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JP7828307B2 - トリュフ由来の甘味タンパク質 - Google Patents
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JP7828307B2 - トリュフ由来の甘味タンパク質 - Google Patents

トリュフ由来の甘味タンパク質

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Description

関連出願の相互参照
[0001]本特許出願は２０２０年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／０４４２４５号の利益を主張するものであり、該仮特許出願を参照により援用する。
電子的に提出された資料の参照による援用
[0002]本明細書中で全体を参照により援用するのは、本明細書と同時に提出され、以下のように同定された、コンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストである：２０２１年６月２５日作成の「３３８８２０＿６４０＿３０Ａ＿ＷＯ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」と名付けられた１つの８６６７８バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
[0003]栄養甘味料の過剰摂取は、肥満、心疾患、代謝異常、および歯科疾患などの食事に関連する健康問題と長い間関連付けられてきた。それに応じて、消費者は、食事における栄養甘味料の量を減少させる方法を次第に探すようになっている。製造業者は、栄養甘味料の望ましい味および機能的特性をよりよく模倣することができる栄養甘味料の代替品を開発しようとすることによって、この要求に応えている。
[0004]好ましくは天然源に由来するゼロカロリーまたは低カロリー甘味料は、多い糖消費の悪影響を制限することが望ましい（例えば、とりわけ、糖尿病および肥満）。一般に知られているゼロカロリーまたは低カロリー甘味料としては、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、羅漢果（モンク）果実抽出物、ネオテーム、サッカリン、ステビアおよびスクラロースが挙げられる。しかしながら、これらの甘味料は、苦味など味の欠陥を有する。
[0005]トリュフは、チャワンタケ綱チャワンタケ目に属する属を含むいくつかの子嚢菌類の真菌の地下子実体である。トリュフは外生菌根菌であり、したがって、通常、木の根と密接に関連して見出される。
[0006]これまでに、甘味および味覚を修飾する７つのタンパク質、すなわち、ブラゼイン、ソーマチン、モネリン、クルクリン、マビンリン、ミラクリンおよびペンタジンが知られている。生物学的活性に関与するタンパク質表面上の重要な残基は、これらのタンパク質のいずれについても、まだ確実に同定されていない。モネリンはモル基準でスクロースより１０００００倍甘く、続いてブラゼインおよびソーマチンはグラム基準でそれぞれスクロースより５００倍および３０００倍甘いことが見出された。これらのタンパク質はすべて、熱帯雨林で生育する植物から単離されている。それらのほとんどは配列相同性または構造的類似性を共有しないが、ソーマチンは、タンパク質配列レベルで、他の植物に見られる特定の甘くないタンパク質と広範な類似性を共有する。真菌由来の甘味修飾タンパク質は知られていない。
[0007]天然源から改善された味を有する新規な低カロリーまたはゼロカロリー甘味料を生産することが、当該技術分野において依然として必要とされている。このような甘味組成物を、その潜在的な供給源、とりわけ子嚢菌類の真菌種から経済的に生産することが、当該技術分野において依然として必要とされている。
[0008]本発明は、新たに同定された真菌由来の甘味タンパク質、ならびに本明細書中でＭＹＤ／Ｍｙｄともよばれる前記タンパク質をコードする遺伝子およびｃＤＮＡに関する。より詳細には、本発明は、新たに同定された甘味タンパク質(sweet-tasting protein)、前記タンパク質をコードする遺伝子およびｃＤＮＡ、ならびに食品の味の調節においてそのようなタンパク質、遺伝子およびｃＤＮＡを使用する方法に関する。本発明は、とりわけ、本明細書中でＭＹＤ１として同定される新規甘味タンパク質および対応するポリペプチドＭｙｄ１（ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎともよばれる）をコードするＤＮＡ配列を提供する。Ｍｙｄ１は、真菌から同定された最初の甘味タンパク質である。Ｍｙｄ１は食品および飲料の酸味、苦味または渋味を低減し、さらに、Ｍｙｄ１は、食品および飲料の味を増強する活性、すなわち味を修飾する活性を有する。
[0009]本発明は、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）であって、ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５からなる群より選択されるポリペプチド配列；（ｂ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；および（ｃ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列から、２４以下のアミノ酸の欠失、挿入、置換または付加により修飾されたポリペプチド配列；からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
[0010]一観点において、甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３に示されるポリペプチド配列、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列である。他の観点において、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドは、配列番号３のポリペプチドではない。
[0011]他の観点において、ポリペプチド配列は、配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含む。
[0012]本発明はまた、（ａ）少なくとも１つの置換修飾を有する配列番号２に示される核酸配列を含むポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドは、配列番号２のポリヌクレオチドではない；および（ｃ）（ｉ）配列番号２に示される核酸配列と、（ｉｉ）ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列とを含むポリヌクレオチド；からなる群より選択されるポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）であって、該ポリヌクレオチドが、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
[0013]一観点において、甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７５を含む。とりわけ、甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、または配列番号６８を含む。
[0014]特定の観点において、ポリヌクレオチドは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７の核酸配列を含む。
[0015]甘味調節活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望により、異種調節エレメントに作動可能に連結される。追加的または代替的に、ポリヌクレオチド配列は、タンパク質タグまたは標識をさらにコードする。タンパク質タグは、所望によりアフィニティータグであり、タンパク質は、所望によりヒスチジンタグである。
[0016]一観点において、ポリヌクレオチドは配列番号２０を含み、これはＥ．ｃｏｌｉにおけるＨｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのコード配列に対応する（残基３６４～３８１が所望によるＨｉｓタグ配列に対応する）。配列番号２０は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化されている。他の観点において、ポリヌクレオチドは配列番号２２を含み、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＨｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのコード配列に対応する（残基３６４～３８１が所望によるＨｉｓタグ配列に対応する）。配列番号２２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化されている。配列番号２１の対応するポリペプチドは、Ｈｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎタンパク質（残基１２２～１２７が所望によるＨｉｓタグ配列に対応する）に対応し、このポリペプチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現について同じである。
[0017]ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに該ベクターで形質転換された宿主細胞を含む、発現カセットを提供する。甘味調節活性を有するタンパク質の生産方法であって、甘味調節活性を有するタンパク質の生産をもたらす条件下にある培地中で宿主細胞を培養することを含む方法も提供される。
[0018]本発明は、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）を包含し；ここで、該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換または修飾を含有していてもよく、該ポリペプチドは、タンパク質タグ、とりわけヒスチジンタグをさらに含んでいてもよく、該ポリペプチドは、甘味調節活性を有する。
[0019]一観点において、ポリペプチドは、配列番号３、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。他の観点において、ポリペプチドは配列番号３のポリペプチドではない。
[0020]さらに他の観点において、ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含む。
[0021]一観点において、ポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５からなる群より選択されるポリペプチド配列を含み、ここで、該ポリペプチドは、配列番号３でなくてもよい。とりわけ、ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
[0022]本発明は、（ａ）経口投与用の製品と、該製品はＭａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではない、（ｂ）ポリペプチドを含む甘味組成物との組み合わせを含む組成物であって、該組み合わせが、経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する、前記組成物を提供する。一観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し；ここで、該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換修飾を含有していてもよく、該ポリペプチドは、配列番号３のポリペプチドでなくてもよく、該ポリペプチドは、ヒスチジンタグをさらに含んでいてもよく、該ポリペプチドは、甘味調節活性を有する。例えば、甘味組成物中のポリペプチドは、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７５のアミノ酸配列を含み、配列番号３からなっていなくてもよい。とりわけ、ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
[0023]一観点において、本発明は、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む甘味組成物を提供し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列のポリペプチド以外のポリペプチドであってもよい。
[0024]本発明は、経口投与用の製品の味を調節するための方法であって、経口投与用の製品を、ポリペプチドを含む有効量の甘味組成物と組み合わせることを含み、該経口投与用の製品が、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではなく、該組み合わせが、経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する、前記方法を提供する。一観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し；ここで、該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換修飾を含有していてもよく、該ポリペプチドは配列番号３のポリペプチドでなくてもよく、該ポリペプチドはヒスチジンタグをさらに含んでいてもよく、該ポリペプチドは甘味調節活性を有する。例えば、甘味組成物中のポリペプチドは、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７５のアミノ酸配列を含み、配列番号３からなっていなくてもよい。とりわけ、ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
[0025]経口投与用の製品は、食品、飲料、栄養補助食品組成物、または医薬組成物であることができる。食品製品の例としては、限定されるものではないが、ベークド品；甘いベーカリー製品、甘いベーカリー製品を調製するための予め作られた甘いベーカリーミックス；パイ用フィリングおよび他の甘いフィリング、ゼラチンおよびプディング；冷凍デザート；ヨーグルト；スナックバー；パン製品；パン製品を調製するための予め作られたパンミックス；ソース、シロップおよびドレッシング；甘いスプレッド；菓子製品；および甘味付き朝食用シリアルが挙げられる。飲料製品の例としては、限定されるものではないが、炭酸飲料；非炭酸飲料；および飲料濃縮物が挙げられる。
[0026]本発明はまた、甘味調節活性を有するポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）ポリペプチドを含む組成物を得、（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して組成物を精製することを含む、前記方法を提供する。一観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し；ここで、該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換修飾を含有していてもよく、該ポリペプチドは配列番号３のポリペプチドでなくてもよく、該ポリペプチドはヒスチジンタグをさらに含んでいてもよく、該ポリペプチドは甘味調節活性を有する。例えば、ポリペプチドは、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７５のアミノ酸配列を含み、配列番号３からなっていなくてもよい。とりわけ、ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
[0027]本発明の他の観点および態様は、本明細書中の図面、詳細な説明、および非限定的な実施例を検討することで明らかになるであろう。
[0028]図１は、ＰＨＹＲＥ２．０タンパク質フォールディング予測ツールを用いた、配列データに基づくＭｙｄ１の予測三次元構造を示す。 [0029]図２は、部分的に精製したＭ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓグレバの画分から得られたタンパク質のクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 [0030]図３は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現された配列番号２１の精製段階のクーマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：分子量標準；レーン３、粗溶解物；レーン４、ＨｉｓＰｕｒＴＭ Ｎｉ－ＮＴＡからのフロースルー画分；レーン５、洗浄１；レーン６、洗浄２；レーン７、洗浄３；レーン８、溶離画分。 [0031]図４は、ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ、アスパルテーム、ソーマチン、レバウジオシドＡの甘味に関する濃度－応答関数を示す。データは、２００ｍＭスクロース関連（「甘味」）標的で生じる応答の割合（ｐ）としてプロットする。ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ、アスパルテーム、ソーマチン、レバウジオシドＡについての曲線における各データ点は、３２回の反復にわたる平均として計算され、スクロース曲線については１６回の反復にわたって平均した；エラーバーは標準誤差である。水およびスクロース対照の点は、それぞれ１２８回および６４回の反復にわたる平均として同様に計算した。曲線は、非線形回帰によってフィットさせた。 [0032]図５Ａは、ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの予測三次構造と、ソーマチン（ＰＤＢ：１ＲＱＷ）、モネリン（ＰＤＢ：２Ｏ９Ｕ）、ブラゼイン（ＰＤＢ：１ＢＲＺ）、およびニワトリ卵白リゾチーム（ＰＤＢ：１ＬＳＮ）の公知の結晶構造（タンパク質データベース）との比較を示しており、ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎが他の公知の甘味タンパク質と同様の予測三次構造を有し、すべてβシートに平行なαヘリックスを有する逆平行βシートを含有することを示している。 [0033]図５Ｂは、推定二次構造モチーフに重ね合わされた配列番号３の予測二次構造および各モチーフ内の点変異の位置の表示を示す。 [0034]図６は、甘味強度、甘味知覚の発現時間、および甘味知覚の持続時間について、変異ｈｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを、互いに、およびＥＬＩＳＡによって測定して同等のタンパク質濃度に同等化されたｈｉｓタグ付き非変異ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎと比較した結果を示す。 [0035]図７Ａは、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣから溶離した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、クーマシー染色を示す。Ｍ：タンパク質マーカー；レーン１：溶離画分、カチオン交換後に低純度を示す。矢印はｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎバンドを示す。 [0036]図７Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されたＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌカラムからの勾配溶離中に収集された２つの溶離画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、クーマシー染色示す。レーン１は、ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを含有しない溶離画分１を示し、レーン２は、溶離ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを示す。溶離画分の純度は、ＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒによって約８６％であると決定された。矢印はｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎバンドを示す。 [0037]図７Ｂは、ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００でのクロマトグラフ後のＨＩＣカラムからの溶離タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、クーマシー染色を示す。レーン１は、精製されたｈｉｓタグｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを示し、レーン２は、精製された未変性(native)ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを示す。溶離画分の純度は、ＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒによって約９８％と決定された。矢印はｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎバンドを示す。
[0038]したがって、本発明は、甘味を調節することができるタンパク質をコードする単離核酸分子、およびそれらがコードするポリペプチドを提供する。本明細書に記載されるように、本発明のポリペプチドは、単独で、または食品、飲料、栄養補助食品、または医薬と組み合わせて、甘味知覚を媒介する。本発明はまた、甘味を修飾することができる単離ポリペプチド、および、食品、飲料、栄養補助食品、または医薬組成物と一緒でのその組成物であって、得られた組み合わせが甘味を有するものを提供する。本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用することによって、食品、飲料、栄養補助食品、または医薬組成物の甘味を修飾するための方法を提供する。
[0039]本発明の一観点において、本明細書中でＭｙｄ１と称される新たに同定された真菌性の甘味タンパク質を提供する。本明細書中で、「Ｍｙｄポリペプチド」という用語は、例えば配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ甘味修飾活性も有する、本発明によるポリペプチドのいずれかを同定するために使用される。Ｍｙｄポリペプチドはまた、甘味修飾活性を有する配列番号８～配列番号１７のペプチドを包含する。Ｍ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓグレバの甘味があり部分的に精製された抽出物を、ｄｅ ｎｏｖｏアミノ酸配列決定に付して、２０－ｍｅｒのＮ末端配列（配列番号４）を同定した。Ｍｙｄ１コード配列（推定上、ＭＹＤ１遺伝子に由来する）は、Ｍ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｄｅｓグレバの全トランスクリプトームをＲＮＡｓｅｑリードを使用してｄｅ ｎｏｖｏアセンブルした後に同定した。２０－ｍｅｒのＮ末端配列を用いてＭ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｄｅｓの全トランスクリプトームをスクリーニングすることにより、Ｎ末端で１００％の同一性を有するタンパク質をコードすると予測される転写産物が同定された。同定された転写産物は、１２１アミノ酸のタンパク質をコードすると予測される。この方法により、配列番号１が同定された。転写産物中の開始コドンおよび終止コドンを同定して、配列番号２の推定コード配列を同定した。配列番号３は、１２１アミノ酸のタンパク質であると推定されるタンパク質である。予測タンパク質配列番号３とＧＥＮＢＡＮＫ中の他のタンパク質配列との間の同一性は３１％以下であった。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化された天然ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのコード配列はそれぞれ、配列番号２０および配列番号２２の核酸配列に対応する（これは、所望による６残基ヒスチジンタグを有する配列番号３のアミノ酸配列、すなわち配列番号２１のアミノ酸配列をコードする）。
[0040]一観点において、本明細書中の「Ｍｙｄポリペプチド」は、抽出によってＭ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｄｅｓグレバから単離された天然に存在するＭｙｄポリペプチドと比較して、少なくとも１０％以上（例えば、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の甘味修飾活性を有する。他の観点において、本明細書中の「Ｍｙｄポリペプチド」は、抽出によってＭ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｄｅｓグレバから単離された天然に存在するＭｙｄポリペプチドと比較して、少なくとも５０％以上の甘味修飾活性を有する。一観点において、本明細書中の「Ｍｙｄポリペプチド」は、抽出によってＭ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｄｅｓグレバから単離された天然に存在するＭｙｄポリペプチドと比較して少なくとも８０％以上の甘味修飾活性を有する。甘味修飾活性は、当技術分野で公知の任意の比較方法によって、とりわけ本明細書中の実施例に記載する任意の方法によって、より具体的には本明細書中に記載する官能パネルを用いる方法を使用して、測定することができる。
[0041]いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、Ｍｙｄ１は甘味活性化に関与すると考えられ、例えば、味覚１受容体メンバー２（Ｔ１Ｒ２）および／または味覚１受容体メンバー３（Ｔ１Ｒ３）のアゴニストである。しかしながら、Ｍｙｄ１は、苦味、うま味、酸味および塩味など他の味覚受容体をアゴナイズする可能性がある。単離または精製されたＭｙｄポリペプチドは、次いで、味をカスタマイズするために、例えば、食品または薬物の甘味を調節するために、食品および製薬産業において使用することができる。
[0042]第１の観点において、本発明は、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）であって、該ポリペプチド配列が、（ａ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７に示されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列；および（ｃ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７に示されるアミノ酸配列から、２４以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、およびこれらの任意の範囲）のアミノ酸の欠失、挿入、置換、または付加により修飾されたアミノ酸配列；からなる群より選択されるポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、前記ポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、甘味調節活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または２４以下のアミノ酸の欠失、挿入、置換、もしくは付加によって配列番号３のアミノ酸配列から修飾されたアミノ酸である。
[0043]特定の観点において、本発明は、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）であって、該ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列；（ｂ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；および（ｃ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列から、２４以下のアミノ酸の欠失、挿入、置換、または付加により修飾されたポリペプチド配列；からなる群より選択されるポリペプチドをコードし、該甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリペプチドが、配列番号３のポリペプチドではない、前記ポリヌクレオチドを提供する。
