鎖間との相互作用を分析することができる。原理としては、まず、複数種の糖鎖がスポットされたガラススライドに生体分子を添加し、生体分子と糖鎖を反応させる。その後、蛍光標識された二次抗体を生体分子に結合させ、蛍光標識のシグナルを定量し、糖鎖と生体分子間の結合性の評価を行う。本実施例では、ＣＬＡを対象に１００種のＮ－結合型糖鎖、９４種のＯ－結合型糖鎖及び５８種のスフィンゴ糖脂質糖鎖との結合活性をグリカンアレイで網羅的に解析した。具体的には図４～図６に示す１００種のＮ－結合型糖鎖を搭載する、Ｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の糖鎖固定化マイクロアレイスライドＮ－Ｇｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ（８－ｓｕｂａｒｒａｙ ｓｌｉｄｅ）、図７及び図８に示す９４種のＯ－結合型糖鎖を搭載するＺ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の糖鎖固定化マイクロアレイスライドＯ－Ｇｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ及び図９に示す５８種のスフィンゴ糖脂質糖鎖を搭載するＺ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の糖鎖固定化マイクロアレイスライドＧｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ－Ｇｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙをそれぞれ用いた。以下にその方法及び結果を説明する。

まず、上記スライドを付属のカセットに取り付け、各ウェルに２００μｌの１％ＢＳＡ含有Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し、付属の粘着フィルムでウェルを覆うことでバッファーの蒸発を防ぎ、振とう培養器で８５ｒｐｍで６０分間インキュベートした。インキュベート後、同緩衝液を取り除き、各ウェルに５μｇ／ｍＬのＣＬＡを含む１％ＢＳＡ含有Ｇｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を２００μｌ添加し、粘着フィルムでウェルを覆い、１００ｒｐｍで６０分間インキュベートした。インキュベート後、ＣＬＡ溶液を取り除き、各ウェルに洗浄バッファー（５０ｍＭのトリス－塩酸、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６）を２００μｌ添加し、粘着フィルムでウェルを覆い、８５ｒｐｍで５分間インキュベートした。インキュベート後、洗浄バッファーを取り除き、各ウェルに１μｇ／ｍｌ抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５５５標識抗Ｈｉｓ－ｔａｇマウス抗体）を含む１％のＢＳＡ含有Ｇｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを２００μｌ添加し、粘着フィルムでウェルを覆い、８５ｒｐｍで６０分間インキュベートした。これ以降の作業からアルミホイルでガラススライドを遮光した。インキュベート後、抗体溶液を取り除き、各ウェルに洗浄バッファーを２００μｌ添加し、すぐに取り除いた。この操作をもう一度繰り返し、スライドからカセットを外し、洗浄バッファーで満たした容器（コプリン染色槽）にスライドを入れ、６０ｒｐｍで１０分間インキュベートした。インキュベート後、超純水で満たした容器にスライドを入れ、６０ｒｐｍで２分間インキュベートした。インキュベート後、スライドを取り出し、十分乾燥させた。反応後スライドはＧｌｙｃｏＬｉｔｅ ２２００により蛍光画像を取得し、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ Ｖｅｒ ５．２（ＬＩ－ＣＯＲ）を用いて蛍光強度を定量し、糖鎖とＣＬＡ間の結合性を数値化した。１００種のＮ－結合型糖鎖の結果を図１０に示し、９４種のＯ－結合型糖鎖の結果を図１１に示し、５８種のスフィンゴ糖脂質糖鎖の結果を図１２に示す。

図１０に示すように、ＣＬＡはＮ－結合型糖鎖におけるＮ００４、Ｎ００５、Ｎ０１４、Ｎ０１５、Ｎ０２４、Ｎ０２５、Ｎ０３４、Ｎ０３５、Ｎ０４４、Ｎ０４５、Ｎ０５４、Ｎ０５５、Ｎ１１４、Ｎ１１５、Ｎ１２４、Ｎ１２５、Ｎ１３４、Ｎ１３５、Ｎ１４４、Ｎ１５５、Ｎ２１４、Ｎ２１５、Ｎ２２４、Ｎ２２５、Ｎ２３４、Ｎ２４４、Ｎ２５５、Ｎ６１４４、Ｎ６２４４、Ｎ３００４、Ｎ０１５Ｇ及びＮ０２５Ｇに対して、高い結合活性を示した。また、図１１に示すように、ＣＬＡはＯ－結合型糖鎖におけるＯ１９、Ｏ２０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ５４、Ｏ６０、Ｏ６６、Ｏ６７、Ｏ７３、Ｏ７６、Ｏ７８、Ｏ８５、Ｏ８６及びＯ９０に対して、高い結合活性を示した。また、図１２に示すように、ＣＬＡはスフィンゴ糖脂質糖鎖における３６、４５及び４６に対して、高い結合活性を示した。

図４～図９に示すように、ＣＬＡと高い結合活性を示す上記各糖鎖は、いずれもＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃであった。すなわち、ＣＬＡは、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃを含むすべての糖鎖に対して強い結合を示した。一方、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃを含まない糖鎖に対してはほとんど結合活性を示さなかった。

以上より、ＣＬＡはＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に特異的に結合でき、従って、そのようなＣＬＡレクチンを利用して試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖を検出することができると考えられる。このため、Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖を細胞表面に発現するがん細胞を検出するのに応用できることが示唆される。

Claims (7)

1. ＣＬＡレクチンを含むことを特徴とするＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出するための組成物。
2. 前記ＣＬＡレクチンには、標識分子が結合されている請求項１に記載の組成物。
3. 試料に対してＣＬＡレクチンを接触させるステップと、
   Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンを定量するステップと、
   前記Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンの量が所定の閾値以上である場合に、試料中にＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造が存在すると判定するステップとを含む、試料中のＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造を検出する方法。
4. 前記ＣＬＡレクチンには、標識分子が結合されている請求項３に記載の方法。
5. 前記定量するステップは、前記ＣＬＡレクチンに結合する結合分子と、前記Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンとを接触するステップを含む請求項３に記載の方法。
6. 前記定量するステップは、前記標識分子に結合する結合分子と、前記Ｆｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンとを接触するステップを含む請求項４に記載の方法。
7. 前記定量するステップは、前記結合分子を定量することによりＦｕｃα１－３ＧｌｃＮＡｃ構造に結合したＣＬＡレクチンを定量するステップを含む請求項５又は６に記載の方法。