JP7748866B2

JP7748866B2 - 痒みの検出方法

Info

Publication number: JP7748866B2
Application number: JP2021201781A
Authority: JP
Inventors: 朋大松本; 将史横田; 准子石川; 大樹村瀬; 光俊冨永; 建二 ▲高▼森
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2025-10-03
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: JP2023087417A; JP2025179237A

Description

本発明は、痒みの検出方法に関する。

痒みはアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患だけでなく、腎不全などの内臓疾患においてもみられる病態である。痒みは皮膚の乾燥、日焼け、皮膚と衣類との擦れなどによっても惹起される。痒みによる掻き動作は皮膚を物理的に侵害し、さらなる症状悪化を引き起こすことから、痒みの解決は皮膚疾患の予防又は改善に寄与する。例えば、後肢の爪を切って、掻破動作による皮膚の物理的損傷を抑制したマウスでは、アトピー性皮膚炎による皮膚症状が予防・改善されることが報告されている（非特許文献１）。

皮膚などの末梢組織における痒みの感覚は，末梢と脊髄後角をつなぐ求心性感覚神経により、脳に伝達される。求心性感覚神経の細胞体は後根神経節（ＤＲＧ）に存在していて、細胞体から末梢組織と脊髄後角へ神経線維を伸長している。求心性感覚神経は、皮膚における感覚を受容し、脊髄後角の二次ニューロンに伝達する役割を持つ。

痒みの起痒物質は対応する受容体との結合により痒みを惹起させる。起痒物質としては、ヒスタミン、セロトニン、クロロキンなど、痒み増強物質（感作物質）としてはＩＬ-４やＩＬ－１３などのＴｈ２サイトカインなどが報告されている。なかでも代表的な化学的起痒物質はヒスタミンである。最近では、ヒスタミンは基本的に一部の急性の痒みのみに関連し、多くの慢性的な痒みを伴う疾患におけるヒスタミンの関与は乏しいと考えられている（非特許文献２）。そのため、現在、抗ヒスタミン薬（Ｈ１受容体拮抗薬）が痒みを抑える薬として多用されているが、抗ヒスタミン薬で解決できる痒みはごく限られており、多くの痒み病態は有効な解決策がない難治性痒みである。アトピー性皮膚炎、乾皮症、腎不全などに伴う痒みは難治性痒みといわれている。難治性痒みの多くはメカニズムが解明されていなく、メカニズムの解明と新たな標的となる分子の開発が求められている。

痒みは、主観的な感覚である。そのため、一見して症状を判断できるものではなく、本人からの申告が重要であるが、申告基準は個々人で異なることから早期かつ適切な対処や治療のタイミングを逃してしまう可能性を秘めている。
従来、臨床場面において、痒みを低侵襲かつ客観的に評価する指標は知られていなく、低侵襲な手法により痒みを検出できる方法は未だ存在しない。

Hashimoto Y et al. Life Sciences. 2004 Dec 31;76(7):783-94 Ikoma A et al. Nature Reviews Neuroscience. 2006 Jul;7(7):535-47