[0044]他の観点において、本発明は、ポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）であって、該ポリヌクレオチドが、（ａ）配列番号２に示され、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、およびこれらの値の任意の範囲）の修飾（例えば、欠失、挿入、置換、もしくは付加を含有していてもよい核酸配列を含む、ポリヌクレオチド；および（ｂ）配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドは、配列番号２のポリヌクレオチドではなくてもよい；からなる群より選択される、前記ポリヌクレオチドを包含する。一態様において、ポリヌクレオチドは、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする。一態様において、甘味調節活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列である。
[0045]一観点において、本発明は、ポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）であって、該ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号２に示され、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、およびこれらの値の任意の範囲）の置換修飾を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも９０％（少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドは、配列番号２のポリヌクレオチドではなくてもよい；ならびに（ｃ）（ｉ）配列番号２に示される核酸配列と、（ｉｉ）ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列とを含む、ポリヌクレオチド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該ポリヌクレオチドが、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
[0046]本発明のＭｙｄをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは人工核酸の形態にあることができ、または、イントロンを含まないｃＤＮＡもしくは化学合成ＤＮＡであることができる。
[0047]「核酸」または「核酸配列」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドをさす。この用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを包含する。この用語は合成骨格を有する核酸様構造も包含する（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ （１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｖｏｌ． ６００， Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．編集 （ＮＹＡＳ １９９２）； Ｍｉｌｌｉｇａｎ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３６：１９２３－１９３７ （１９９３）； Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （１９９３， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）， ＷＯ ９７／０３２１１； ＷＯ ９６／３９１５４； Ｍａｔａ， Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １４４：１８９－１９７ （１９９７）； Ｓｔｒａｕｓｓ－Ｓｏｕｋｕｐ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２－８６９８ （１９９７）； Ｓａｍｓｔａｇ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ， ６：１５３－１５６ （１９９６）参照）。
[0048]特記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示された配列も、非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、例えば、１以上の選択されたコドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９：５０８１ （１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６０：２６０５－２６０８ （１９８５）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ， ８：９１－９８ （１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
[0049]本発明はまた、Ｍｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびベクターで形質転換された宿主細胞を含む発現カセットも提供する。
[0050]他の観点において、本発明は、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）を提供し、ここで、該ポリペプチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、およびこれらの値の任意の範囲）の修飾（例えば、欠失、挿入、置換または付加）を含有していてもよく、該ポリペプチドは、ヒスチジンタグをさらに含んでいてもよく、該ポリペプチドは甘味調節活性を有する。「から本質的になる」という用語は、製品の機能または活性に必須ではなく、機能または活性に実質的に影響を及ぼさない成分、例えば、凝固防止剤、充填剤、安定剤（例えば、熱安定剤）、および増量剤（例えば、マルトデキストロース、アカシアゴムなど）の包含を可能にする。
[0051]ポリペプチドは、配列番号３または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号８または配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号９または配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１１または配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１３または配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１４または配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１６または配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号１７または配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。
[0052]一態様において、ポリペプチド配列は、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７からなる群より選択される。一態様において、ポリペプチドは配列番号３のポリペプチドではない。
[0053]一観点において、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含む。一観点において、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含むが、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドではない。
[0054]他の観点において、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基１～１２１を含み、ここで、該ポリペプチド配列のアミノ酸残基１２～１６、３３～３８、４１～４４、６８～７２または１０１～１０９には、列挙した残基における配列番号３と比較して、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれらの値の任意の範囲）のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失が存在する。他の観点において、ポリヌクレオチドによってコードされる甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３のアミノ酸残基１～１２１を含むポリペプチドであり、ここで、該ポリペプチド配列のアミノ酸残基１２～１６、３３～３８、４１～４４、６８～７２または１０１～１０９には、列挙した残基における配列番号３と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失が存在し、該ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する。
[0055]他の観点において、本発明は、異種シグナルペプチドまたは輸送ペプチドに融合している配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、甘味調節活性を有する組換えポリペプチドを包含する。「から本質的になる」という用語は、製品の機能または活性に必須ではなく、機能または活性に実質的に影響を及ぼさない成分、例えば、凝固防止剤、充填剤、安定剤（例えば、熱安定剤）、および増量剤（例えば、マルトデキストロース、アカシアゴムなど）の包含を可能にする。
[0056]他の観点において、本発明は、甘味調節活性を有し、配列番号３（または、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ酸を含むか、それから本質的にになるか、またはそれからなり、配列番号３（または、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７）に関して少なくとも１つの置換修飾を含有するポリペプチドを包含する。いくつかの観点おいて、本発明のポリぺプチドは、対応する配列番号３のアミノ酸と比較して１～２４のアミノ酸置換を位置２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、または１２１に含む。「から本質的になる」という用語は、製品の機能または活性に必須ではなく、機能または活性に実質的に影響を及ぼさない成分、例えば、凝固防止剤、充填剤、安定剤（例えば、熱安定剤）、および増量剤（例えば、マルトデキストロース、アカシアゴムなど）の包含を可能にする。
[0057]特定の観点において、ポリヌクレオチドによってコードされ、甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、または配列番号７５のアミノ酸配列を含む。
[0058]配列番号７１（コンセンサス配列１）は、位置３、１１～１６、２６、３３、３４、３６～３８、４１～４３、５１、５７、６６、６８～７２、８５、８６、８９、９７、１０１～１１０、１１７、および１２０が任意のアミノ酸である点を除き、配列番号３に対応する。本発明は、配列番号７１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
[0059]配列番号７２（コンセンサス配列２）は、位置３、１１～１６、２６、３３、３７、３８、４１、４３、５１、５７、６６、６８～７０、７２、８５、８６、８９、９７、１０１～１０３、１０５～１１０、１１７、および１２０が任意のアミノ酸である（すなわち、配列番号３の位置３４、３６、４２、７１、および１０４のプロリンは維持される）点を除き、配列番号３に対応する。本発明は、配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
[0060]配列番号７３（コンセンサス配列３）および配列番号７４（コンセンサス配列４）は、位置３、１１～１６、２６、３３、３７、３８、４１、４３、５１、５７、６６、６８～７０、７２、８５、８６、８９、９７、１０１～１０３、１０５～１１０、１１７、および１２０が、本明細書中に記載される保存的修飾を包含することができる点を除き、配列番号３に対応する。本発明は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明は、配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
[0061]配列番号７５（コンセンサス配列５）は、位置３、１１、２６、５１、５７、６６、６９、８５、８６、８９、９７、１０３、１０６、１１０、１１７、および１２０が、本明細書中に記載される保存的修飾を包含することができる点を除き、配列番号３に対応する。本発明は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
[0062]特定の観点において、甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３の残基３、１１、２６、５１、５７、６６、６９、８５、８６、８９、９７、１０３、１０６、１１０、１１７、および１２０に１以上の修飾（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６）を有する配列番号３を含む。配列番号３（ポリペプチドについて）に関する代表的な修飾を本明細書中に記載する（実施例８；表３参照）。例えば、甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６もしくは配列番号６８、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６もしくは配列番号６８に対して少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む 。
[0063]甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２４（Ｄ３Ｅ）または配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２６（Ｋ１１Ｒ）または配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３０（Ｋ２６Ｒ）または配列番号３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３８（Ｋ５１Ｒ）または配列番号３８に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号４２（Ｒ５７Ｋ）または配列番号４２に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号４４（Ｒ６６Ｋ）または配列番号４４に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号４６（Ｄ６９Ｅ）または配列番号４６に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５０（Ｄ８５Ｅ）または配列番号５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５２（Ｅ８６Ｄ）または配列番号５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５４（Ｅ８９Ｄ）または配列番号５４に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５８（Ｄ９７Ｅ）または配列番号５８に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６０（Ｋ１０３Ｒ）または配列番号６０に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６２（Ｒ１０６Ｋ）または配列番号６２に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６４（Ｒ１１０Ｋ）または配列番号６４に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６６（Ｅ１１７Ｄ）または配列番号６６に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６８（Ｋ１２０Ｒ）または配列番号６８に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。
[0064]他の観点において、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５もしくは配列番号６７、または配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５もしくは配列番号６７に対して少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する核酸配列を含む。
[0065]ポリヌクレオチドは、配列番号２３（Ｄ３Ｅに対応する）または配列番号２３に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号２５（Ｋ１１Ｒに対応する）または配列番号２５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号２９（Ｋ２６Ｒに対応する）または配列番号２９に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号３７（Ｋ５１Ｒに対応する）または配列番号３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号４１（Ｒ５７Ｋに対応する）または配列番号４１に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号４３（Ｒ６６Ｋに対応する）または配列番号４３に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号４５（Ｄ６９Ｅに対応する）または配列番号４５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号４９（Ｄ８５Ｅ）または配列番号４９に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号５１（Ｅ８６Ｄに対応する）または配列番号５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号５３（Ｅ８９Ｄに対応する）または配列番号５３に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号５７（Ｄ９７Ｅに対応する）または配列番号５７に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号５９（Ｋ１０３Ｒに対応する）または配列番号５９に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号６１（Ｒ１０６Ｋに対応する）または配列番号６１に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号６３（Ｒ１１０Ｋ）または配列番号６３に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号６５（Ｅ１１７Ｄ）または配列番号６５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号６７（Ｋ１２０Ｒ）または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。
[0066]一観点において、ポリヌクレオチドは配列番号２０を含み、これはＥ．ｃｏｌｉにおけるＨｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのコード配列に対応する（残基３６４～３８１が、所望によるＨｉｓタグ配列に対応する）。配列番号２０は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化されている。他の観点において、ポリヌクレオチドは配列番号２２を含み、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＨｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのコード配列に対応する（残基３６４～３８１が、所望によるＨｉｓタグ配列に対応する）。配列番号２２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化されている。配列番号２１の対応するポリペプチドは、Ｈｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎタンパク質（残基１２２～１２７が、所望によるＨｉｓタグ配列に対応する）に対応し、このポリペプチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現について同じである。したがって、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。
[0067]本発明はまた、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４８もしくは配列番号５６のアミノ酸配列、または配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４８もしくは配列番号５６に対して少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。
[0068]ポリペプチドは、配列番号２８（Ｒ２０Ｋ）または配列番号２８に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号３２（Ｅ３５Ｄ）または配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号３４（Ｋ４４Ｒ）または配列番号３４に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号３６（Ｄ４６Ｅ）または配列番号３６に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号４０（Ｄ５２Ｅ）または配列番号４０に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号４８（Ｒ７５Ｋ）または配列番号４８に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリペプチドは、配列番号５６（Ｄ９４Ｅ）または配列番号５６に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。
[0069]他の観点において、ポリヌクレオチドは、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４７もしくは配列番号５５、または配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４７もしくは配列番号５５に対して少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する核酸配列を含む。
[0070]ポリヌクレオチドは、配列番号２７（Ｒ２０Ｋに対応する）または配列番号２７に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号３１（Ｅ３５Ｄに対応する）または配列番号３１に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号３３（Ｋ４４Ｒに対応する）または配列番号３３に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号３５（Ｄ４６Ｅに対応する）または配列番号３５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号３９（Ｄ５２Ｅに対応する）または配列番号３９に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号４７（Ｒ７５Ｋに対応する）または配列番号４７に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ポリヌクレオチドは、配列番号５５（Ｄ９４Ｅに対応する）または配列番号５５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。
[0071]「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中では、アミノ酸残基のポリマーをさすために互換的に使用される。この用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然由来のアミノ酸の人工的化学模倣物である、アミノ酸ポリマー、ならびに、天然由来のアミノ酸ポリマーおよび非天然由来のアミノ酸ポリマーに適用される。
[0072]ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然由来または非天然由来（例えば、合成、組換え、修飾、および／またはバリアント生成物）であることができる。一観点において、天然由来または非天然由来の産物が単離または精製される。
[0073]一観点において、「単離された」という用語は、生物学的環境（例えば、細胞、組織、培養培地、体液など）から除去された、またはそわなければ任意の程度まで純度を増大させた（例えば、合成培地から単離された）生成物を包含する。したがって、単離された生成物は、合成することができ、または天然に生じることができる。
[0074]本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドをさす場合、「単離された」という用語は、天然由来のものとは異なる精製または濃度の状態をさす。（１）他の天然由来のものに関連する構造物または化合物からの精製、または（２）体内で通常関連していない構造物または化合物との関連を含む、天然由来のものよりも高い任意の程度の精製または濃度は、本明細書中で使用される「単離された」の意味の範囲内である。本明細書中に記載の核酸またはポリペプチドは、当業者に公知のさまざまな方法およびプロセスに従って、単離されるか、またはそわなければ天然では通常関連していない構造または化合物と関連付ることができる。一態様において、本明細書中に記載のポリペプチドは、他の真菌タンパク質を重量基準で最大５％（例えば、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％）含有する。
[0075]本明細書中で使用される場合、「組換え」は、インビトロで合成された、またはそわなければ操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞または他の生物学的系において遺伝子産物を産生するために組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質」）をさす。「組換え手段」はまた、本発明の転座ドメインおよび本発明のプライマーを用いて増幅された核酸配列を含む融合タンパク質の発現、例えば、誘導性または構成的発現のための発現カセットまたはベクターへの、異なる供給源由来のさまざまなコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸のライゲーションを包含する。
[0076]「修飾された」または「バリアント」生成物は、元の（例えば、天然由来の）構造から変更されている生成物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）をさす。本明細書中に記載されるように、バリアントは、それぞれ核酸またはアミノ酸配列に対し１以上の変化を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。変化としては、核酸またはアミノ酸配列に対する修飾、例えば、付加、欠失、挿入、および置換が挙げられる。修飾またはバリアント生成物はまた、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または元の構造に関する任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを、包含することができる。
[0077]本明細書で使用される場合、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に記載するように、組換えまたは天然に発現された核酸を生成または検出するための任意の適した増幅方法論の使用をさす。例えば、本発明は、本発明の天然に発現される（例えば、ゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡ）または組換え（例えば、ｃＤＮＡ）核酸（例えば、本発明の味覚刺激結合配列）を、インビボまたはインビトロで増幅する（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲによって）ための方法および試薬（例えば、特異的縮重オリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
[0078]「ライブラリー」という用語は、さまざまな核酸またはポリペプチド分子の混合物である調製物、例えば、縮重プライマー対による核酸の増幅によって生成された組換え的に生成されたＭｙｄ関連ポリヌクレオチドのライブラリー、または増幅されたリガンド結合ドメインを包含するベクターの単離されたコレクション、またはＭＹＤをコードする少なくとも１つのベクターでそれぞれランダムにトランスフェクトされた細胞の混合物を意味する。
[0079]本明細書中で使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１以上のタイプの化学結合を介して、通常は相補的塩基対合を介して、通常は水素結合形成を介して、相補的配列の標的核酸に結合することができる核酸として定義される。本明細書中で使用される場合、プローブは、天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７－デアザグアノシン、イノシンなど）を包含することができる。これに加えて、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の連結によって結び付けられていてもよい。したがって、例えば、プローブは、構成塩基がホスホジエステル連結ではなくペプチド結合によって結び付けられているペプチド核酸であってもよい。当業者なら、プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列に結合することができることを、理解するであろう。プローブは、所望により、同位体、発色団、ルミフォア(lumiphore)、色原体などで直接的に標識されるか、またはストレプトアビジン複合体が後で結合し得るビオチンなどで間接的に標識される。プローブの有無をアッセイすることによって、選択配列または部分配列(subsequence)の有無を検出することができる。
[0080]「異種の」という用語は、核酸の一部分に関して使用される場合、核酸が、天然において互いに同じ関係で見出されない２以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換技術により生成され、新しい機能性核酸、例えば、１つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、天然において互いに同じ関係で見出されない２以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
[0081]「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸配列のアレイとして定義される。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合のＴＡＴＡエレメントなど、転写の開始部位付近に必須の核酸配列を包含する。プロモーターはまた、所望により、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも包含する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発生的調節下で活性であるプロモーターである。「作動可能に連結される」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的連結をさし、該発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
[0082]「ＭＹＤファミリー」という用語は、（１）約２５アミノ酸、所望により５０～１００アミノ酸のウィンドウにわたって、配列番号３に対して少なくとも約３５～５０％のアミノ酸配列同一性、所望により約６０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、天然のアレル、変異体、アレルおよび種間相同体を含む多型バリアントをさすことができる。
[0083]「発現ベクター」または「発現カセット」という用語は、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞を含む任意の細胞において、本発明の核酸配列をインビトロまたはインビボで、構成的にまたは誘導的に発現させる目的のための、任意の組換え発現系をさす。この用語は、線状または環状発現系を包含する。この用語は、エピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現系を包含する。発現系は、自己複製する、または自己複製しない、すなわち、細胞における一過性発現のみを駆動する能力を有することができる。この用語は、組換え核酸の転写に必要な最小エレメントのみを含有する組換え発現「カセットを包含する。
[0084]「宿主細胞」とは、発現ベクターを含有し、発現ベクターの複製または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類もしくは哺乳類細胞などの真核細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ－２９３などの、例えば培養細胞、外植片、およびインビボ細胞であることができる。
[0085]一態様において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓおよびＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからなる群より選択される。
[0086]他の観点において、宿主細胞は、グラム陽性無芽胞菌、グラム陽性芽胞菌、グラム陰性菌、酵母、および原生生物／藻類からなる群より選択される。
[0087]グラム陽性無芽胞菌の非限定的な例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｅ、ｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｐｅｒｉａｌ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｎｉｓｈｉｚａｗａｅ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓが挙げられる。
[0088]グラム陽性芽胞菌の非限定的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、およびＰａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓが挙げられる。グラム陰性菌の非限定的な例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓが挙げられる。
[0089]酵母の非限定的な例としては、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉ、Ｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉ、Ｏｇａｔａｅａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、およびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉが挙げられる。
[0090]原生生物／藻類の非限定的な例としては、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、およびＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉｉが挙げられる。
[0091]本明細書中に記載されるＭｙｄタンパク質はまた、代表的な配列に実質的に対応する構造および活性を有する「類似体」または「保存的バリアント」および「模倣体」（「ペプチド模倣体」）も包含する。したがって、「保存的バリアント」または「類似体」または「模倣体」という用語は、本明細書中で定義されるように、変化（１以上）によりポリペプチド（保存的バリアント）の構造および／または活性が実質的に変更されないように、修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。これらには、アミノ酸配列の保存的に修飾されたバリエーション、すなわち、タンパク質活性にとって重要ではないそれらの残基のアミノ酸置換、付加もしくは欠失、または同様の特性（例えば、酸性、塩基性、正もしくは負に帯電している、極性もしくは非極性など）を有する残基でのアミノ酸の置換が含まれ、その結果、重要なアミノ酸の置換であっても、構造および／または活性は実質的に変更されない。
[0092]より詳細には、「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列をさす。遺伝暗号の縮重に起因して、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。
[0093]例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変更することなく、コドンを、記載される対応するコドンのいずれかに変更することができる。
[0094]このような核酸のバリエーションは「サイレントバリエーション」であり、これは、保存的に修飾されたバリエーションの１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列には、核酸のあらゆる可能なサイレントバリエーションも記載されている。当業者なら、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列に潜在する。
[0095]機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。例えば、保守的置換を選択するための１つの代表的ガイドラインは以下を包含する（もとの残基、続いて代表的置換）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ；ａｒｇ／ｌｙｓ；ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ；ａｓｐ／ｇｌｕ；ｃｙｓ／ｓｅｒ；ｇｌｎ／ａｓｎ；ｇｌｙ／ａｓｐ；ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ；ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ；ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ；ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ；ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ；ｓｅｒ／ｔｈｒ；ｔｈｒ／ｓｅｒ；ｔｒｐ／ｔｙｒ；ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕ。代替的な代表的ガイドラインでは、各々が互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する以下の６つの群を使用する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｉ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）；Ｓｃｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｒｌａｇ （１９７９）も参照されたい）。他の代替的な代表的ガイドラインでは、プロリンが独特である以下の６つの群を使用する：１）Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）；２）Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；３）Ｐｒｏ（Ｐ）；４）Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｙ（Ｗ）；５）Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）；および６）Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｎ）。当業者なら、上記の置換が唯一の可能な保存的置換ではないことを理解するであろう。例えば、いくつかの目的のために、すべての荷電アミノ酸は、それらが正であるか負であるかにかかわらず、互いの保存的置換と考えることができる。さらに、コードされた配列中の単一アミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加も、「保存的に修飾されたバリエーション」とみなすことができる。当業者なら、目的のタンパク質を発現している所与の宿主におけるコドン選択を熟知しているであろう。
[0096]「模倣体」および「ペプチド模倣体」という用語は、ポリペプチドの実質的に同じ構造的および／または機能的特徴、例えば、本発明の転座ドメイン、リガンド結合ドメイン、またはキメラ受容体を有する合成化合物をさす。模倣体は、アミノ酸の合成非天然類似体で完全に構成されていることができ、または部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子であってもよい。模倣体はまた、任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を、そのような置換が模倣体の構造および／または活性を実質的に変更しない限り、包含することもできる。
[0097]保存的バリアントである本発明のポリペプチドと同様に、日常の実験により、模倣体が本発明の範囲内にあるかどうか、すなわち、その構造および／または機能が実質的に変更されていないかどうかを決定する。ポリペプチド模倣組成物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含有することができ、該成分は、典型的には以下の３つの構造基に由来する：ａ）天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；ｂ）天然由来のアミノ酸残基の代わりの非天然残基；またはｃ）二次構造模倣を誘導する、すなわち、二次構造、例えば、βターン、γターン、βシート、αヘリックス立体配座などを誘導または安定化する残基。ポリペプチドは、その残基のすべてまたはいくつかが天然ペプチド結合以外の化学的手段によって結び付いている場合、模倣体として特徴付けることができる。個々のペプチド模倣残基は、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング手段、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などによって結び付いていることができる。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代替となり得る連結基としては、例えば、ケトメチレン（例えば、－－Ｃ（Ｏ）－－ＮＨ－－の代わりに－－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－－）、アミノメチレン（ＣＨ２－－ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２ －－Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ－－Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステル（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ ２６７－３５７， “Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ （１９８３）参照）が挙げられる。ポリペプチドはまた、天然由来のアミノ酸残基の代わりにすべてまたはいくつかの非天然残基を含有することによって模倣体として特徴付けることもでき；非天然残基は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。Ｐｈｙｒｅ２は、タンパク質の構造、機能および変異を予測および解析するたためにウェブ上で利用可能な一連のツールである。
[0098]タンパク質フォールディング分析は、タンパク質二次構造予測サーバーであるＰＨＹＲＥタンパク質相同性／類似Ｙ認識エンジンＶ２．０およびＪＰｒｅｄを含むツールを使用して実施される。これらのツールは、配列番号３が、かなりの部分がβ－シートで、少しの部分がα－ヘリックスである、β－シートが支配的な球状型タンパク質を予測することを示す。具体的には、Ｊｐｒｅｄツールが、推定上のβシートを配列番号３の残基約５～１１、１６～１９、２８～２９、３９～４０、６１～６７、７１～７７、および９８～１０１から予測し、α－ヘリックスを配列番号３の残基約２０～２５、４５～５５、１１１～１１９から予測し；ＰＨＹＲＥツールが、βシートを配列番号３の残基約５～１２、１７～３２、３８～４０、４５～５７、６２～６６、７３～８１、９８～１０４、および１１２～１１６から予測し、α－ヘリックスを配列番号３の残基約８４～８９および１１６～１１８から予測する。図１参照。
[0099]Ｍｙｄ１タンパク質構造の保存的に修飾されたバリエーションの例は、相同性モデリングアルゴリズム：ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ、ＰＨＹＲＥ２．０、およびＪｐｒｅｄを用いて、当技術分野で公知のような配列ベースのコンセンサスループ領域を同定することにより導くことができる。例えば、Ｐｅｃｈｍａｎｎ， Ｓ． ＆ Ｆｒｙｄｍａｎ， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０， ｅ１００３６７４ （２０１４）参照。
[00100]Ｍｙｄ１と同様の構造および機能を有すると推定される代替的なタンパク質配列は、本明細書において配列番号８～配列番号１７として提供される。配列番号８から配列番号１７を導出するために、コンセンサスループ領域を変位部位として選択した。これは、ほとんどの挿入および欠失が、通常、二次構造エレメント間の領域に見出されるためであり、ここで、それらはタンパク質の全体的な折り畳みにおいて大きな歪みを生じることなく、より容易に適応することができる。このタンパク質のコアは４ＪＯＸ内で見出されたように、より高度の配列保存を有する。
[00101]コンセンサスループ領域内の２９の考えうるアミノ酸の位置のうち、１２のアミノ酸を保存的置き換えを用いて置換した。変異について選択する場合、野生型アミノ酸は、保存的アミノ酸残基間で等確率を与えられた。（Ｇｌｙは、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇで等しく２０％の確率で置き換えられることができる）。
[00102]ＭＹＤ／Ｍｙｄヌクレオチドおよびアミノ酸配列の特定の領域を使用して、Ｍｙｄファミリーメンバーの多型バリアント、種間相同体、およびアレルを同定することができる。この同定は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはＰＣＲ（例えば、本明細書中で同定されたＭｙｄ配列をコードするプライマーを使用する）下で、または他のヌクレオチド配列と比較するためのコンピューターシステムにおいて配列情報を使用することによって、インビトロで行うことができる。単一種集団内のＭＹＤ遺伝子のさまざまなアレルはまた、アレル配列の差異が集団のメンバー間の味覚の差異と相関するかどうかを決定するのに有用である。古典的なＰＣＲ型増幅およびクローニング技術は、例えば、縮重プライマーが種の全体にわたり関連遺伝子を検出するのに十分である場合、オルソログを単離するのに有用である。
[00103]例えば、本明細書中に開示される配列を使用して設計されたプライマーを用いて、異なる真菌ゲノム由来のＭＹＤ関連遺伝子を増幅およびクローニングすることができる。対照的に、ＭＹＤに関連する単一種内の遺伝子は、関連する配列を探すために配列パターン認識ソフトウェアを使用してもっとも良好に同定される。典型的には、ＭＹＤファミリーメンバーの多型バリアントおよびアレルの同定は、約２５アミノ酸以上、例えば、５０～１００アミノ酸のアミノ酸配列を比較することによって行うことができる。だいたい少なくとも３５～５０％、および所望によりで６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５～９９％以上のアミノ酸同一性は、典型的にはタンパク質がＭＹＤファミリーメンバーの多型バリアント、種間相同体、またはアレルであることを明示する。配列比較は、以下で論じる配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。Ｍｙｄポリペプチドまたはその保存領域に特異的に結合する抗体を使用して、アレル、種間相同体、および多型バリアントを同定することもできる。
[00104]ＭＹＤファミリーメンバーについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報はまた、コンピューターシステムにおける甘味調節ポリペプチドのモデル、ならびにそれらが甘味受容体およびそのコンピューターシステムモデルとどのように相互作用するかを構築するために使用することができる。甘味受容体は、味覚１受容体メンバー２（Ｔ１Ｒ２）および味覚１受容体メンバー３（Ｔ１Ｒ３）のヘテロダイマーから構成される。続いて、これらのモデルは、甘味受容体の活性化を増加させることができるＭｙｄのバリアントおよび変異を同定し、Ｍｙｄのより活性なバージョンを同定するために使用することができる。
[00105]さまざまな保存的変異および置換が本発明の範囲内であると想定される。例えば、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的変異誘発、宿主細胞のトランスフェクション、およびインビトロ転写を含む組換え遺伝子技術の公知のプロトコルを用いてアミノ酸置換を行うことは、当業者のレベルの範囲内であろう。次いで、バリアントを味覚受容体アゴニスト機能活性についてスクリーニングすることができる。
[00106]一態様において、Ｍｙｄｓ融合タンパク質をコードする核酸を含むハイブリッドタンパク質コード配列を構築することができる。これらの核酸配列は、転写または翻訳制御エレメント、例えば、転写および翻訳開始配列、プロモーターおよびエンハンサー、転写および翻訳ターミネーター、ポリアデニル化配列、ならびにＤＮＡをＲＮＡに転写するのに有用な他の配列に、作動可能に連結することができる。融合タンパク質は、Ｃ末端またはＮ末端転座配列を包含していてもよい。さらに、融合タンパク質は、例えば、タンパク質検出、精製、または他の用途のための追加的エレメントを含むことができる。検出および精製を容易にするドメインとしては、例えば、金属キレートペプチド、例えば、ポリヒスチジントラクト、ヒスチジン－トリプトファンモジュール、または固定化された金属上での精製を可能にする他のドメイン；マルトース結合タンパク質；固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン；またはＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈ．）において利用されるドメインが挙げられる。
[00107]一態様において、融合タンパク質は、ペプチドまたはタンパク質タグ（例えば、タンパク質の精製または検出のためのもの）を含む。ペプチド／タンパク質タグは、Ｊｏｈｎｓｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔａｇｓ，”ＤＯＩ／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３０７０／ｍｍ．ｅｎ．２．１１６に記載されているものように当業者には公知であり、例えば、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃエピトープ、ポリヒスチジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＡ、Ｖ５、ＡＢＤｚ１－タグ、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ－タグ）、ＢＣ２－タグ、カルモジュリン結合ペプチド、ＣｕｓＦ、Ｆｃ、Ｆｈ８、Ｈａｌｏタグ、ヘパリン結合ペプチド（ＨＢ－タグ）、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、ＰＡ（ＮＺ－１）、ポリ－Ａｒｇ、ポリ－Ｌｙｓ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ／ストレプトアビジン結合ペプチド、ＳＮＡＰ、Ｓｔｒｅｐ－ＩＩ（Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ）、およびＳＵＭＯ／ＳＵＭＯ２である。
[00108]アフィニティータグは、タンパク質に付けられるタンパク質タグの一種であり、これにより、タンパク質を、それらの粗生物学的供給源からアフィニティー技術を用いて精製することができる。アフィニティータグは当技術分野で公知であり、例えば、Ｋｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．； ７３： Ｕｎｉｔ-９．９． ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４０８６４．ｐｓ０９０９ｓ７３に記載されている。これらには、ポリヒスチジン、ＧＳＴ、ＭＢＰ、カルモジュリン結合ペプチド、インテイン－キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン／ビオチンに基づくタグ、およびＨｉｓ－Ｐａｔｃｈ ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ（チオレドキシン）が包含される。アフィニティータグは、小さい（例えば、２０以下のアミノ酸残基）または大きいアフィニティータグを包含する。小さいアフィニティータグの例としては、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ、およびＳ－ペプチドが挙げられ、大きいアフィニティータグの例としては、ＭＢＰ、ＧＳＴ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、およびＨｉｓ－パッチチオレドキシンが挙げられる。
[00109]アフィニティータグには、エピトープタグおよびレポータータグが含まれる。レポータータグは、タンパク質発現およびタンパク質－タンパク質相互作用のレポーターとして働く。レポータータグとしては、限定されるものではないが、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素が挙げられる。
[00110]エピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｃ－ｍｙｃ、Ｔ７、およびＧｌｕ－Ｇｌｕが挙げられ、これらはインビトロおよび細胞培養における融合タンパク質の検出に使用される。それらの短い線状認識モチーフは目的のタンパク質の特性にほとんど影響を及ぼさず、通常、それら各々の一次抗体に非常に特異的である。抗ｍｙｃ抗体を使用する場合、特異性は、ＨＲＰ－またはＡＰ－抗ｍｙｃコンジュゲートを単独で使用する代わりに、コンジュゲートされた抗ｍｙｃ一次抗体を検出するために酵素連結二次抗体を使用することによって、増大させることができる。
[00111]タグは、標的タンパク質のいずれかの末端に存在することができる。ＦＬＡＧなどいくつかのエピトープタグは、しばしば、それらの望ましい特徴を増大させるためにタンデムで、またはＨｉｓ－ＭｙｃおよびＨｉｓ－Ｖ５の構築物のように別のタグと組み合わせて使用される。
[00112]タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）は、２つのアフィニティータグと目的のタンパク質との融合に基づく二重アフィニティー精製法であり、タグ付きタンパク質の精製および目的のタンパク質と相互作用するタンパク質複合体の単離が可能になる。ＴＡＰの使用は、本発明内に包含される。