本発明は、痒みを検出するためのマーカー、及び当該検出マーカーを用いた痒みの検出方法を提供することに関する。

本発明者は、先ずアセトン・エーテル混合物及び水処理で乾皮症様の皮膚症状を示すモデルマウス（以下、ＡＥＷモデルマウス）より後根神経節（ＤＲＧ）を採取し、網羅的な遺伝子発現解析を実施したところ、発現変動を示す遺伝子としてＶｇｆを同定した。さらにＡＥＷモデルマウス及びアトピー性皮膚炎モデルマウス（以下、ＡＤモデルマウス）のＤＲＧにおけるＶｇｆ遺伝子の定量的発現解析を実施したところ、コントロールマウスと比較して両モデルマウスにおいて、ＤＲＧ組織のＶｇｆ発現は有意に増加していた（実施例１）。Ｖｇｆは神経分泌因子ＶＧＦｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｉｂｌｅ（以下、ＶＧＦ）をコードする遺伝子である。ＶＧＦは生体内のプロテアーゼなどで分解を受け、いくつかの生理活性ペプチドを生じることが知られている（Lewis JE et al. Front Endocrinol (Lausanne). 2015 Feb 2;6:3）。その一つであるＴＬＱＰ－２１を健常マウスの後頚部皮膚内に注射すると、マウスにおいて掻破行動が惹起され（実施例２）、ＴＬＱＰ－２１は痒みを誘発することを見出した。そしてさらに研究を重ねた結果、ヒトにおいて血中のＴＬＱＰ－２１レベルが痒みの程度と有意に正相関し、ＴＬＱＰ－２１を指標として痒みを検出できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～３）に係るものである。
１）被験者から採取された生体試料について、ＴＬＱＰ－２１レベルを測定する工程を含む、当該被験者における痒みを検出する方法。
２）ＴＬＱＰ－２１レベルを測定するための試薬を含有する、１）記載の方法に用いられる被験者の痒みを検出するための検査用キット。
３）ＴＬＱＰ－２１からなる、被験者の痒みを検出するための検出マーカー。

本発明によれば、簡便且つ低侵襲的に、痒みを検出することが可能である。これにより、個々人の主観に因らずに痒みを客観的に把握できるため、当該痒みに対する適切な対策を講じることが可能となる。

ＡＥＷモデルＤＲＧ組織のＲＮＡ－ｓｅｑ解析結果を示す。ＡＥＷモデルにおけるＶｇｆ発現量のリアルタイムＰＣＲ解析結果を示す。ＡＤモデルにおけるＶｇｆ発現量のリアルタイムＰＣＲ解析結果を示す。ＴＬＱＰ－２１投与後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの掻痒回数を示す。血中ＴＬＱＰ－２１と痒みＶＡＳとの相関解析の結果を示す。

本発明の痒みの検出方法は、被験者から採取された生体試料について、ＴＬＱＰ－２１レベルを測定する工程を有する。

本発明において、「痒み」は、主観的な感覚であり、その原因は特に限定されない。痒みの部位は、例えば、全身、頭皮、顔、背中、腕、手の甲、指、脚などの広い範囲又は特定の部位が挙げられる。
本発明においては、難治性痒みの検出に適する。
「難治性痒み」とは、抗ヒスタミン薬で痒みが解決されない痒みを意味する。難治性痒みとしては、例えば、アトピー性皮膚炎、乾皮症、乾癬、痒疹、腎不全、肝疾患などに伴う痒みが挙げられる。

本発明において、「検出」は、検査、測定、判定又は評価支援等の用語で言い換えることもできる。なお、本発明における「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による診断を含むものではない。

本発明において、「被験者」は、特に限定されないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物であって、痒みの検出を所望するか又は必要とする者が挙げられる。例えば、掻痒性皮膚疾患を有する者が挙げられる。掻痒性皮膚疾患としては、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、皮膚掻痒症、乾皮症、乾癬、結節性痒疹などが挙げられる。これらのうち、蕁麻疹を除く皮膚疾患は、難治性痒みを伴う皮膚疾患に該当する皮膚疾患である。被験者は、好ましくはヒトであり、より好ましくは掻痒性皮膚疾患の痒みによる睡眠の妨げについて自覚症状を有するヒトである。

本発明において、「生体試料」は、ＴＬＱＰ－２１レベルを検出できる細胞、組織及び生体材料であればよい。具体的には、臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿、その他、便、毛髪等が挙げられる。好ましくは、血液、血液から調製された血清又は血漿である。