[00113]一態様において、融合タンパク質は、２～１０個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグを含む。例えば、ヒスチジンタグは、６個のヒスチジン残基を含むことができる。
[00114]第Ｘａ因子（例えば、Ｏｔｔａｖｉ， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８０：２８９－２９３ （１９９８）参照）、サブチリジンプロテアーゼ認識モチーフ（例えば、Ｐｏｌｙａｋ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０：６１５－６１９ （１９９７）参照）；エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）などの切断可能なリンカー配列を、転座ドメイン（効率的な原形質膜発現のため）と新たに翻訳されたポリペプチドの残りとの間に含めることは、精製を容易にするのに有益であることができる。例えば、１つの構築物は６つのヒスチジン残基に連結された核酸配列、続いてチオレドキシン、エンテロキナーゼ切断部位（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１７８７－１７９７ （１９９５）参照）、およびＣ末端転座ドメインをコードするポリペプチドを包含することができる。ヒスチジン残基は検出および精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質の残りから望ましいタンパク質（１以上）を精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の適用に関する技術は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Ｋｒｏｌｌ， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１２：４４１－５３（１９９３）参照。
[00115]融合タンパク質は、１以上のリンカー（例えば、柔軟性(flexible)リンカー、剛性(rigid)リンカー、およびインビボで切断可能なリンカー）を含有することができる。機能ドメインを一緒に連結する（柔軟性および剛性リンカーなどの場合）か、または遊離機能ドメインをインビボで放出する（インビボで切断可能なリンカーなどの場合）際の基本的な役割に加えて、リンカーは融合タンパク質の生産のための多くの他の利点、例えば、生物学的活性の改善、発現収量の増加、および望ましい薬物動態プロファイルの達成を提供する。リンカーは当技術分野で公知である（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ６５（１０）： １３５７－１３６９ （２０１３）参照）。
[00116]柔軟性リンカーは、結び付けられたドメインがある程度の動きまたは相互作用を必要とする場合に使用される。それらは、一般に、小さな非極性（例えば、Ｇｌｙ）または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）アミノ酸から構成される。これらのアミノ酸のサイズが小さいことにより、柔軟性もたらされ、連結する機能ドメインの可動性が可能になる。ＳｅｒまたはＴｈｒを組み込みは、水分子と水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの安定性を維持することができ、したがって、リンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用が低減する。
[00117]もっとも一般的に使用される柔軟性リンカーは、主に一続きのＧｌｙおよびＳｅｒ残基（「ＧＳ」リンカー）からなる配列を有する。もっとも広く使用されている柔軟性リンカーの例は、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６９）の配列を有する。コピー数「ｎ」を調整することによって、このＧＳリンカーの長さを最適化して、機能ドメインの適切な分離を達成するか、または必要なドメイン間相互作用を維持することができる。ＧＳリンカーの他に、多くの他の柔軟性リンカーが組換え融合タンパク質のために設計されてきた。これらの柔軟性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなどの小さいまたは極性アミノ酸に富むが、柔軟性を維持するためにＴｈｒおよびＡｌａなどの追加的アミノ酸、ならびに溶解度を改善するためにＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を含有することができる。
[00118]剛性リンカーはドメイン間の固定距離を保ち、それらの独立した機能を維持する。剛性リンカーの例としては、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号７０）の配列を有するαヘリックス形成リンカー、およびＰｒｏに富む配列を有するリンカー、（ＸＰ）ｎ［式中、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、ＬｙｓまたはＧｌｕを意味する］が挙げられる。
[00119]本発明のポリペプチドはまた、シグナルペプチド（すなわち、シグナル配列、標的シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチド）を含有することができ、これは、分泌経路に向かうほとんどの新しく合成されたタンパク質のＮ末端または時折Ｃ末端に存在する短いペプチドである。これらのタンパク質には、特定の細胞小器官（小胞体、ゴルジ体またはエンドソーム）の内部に存在するもの、細胞から分泌されるもの、またはほとんどの細胞膜に挿入されるものが含まれる。代表的なシグナルペプチドは当技術分野で公知であり、当業者なら、本発明で使用するための特定のシグナルペプチドを選択する方法を認識するであろう。
[00120]本明細書中で使用される場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性をさす。
[00121]本明細書中で使用される場合、「１以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換、または付加によって修飾されたアミノ酸配列」の例は、１以上～３０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはこれらの任意の範囲）の欠失、挿入、置換、または付加によって修飾されたアミノ酸配列を包含する。本明細書中で使用される場合、「１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、置換、または付加によって修飾されたヌクレオチド配列」の例は、１以上～９０以下、好ましくは６０以下、好ましくは３０以下、さらに好ましくは１５以下、さらにより好ましくは１０以下のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、またはこれらの任意の範囲）の欠失、挿入、置換、または付加によって修飾された核酸配列を包含する。
[00122]例えば、配列比較においては、典型的には１つの配列が参照配列としての役割を果たし、これと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムについて以下に記載するようなデフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
[00123]本明細書中で使用される「比較ウィンドウ」は、２０～６００、通常約５０～約２００、さらに通常は約１００～約１５０からなる群より選択される番号の連続する位置のうちのいずれか１つのセグメントに対する関連を包含し、２つの配列を最適にアラインメントした後、配列を同じ番号の連続する位置の参照配列と比較することができる。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）の類似性法の検索によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によるか、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編集，１９９５ 補遺）参照）により行うことができる。
[00124]配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ａｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２ （１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０ （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときに、マッチするか、またはいくつかの正値の閾値スコアＴを満たすかいずれかの問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは近隣ワードスコア閾値とよばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２ （１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０（１９９０））。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。そのワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大しうる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（マッチ残基対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１以上の負のスコアリング残基アラインメントの累積により、累積スコアが０以下に進んだ場合；または、いずれかの配列の末端に達した場合、各方向におけるワードヒットの拡張は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９）参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。
[00125]有用なアルゴリズムの他の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性および配列同一性パーセントを示すために、プログレッシブ、ペアワイズアラインメントを使用して、関連配列の群から多重配列アラインメントを作製する。それはまた、アラインメントを作製するために使用されるクラスタリング関係性を示す、いわゆる「ツリー」または「デンドグラム(dendogram)」をプロットする（例えば、図２参照）。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０（１９８７）のプログレッシブアラインメント法の簡略化したものを用いる。使用方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３ （１９８９）によって記載された方法と同様である。このプログラムは、それぞれ最大長５０００ヌクレオチドまたはアミノ酸の３００配列までアラインメントすることができる。多重アラインメント手順は、２つのもっとも類似する配列のペアワイズアラインメントから始まり、２つのアラインメントされた配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターは、次にもっとも関連する配列またはアラインメントされた配列のクラスターに対してアラインメントされる。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列のペアワイズアラインメントの単純な拡張によってアラインメントされる。最終的なアライメントは、一連のプログレッシブ、ペアワイズアライメントによって達成される。本プログラムは、配列比較の領域に関する特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定し、プログラムパラメーターを指定することによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用し、以下のパラメーター：デフォルトギャップ重み(gap weight)（３．００）、デフォルトギャップ長さ重み(length weight)（０．１０）、および重み付き末端ギャップを使用して、参照配列を他の試験配列と比較して配列同一性パーセント関係を決定する。ＰＩＬＥＵＰはＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージから得ることができ、例えば、遺伝子によってコードされるバージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７－３９５ （１９８４）は、対応するオープンリーディングフレームの概念翻訳によって導き出された。
[00126]本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学的に、またはＭｙｄのアミノ酸配列に基づく遺伝子工学によって、合成することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドまたはそのプレタンパク質のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸の委託合成サービス（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔなどから提供される）を用いることができる。また、合成されたポリヌクレオチドは、ＰＣＲおよびクローニングなどにより増幅することができる。
[00127]本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることにより生成することができる。好ましくは、本発明のＭｙｄポリペプチドは、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体から生成することができる。例えば、本発明のＭｙｄポリペプチドは、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得、該形質転換体を適切な培地中で培養した後、形質転換体に導入された本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから生成される。本発明のタンパク質は、生成したＭｙｄポリペプチドを培養物から単離または精製することによって得ることができる。
[00128]したがって、本発明はさらに、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれを含むベクターを提供する。本発明はさらに、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含むベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。本発明はさらに、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体、または細胞の外部から導入されたそれを含むベクターを提供する。本発明はさらに、該形質転換体を培養することを含む、本発明のＭｙｄポリペプチドの製造方法を提供する。
[00129]本発明はまた、異種調節エレメントに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを包含する。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットまたはベクター、および本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を包含することができる。
[00130]あるいは、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、紫外線照射および部位特異的変異誘発など公知の変異誘発方法での手順に従って合成されたポリヌクレオチドに変異を導入することによって、生成することができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチドに公知の方法で変異を導入し、得られたポリヌクレオチドを発現させ、発現されたタンパク質の甘味修飾活性を調べ、望ましい甘味修飾活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択することにより、得ることができる。
[00131]ポリヌクレオチドの部位特異的変異誘発は、例えば、インバースＰＣＲおよびアニーリング（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．編集， “Ｒｅｖｉｓｅｄ ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｎｅｗ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ”， ＹＯＤＯＳＨＡ， ｐ．８２－８８）などの任意の方法で行うことができる。部位特異的変異誘発のためのさまざまな市販のキット、例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＫｉｔおよびＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを、必要に応じて使用することができる。
[00132]本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのタイプの例としては、特に限定されないが、遺伝子クローニングに通常用いられるベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣおよびＢＡＣが挙げられる。ベクターの例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびウイルスベクター、例えば、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、シンドビスウイルス、植物ウイルス（例えば、ＡｌｐｈａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅまたはＰｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、および昆虫ウイルス（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）が挙げられる。
[00133]これらの中でも、プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２など（いずれもＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ．製）を用いることができる。
[00134]ベクターは、複製開始領域またはＤＮＡの複製起点を含むＤＮＡ領域を含むことができる。あるいは、調節配列、例えば、遺伝子の転写を開始するためのプロモーター領域、ターミネーター領域、または発現したタンパク質を細胞外に分泌するための分泌シグナル領域を、ベクター中の本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のＭＹＤ遺伝子）の上流に、作動可能に連結することができる。本明細書中で用いられる場合、遺伝子および調節配列が「作動可能に連結される(operably liked)」とは、遺伝子および調節領域が、遺伝子が調節領域による調節下で発現され得るように位置する状態をさす。
[00135]プロモーター領域、ターミネーター、および分泌シグナル領域などの調節配列のタイプは特に限定されず、通常用いられるプロモーターおよび分泌シグナル配列は、その配列が導入される宿主に応じて適宜選択して用いることができる。例えば、本発明のベクターに組み込むことができる調節配列の好ましい例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のｃｂｈ１プロモーター配列が挙げられる（Ｃｕｒｒ， Ｇｅｎｅｔ， １９９５， ２８ （１）： ７１－７９）。
[00136]あるいは、ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシンおよびクロラムフェニコールなどの薬剤に対する耐性遺伝子）を、本発明のベクターにさらに組み込むことができる。あるいは、栄養要求性株が宿主として使用される場合、必要な栄養素のシンターゼをコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込むことができる。あるいは、増殖のために特異的代謝を必要とする選択培地が使用される場合、代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込むことができる。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として用いるためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
[00137]本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、調節配列およびマーカー遺伝子とのライゲーションは、当技術分野で公知の方法、例えば、ＳＯＥ（重複伸長によるスプライシング）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ， １９８９， ７７： ６１－６８）により行うことができる。ライゲーションされた断片をベクターに導入するための手順は、当技術分野で公知である。
[00138]ベクターが導入される形質転換体の宿主の例としては、細菌および糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ならびに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｉｓｔｅｒｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓに属する細菌が挙げられ、これらのうち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはその変異体）が好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ変異体の例としては、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ２００７， １０４ （２）： １３５－１４３に記載されているプロテアーゼ９二重欠損株ＫＡ８ＡＸ、およびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ２０１１， ３３ （９）： １８４７－１８５２に記載されているプロテアーゼ８二重欠損株由来の変異体であるＤＢＰＡ株が挙げることができ、そのタンパク質フォールディング効率は改善されている。糸状菌の例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓが挙げられる。また、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓは、適した発現宿主である。さらに他の観点において、本発明は、細胞における発現に適合する制御エレメントに作動可能に連結された本明細書中に記載の１以上の発現カセットを含む宿主細胞を包含する。細胞は、例えば、哺乳類細胞（例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ－７、またはＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｎ５）またはＳｆ９）、細菌細胞、植物細胞、または酵母細胞であることができる。
[00139]Ｍｙｄをコードする発現カセットからの組換え発現ポリペプチドは、典型的には溶解細胞または培養培地から単離される。精製は、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分画、およびアフィニティークロマトグラフィーを含む当技術分野で公知の方法によって行うことができる。免疫アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、Ｇａｇ抗原に基づいて生じさせた抗体を使用して用いることができる。
[00140]本発明は、甘味調節活性を有するポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）ポリペプチドを含む組成物を得て、（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）とそれに続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して組成物を精製することを含む、前記方法を提供する。一観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の観点において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し；ここで、（ａ）該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換修飾を含有し、該ポリペプチドは配列番号３のポリペプチドではなく、またはｂ）該ポリペプチドは、ヒスチジンタグをさらに含み、該ポリペプチドは甘味調節活性を有する。
[00141]当業者は、適切なカラム、緩衝液、および溶離溶液の選択を含め、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の精製技術に精通している。代表的なＨＩＣおよびＳＥＣ精製技術は、本明細書の実施例１１に記載されている。代表的な観点において、ＨＩＣおよびＳＥＣによる精製後のポリペプチドの精製は、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはその値の任意の範囲である。
[00142]本発明はまた、本明細書中に記載の本発明の異種ポリヌクレオチドおよび／または異種ポリペプチドを含むトランスジェニック植物を企図する。植物は、異種核酸配列の発現により変更された表現型を有する。変更された表現型は、果実を含む任意の植物部分において増大した甘味を有する表現型を包含することができる。トランスジェニック植物は、植物の一部として本明細書中で定義される発現カセットを含有することができ、このカセットは植物を本発明のベクターで形質転換することによって導入されている。そのような発現カセットは、植物発現性(plant-expressible)プロモーターおよびターミネーターを含む、植物における異種コード配列の発現のための調節配列を包含する。トランスジェニック植物は、本明細書中に記載の異種核酸配列を発現することができる任意のタイプの植物であることができる。「植物」という用語は、全植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子および植物細胞およびそれらの子孫を包含する。本発明の方法で使用することができる植物のクラスは、一般に、単子葉(monocotyledonous)植物（単子葉植物(monocot)）および双子葉(dicotyledonous)植物（双子葉植物(dicot)）の両方を含む、形質転換技術に適した高等植物のクラスと同じくらい幅広い。それは、倍数体、二倍体および一倍体を含む、さまざまな倍数性レベルの植物を包含する。例えば、トランスジェニック植物は、リンゴまたはイチゴであることができる。
[00143]多種多様な植物種を形質転換するための技術は当技術分野で周知であり、技術文献および科学文献に記載されている。例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２：４２１－４７７およびＪｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５） “Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， （Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，編集） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｌｏｎｄｏｎ，９章，２９７－３４４頁参照。植物プロトプラストを含む植物細胞または植物組織の形質転換のための当技術分野で公知の任意の方法を、植物形質転換のために使用することができる。植物形質転換のための特定の方法としては、とりわけ、ボリスティック(bolistic)法（遺伝子銃）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が挙げられる。アグロバクテリウム媒介形質転換は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたは他のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株において複製するバイナリーベクターを用いることができる。さまざまなそのようなバイナリーベクターが当技術分野で公知であり、異種ポリヌクレオチドを植物細胞および植物組織に導入するために使用することができる。植物細胞および植物組織における、植物発現性プロモーター配列および他の植物調節配列を含む、異種コード配列の発現のための調節配列を含む植物発現ベクターは当技術分野で公知であり、本明細書に記載のポリペプチドを発現するように植物を形質転換するために使用することができる。