本発明において、「ＴＬＱＰ－２１」は、生体内においてＶＧＦの分解により生じる生理活性ペプチドである。具体的なＴＬＱＰ－２１の配列としては、ヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）でＴＬＱＰＰＳＡＬＲＲＲＨＹＨＨＡＬＰＰＳＲ（配列番号１）、マウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）でＴＬＱＰＰＡＳＳＲＲＲＨＦＨＨＡＬＰＰＡＲ（配列番号２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）でＴＬＱＰＰＡＳＳＲＲＲＨＦＨＨＡＬＰＰＡＲ（配列番号３）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）でＴＬＱＰＰＳＡＬＲＲＲＨＹＨＨＡＬＰＰＳＲ（配列番号４）、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘｊａｃｃｈｕｓ）でＴＬＱＰＰＳＡＳＲＲＲＨＹＨＨＡＬＰＰＳＲ（配列番号５）等の配列で示すことができる。ＴＬＱＰ－２１は細胞膜上に存在するＧＰＣＲ型受容体である補体因子Ｃ３ａ受容体に結合し、シグナルを惹起することが知られている（ＣｅｒｏＣｅｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１４Ｄｅｃ２；２２（１２）：１７４４－１７５３）。
後記実施例に示すように、ＴＬＱＰ－２１を健常マウスの後頚部皮膚内に注射すると、マウスにおいて掻破行動が惹起された（図４）。また、血中のＴＬＱＰ－２１レベルは、痒みの程度と正相関が認められた。特に夜間の痒みの程度と有意な正相関が認められた(図５)。これらの結果から、ＴＬＱＰ－２１は痒みを誘発することが明らかであり、ＴＬＱＰ－２１は痒みを検出するための検出マーカーとなり得る。また、ＴＬＱＰ－２１を検出マーカーとし、そのレベルに基づいて痒みを検出することが可能である。
本発明においては夜間、特に睡眠時の痒みの検出に適する。痒みには日内変動があり、特に夜間の痒みはアトピー性皮膚炎などの掻痒性皮膚疾患においては重要な課題である（ＴＥｂａｔａｅｔａｌＪＤｅｒｍａｔｏｌ．１９９６Ｍａｒ；２３（３）：１５３―５．）。そのため、特に夜間の痒みを検出し、当該痒みを解決できれば痒みによる掻き動作に起因する皮膚疾患の予防又は改善、さらには痒みによる睡眠への悪影響を改善するために有効である。なお、夜間は、日没時刻から日出時刻までの時間（通常、一日２４時間で、１８時以降、翌６時までの時間）であり、睡眠時は、一般に夜間のうちの就寝時間であるが、時間帯はこれに限定されない。

本発明において、ＴＬＱＰ－２１レベルとは、ＴＬＱＰ－２１の存在量や活性等を包括的に意味する。
ＴＬＱＰ－２１レベルの測定は、当該分野で通常用いられる公知の方法に従って行えばよい。測定方法の例としては、免疫測定法（例えば、ウェスタンブロット、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等）、蛍光法、電気泳動、プロテインチップ、クロマトグラフィー、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（ＰＮＡＳ１００，１２２７１－１２２７６（２００３））、２－ハイブリッド法（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８，３０２－３１１（１９９８））、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
免疫測定法を用いてＴＬＱＰ－２１レベルを測定する場合、例えば、当該ＴＬＱＰ－２１に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合したＴＬＱＰ－２１を定量すればよい。ＴＬＱＰ－２１に対する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、当該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は当該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．；Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ９，Ｎｕｍｂｅｒ１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ１９９８，ｐｐ．１０２－１０８（７））。