[00144]さまざまな植物発現性プロモーターが当技術分野で公知であり、甘味調節活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する本明細書中の異種構築物、ベクターおよび形質転換植物材料における使用に利用可能である。植物発現性プロモーターは、天然の植物源、植物ウイルス源、および植物発現性であるプロモーターを有する細菌、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株から誘導することができる。植物発現性プロモーターとしては、とりわけ、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ ３５Ｓ）、オクトピンおよびノパリンシンターゼプロモーター（例えば、ｎｏｓプロモーター）、植物ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ）、イネアクチンプロモーター（Ａｃｔ－１）、およびトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ－１）が挙げられる。植物発現性プロモーターには、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、発生段階特異的プロモーターが含まれ、各タイプのプロモーターの例は当技術分野で公知である。組織特異的プロモーターとしては、とりわけ、植物の根、植物の葉、果実、花、花粉、または活性光合成に関与する細胞における発現を指示するもの（例えば、ホスホエノールピルビン酸塩プロモーター（ＰＥＰ））が挙げられる。発生段階特異的プロモーターとしては、果実熟成、開花または結実中に発現を指示するものが挙げられる。合成植物プロモーターも当技術分野で公知であり、異種構築物、ベクターおよび形質転換植物材料において有用である（例えば、Ａｌｉ Ｓ． ＆ Ｋｉｍ Ｗ－Ｃ（２０１９）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １０，記事１４３３参照）。
[00145]形質転換されたプロトプラスト、植物細胞、カルス、または他の植物組織からの植物の再生技術は当技術分野で周知であり、そのような形質転換された植物材料から全植物および植物部分を再生するために使用することができる。再生方法としては、器官形成および胚形成が挙げられる。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｖｏｌｕｍｅ １： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ （１９８３） Ｄ．Ａ．Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．編集， Ｍａｃｍｉｌｌａｎ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ｒ．Ｈ． Ｓｍｉｔｈ， Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，第３版（２０１２） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ｍ．Ｒ． Ｄａｖｅｙ ＆ Ｐ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１０） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），詳細には第３章および第９章参照。
[00146]宿主にベクターを導入する方法としては、プロトプラスト法およびエレクトロポレーションなどの分野で通常用いられる方法を使用することができる。目的の形質転換体は、マーカー遺伝子および／または栄養要求性の発現などの指標を用いて、ベクターが適切に導入された株を選択することにより得ることができる。
[00147]あるいは、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、調節配列およびマーカー遺伝子がライゲーションされている断片を、宿主のゲノムに直接導入することができる。例えば、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ライゲーションされた断片の両端で宿主のゲノムに対し相補的な配列が付加されたＤＮＡ断片を構築し、その断片を宿主に導入し、ＳＯＥ－ＰＣＲによって宿主ゲノムとＤＮＡ断片との間の相同組換えを誘導することによって、宿主のゲノムに導入される。
[00148]このようにして得られた、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含むベクターが導入されている形質転換体を、適切な培地に導入して培養すると、ベクター上でのＭＹＤ ｃＤＮＡの発現と、続いて本発明のＭｙｄポリペプチドの産生がもたらされる。このような形質転換体の培養に用いられる培地は、当業者であれば、このような形質転換体の微生物のタイプに応じて適宜選択することができる。
[00149]あるいは、本発明のＭｙｄポリペプチドは、無細胞翻訳系を用いて、本発明のＭｙｄポリペプチドまたはその転写産物をコードするポリヌクレオチドから発現させることができる。「無細胞翻訳系」は、宿主となる細胞を機械的に破壊することにより得られる懸濁液に、タンパク質の翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を添加することにより構築される、インビトロ転写－翻訳系またはインビトロ翻訳系をさす。
[00150]培養または無細胞翻訳系で産生された本発明のＭｙｄポリペプチドは、タンパク質の精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーなどを、単独または適宜組み合わせて用いることにより、単離または精製することができる。ここで、本発明のＭｙｄポリペプチドをコードする遺伝子および分泌シグナル配列が、形質転換体内のベクター上で作動可能に連結されている(operably liked)場合、Ｍｙｄポリペプチドは細胞外に分泌されるため、産生されたＭｙｄポリペプチドを培養物からより容易に収集することができる。培養物から収集されたＭｙｄポリペプチドは、公知の手段を用いてさらに精製することができる。
[00151]本発明はまた、甘味調節活性を有するタンパク質を生産する方法であって、公知の甘味香味料または甘味化合物と同様の甘味調節活性を有するタンパク質の生成をもたらす条件下で、本発明の宿主細胞を培地中で培養することを含む方法も包含する。
[00152]本明細書で使用される場合、「甘味香味料」、「甘味化合物」または「甘味受容体活性化化合物」は、被験体において検出可能な甘味香味を生じさせる組成物、例えば、スクロース、フルクトース、グルコース、および他の公知の天然糖質ベースの甘味料、または本明細書中でさらに考察されるようなサッカリン、チクロ、アスパルテームなどの公知の人工甘味料、またはインビトロでＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体を活性化する材料をさす。被験体は、ヒトまたは動物であることができる。
[00153]甘味香味料または甘味料組成物は、経口投与用の製品中に存在する場合、被験体において甘味を誘発するのに十分な本発明の甘味料組成物の量をさす、有効量で使用することができる。
[00154]一態様において、本発明の甘味タンパク質は、甘味調節活性を有することができる。本発明のＭｙｄポリペプチドは、例えば、甘味受容体などの味覚受容体において機能的、物理的および化学的効果を有することができる。「甘味調節活性」は、味覚変換に関するインビトロおよびインビボアッセイを使用して同定される、本発明のポリペプチドの阻害、活性化、例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト特性をさすことができる。阻害活性を有するタンパク質が結合すると、部分的もしくは全体的な刺激の遮断、活性化の低減、防止、遅延、味覚変換の不活性化、脱感作またはダウンレギュレーションをもたらすことができる（例えば、アンタゴニスト）。活性化ポリペプチドが結合すると、活性化の刺激、増大、開放、活性化、促進、増強、味覚変換の感作またはアップレギュレーションをもたらすことができ、例えばアゴニストである。活性化ポリペプチドが好ましい。
[00155]甘味調節はまた、組み合わせとして投与される場合、経口投与のための特定の製品の甘味などの味を増強することをさす。
[00156]甘味調節活性は、当技術分野で公知の方法、例えば、インビトロ方法によって、または動物もしくはヒトの官能検査によってインビボで、検出することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、Ｍｙｄは甘味活性化に関与し、例えば、味覚１受容体メンバー２（Ｔ１Ｒ２）および／または味覚１受容体メンバー３（Ｔ１Ｒ３）のアゴニストである。しかしながら、Ｍｙｄは、苦味、うま味、酸味および塩味など他の味覚受容体をアゴナイズする。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段、例えば、分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（例えば、形状）、クロマトグラフ的、または溶解度特性、パッチクランプ法、膜電位感受性色素(voltage-sensitive dyes)、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導性マーカー、Ｔ１Ｒ遺伝子の転写活性化における変化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンス変化；イオン束アッセイ；ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、およびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）などの細胞内セカンドメッセンジャーにおける変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質放出などを介して、味覚受容体Ｔ１Ｒへの結合を測定することにより、測定することができる。
[00157]官能検査（ヒトまたは動物）を用いて、Ｍｙｄ候補ポリペプチドが甘味調節活性を有するかどうかを決定することもできる。官能評価は、外観、触感、匂い、食感、温度および味など、食品および飲料の組成物に対するヒトの応答を分析および測定する科学的分野である。計器として人を用いる測定が、場合によっては必要である。甘味を決定するための適切な方法の選択は、当業者によって決定されることができ、例えば、２つの製品が知覚的に異なる可能性を測定するように設計された弁別試験または差分試験(difference test)を包含する。評価者からの応答を正確性について記録し、統計的に解析して、偶然のみに起因して予想されるよりも正確であるかどうかを確かめる。
[00158]官能評価は、外観、触感、匂い、食感、温度および味など、食品および飲料の組成物に対するヒトの応答を分析および測定する科学的分野である。計器として人を用いる測定が、場合によっては必要である。香味および食感の官能特性は、機器によって容易に測定することができない明らかな属性であるので、食品産業はこの測定ツールを開発することが最初に必要であった。感覚刺激的性質、例えば、本発明で開示されるタンパク質の甘味を決定するための適切な方法の選択は、当業者によって決定されることができ、例えば、２つの製品が知覚的に異なる可能性を測定するように設計された弁別試験または差分試験を包含する。甘味知覚については、例えば、５％スクロース、６％スクロース、７％スクロース、８％スクロース、９％スクロース、１０％スクロースのうちの１以上の試料、および試験試料を、訓練されたパネリストが、低い甘味から高い甘味までの甘味強度の順にランク付けすることができる。本発明では、当業者が感覚の違いを測定することができる方法がいくつもあることを理解されたい。
[00159]Ｂｒｉｘ測定（またはＢｒｉｘスケール）は食品および飲料産業において周知の適用であり、水中の純粋なスクロース含有量を決定する：１度のブリックス（°Ｂｘ）＝スクロース１ｇ／溶液１００ｇであり、質量パーセントとして溶液の強度を表す。８°Ｂｘは、約８％の糖溶液と同等である。実施例に記載するように、配列番号２１に対応する精製ポリペプチドを、訓練された感覚科学者が０．０３ｍｇ／ｍＬで味付けし（０．２ｍＬアリコート）、８°Ｂｘ（約８％糖溶液）と同等の甘味を有することが見出された（実施例４、５、９、および１０参照）。
[00160]いくつかの態様において、本発明のＭｙｄポリペプチドは、上記または当技術分野で公知の方法のいずれかによって測定して、少なくとも糖と同程度に甘いか（重量／重量ベースで）（例えば、１Ｘ）、あるいは、糖よりも２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、５０Ｘ、１００Ｘ、２００Ｘ、４００Ｘ、６００Ｘ、８００Ｘ、１０００Ｘ、１５００Ｘ、２０００Ｘ、３０００Ｘ、５０００Ｘ、１００００Ｘ、２００００Ｘ、またはそれより甘い、ポリペプチドを包含する。他の態様において、Ｍｙｄポリペプチドは、糖の少なくとも１％（少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）の甘さである。
[00161]食品、飲料、栄養補助食品、医薬品
[00162]一態様において、本発明は、経口投与用の製品と、本明細書に記載の本発明による単離Ｍｙｄポリペプチドを含む甘味組成物との組み合わせを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる組成物を包含する。一観点において、組み合わせは、Ｍｙｄポリペプチドを欠く経口投与用の製品（対照）と比較して、増強された甘味を有する。一態様において、経口投与用の製品は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではない。「から本質的になる」という用語は、製品の機能または活性に必須ではなく、機能または活性に実質的に影響を及ぼさない成分、例えば、凝固防止剤、充填剤、安定剤（例えば、熱安定剤）、および増量剤（例えば、マルトデキストロース、アカシアゴムなど）の包含を可能にする。
[00163]一態様において、本発明の単離Ｍｙｄタンパク質を含む組成物は、単離Ｍｙｄタンパク質に増強された機能性を提供する製剤を含むことができる。例えば、組成物は、熱、浸透圧、ｐＨ、または他のタイプの分解に対してＭｙｄタンパク質を安定化する製剤を包含することができる。一態様において、製剤は、Ｍｙｄタンパク質を熱分解に対して安定化する。Ｍｙｄタンパク質の安定化のための代表的な化合物としては、例えば、Ｌ－アルギニングリジン、Ｌ－ヒスチジン、β－アラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニンエチルエステル二塩酸塩、Ｌ－アルギニンアミド二塩酸塩、６－アミノヘキサン酸、ｇｌｙ－ｇｌｙ、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ、トリプトン、ベタイン一水和物、Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物、キシリトール、Ｄ－ソルビトール、スクロース、ヒドロキシエクトイン、トリメチルアミンＮ－オキシド二水和物、メチル－α－ｄ－グルコピラノシド、トリエチレングリコール、スペルミン四塩酸塩、スペルミジン、５－アミノ吉草酸、グルタル酸、アジピン酸、エチレンジアミン二塩酸塩、グアニジン塩酸塩、尿素、ｎ－メチル尿素、Ｎ－エチル尿素、Ｎ－メチルホルムアミド、ヒポタウリン、ＴＣＥＰ塩酸塩、ＧＳＨ（ｌ－グルタチオン還元型）、ベンズアミジン塩酸塩、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、塩化マグネシウム六水和物、塩化カドミウム水和物、非界面活性剤スルホベタイン１９５（ｎｄｓｂ－１９５）、非界面活性剤スルホベタイン２０１（ＮＤＳＢ－２０１）、非界面活性剤スルホベタイン２１１（ＮＤＳＢ－２１１）、非界面活性剤スルホベタイン２２１（ＮＤＳＢ－２２１）、非界面活性剤スルホベタイン２５６（ＮＤＳＢ－２５６）、タウリン、アセトアミド、シュウ酸二水和物、マロン酸ナトリウムｐＨ７．０、コハク酸ｐＨ７．０、タクシメート(tacsimate)ｐＨ７．０、テトラエチルアンモニウムブロミド、酢酸コリン、１－エチル－３－メチルイミダゾリウム酢酸塩、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムクロリド、エチルアンモニウム硝酸塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム水和物、チオシアン酸カリウム、塩化ガドリニウム（ＩＩＩ）六水和物、塩化セシウム、４－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、硝酸リチウム、ＤＬ－リンゴ酸ｐＨ７．０、クエン酸リチウム三塩基性四水和物、酢酸アンモニウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ－トルエンスルホン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム一塩基性一水和物、硫酸ナトリウム十水和物、塩化リチウム、臭化ナトリウム、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル５５０、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル７５０、ホルムアミド、ポリエチレングリコール４００、ペンタエリトリトールエトキシレート（１５／４ ＥＯ／ＯＨ）、１，２－プロパンジオール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル１９００、ポリエチレングリコール３３５０、ポリエチレングリコール８０００、ポリビニルピロリドンｋ１５、ポリエチレングリコール２００００、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、メチル－β－シクロデキストリンが挙げられる。
[00164]一観点において、甘味組成物のＭｙｄポリペプチドは、配列番号３（または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。他の観点において、Ｍｙｄポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し；ここで、（ａ）該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換修飾を含有し、該ポリペプチドは配列番号３のポリペプチドではなく、または（ｂ）該ポリペプチドは、ヒスチジンタグをさらに含み、該ポリペプチドが甘味調節活性を有する。例えば、ポリペプチドは、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７５のアミノ酸配列を含み、配列番号３から構成されない。特定の観点において、ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
[00165]本発明はまた、経口投与用の製品の味を調節するための方法であって、経口投与用の製品を、有効量の本明細書に記載の単離Ｍｙｄポリペプチドと組み合わせることを含む方法も包含する。一観点において、組み合わせは、Ｍｙｄポリペプチドを欠く経口投与用の製品（対照）と比較して、増強された甘味を有する。一態様において、経口投与用の製品は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではない。
[00166]一観点において、甘味組成物のＭｙｄポリペプチドは、配列番号３（または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。他の観点において、Ｍｙｄポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し；ここで、（ａ）該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換修飾を含有し、該ポリペプチドは配列番号３のポリペプチドではなく、または（ｂ）該ポリペプチドは、ヒスチジンタグをさらに含み、該ポリペプチドは甘味調節活性を有する。
[00167]経口投与用の製品は、食品、飲料、栄養補助食品組成物、または医薬組成物であることができる。
[00168]「経口投与用の製品」という用語は、食品製品、飲料製品などの食用製品；薬用（医薬用）製品、またはハーブ系サプリメントなどの栄養補助食品をさすことができる。本明細書中で使用される場合、「薬用製品」という用語は、薬理効果を有するか、または咳止めシロップ、咳止めドロップ、アスピリンおよび薬用チュアブル錠などの薬学的に活性な薬剤を含む、摂取可能な非毒性材料である固形および液体組成物の両方を包含する。口腔衛生製品も経口投与用の製品であり、練り歯磨きまたは洗口液などの固体および液体が含まれる。
[00169]一般的に、本発明は、食品または飲料製品が、本発明の単離された甘味タンパク質を、有効量、例えば、食品または飲料製品の総重量に関して最大約９９重量％の量、例えば約０．０１重量％～約９９重量％の量で、包含することができることを企図する。食品または飲料製品の総重量に関するすべての中間重量（すなわち、重量に基づき０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、・・・９０％、９５％、９９％）が、これらの量に基づくすべての中間範囲として企図される。
[00170]本発明の組成物は、Ｍｙｄポリペプチドの生物学的有効性が最大化されるように、分散／希釈された形態のＭｙｄポリペプチドを投与するために、望ましい剤形のＭｙｄポリペプチドの調製に用いられる固形または液体培地および／または組成物を包含することができる「食用に、生物学的に、または薬学的に許容される担体または賦形剤」を包含することができる。食用に、生物学的に、または薬学的に許容される担体としては、多くの一般的な食品成分、例えば、中性、酸性もしくは塩基性ｐＨの水、果物もしくは野菜のジュース、酢、マリネ、ビール、ワイン、ミルクもしくはコンデンスミルクなど天然の水／脂肪エマルション、食用油およびショートニング、脂肪酸、プロピレングリコールの低分子量オリゴマー、脂肪酸のグリセリルエステル、および水性媒体中のこのような疎水性物質の分散液またはエマルション、塩化ナトリウムなどの塩、小麦粉、エタノールなどの溶媒、野菜パウダーもしくは粉末などの固形食用希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤；増粘剤または乳化剤、防腐剤、固形バインダー、潤滑剤などが挙げられる。
[00171]本発明の文脈において企図され得る食品または飲料製品としては、ベークド品；スイートベーカリー製品（例えば、限定されるものではないが、ロール、ケーキ、パイ、ペストリーおよびクッキー）；スイートベーカリー製品を調製するための予め作製されたスイートベーカリーミックス；パイフィリングおよび他のスイートフィリング（例えば、限定されるものではないが、フルーツパイフィリングおよびピーカンパイフィリングなどのナッツパイフィリングのほか、クッキー、ケーキ、ペストリー、菓子製品などのフィリング）；デザート、ゼラチンおよびプディング；冷凍デザート（例えば、限定されるものではないが、普通のアイスクリーム(regular ice cream)、ソフトクリームおよび他のすべてのタイプのアイスクリームを含むアイスクリームのような冷凍乳製品デザート、ならびに非乳製品アイスクリーム、シャーベットなどのような冷凍非乳製品デザート）；炭酸飲料（例えば、限定されるものではないが、炭酸ソフト飲料）；非炭酸飲料（例えば、限定されるものではないが、フレーバー水および茶またはコーヒーベースの甘味飲料のような非炭酸ソフト飲料）；飲料濃縮物（例えば、限定されるものではないが、液体濃縮物およびシロップ、ならびに凍結乾燥および／または粉末調製物のような非液体濃縮物）；ヨーグルト（例えば、限定されるものではないが、高脂肪、低脂肪および無脂肪の乳製品ヨーグルト、ならびに非乳製品ヨーグルトおよび無乳糖ヨーグルトおよびこれらのすべての凍結同等物）；スナックバー（例えば、限定されるものではないが、シリアル、ナッツ、種子および／またはフルーツバー）；パン製品（例えば、限定されるものではないが、発酵パンおよび無発酵パン、酵母パンおよび無酵母パン、例えば、ソーダブレッド、任意のタイプの小麦粉を含むパン、任意のタイプの非小麦粉（ジャガイモ、米およびライ麦粉など）を含むパン、グルテンフリーのパン）；パン製品を調製するための予め作製されたパンミックス；ソース、シロップおよびドレッシング；スイートスプレッド（例えば、限定されるものではないが、ゼリー、ジャム、バター、ナッツスプレッドおよび他のスプレッド可能なプリザーブ、コンサーブ(conserve)など）；菓子製品（例えば、限定されるものではないが、ゼリーキャンディー、ソフトキャンディー、ハードキャンディー、チョコレートおよびガム）；甘味付き朝食用シリアル（例えば、限定されるものではないが、押出（ｋｉｘタイプ）朝食用シリアル、フレーク状朝食用シリアルおよびパフ状朝食用シリアル）；ならびに、甘味付き朝食用シリアルの調製で使用するためのシリアルコーティング組成物が挙げられる。本明細書中では言及していないが、慣例的に１以上の栄養甘味料を包含する他のタイプの食品および飲料製品もまた、本発明の文脈において企図することができる。
[00172]本発明の食品または飲料製品における栄養甘味料の完全または部分的な置き換えの結果、本発明の食品または飲料製品は、低カロリーまたはダイエット製品、医療食品／製品（丸剤および錠剤を含む）、およびスポーツ栄養製品として有用であることができ、所与の可溶性固形分レベルでより少ない甘味を必要とする食品または飲料製品に特に適していることができる。
[00173]いくつかの態様において、本発明の甘味組成物に、他の栄養または非栄養甘味料を補充して、甘味料系を形成することができる。甘味料系は、本発明の甘味料組成物、マルトデキストロース、アカシアゴムなどの増量剤、および少なくとも１つの高強度甘味料を含むことができる。組成物は、液体組成物または乾燥ブレンドとして提供することができる。
[00174]一態様において、本発明は、経口投与用の製品の甘味を増強するためのプロセスであって、本発明のＭｙｄポリペプチドの添加を含むプロセスを包含する。
[00175]他の態様において、本発明の方法は、経口投与用の製品の甘味香味を改善するための方法であって、経口投与用の製品に、本発明の方法によって作製された甘味組成物を加えることを含む方法を包含する。添加する量は、例えば、官能検査を指針として使用して、当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
[00176]以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであるが、言うまでもなく、決してその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
[00177]実施例１
[00178]新鮮なＭａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフを、その自然の範囲で適切な手順および許可を用いてｉｎ ｓｉｔｕで得た。新鮮な試料（合計２９個）をＭｙｃｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．施設に送付し、ＲＯ水中で穏やかに洗浄した後、液体窒素中で凍結し、－８０℃で保存した。トリュフの平均含水率は８３．６％±４．６％であった。
[00179]トリュフの水性抽出を以下のように行った。トリュフの８つの異なる試料を液体窒素中で乳棒を用いて磨砕して粉末にした後、４℃の水の５：１体積／重量トリュフを加え、そのまま４℃で３０分間インキュベートした。次いで、抽出した材料を低速短時間遠心分離にかけ、濾液を「ニート(neat)」で味見した。甘味強度を、甘味なしの０～極度に甘い１０の間で採点した。試料について、甘味は以下のように採点された：
[00180] 表１：さまざまなトリュフ試料の甘味。
[00181]水性抽出物を、４℃で、リン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ ７およびｐＨ ２で保存した。８日間にわたって甘味の変化はほとんどまたはまったく観察されなかった。
[00182]実施例２
[00183]Ｍ．ｔｅｒｆｅｚｏｉｄｅｓ由来の甘味タンパク質Ｍｙｄの精製。新鮮なＭａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフを、その自然の範囲で適切な手順および許可を用いてｉｎ ｓｉｔｕで得て、－８０℃で保存した。１６．３ｇの試料を冷凍庫から取り出し、乳鉢および乳棒（白色セラミック）を用いて液体窒素中で磨砕した。１５分間磨砕を行って、組織を完全に微粉砕し、微細な凍結粉末を得た。粉末を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに加え、２０ｍＬのＲＯ－Ｈ２Ｏを加え、氷晶が観察されなくなるまでボルテックスして組織を混合した。４℃において２×１分で２０の設定のローター－ステーターを使用して、断片を分解し、均質溶液（Ｈ１）を作製した。スラリーの体積をＲＯ－Ｈ２Ｏで５３ｍＬに調整し、４℃において７５００×Ｇで３０分間遠心分離した。この段階からの上清（Ｓ１）を２ｍＬのエッペンドルフチューブに収集し、５４１７Ｒおよびエッペンドルフ遠心分離機において４℃、２００００×Ｇで１５分間遠心分離した。ペレット（Ｐ１）を廃棄した。甘味（ヒト感覚による）は、上清で知覚された。この段階からの上清を収集し、プールした。次いで、上清を２５ｍｍの０．４５ミクロンシリンジフィルター（セルロース、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に通して濾過し、Ｓ１＋０．２２ｕｍ濾過とした。次いで、濾液をヘキサンで洗浄し（ヘキサン３８ｍＬ～５０ｍＬで２回）、水相を収集した。Ｓ１ＦＨは、Ｓ１Ｆ＋ヘキサン洗浄である。ヘキサン相を保存して乾燥した。その後、水相をアセトンで沈殿させた（－２０℃で５０ｍＬを３３ｍＬの画分Ｓ１ＦＨに添加し、－２０℃で３０分間設定した）。試料を３０００×ｇで遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物をｐＨ６の１０ｍＭリン酸ナトリウムに再懸濁し、この段階からの上清をＳ２とし、沈殿物をＰ２とした。上清Ｓ２を、最初に、１００ｋＤの分子量カットオフを有するＡＭＩＣＯＮ遠心フィルターユニットに適用して、濾液（フロースルー）部分（１００Ｆとする）および保持液（１００Ｒとする）を得；次いで、３０ｋＤの分子量カットオフを有するユニットに１００Ｆを適用して、濾液（３０Ｆ）および保持液（３０Ｒ）を得た。甘味画分は、１００ｋＤカラムを通って流れて１００Ｆに現れ、３０ｋＤカラム上に保持された（３０Ｒ）。図２のＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて約１３ｋＤａに矢印で示したバンドが観察され、このバンドを切り出し、標準的な検出方法、例えば液体クロマトグラフィーおよび質量分析を用いてエドマン分解によるＮ末端配列解析を行って、各サイクルの残基を同定した。配列番号４のポリペプチドが検出された。
[00184]実施例３（ＲＮＡの同定）
[00185]試料の収集
[00186]新鮮なＭａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフを、その自然の範囲で適切な手順および許可を用いてｉｎ ｓｉｔｕで得た。Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフ（グレバ）の野生分離株（ＢＤＰ２＿１８）を自然環境から調達した。ＢＤＰ２＿１８は最大の捕捉されている野生のトリュフであり、このトリュフは「甘味が先行し、より真菌性であり、土臭く、甘味の残存が少ない」という甘味特性を有していた
[00187]試料の同定
[00188]グレバの野生分離株をＧｅｎｅＷｉｚ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに凍結輸送した。配列決定されたゲノム遺伝子座は、ＩＴＳ １および２領域である。次いで、得られたサンガーシーケンシングリードをアラインメントし、低クオリティ塩基をトリミングした。その後、各配列を、個々のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｇｉｓｈ， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｍｙｅｒｓ， ＆ Ｌｉｐｍａｎ， １９９０）検索に付して、同一性を検証した。未発表試料の配列を除外したヌクレオチドコレクション（ｎｒ／ｎｔ）を用いてＢＬＡＳＴｎ検索を採用した。野生分離株に対してもっとも高い同一性パーセントを有するエントリーは、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓ株ｒｉｂ０２である。
[00189]試料の調製
[00190]野生分離株ＢＰＤ２＿１８を滅菌水で表面的に洗浄し、重さ約１００ｍｇの立方体に切断し、液体Ｎ２中で急速凍結して、－８０℃で保存した。ＧｅｎｅＷｉｚに向けてドライアイス上で輸送した。
[00191]ＲＮＡシーケンシング
[00192]以下の試料を、ＧｅｎｅＷｉｚ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＲＮＡＳｅｑを通して提出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ、２ｘ１５０ｂｐ、シングルインデックス、レーンあたり約３５０Ｍのレーンあたり未処理ペアエンドリードで精査した。このＲＮＡＳｅｑ試験は、トランスクリプトームプロファイリングのためのポリＡ＋選択を包含していた。
[00193]ＧｅｎｅＷｉｚは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍｉｎｉキットを使用し、製造業者の指示に従ってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡライブラリー調製は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａを用いて行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を以下に概説する。
[00194]５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’（配列番号１８）
[00195]５’－ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ［ｉ７バーコード］ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’（配列番号１９）
[00196]Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓの２つの株（それぞれ３回複製）でのＲＮＡ－ｓｅｑ試験からのＦａｓｔｑ配列ファイルをＨＴＳｔｒｅａｍを用いてトリミングおよびクリーニングして、以下のコンタミナントを除去した： ＰｈｉＸ（シーケンシング由来の一般的コンタミナント）、ｒＲＮＡリード、シーケンシングアダプター、低クオリティおよび「Ｎ」塩基、ポリ－ａトラクト、プライマーおよび＜５０ｂｐのリード。その後、ｒｎａＳＰＡｄｅｓ（Ｂｕｓｈｍａｎｏｖａ Ｅ， Ａｎｔｉｐｏｖ Ｄ， Ｌａｐｉｄｕｓ Ａ， Ｐｒｊｉｂｅｌｓｋｉ ＡＤ． ｒｎａＳＰＡｄｅｓ： ａ ｄｅ ｎｏｖｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｄａｔａ． Ｇｉｇａｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１９；８（９）：ｇｉｚ１００． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｇｉｇａｓｃｉｅｎｃｅ／ｇｉｚ１００）を、クリーニングしたファイルからのＭ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓの各株についてのトランスクリプトームのｄｅ ｎｏｖｏアセンブリーに用いた。Ｂａｎｄａｇｅ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎａｖｉｇａｔｉｎｇ Ｄｅ ｎｏｖｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｅａｓｉｌｙ）（Ｒｙａｎ Ｒ． Ｗｉｃｋ， Ｍａｒｋ Ｂ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｊｕｓｔｉｎ Ｚｏｂｅｌ， Ｋａｔｈｒｙｎ Ｅ． Ｈｏｌｔ， Ｂａｎｄａｇｅ： ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ３１， Ｉｓｓｕｅ ２０，２０１５年１０月１５日，３３５０－３３５２頁）を用いて標的ペプチドについてのアセンブリーを可視化し、ｔＢＬＡＳＴｎ検索（Ｇｅｒｔｚ ＥＭ， Ｙｕ ＹＫ， Ａｇａｒｗａｌａ Ｒ， Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ＡＡ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ． Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅａｒｃｈｅｓ： ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ＴＢＬＡＳＴＮ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ ＢＬＡＳＴ． ＢＭＣ Ｂｉｏｌ． ２００６；４：４１． ２００６年１２月７日出版、 ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４１－７００７－４－４１）を用いて検索し、タンパク質の問い合わせ配列（ＰＤＬＳＳＦＩＴＩＫＮＮＳＮＨＶＦＴＲＴ、配列番号４）を、６つのリーディングフレームすべてにおいて動的に翻訳されるアセンブルされたトランスクリプトーム配列データベースと比較する。問い合わせタンパク質配列との完全なマッチを含有するコンティグをオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）について解析し、最終的に標的ペプチドに接続された完全長ｍＲＮＡを構築するために使用した。
[00197]ＲＮＡ転写物を同定し、そのＤＮＡコピーは配列番号１として示される配列を有し、そのうちの配列番号２は、開始コドンおよび終止コドンに基づく予測コード配列である。推定サイズ１３．３ｋＤで１２１個のアミノ酸を有する予測タンパク質、配列番号３も提供される。長さ：１２２ａａ、分子量：１３．３８１ｋＤａ、予測等電点：８．６４、およびｐＨ７での予測電荷：１．０１。
[00198]Ｂｌａｓｔ解析。配列番号３の予測タンパク質とＧＥＮＢＡＮＫ中の他のタンパク質配列との間の同一性は３１％以下であった。Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ ｔｉｎｃｔｕｒｉｕｓ由来の仮想タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＩＮ９８１５４．１；配列番号７）が配列番号３に対して約３１％の相同性を有することが見出され、仮想タンパク質Ｍ４０４ＤＲＡＦＴ＿１００５５１９［Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｍａｒｘ ２７０］とされた。配列番号７はまた、甘味調節活性を有し得ると仮定される。ＲＮＡ転写物の完全なｃＤＮＡコピーは配列番号５であり、コード配列は配列番号６として与えられる。
[00199]実施例４（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのクローニングおよび異種発現；甘味の確認。）
[00200]配列番号３と同定されたヌクレオチド配列に基づき、ヒスチジンタグを含有する配列番号２０を発現するための３つの発現ベクターを合成し、Ａｔｕｍ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）によって３つの異なるＡｔｕｍベクター骨格：ｐＤ４５４－ＳＲ（プラスミドｐＭｙ＿３０００）、ｐＤ４５４－ＭＲ（プラスミドｐＭｙ＿３００１）、およびｐＤ４５４－ＷＲ（プラスミドｐＭｙ＿３００２）にクローニングした。これらはすべて、アンピシリン耐性、ｌａｃｌ、Ｌａｃ０１、Ｏｒｉ＿ｐＵＣ、およびプラスミド上に中程度（Ｍ）、強い（Ｓ）および弱い（Ｗ）リボソーム結合部位を有するＥ．ｃｏｌｉ ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーター発現ベクターである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１８９：１１３－１３０）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、製造業者のプロトコルを用いて、ｐＭｙ＿３０００、ｐＭｙ＿３００１、ｐＭｙ＿３００２で形質転換した。手短に言うと、以前に凍結したコンピテント細胞を解凍し、１ｐｇ～１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、氷上で３０分間保持した。この混合物に４２℃の熱ショックを４５秒間加えた。その直後、混合物を氷浴中に入れ、１０分間そのままにした。９５０μＬの予め加温したＬＢ培地を加えた後、３７℃で振盪しながら１時間にわたり２２５ｒｐｍにかけた。細胞を１：１０および１：１００に希釈し、抗生物質プレート上に１００μＬをプレーティングして、各形質転換反応を行った。３７℃で一晩増殖させると、コロニーは完全に回復し、可視化された。形質転換の成功を確認するために、ｃｓＰＣＲ（コロニースクリーニングＰＣＲ）を実施してプラスミドのｃＤＮＡ領域を調べ、発現を溶解物ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して確認した。振盪フラスコスケールの誘導発現を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種発現を確認した。このプロセスにより、それぞれプラスミドｐＭｙ＿３０００、ｐＭｙ＿３００１、およびｐＭｙ＿３００２を含有する株Ｚ１４ＣＥ、Ｚ１５ＣＥ、Ｚ１６ＣＥを得た。３つの株（Ｚ１４ＣＥ、Ｚ１５ＣＥ、Ｚ１６ＣＥ）をＬＢ＋アンピシリン１００μｇ／ｍＬ寒天プレート上に維持しする一方、陰性対照（Ｅｃｏ＿０００１）をＬＢ寒天プレート上に維持した。３７℃においてバッフルのない２５０ｍＬ培養振盪フラスコ中の５０ｍＬのＬＢ液体培地中で適切な抗生物質と一緒に一晩１５０ｒｐｍで振盪して、各株について一晩培養物を増殖させた。その後、翌日、２００ｒｐｍで振盪し、適切な抗生物質で０．１ ＯＤ６００に調整した３７℃のバッフル付き１０００ｍＬ培養振盪フラスコ中に、各一晩培養物を２００ｍＬのＴＢ液体培地中に播種した。ＯＤ６００が０．８に達したら、ＩＰＴＧの捕捉物を培地中に添加して、最終濃度を０．６６ｍＭにした。３７℃でさらに５時間振盪を続けた。発現後、細胞を４０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを約２０ｍＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０）に懸濁した。懸濁細胞を、最大２０００ｂａｒで操作される高圧ホモジナイザー（Ｃ３ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ， Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．， Ｏｔｔａｗａ， ＯＮ， カナダ）中で破壊した。破壊された細胞を１３０００ｇ（３０分間）で遠心分離し、上清を収集し、ペレットを廃棄した。可溶化タンパク質を含有する上清を、０．２２μｍ ＰＥＳ膜Ｂユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ， 米国）に通して濾過した。ＳＤＳ ＰＡＧＥを実施し、１３．１ｋＤのバンド（クーマシー染色）を観察して発現を確認した。
[00201]Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ ＨｉｓＰｕｒＴＭ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を用い、効率的な固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて、ｈｉｓタグ付きタンパク質配列番号２０を精製した。配列番号２０は、６％架橋アガロース樹脂上に固定化したニッケル荷電ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）キレートを用いて精製した。溶解物を、調製したＩＭＡＣカラム上にローディングし、結合緩衝液：２０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４と平衡化し、溶離緩衝液：２０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾールを用いて溶離した。カラムを結合緩衝液で３回洗浄した後、溶離緩衝液でｈｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを４回溶離し、続いて３０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターを用いて溶離画分を限外濾過した後、濾液を１０ｋＤフィルターに４０００ｘＧで１５分間通して濾過した。保持液を希釈し、洗浄段階のために再び回転させ、３回繰り返した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる精製段階の分析を図３に示す。
[00202]精製された画分（図３のレーン８に示され、高度に精製された配列番号２１を含有する）は、訓練された感覚科学者によって０．０３ｍｇ／ｍＬで味見され（０．２ｍＬアリコート）、８°ｂｒｉｘ（約８％の糖溶液）と同等の甘味を有することが見出され、これにより、Ｍ．ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓから単離されたｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎが、実施例１および２で観察された甘味活性に関与することが確認された。甘味は非常に顕著に甘く、「クリーンな」甘味（砂糖のような味）を有し、他の香味はなく、甘味発現(onset)はわずかに遅く、甘い後味を有していた。
[00203]実施例５（ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ（ｈｉｓタグ）のパイロットスケール生産）
[00204]配列番号２０のコード配列を含有する実施例４で調製したＥ．ｃｏｌｉ Ｚ１４ＣＥ株を、実験室規模のバイオリアクターにおける発酵中の性能について試験した。バイオリアクター培養は、１０．０Ｌ Ｂｉｏｆｌｏ ３２０丸底撹拌発酵槽（ＢｉｏＦｌｏ／ ＣｅｌｌｉＧｅｎ ３１０， Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｅｄｉｓｏｎ， ＮＪ， 米国）で行った。発酵槽にｐＨおよび溶存酸素センサー（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ， ＯＨ， 米国）を取り付けた。温度は、水を充填したステンレス鋼ベースを介して制御した。撹拌は、４７ｍｍ間隔で配置され、もっとも下のインペラーがシャフトの底部のすぐ上に位置する、６枚翼のラシュトンタービンを２つ取り付けることによって提供した。多孔管スパージャーリングを通してエアレーションを行った。５００～８００ｒｐｍの攪拌、高細胞密度で散布した空気での５～８Ｌ／分のエアレーションの連続的カスケードを用いて、溶存酸素（ＤＯ）を２０％の空気飽和で制御した。５．０Ｍ水酸化アンモニウムを用いてｐＨを７．０に制御した。Ａｎｔｉｆｏｒｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， 米国）を自動的に添加して発泡を制御した。後者は、培養物レベルの１０ｃｍ上に取り付けられた導電率プローブを使用して感知した。主要な発酵培地は、（１リットル当たり）２４ｇの酵母抽出物、１２ｇのトリプトン、５．４２ｍＬのグリセロール、１００ｍＬのリン酸緩衝液ストック（０．１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．７２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４）を含有していた。培地は、２Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨ７．０に調整した。最初のグルコース供給物が激減したときに（ｐＨの上昇によって示される）、２００ｇのグルコース、２１．１ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４および１９．７ｇのＭｇＳＯ４からなる供給培地（１リットル当たり）を、１．００ｍＬ／分の初期流速で発酵槽にポンプで注入した。特に明記しない限り、容器中の培地の初期体積は４．０Ｌであった。接種材料（２００ｍＬ）は、１Ｌバッフル付き振盪フラスコ（３７℃、２００ｒｐｍ）中、ＬＢ開始培地中で、１６時間増殖させた培養物からなっていた。発酵槽温度は３７℃であった。発酵は光学濃度が１０～２０に達した後、０．６６ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、その後２４時間継続させた。続いて、２４時間の誘発後、ブロスを４０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１Ｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０）に懸濁した。懸濁細胞を、最大１５００ｂａｒ以下で操作される高圧ホモジナイザー（Ｃ３ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ， Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．， Ｏｔｔａｗａ， ＯＮ， カナダ）中で破壊した。破壊された細胞を１３０００ｇ（３０分間）で遠心分離し、上清を収集し、ペレットを廃棄した。可溶化タンパク質を含有する上清を、０．２２μｍ ＰＥＳ膜ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ， 米国）に通して濾過した。
[00205]この実施例で調製した精製上清は、訓練された感覚科学者によって０．０３ｍｇ／ｍＬで味見され（０．２ｍＬアリコート）、８°ｂｒｉｘ(約８％の糖溶液）と同等の甘味を有することが見出された。甘味は非常に顕著に甘く、「クリーンな」甘味（砂糖のような味）を有し、他の香味はなく、甘味発現はわずかに遅く、甘い後味を有していた。
[00206]上清は－２０℃においてアリコートで保存し、さらなる実験に使用した。
[00207]実施例６（Ｅ．ｃｏｌｉからのｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのＥＬＩＳＡ定量）
[00208]ｈｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ（配列番号２１）を定量するために、配列番号２１のカルボキシ末端上の６ＸＨｉｓ－Ｔａｇ配列に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体をコンジュゲートさせて、直接ＥＬＩＳＡを展開した。ＥＬＩＳＡは、複合溶解物および精製タンパク質中のｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ濃度の測定を可能にする。組換え６ＸＨｉｓタグ付きＥ．ｃｏｌｉ ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎは、当技術分野で公知の方法によってアミノ酸配列から計算して、１４．２ｋＤａの分子量および２７９６０ Ｍ－１ｃｍ－１のモル吸光係数を有する。純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより≧９８％と評価された。ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎタンパク質濃度を、Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則を用いて２８０ｎｍでの吸光度によって決定し、次いで、ＥＬＩＳＡのために既知濃度のｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ（μｇ／ｍＬ）を用いて標準曲線を作成した。
[00209]ＥＬＩＳＡ手順：タンパク質を、室温で３０分間、高タンパク質結合９６ウェルプレートの壁に、５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．４コーティング緩衝液中で結合させた。プレートを、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むｐＨ ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。マイクロプレート上の非特異的結合部位を室温においてＰＢＳ ｐＨ７．４中の５％ ＢＳＡで１５分間ブロッキングし、ＰＢＳ ０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した。一次抗体をブロッキング緩衝液で希釈（１：１０００）し、マイクロプレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳ ０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した。比色基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いてＨＲＰ反応を８分間展開し、２Ｎ硫酸で停止させた。
[00210]実施例７（ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの濃度依存性の定量的特性評価）
[00211]実施例５に記載したようにＥ．ｃｏｌｉから得られ、実施例４に記載したように精製した、精製ｈｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ（配列番号２１）の味覚特性の濃度依存性の定量的特性評価を、Ｏｐｅｒｔｅｃｈ Ｂｉｏ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ）により行った。ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの甘味効力および相対的有効性を、スクロースおよび他の甘味料であるソーマチン、レバウジオシドＡ、およびアスパルテームと比較した。対照標準は、２００ｍＭスクロース、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭキニン、および１０ｍＭクエン酸の溶液であった。図４は、ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ、アスパルテーム、ソーマチン、レバウジオシドＡの甘味に関する濃度－応答関数を示す。データは、２００ｍＭスクロース関連（「甘味」）標的上で生じる応答の割合（ｐ）としてプロットする。ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ、アスパルテーム、ソーマチン、レバウジオシドＡについての曲線における各データ点は、３２回の反復にわたる平均として計算され、スクロース曲線については１６回の反復にわたって平均した；エラーバーは標準偏差である。水およびスクロース対照の点は、それぞれ１２８回および６４回の反復にわたる平均として同様に計算した。曲線は、非線形回帰によってフィットさせた。
[00212]最大値の半分の甘味応答（ＥＣ５０、または効力）を生じさせる濃度を、非線形回帰から導出した。ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ（ＭＹＣ）、スクロース（ＳＵＣ）、アスパルテーム（ＡＳＰ）、レバウジオシドＡ（ＲＥＢ）、およびソーマチン（ＴＨＮ）のＥＣ５０（および９５％信頼区間）を表２に示す。モル基準および重量基準でのスクロースに対する同等性(equivalency)も提供する。
[00213]表２。
[00214]ソーマチン、スクロース、および配列番号２１の評価は、タンパク質および１０％スクロースに関する水中０．０４５ｍｇ／ｍＬの名前付き検体の甘味感覚の時間強度のＣＡＴＡ（該当すべてクリック）を用いて行った。方法論：時間強度技術；データ収集ソフトウェア：ＥｙｅＱｕｅｓｔｉｏｎ、２．５７秒ごとに応答を記録；スケーリング方法：１５ポイント甘味スケール、例えば、スコア５＝５％スクロース、スコア１０＝１０％スクロース；評価プロトコル：小容量一口(sip)、傾斜(tilt)および唾液(spit)試験。パネリストは３～６人で、反復は２回であった。すべての試料を盲検化し、無作為化した３桁コードを提示した。