本発明においては、ＴＬＱＰ－２１レベルを、予め設定した基準値と比較することによって、被験者の痒みを検出することができる。
ここで、「基準値」は、痒みの程度と、生体試料におけるＴＬＱＰ－２１レベルの関係に基づき、予め決定することができる。
例えば、ある集団を、痒みの程度、例えば、皮膚の痒みに関するＶＡＳスコア（アトピー性皮膚炎診療ガイドライン２０１８）やＮＲＳなどの各種指標に基づいて、異なる痒みの程度を有する複数の群に分ける。そして、それぞれの群における当該ＴＬＱＰ－２１の発現レベルの平均値や標準偏差等の統計値を参考に決定した値を、それぞれの群への属否を判別する基準値として決定することができる。
集団としては、特に限定されず、任意の集団でも良く、難治性痒みを有する集団でも良い。難治性の痒みを有する集団に痒みの自覚がない健常集団を加えた集団でもよい。また、対象となる被験者の属性（性別、人種、年代等）が一致した集団であることが好ましい。
基準値の設定、及び当該基準値に基づく痒みの検出の具体的手法は、当業者の技術常識にしたがって適宜実施することができる。

本発明において、例えば痒みの有無を検出することを目的として基準値を設定した場合は、ＴＬＱＰ－２１レベルが基準値よりも高いと、被験者は痒みを有すると検出され得、そうでない場合、被験者は痒みはないと検出され得る。例えば、被験者におけるＴＬＱＰ－２１レベルが基準値に対して好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１３０％以上であれば、当該被験者は痒みを有すると検出され得、そうでない場合、被験者は痒みはないと検出され得る。あるいは、被験者におけるＴＬＱＰ－２１レベルと基準値との差異は、例えば両者が統計学的に有意に異なるか否かによって判断することができる。すなわち、被験者におけるＴＬＱＰ－２１レベルが基準値と比べて統計学的に有意に高ければ、当該被験者は痒みを有すると検出され得、そうでない場合、被験者は痒みはないと検出され得る。
また、本発明では、異なる痒みの程度を有する複数の群から決定した２以上の基準値を用いた痒みの程度が異なる群への属否に基づき、被験者の痒みの程度を検出することができる。または、被験者におけるＴＬＱＰ―２１の発現レベルをそのまま痒みの程度を表す間接的な指標として用いることで、被験者の痒みの程度を検出しても良い。

また、本発明においては、一被験者から少なくとも２つの時期、あるいは定期的（例えば、毎日、毎週、毎月）に生体試料を採取して、生体試料中のＴＬＱＰ－２１レベルを測定し、そのレベルの変化や変化量を指標に、当該被験者における痒みの変化の有無、変化傾向の予測、変化の程度、痒みの改善状況等を検出することができる。この場合、検出開始時点におけるＴＬＱＰ－２１レベルを基準値とし、その後のＴＬＱＰ－２１レベルを当該基準値と比較することによって、被験者の痒みの変化の有無などを検出してもよい。

本発明の被験者の痒みを検出するための検査用キットは、被験者から分離した生体試料におけるＴＬＱＰ－２１レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、ＴＬＱＰ－２１レベルを測定するための試薬（ＴＬＱＰ－２１を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬など）が挙げられる。当該キットに包含される抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、生体試料を採取するための用具などを含むことができる。

上述した実施形態に関し、本発明は以下の態様をさらに開示する。

＜１＞被験者から採取された生体試料について、ＴＬＱＰ－２１レベルを測定する工程を含む、当該被験者における痒みを検出する方法。

＜２＞痒みが好ましくは難治性痒みであり、より好ましくはアトピー性皮膚炎、乾皮症、乾癬、痒疹、腎不全、又は肝疾患に伴う痒みである＜１＞記載の方法。
＜３＞痒みが好ましくは睡眠時の痒みである＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞生体試料が、被験者の好ましくは臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿、便、又は毛髪であり、より好ましくは血液、血液から調製された血清又は血漿である＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の方法。
＜５＞ＴＬＱＰ－２１レベルに基づいて被験者の痒みを検出することを含む＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞被験者が、掻痒性皮膚疾患を有するヒト、好ましくは掻痒性皮膚疾患による痒みを有するヒト、より好ましくは掻痒性皮膚疾患の痒みによる睡眠の妨げについて自覚症状を有するヒトである＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞ＴＬＱＰ－２１レベルを測定するための試薬を含有する、＜１＞～＜６＞のいずれかの方法に用いられる被験者の痒みを検出するための検査用キット。
＜８＞ＴＬＱＰ－２１からなる、被験者の痒みを検出するための検出マーカー。
＜９＞ＴＬＱＰ－２１が、ＴＬＱＰＰＳＡＬＲＲＲＨＹＨＨＡＬＰＰＳＲ（配列番号１、４）、ＴＬＱＰＰＡＳＳＲＲＲＨＦＨＨＡＬＰＰＡＲ（配列番号２、３）及びＴＬＱＰＰＳＡＳＲＲＲＨＹＨＨＡＬＰＰＳＲ（配列番号５）から選ばれるいずれかの配列のペプチドである、＜１＞～＜６＞のいずれかの方法、＜７＞の検査用キット又は＜８＞の検出マーカー。