[00215]訓練戦略：甘味の値を自信を持って割り当てるための、１５ポイント甘味スケールでの６週間にわたる甘味スケールに対する強力な訓練。独特の甘味挙動パターンに起因にして、３週間にわたって時間強度原理を訓練する必要がある。試料は、時間を記録し、コンセンサスに達するのを助けるために、ストップウォッチを用いて味見した。パネリスト数：３～６、反復数：２。すべての試料を盲検化し、無作為化した３桁コードを提示した。統計解析：パネリストの数が少ないため、統計解析を行うことはできない。
[00216]ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎおよびソーマチンの最大強度（Ｉｍａｘ）は、スクロースに比べ、試験量での１５ポイントスケールで約１ポイント高いことを示す。ソーマチンおよびｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎはより平坦な勾配を有し、より長いピーク時間およびより漸進的／より長い低下を示す。スクロースは、ソーマチンおよびｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎよりも早く、１６２秒で閾値甘味度（強度＜１）に近づく。スクロースが閾値レベルに達するときに、ソーマチンおよびｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎは低～中程度の強度で認識可能である。ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎおよびソーマチンは、この実験では同様の効力を有するように思われ、これは、重量基準でスクロースよりもおよそ３０００倍甘く、またはモル基準でスクロースよりも約１２００００倍甘い。これら２つの実験から、ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎは、重量基準でスクロースよりも４００倍甘い～スクロースよりも３０００倍甘い効力を有する高強度甘味タンパク質であることが示される。
[00217]実施例８（甘味および熱安定性のためのｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのバリアントの生産および試験）
[00218]ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ中の潜在的な重要残基を同定する方法。甘味タンパク質は一次配列同一性を有さないが、全体の三次構造は甘味フィンガーモチーフを有する（Ｔａｎｃｒｅｄｉ， Ｔ．， Ｐａｓｔｏｒｅ， Ａ．， Ｓａｌｖａｄｏｒｉ， Ｓ．， Ｅｓｐｏｓｉｔｏ， Ｖ． ＆ Ｔｅｍｕｓｓｉ， Ｐ． Ａ． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： Ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｌｏｏｐｓ ｏｆ ｂｒａｚｚｅｉｎ， ｍｏｎｅｌｌｉｎ ａｎｄ ｔｈａｕｍａｔｉｎ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１， （２００４）： ２２３１-２２４０）。甘味タンパク質は、βシートに垂直なαヘリックスを有する逆平行βシートを有する。甘味タンパク質であるソーマチン、モネリン、ブラゼイン、およびリゾチームの三次構造を、ＰｙＭＯＬ ２．０（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ， ＬＬＣ）を用いて解析し、Ｐｈｙｒｅ２（Ｋｅｌｌｅｙ ＬＡ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ ｗｅｂ ｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ， ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １０， （２０１５）： ８４５－８５８）で生成したｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのモデルと比較した（図５Ａ）。イオン性アミノ酸残基の保存的単一点変異が２３個生じた。負に荷電したグルタミンおよびアスパラギン酸は、脂肪族鎖中の追加の炭素によって異なっている。正に荷電したリジンおよびアルギニンを置換することは保存的置換と考えられるが、アルギニンのグアニジニウムは、水素結合、芳香族および脂肪族接触を含むアミノ酸とのさらなる相互作用を形成することができる。イオン性アミノ酸変異は、リジンからアルギニン、アルギニンからリジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、およびグルタミン酸からアスパラギン酸であった。各変異体の相対的位置は、ＰｙＭＯＬ ２．０によってモデル化され、Ｎ末端、３つのループ領域、５つのβシート、１つのαヘリックス、およびＣ末端として分類された（図５Ｂ参照）。
[00219]具体的には、以下の単一変異体を作製した。それらの予測される位置を表３に示す。図５Ｂも参照されたい。これは、推定二次構造モチーフに重ね合わされた配列番号３の予測二次構造および各モチーフ内の表３の点変異の位置の表示を示す。
[00220]クローニング：Ｅｃｏ＿０００１ ａｋａ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ （Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｂ Ｆ－ ｏｍｐＴ ｇａｌ ｄｃｍ ｌｏｎ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ －ｍＢ －）λ（ＤＥ３ ［ｌａｃＩ ｌａｃＵＶ５－Ｔ７ｐ０７ ｉｎｄ１ ｓａｍ７ ｎｉｎ５］）［ｍａｌＢ＋］Ｋ－１２（λＳ））（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ＃ Ｃ２５２７Ｉから入手）を、製造業者プロトコルを用いて２３個のプラスミド（ｐＭｙ＿３０１８～ｐＭｙ＿３０４０）で形質転換した。手短に言うと、以前に凍結したコンピテント細胞を解凍し、１ｐｇ～１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、氷上で３０分間保持した。この混合物に４２℃の熱ショックを４５秒間加えた。その直後、混合物を氷浴中に入れ、１０分そのままにした。９５０μＬの予め加温したＬＢ培地を加え後、３７℃で振盪しながら１時間にわたり２２５ｒｐｍにかけた。細胞を１：１０および１：１００に希釈し、抗生物質プレート上に１００μＬをプレーティングして、各形質転換反応を行った。３７℃で一晩増殖させると、コロニーは完全に回復し、可視化された。このプロセスにより、プラスミドｐＭｙ＿３０１８～ｐＭｙ＿３０４０を連続的に含有するＺ１８ＣＥ～Ｚ４０ＣＥ株が得られた。振盪フラスコスケールで誘導した発現を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種発現を確認した。形質転換後変異体をプレーティングし、ＬＢ＋アンピシリン１００μｇ／ｍＬ寒天プレート上に維持した。
[00221]プレートを３７℃で１６時間インキュベートした。コロニースクリーニングＰＣＲを実施して、プラスミドのｃＤＮＡ領域と共に隣接領域を調べるように設計されたコロニースクリーニングプライマーを用いて遺伝子型を確認した。成功した形質転換は特定サイズのＤＮＡ断片をもたらし、一方、陰性対照および無鋳型対照は、ＰＣＲバンドをもたらさなかった。成功した形質転換は、すべての変異体について観察された。
[00222]振盪フラスコスケールで誘導した発現を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種発現を確認した。
[00223]２３株（Ｚ３８ＣＥ～Ｚ６０ＣＥ）をＬＢ＋アンピシリン１００μｇ／ｍＬ寒天プレート上に維持する一方、陰性対照（Ｅｃｏ＿０００１）をＬＢ寒天プレート上に維持した。３７℃においてバッフルのない２５０ｍＬ培養振盪フラスコ中の５０ｍＬのＬＢ液体培地中で、適切な抗生物質と一緒に一晩１５０ｒｐｍで振盪して、各株について一晩培養を増殖させた。その後、翌日、２００ｒｐｍで振盪し、適切な抗生物質で０．１ ＯＤ６００に調整した３７℃のバッフル付き１０００ｍＬ培養振盪フラスコ中に、各一晩培養物を２００ｍＬのＴＢ液体培地中に播種した。ＯＤ６００が０．８に達したら、ＩＰＴＧの捕捉物を培地中に添加して、最終濃度を０．６６ｍＭにした。３７℃でさらに５時間振盪を続けた。その後、４℃において５分間、５０００ｇで遠心分離することにより細胞を収集した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を冷ｄＨ２Ｏで１回洗浄し、４℃において１０分間、５０００ｇで再度遠心分離した。発現の成功を確認するために、液体窒素および乳鉢および乳棒を用いて細胞溶解物を作製した。細胞ペレットを１０ｍＬの冷ｄＨ２Ｏに再懸濁し、粗溶解物を４℃において５分間、２００００ｇで回転させた。最後に、上清を吸引し、０．２μｍ ＰＥＳフィルターで濾過し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動を行った。甘味変異体を同定するために、粗溶解物を味見した。表３に試験結果を示す。
[00224]表３． ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの単一点変異に関する甘味試験の結果
[00225]すべて甘味を有する１６種のバリアント（Ｚ３８ＣＥ、Ｚ３９ＣＥ、Ｚ４１ＣＥ、Ｚ４５ＣＥ、Ｚ４７ＣＥ、Ｚ４８ＣＥ、Ｚ４９ＣＥ、Ｚ５１ＣＥ、Ｚ５２ＣＥ、Ｚ５３ＣＥ、Ｚ５５ＣＥ、Ｚ５６ＣＥ、Ｚ５７ＣＥ、Ｚ５８ＣＥ、Ｚ５９ＣＥ、Ｚ６０ＣＥ）を、２００ｍＬの培地を用いてさらに再発現させた。発現後、２４時間の誘発後に、細胞を４０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを約２０ｍＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０）に懸濁した。懸濁細胞を、最大２０００ｂａｒで操作される高圧ホモジナイザー（Ｃ３ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ， Ａｖｅｓｔｉｎ， Ｉｎｃ．， Ｏｔｔａｗａ， ＯＮ， カナダ）中で破壊した。破壊された細胞を１３０００ｇ（３０分間）で遠心分離し、上清を収集し、ペレットを廃棄した。可溶化タンパク質を含有する上清を、０．２２μｍ ＰＥＳ膜ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ， 米国）に通して濾過した。その後、材料を、実施例４に記載したようにＩＭＡＣ精製によって単離した。
[00226] 精製した試料は、訓練された感覚科学者によって味見された。ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎストックを、ＥＬＩＳＡによって測定して同等のタンパク質濃度に希釈した。被験体は施設内審査委員会の承認を受けた一口試験および唾液試験のプロトコルに従った。各精製変異体０．２ｍＬを舌上に置き、甘味知覚の強度、甘味知覚の発現時間、および甘味知覚の持続時間を記録した。結果を図６に示し、以下に説明する。
[00227]ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ甘味に対する保存的点変異の効果
[00228] 保存的単一点変異の効果を甘味と相関させるために、ソーマチン、ブラゼイン、モネリンおよびリゾチームの公表されている変異をｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎと比較した。目的はｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの時間および強度プロファイルをスクロースの時間および強度プロファイルとマッチさせることであるので、われわれは、感覚分析によってスクロース同等性(equivalence)、甘味発現および合計持続時間を測定した。スクロースは、速い甘味発現、高い強度、および速い持続時間を有する。したがって、スクロース同等性にマッチするかまたはそれを改善する変異と同様に、甘味発現および持続期間を低減する変異が望ましい。スクロース同等性を低減する変異と同様に、甘味発現および合計持続時間を増大させる変異は望ましくない。図５Ｂおよび６参照。
[00229]Ｎ末端－外部－Ｄ３Ｅ
[00230]外部Ｎ末端でのＤ３Ｅの単一変異の保存的変化は、スクロース同等性および持続時間の損失をもたらした；しかしながら、甘味発現はわずかにしか低減しなかった。これらの結果は、甘味タンパク質のＮ末端の荷電、サイズ、および極性が、甘味とタンパク質の安定性に重要であることを示唆している。
[00231]βシート１ －外部－Ｋ１１Ｒ
[00232]Ｋ１１Ｒでの単一変異の保存的変化は、スクロース同等性のわずかな増大および甘味発現の中程度の低減をもたらした；しかしながら、甘味の持続時間は劇的に増大した。これらの結果は、Ｋ１１が甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３への結合に重要な残基であり、受容体からのｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのオフ速度に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。
[00233]βシート２と３の間の領域－外部－Ｋ２６Ｒ－リンカー領域
[00234]Ｋ２６における保存的変異はスクロース同等性についてわずかな低減をもたらし、この保存的変異が、タンパク質機能性に対して大きな効果を有さないことが示された。
[00235]ループ２領域－外部－Ｋ５１Ｒ
[00236]分子モデリングは、すべての推定ループ領域変異が溶媒曝露されたことを示した。甘味発現の中程度の低減を除いて、感覚試験では、スクロース同等性および合計持続時間のわずかな低減のみが観察され、この保存的変異がタンパク質機能性に大きな効果を有さないことがされた。
[00237]ループ２領域－外部－Ｒ５７Ｋ
[00238]変異Ｒ５７Ｋは、甘味発現、スクロース同等性、および合計持続時間に対して著しい阻害効果を有する。
[00239]βシート４ －外部－Ｒ６６Ｋ
[00240]変異体Ｒ６６Ｋは、スクロース同等性および合計持続時間に対して著しい低減を有するが、甘味発現をわずかに増大させる。Ｒ６６Ｋ変異は、甘味受容体に対するアフィニティーおよびオフ速度のための重要な残基であることができる。
[00241]ループ３領域－外部－Ｄ６９Ｅ
[00242]Ｄ６９Ｅにおける変異は、スクロース同等性、持続時間についてわずかな低減を有し、持続時間のわずかな増大を有する。この領域のこの範囲は、保存的変異に対して比較的非感受性であることが予測される。
[00243]αヘリックス領域－外部－Ｄ８５ＥおよびＤ８６Ｅ
[00244]Ｄ８５ＥおよびＤ８６Ｅは両方とも、ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの感覚刺激的性質に対して同様の効果を有する。Ｄ８５ＥおよびＤ８６Ｅのスクロース同等性および持続時間は低減した。甘味発現は対照と同様であった。
[00245]Ｃ末端－外部－Ｄ９７Ｅ、Ｋ１０３Ｒ、Ｒ１０６ＫおよびＥ１１７Ｄは、対照と比較して最小限の効果を有し、これらの領域が保存的変異に対して比較的非感受性であることを示唆した。しかしながら、Ｒ１１０ＫおよびＫ１２０Ｒは、甘味と持続時間の低減を示したが、甘味発現は同様であった。
[00246]表３に示すように、Ｒ２０Ｋ、Ｅ３５Ｄ、Ｋ４４Ｒ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ５２Ｅ、Ｒ７５ＫおよびＤ９４Ｅにおける保存的単一点変異は、タンパク質発現の喪失をもたらした。これらのデータは、これらの残基がＥ．ｃｏｌｉ宿主内のタンパク質フォールディングまたは発現に関与し得ることを示唆している。この実施例において上記で議論された予測三次構造モデルは、これらのすべての残基が予測βシートに含有されるので、これらの変化に起因するタンパク質ミスフォールディングを裏付けている。
[00247]参考文献：
[00248]Ｋｏｒｚ， Ｄ． Ｊ．， Ｒｉｎａｓ， Ｕ．， Ｈｅｌｌｍｕｔｈ， Ｋ．， Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｅ． Ａ． ＆ Ｄｅｃｋｗｅｒ， Ｗ．－Ｄ． Ｓｉｍｐｌｅ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３９， ５９-６５ （１９９５）。
[00249]Ｎｏｒｓｙａｈｉｄａ， Ａ．， Ｒａｈｍａｈ， Ｎ． ＆ Ａｈｍａｄ， Ｒ． Ｍ． Ｙ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢｍＲ１ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４９， ５４４-５５０ （２００９）。
実施例９。
[00250]熱安定性は、ＧｌｏＭｅｌｔＴＭ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ， Ｉｎｃ． Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）を使用し、製造業者によって提供された説明書を使用して、０．０４ｍｇ／ｍＬに標準化された上記実施例８に記載の１６種の甘味変異体のＩＭＡＣ精製からのタンパク質試料に対して行った。手短に言うと、熱シフトを測定するための個々の反応は、以下のものを混合することに依存する：ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の３６μｇ／ｍＬと、製造業者の説明書によるキットに提供されている試薬。熱シフト測定には、ＢＲ Ｃｌｅａｒプレート、スキャンモードＳＹＢＥＲ／ＦＡＭのみ、２５℃で３０秒間、融解曲線２５℃～９５℃、増分１０秒で０．５℃、およびプレートリードを用いたＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈシステムを使用した。Ｔｍは、Ｓｃｈｕｌｚ， Ｍ． Ｎ．， Ｌａｎｄｓｔｒｏｅｍ， Ｊ． ＆ Ｈｕｂｂａｒｄ， Ｒ． Ｅ． ＭＴＳＡ-Ａ Ｍａｔｌａｂ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ ｆｉｔ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｄａｔａ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３３， ４３-４７ （２０１３）に記載されている技術を用いて、５パラメーター方程式を用いて実験データにフィットさせた曲線について決定された中点に基づき決定した。結果（表４）は、熱安定性が、試験した変異体におけるアミノ酸変化によって最小限の影響を受けることを示す。
[00251]実施例１０（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎのクローニングおよび異種発現；甘味の確認）
[00252]配列番号３と同定されたヌクレオチド配列に基づき、配列番号２１（ｐＭｙ＿４００３）（ｈｉｓタグ付き）および配列番号３（ｐＭｙ＿４００２）（未変性）ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを発現する２つの発現ベクターを合成し、Ａｔｕｍ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ， ＣＡ）によって、ＵＲＡ３マーカーおよび強力な構成的プロモーターＧＰＤを含有するＡｔｕｍベクター非分泌性骨格ｐＤ１２３４にクローニングした。形質転換手順は、エレクトロコンピテント細胞を作製した後、エレクトロポレーションにより発現ベクターを導入することを包含する。手短に言うと、エレクトロコンピテント細胞は、最初に、複数回洗浄して増殖培地から塩を除去しつつ、細胞を対数期の初期と中期の間まで増殖させることによって作製される。１～５μｇの発現ベクターを混合した後、試料をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ上で以下の設定に付し（充電電圧：１．５ｋＶ、キャパシタンス：２５μＦ、抵抗：２００Ω）、１ｍＬの予め加温した３０℃のＹＰＤを直ちに加え、懸濁液を２００～２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１～２時間インキュベートする。形質転換後の変異体を、ＳＣ－ｕｒａ寒天プレート上にプレーティングし、維持した。このプロセスにより、それぞれプラスミドｐＭｙ＿４００２およびｐＭｙ＿４００３を含有する株Ｚ１９ＥＳ、Ｚ２０ＥＳが得られた。ｃｓＰＣＲ（コロニースクリーニングＰＣＲ）を実施して、プラスミドのｃＤＮＡ領域を調べた。したがって、成功した形質転換は３０３ｂｐのＤＮＡ断片をもたらし、一方、陰性対照および無鋳型対照は、ＰＣＲバンドをもたらさず、発現が確認された。
[00253]２つの株（Ｚ１９ＥＳ、Ｚ２０ＥＳ）をＳＣ－ｕｒａ寒天プレート上に維持し、一方、陰性対照をＳＣ寒天プレート上に維持した。３７℃においてバッフルのない２５０ｍＬ培養振盪フラスコ中の５０ｍＬのＳＣ－ｕｒａ／ＳＣ液体培地中で、１５０ｒｐｍで一晩振盪して、各株について一晩培養物を増殖させた。２００ｒｐｍで振盪し、０．０２ ＯＤ６００に調整した３０℃のバッフル付き１０００ｍＬ培養振盪フラスコ中の２００ｍＬのＳＣ－ｕｒａ／ＳＣ（Ｏ－ＲＤＬ－Ｒ１０＿ＴＢ培地）液体培地中に、各一晩培養物を播種した。振盪を３０℃でさらに４８時間続けた。その後、４℃において５分間、５０００ｇで遠心分離することにより細胞を収集した。その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を冷ｄＨ２Ｏで洗浄し、再び４℃において５分間、５０００ｇで遠心分離した。発現の成功を確認するために、液体窒素および乳鉢および乳棒を用いて細胞を溶解した。細胞ペレットを１０ｍＬの冷ｄＨ２Ｏに再懸濁し、溶解物を４℃において５分間、２００００ｇで回転させた。上清を０．２μｍ ＰＥＳフィルターで濾過した。濾液（両方の株）は、実施例３に記載の方法によって甘味があることが確認された。
[00254]Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ ＨｉｓＰｕｒＴＭ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を用い、効率的な固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからｈｉｓタグ付きタンパク質配列番号２０を精製した。配列番号２０は、６％架橋アガロース樹脂上に固定化したニッケル荷電ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）キレートを用いて精製した。溶解物を、調製したＩＭＡＣカラムにローディングし、カラムをＰＢＳ中の０．０２ Ｍイミダゾールで３回洗浄した後、ＰＢＳ中の０．３Ｍイミダゾールでｈｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを４回溶離し、続いて５０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターを用いて溶離画分を限外濾過した後、３ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターで濃縮し、脱塩した。
[00255]実施例１１（Ｚ１９ＥＳ株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの精製）
[00256]３つのクロマトグラフィー技術：カチオン交換（ＣＩＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現される未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎ（配列番号３）の精製の有効性について評価した。
[00257]カチオン交流評価。
[00258]未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの等電点は等電点電気泳動法により約９．５と決定され、カチオン交換カラムがｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの精製に成功し得ることが示唆された。実施例１０に記載したように調製された清澄化した細胞溶解物を、２ｘ出発緩衝液と混合して、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０中の細胞溶解物を得、それを、後で使用するために４℃で保存した。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，スウェーデン）で精製手順を行い、溶離したタンパク質をＵＶ検出器ＵＶ－９００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， スウェーデン）において２８０ｎｍおよび２１５ｎｍでモニタリングした。ＣＩＥＸ樹脂を予め充填したＰｒｅＤｉｃｔｏｒプレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， スウェーデン）を使用して、未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎの結合条件をスクリーニングした。予め充填したプレートは、３つの主な樹脂：Ｃａｐｔｏ Ｓ（強いＣＩＥＸ）、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（弱いＣＩＥＸ）、およびＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（強いＣＩＥＸ）を含有する。溶解物を２０ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム中に透析し、４～９の範囲の異なるｐＨ値をスクリーニングした後、ＨｉＳｃｒｅｅｎカラムを用いて最適条件をスケールアップした。ｐＨ５の２５ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウムを３ｍＬ／分の流速で用いて、平衡化を行った。結合タンパク質を、２５ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７を使用して、０から１Ｍまで増加する塩化ナトリウム勾配によって溶離した。さまざまな結合および溶離条件をスクリーニングし、弱いカチオン交換体であるＣａｐｔｏ ＭＭＣがｐＨ５で最良の結合能力を示した。しかしながら、この段階後の純度が低い（２５％）ため、代替的な精製段階が求められた。図７Ａは、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣからの溶離画分のＰＡＧＥ分析を示す。Ｍ：タンパク質マーカー；レーン１：溶離画分、カチオン交換後に低い純度を示す。矢印はｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎバンドを示す。
[00259]ＨＩＣ評価。
[00260]ＨｉＳｃｒｅｅｎ ＣａｐｔｏＢｕｔｙｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ， スウェーデン）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）にも細胞溶解物を付した；５つのカラム容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０を用いて平衡化を行った。次いで、３ｍＬ／分の流速で、細胞溶解物をカラムにローディングした。ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸ナトリウムを用いて、硫酸アンモニウム勾配を１から０Ｍに減少させることにより、結合タンパク質の溶離を行った。すべての得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。
[00261]図７Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されたＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌカラムからの勾配溶離中に収集された２つの溶離画分を示す。レーン１はｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを含有しない溶離画分１を示し、レーン２は溶離ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを示す。溶離画分の純度は、ＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒによって約８６％であると決定された。