実施例１網羅的遺伝子発現解析
１．実験動物
動物は雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及び雄性ＮＣ／Ｎｇａマウスを使用した。
乾皮症モデル（ＡＥＷモデル）：毛刈りしたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス皮膚にアセトン及びジエチルエーテルの１：１混合液を浸み込ませた脱脂綿を当て、１５秒間静置した。その後直ちに純水を浸み込ませた脱脂綿を３０秒間当てた。この処置を２回／日（朝・夕）で７日間繰り返し実施することでＡＥＷモデルマウスを作製した。対照として、純水を浸み込ませた脱脂綿のみを３０秒当てたコントロールマウスを作製した。各群ｎ＝７を本解析に使用した。

アトピー性皮膚炎モデル（ＡＤモデル）：ＮＣ／Ｎｇａマウスにハツカネズミケモチダニ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｉ）を寄生させ、自然発症的に皮膚炎を生じさせることでＡＤモデルとした。コントロールマウスとして、ダニ寄生のないＳＰＦで飼育された同系統のマウスを使用した。各群ｎ＝８を本解析に使用した。

２．ｔｏｔａｌＲＮＡの精製
マウス頸椎より後根神経節を摘出した。摘出した組織はポリトロンホモジナイザーによりホモジナイズし、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔを用いてｔｏｔａｌＲＮＡを精製した。

３．遺伝子発現解析
ＲＮＡ－ｓｅｑ：ＡＥＷモデルマウス及びそのコントロールマウスから精製したｔｏｔａｌＲＮＡを用いた。逆転写にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＶＩＬＯ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用し、以降の処理は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ標準プロトコルに則った。シーケンスはＩｏｎＳ５ｓｙｓｔｅｍを使用した。結果を図１に示す。図１に示すように、ＡＥＷモデルにおいて、一定シーケンス量当たりのＶｇｆ発現は、コントロールマウスと比較してＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ－ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で、有意に増加していた。

リアルタイムＰＣＲ：ＡＥＷモデルマウス、ＡＤモデルマウス及びそれらのコントロールマウスから精製したｔｏｔａｌＲＮＡを用い、Ｖｇｆを目的遺伝子として特異的なＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓを用いたＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍによりＶｇｆ遺伝子の定量的ＰＣＲ解析を行った。内部標準として、Ｒｐｌｐ０を使用した。図２及び図３に、コントロールマウスのＶｇｆ遺伝子発現量を１としたＶｇｆ遺伝子の相対的発現量を示す。

図２に示すように、ＡＥＷモデルマウスにおいてＤＲＧ組織のＶｇｆ発現量は、コントロールマウスと比較して有意に増加していた。また、図３に示すように、ＡＤモデルマウスにおいてもＤＲＧ組織のＶｇｆ発現量は、コントロールマウスと比較して有意に増加していた。

実施例２ＴＬＱＰ－２１による掻痒発現
１．実験動物
マウスは雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。