[00262]ＳＥＣの評価。
[00263]次いで、未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを含有する溶離画分を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ＨＲカラム（Ｃｙｔｉｖａ， スウェーデン）を用いてさらに精製し、５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含有する緩衝液で溶離した。画分を収集し、次いで濃縮し、３ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、ドイツ）を使用して脱塩し後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
[00264]要約：未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎは弱いカチオン交換体Ｃａｐｔｏ ＭＭＣに良好に結合するが、溶離画分の比較的低い純度により、ＣＩＥＸはあまり好ましくない捕捉／中間体精製段階になった。一方、ＨＩＣ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌカラムからはより高い純度の画分が得られた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によれば、不純物は比較的大きい分子量を有すると思われ、ＳＥＣは高純度の未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを得るための重要な候補となった。
[00265]ＨＩＣ／ＳＥＣ後の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒによって約９８％である。図７Ｃは、ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００でのクロマトグラフィー後のＨＩＣカラムからの溶離タンパク質を示す。レーン１は精製されたｈｉｓタグｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを示し、レーン２は精製された未変性ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを示す。
[00266]Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから精製された精製未変性タンパク質は、訓練された感覚科学者によって０．０３ｍｇ／ｍＬで味見され（０．２ｍＬアリコート）、８°ｂｒｉｘ(約８％糖溶液）と同等の甘味を有することが見出された。甘味は非常に顕著に甘く、「クリーンな」甘味（砂糖のような味）を有し、他の香味はなく、甘味発現はわずかに遅く、甘い後味を有していた。
[00267]実施例１２（適用データ）
[00268]実施例５のように調製し、実施例５に記載したように精製したＨｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを、ヨーグルトベース中で試験した。ヨーグルトベースは、以下のレシピを有していた（表５）：
[00269]表５：
[00270]サトウキビ糖は、ヨーグルト培養物のための炭素源として添加され、少なくとも部分的に培養物によって消費される。Ｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを添加して、甘味を８°～１０°Ｂｒｉｘの糖に近づけた。ヨーグルトベース中の最終濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬである。味覚試験は訓練された感覚科学者によって実施され、ヨーグルトは８°ｂｒｉｘ(約８％の糖溶液）と同等の甘味を有することが見出された。甘味は非常に顕著に甘く、「クリーンな」甘味（砂糖のような味）を有し、他の香味はなく、甘味発現はわずかに遅く、甘い後味を有していた。
[00271]実施例５に記載のように調製され、実施例５に記載したように精製されたＨｉｓタグ付きｍｙｃｏｄｕｌｃｅｉｎを、全乳；非乳製品エンドウマメベース乳（水９３．７５％、エンドウタンパク質４．２％、キャノーラ油１．７％、ＴＩＣ Ｇｕｍ Ｂｌｅｎｄ Ｐｒｏ １８１ ＡＧ（Ａｃａｃｉａ＋Ｇｅｌｌａｎ）０．３％、ヒマワリレシチン０．０５％）；コールドコーヒー；および水（対照）において、８°～１０°Ｂｒｉｘの糖の甘味レベルをもたらすと予測される０．０４ｍｇ／ｍＬの最終濃度で試験した。甘味試験によって、甘味タンパク質はすべての試料において８°～１０°Ｂｒｉｘの間の甘味レベルを達成し、すべての試料は、水対照と同様の甘味強度、甘味発現、および持続時間を有することが確認された。
[00272]本明細書中で引用する刊行物、特許出願および特許を含むすべての文献を、各文献を個々に具体的に参考として援用すると示し、その内容のすべてをここで述べるのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用する。
[00273]本発明を記載する文脈（特に以下の請求項の範囲の文脈）における「１つの(a)」および「１つの(an)」および「その」および「少なくとも１つの」および同様の指示の用語の使用は、本明細書に別段の記載がないか、または文脈によって明確に矛盾する場合を除き、単数および複数の両者を対象とするものと解釈される。用語「少なくとも１つ」の使用と、これに続く１以上の項目のリスト（例えば、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、列挙された項目（ＡまたはＢ）から選択される１つの項目、または列挙された項目（ＡおよびＢ）のうちの２以上の任意の組合せを意味すると解釈されるべきである。語句「含む(compising)」、「有する(having)」、「包含する(including)」、および「含有する(containing)」は、特に断りのない限り、オープンエンドターム（すなわち「～を含むが限定しない」という意味）として解釈される。用語「からなる(consisting of)」はクローズエンドターム（すなわち、列挙されたもの以外の成分または段階を除外する）として解釈される。「から本質的になる」という用語は、製品または方法の機能または活性に必須ではなく、機能または活性に実質的に影響を及ぼさない成分または段階の包含を可能にする。
[00274]本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で特に指摘しない限り、その範囲内に該当する各別個の値を個々に言及するための略記法としての役割を果たすことだけを意図しており、各別個の値は、本明細書中で個々に列挙されるかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書で記載したすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、あるいは明らかに文脈に矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行することができる。本明細書中で提供される任意およびすべての例、または代表的な言語（例えば「など」）は、特に主張しない限り、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。本明細書中の言語は、主張されていない如何なる要素も本発明の実施に不可欠であることを指示していると解釈されてはならない。
[00275]本発明の好ましい態様を、発明者らが知っている本発明を実施するための最良のモードを含めて本明細書中に記載する。これらの好ましい態様の変形は、上述の記載を読めば当業者には明らかとなり得る。本発明者らは熟練者が適宜このような変形を採用することを期待しており、本発明者らは、本明細書中で具体的に説明される以外の方法で発明が実施されることを意図している。従って本発明は準拠法で容認されているように、本明細書に添付された請求項に挙げた主題の修正および等価物をすべて包含する。さらに、上記要素のすべての可能な変形でのあらゆる組み合わせが、本明細書に別段の指示がない限り、または明らかに文脈に矛盾しない限り、本発明に包含される。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５からなる群より選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；および
（ｃ）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列から、２４アミノ酸以下の欠失、挿入、置換または付加により修飾されたポリペプチド配列；
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、前記単離ポリヌクレオチド。
［態様２］甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列が、配列番号３に示されるポリペプチド配列、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列である、態様１に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様３］ポリペプチド配列が、配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含む、態様１または２に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様４］甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列が、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７５を含む、態様１または２に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様５］甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列が、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８を含む、態様４に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様６］ポリヌクレオチドが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７を含む、態様４または５に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様７］異種調節エレメントに作動可能に連結された、態様１～６のいずれか一に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様８］ポリヌクレオチド配列がヒスチジンタグをさらにコードする、態様１～７のいずれか一に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様９］態様１～８のいずれか一に記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現カセット。
［態様１０］態様１～８のいずれか一に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
［態様１１］態様１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
［態様１２］甘味調節活性を有するタンパク質の生産方法であって、甘味調節活性を有するタンパク質の生産をもたらす条件下にある培地中で態様１１に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
［態様１３］配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチド配列に関して少なくとも１つの置換修飾を含有していてもよく、または
該ポリペプチドが、ヒスチジンタグをさらに含んでいてもよく、そして
該ポリペプチドが、甘味調節活性を有する、
前記単離ポリペプチド。
［態様１４］ポリペプチドが、配列番号３、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、態様１３に記載の単離ポリペプチド。
［態様１５］ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含む、態様１３または１４に記載の単離ポリペプチド。
［態様１６］ポリペプチドが、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７５を含む、態様１３または１４に記載の単離ポリペプチド。
［態様１７］ポリペプチドが、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８を含む、態様１６に記載の単離ポリペプチド。
［態様１８］ポリヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号２に示される核酸配列；および
（ｂ）配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列；
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする、前記単離ポリヌクレオチド。
［態様１９］甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列が、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５からなる群より選択される、態様１８に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様２０］ポリヌクレオチドが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７の核酸配列を含む、態様１８または１９に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様２１］異種調節エレメントに作動可能に連結された、態様１８～２０のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様２２］（ａ）および（ｂ）のポリペプチドが、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様１８～２１のいずれか一に記載の単離ポリヌクレオチド。
［態様２３］態様１８～２２のいずれか一に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
［態様２４］態様２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［態様２５］態様２４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
［態様２６］甘味調節活性を有するタンパク質の生産方法であって、甘味調節活性を有するタンパク質の生産をもたらす条件下にある培地中で態様２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
［態様２７］以下の組み合わせを含む組成物
（ａ）経口投与用の製品、該製品はＭａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではない、および
（ｂ）単離ポリペプチドを含む甘味組成物、ここで、
（ｉ）該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉ）該ポリペプチドは、態様１３～１７のいずれか一に記載のポリペプチドであり；
該組み合わせは、経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する。
［態様２８］経口投与用の製品の味を調節するための方法であって、経口投与用の製品を、単離ポリペプチドを含む有効量の甘味組成物と組み合わせることを含む方法、ここで、
（ｉ）該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉ）該ポリペプチドは、態様１３～１７のいずれか一に記載のポリペプチドであり、
該経口投与用の製品は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではなく、そして
該組み合わせは、経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する。
［態様２９］経口投与用の製品が、食品、飲料、栄養補助食品組成物、または医薬組成物である、態様２７に記載の組成物または態様２８に記載の方法。
［態様３０］経口投与用の製品が、ベークド品；甘いベーカリー製品、甘いベーカリー製品を調製するための予め作られた甘いベーカリーミックス；パイ用フィリングおよび他の甘いフィリング、ゼラチンおよびプディング；冷凍デザート；ヨーグルト；スナックバー；パン製品；パン製品を調製するための予め作られたパンミックス；ソース、シロップおよびドレッシング；甘いスプレッド；菓子製品；および甘味付き朝食用シリアルからなる群より選択される食品製品である、態様２７に記載の組成物。
［態様３１］経口投与用の製品が、炭酸飲料；非炭酸飲料；および飲料濃縮物からなる群より選択される飲料製品である、態様２７に記載の組成物または態様２８に記載の方法。
［態様３２］甘味調節活性を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）ポリペプチドを含む組成物を得、
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して組成物を精製する、
ことを含む前記方法、ここで、
（ｉ）該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉ）該ポリペプチドは、態様１３～１７のいずれか一に記載のポリペプチドである。

Claims (31)

  1. 甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド配列が、
    （ａ）配列番号３に示されるポリペプチド配列を有するポリペプチド；および
    （ｂ）配列番号３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
    からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、前記単離ポリヌクレオチド。
  2. ポリペプチド配列が、配列番号３のポリペプチド配列から、１アミノ酸以下の欠失、挿入、置換または付加により修飾されている、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
  3. ポリペプチド配列が、配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含む、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチド。
  4. 甘味調節活性を有するポリペプチドのポリペプチド配列が、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８を含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
  5. ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７を含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
  6. 異種調節エレメントに作動可能に連結された、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
  7. ポリヌクレオチド配列がヒスチジンタグをさらにコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現カセット。
  9. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
  10. 請求項９に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  11. 甘味調節活性を有するタンパク質の生産方法であって、甘味調節活性を有するタンパク質の生産をもたらす条件下にある培地中で請求項１０に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
  12. 配列番号３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドであって、
    該ポリペプチドが、ヒスチジンタグをさらに含んでいてもよく、そして
    該ポリペプチドが、甘味調節活性を有する、
    前記単離ポリペプチド。
  13. ポリペプチドが、配列番号３に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１２に記載の単離ポリペプチド。
  14. ポリペプチド配列が、配列番号３のポリペプチド配列から、１アミノ酸以下の欠失、挿入、置換または付加により修飾されている、請求項１２に記載の単離ポリペプチド。
  15. ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸残基１～１１、１７～３２、３９、４０、４５～６７、７３～１００、および１１０～１２１を含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  16. ポリペプチドが、配列番号４のＮ末端アミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離ポリペプチド。
  17. ポリペプチドが、配列番号４のＮ末端アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離ポリペプチド。
  18. ポリペプチドが、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号６８を含む、請求項１２に記載の単離ポリペプチド。
  19. ポリヌクレオチド配列が、
    （ａ）配列番号２に示される核酸配列；および
    （ｂ）配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列；
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、甘味調節活性を有するポリペプチドをコードする、前記単離ポリヌクレオチド。
  20. ポリヌクレオチドが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７の核酸配列を含む、請求項１９に記載の単離ポリヌクレオチド。
  21. 以下の（ａ）および（ｂ）の組み合わせ：
    （ａ）経口投与用の製品、該製品はＭａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではない、および
    （ｂ）単離ポリペプチドを含む甘味組成物、
    を含み、かつＭａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフを含まない組成物であって、ここで、
    （ｉ）該単離ポリペプチドは、配列番号３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ甘味調節活性を有し；または
    （ｉｉ）該単離ポリペプチドは、請求項１２～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドであり；
    該組み合わせは、経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する、
    上記組成物。
  22. 経口投与用の製品の味を調節するための方法であって、経口投与用の製品を、単離ポリペプチドを含む有効量の甘味組成物と組み合わせることを含み、ここで、
    （ｉ）該単離ポリペプチドは、配列番号３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ甘味調節活性を有し；または
    （ｉｉ）該単離ポリペプチドは、請求項１２～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドであり、
    該経口投与用の製品は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではなく、
    該甘味組成物は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフを含まず、そして
    該組み合わせは、経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する、
    上記方法。
  23. 経口投与用の製品が、食品、飲料、栄養補助食品組成物、または医薬組成物である、請求項２１に記載の組成物。
  24. 経口投与用の製品が、食品、飲料、栄養補助食品組成物、または医薬組成物である、請求項２２に記載の方法。
  25. 経口投与用の製品が、ベークド品；甘いベーカリー製品、甘いベーカリー製品を調製するための予め作られた甘いベーカリーミックス；パイ用フィリングおよび他の甘いフィリング、ゼラチンおよびプディング；冷凍デザート；ヨーグルト；スナックバー；パン製品；パン製品を調製するための予め作られたパンミックス；ソース、シロップおよびドレッシング；甘いスプレッド；菓子製品；および甘味付き朝食用シリアルからなる群より選択される食品製品である、請求項２１に記載の組成物。
  26. 経口投与用の製品が、ベークド品；甘いベーカリー製品、甘いベーカリー製品を調製するための予め作られた甘いベーカリーミックス；パイ用フィリングおよび他の甘いフィリング、ゼラチンおよびプディング；冷凍デザート；ヨーグルト；スナックバー；パン製品；パン製品を調製するための予め作られたパンミックス；ソース、シロップおよびドレッシング；甘いスプレッド；菓子製品；および甘味付き朝食用シリアルからなる群より選択される食品製品である、請求項２２に記載の方法。
  27. 経口投与用の製品が、炭酸飲料；非炭酸飲料；および飲料濃縮物からなる群より選択される飲料製品である、請求項２１に記載の組成物。
  28. 経口投与用の製品が、炭酸飲料；非炭酸飲料；および飲料濃縮物からなる群より選択される飲料製品である、請求項２２に記載の方法。
  29. 甘味調節活性を有するポリペプチドを精製する方法であって、
    （ａ）ポリペプチドを含む組成物を得、
    （ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して組成物を精製する、
    ことを含む前記方法、ここで、
    （ｉ）該ポリペプチドは、配列番号３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ甘味調節活性を有し；または
    （ｉｉ）該ポリペプチドは、請求項１２～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドである。
  30. 以下の組み合わせ：
    （ａ）経口投与用の製品、および
    （ｂ）単離ポリペプチドを含む甘味組成物、
    を含む組成物の製造方法であって、
    該方法は、該経口投与用の製品を該甘味組成物と組み合わせることを含み、
    該単離ポリペプチドは、請求項１１に記載の方法により準備され、
    該経口投与用の製品は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではなく、
    該甘味組成物は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフを含まず、
    該組み合わせは、該経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する、
    上記製造方法。
  31. 経口投与用の製品を、単離ポリペプチドを含む有効量の甘味組成物と組み合わせることを含む、経口投与用の製品の味を調節するための方法であって、
    該単離ポリペプチドは、請求項１１に記載の方法により準備され、
    該経口投与用の製品は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフではなく、
    該甘味組成物は、Ｍａｔｔｉｒｏｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｒｆｅｚｉｏｉｄｅｓトリュフを含まず、そして
    該組み合わせは、経口投与用の製品と比較して増強された甘味を有する、
    上記方法。
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