２．メディエーター候補分子の投与
ＴＬＱＰ－２１は、マウス配列と同一のペプチド（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、配列：ＴＬＱＰＰＡＳＳＲＲＲＨＦＨＨＡＬＰＰＡＲ（配列番号６））を使用し、１５ｎｍｏｌ/２０μＬ、３０ｎｍｏｌ/２０μＬとなるように調製した。溶媒は生理食塩水とした。これを毛刈りしたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの後頚部皮内に２０μＬ投与した。注射後のマウスは直ちに掻破行動測定を開始し、開始後３０分間の測定値を解析した。

３．掻破行動の測定
ＴＬＱＰ－２１投与後の掻破行動の測定にはＭｉｃｒｏＡｃｔ（ニューロサイエンス）を使用した。結果を図４に示す。連続した一連の掻き動作を１回とカウントし、その合計値をＥｖｅｎｔｓと表記し、全ての掻き動作回数の合計値をＢｅａｔｓとして表記した。

図４に示すように、ＴＬＱＰ－２１投与後にマウスの掻破行動の増加が、ＥｖｅｎｔｓとＢｅａｔｓの有意な増加として観察された。掻破行動の発現は３０分以内の即時的反応であった。

実施例３血中ＴＬＱＰ－２１と痒みＶＡＳとの相関解析
１．血清分離
研究参加の同意を得た２２～８０歳の男女被験者（健常４名、アトピー性皮膚炎６名、痒疹１名）より採血した血液を凝固促進フィルムを含む採血管に回収し、１，２００×ｇ、１５分、４℃条件下で遠心分離した。その後、上清を分離し、解析まで－８０℃で保存した。

ＴＬＱＰ－２１ＥＩＡ
血清中のＴＬＱＰ－２１の定量にはＰｈｏｅｎｉｘｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のＴＬＱＰ－２１，Ｈｕｍａｎ，ＥＩＡＫｉｔを使用した。保存血清は融解後、Ｋｉｔに付属の１×ＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒにより１６倍希釈し、Ｋｉｔ付属のＰｒｏｔｏｃｏｌに則って実験を行った。吸光度の測定にはＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ３８４を使用し、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアによりＴＬＱＰ－２１濃度を算出した。

２．統計解析
アンケートの解析
採血を行った被験者に対して、痒みについてＶＡＳ（ＶｉｓｕａｌＡｎａｌｏｇＳｃａｌｅ）法による自覚症状を最大値１００として数値化した。アンケート項目は以下の通りである。
［最近７日間について］
・皮膚の痒みの程度（ＶＡＳ１）
・痒みによる眠りの妨げ（ＶＡＳ２）
［最近１日間（現在）について］
・皮膚の痒みの程度（ＶＡＳ１）
・痒みによる眠りの妨げ（ＶＡＳ２）

統計解析
血清中のＴＬＱＰ－２１の濃度と、アンケートによる各ＶＡＳ指標について、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数（ｒ）を算出した。相関係数が正かつｐ値（両側）＜０．０５となるものを有意な相関ありと判定した。解析ソフトウェアはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用した。結果を図５に示す。

図５に示すように、血中ＴＬＱＰ－２１について痒みＶＡＳと有意な正相関が認められた。すなわち、ＴＬＱＰ－２１は痒み検出の指標になると考えられた。
また、痒みによる眠りの妨げ（ＶＡＳ２）についてより強い相関が認められており、ＴＬＱＰ－２１は特に夜間における痒みの検出の指標として好ましいと考えられた。

Claims

被験者から採取された生体試料について、ＴＬＱＰ－２１レベルを測定する工程を含む、当該被験者における痒みを検出する方法であって、前記生体試料が、被験者の血液、血液から調製された血清又は血漿であり、前記痒みが、アトピー性皮膚炎又は乾皮症に伴う痒みである、方法。
ＴＬＱＰ－２１レベルを測定するための試薬を含有する、請求項１記載の方法に用いられる被験者の痒みを検出するための検査用キット。
ＴＬＱＰ－２１からなる、被験者のアトピー性皮膚炎又は乾皮症に伴う痒みを検出するための検出マーカー。