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JP7842101B2 - ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド - Google Patents
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JP7842101B2 - ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド - Google Patents

ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド

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Description

１ 分野
本開示は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）およびＴＮＦ－αを標的化するポリペプチドに関する。本開示はまた、該ポリペプチドをコードする核酸分子および該核酸を含むベクター、ならびに該ポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物にも関する。本開示はさらに、炎症性疾患および／または自己免疫疾患に罹っている対象を処置する方法における使用のためのこれらの製品に関する。さらに、本開示は、これらの製品を生産する方法に関する。
２ 技術的背景
関節リウマチは、全世界でおよそ２５００万人の患者が罹患している重度の自己免疫疾患である（非特許文献１）。関節リウマチの主な症状は関節痛および関節腫脹である。これは、関節の滑液腔の炎症を伴う関節炎に起因する。関節リウマチのこの炎症を起こした滑液腔は、免疫細胞の浸潤および間質細胞活性化によって特徴付けられる（非特許文献２；非特許文献３）。特殊化した細胞である線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）は、このプロセスのキープレーヤーと考えられている（非特許文献４）。ＦＬＳは、マクロファージ様滑膜細胞と一緒になって滑膜の内膜内層を形成する。関節リウマチでは、ＦＬＳ増殖および免疫細胞の蓄積は炎症の引き金となり、関節リウマチの主要症状の１つである滑膜過形成として知られる膜の肥厚をもたらす。関節リウマチにおける関節炎の重要なメディエーターとして、ＦＬＳは関節リウマチ処置のための魅力的な標的細胞型となる。
ＩＬ－６は、Ｔ細胞およびＢ細胞、単球、線維芽細胞ならびに滑膜細胞を含む数多くの細胞型によって分泌される多面発現性サイトカインである。
元々はＢ細胞分化因子として同定されたタンパク質、ＩＬ－６（非特許文献５；特許文献１）と、ＩＬ－６Ｒ（非特許文献６；特許文献２）との相互作用は、ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ複合体の形成をもたらす。この複合体は、ＩＬ－６の様々な生理的作用を伝達する受容体タンパク質、ｇｐ１３０（非特許文献７；特許文献３）に結合する。ＩＬ－６は、特に、免疫応答、造血、急性期反応、骨代謝、血管新生、および炎症の制御に関与していることが現在知られている。ＩＬ－６生産の脱制御は、いくつかの自己免疫および慢性炎症性増殖性疾患プロセスの病態に関与している（非特許文献８）。ＩＬ－６（非特許文献９；特許文献４）、ＩＬ－６Ｒ（特許文献５）またはｇｐ１３０（非特許文献１０；特許文献６）に特異的に結合するポリペプチドは、ＩＬ－６の機能に対して効率的な抑制効果を示すことが判明した。
先行技術は、ＩＬ－６関連障害の予防および処置のためのヒトＩＬ－６、ヒトＩＬ－６Ｒおよびヒトｇｐ１３０タンパク質に対する抗体および抗体断片を記載している。例は、トシリズマブ（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４を参照されたい）、ＢＥ８（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８を参照されたい）およびＣｅｎｔｏｃｏｒのＣＮＴＯ－３２８（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１を参照されたい）である。ＩＬ－６関連障害の予防および処置のための当技術分野で公知の別の有効成分は、可溶性ｇｐ１３０のＦｃ融合物である（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５を参照されたい）。ＩＬ－６Ｒに対するアミノ酸配列およびナノボディならびにこれらを含むポリペプチドは、特許文献７に記載されている。
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α；ＴＮＦ－アルファは主に単球およびマクロファージによって産生されるホモ単量体サイトカインであるが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球によって分泌されることも知られている。ＴＮＦ－αは、溶解型または膜貫通型タンパク質として存在することができる。ＴＮＦ－αの主要な役割は免疫細胞の制御にある。ＴＮＦ－αは内因性発熱物質として作用し、その産生の調節異常は、炎症性腸疾患および他の炎症性疾患、例えばＲＡを含む様々なヒト疾患に関与している。
関節リウマチに対してＦＤＡにより現在承認されている処置としては、抗ＴＮＦ－α生物学的製剤（例えば、シンポニー（Ｓｉｍｐｏｎｉ）（登録商標）［ゴリムマブ］、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）［エタネルセプト］、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）［インフリキシマブ］およびヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（登録商標）［アダリムマブ］）が挙げられる。しかしながら、これらの抗ＴＮＦ－α処置は、少数の患者で完全な疾患寛解を示すにすぎず、非応答者の大部分が依然として残っている。故に、これまでのところ、かなりの割合の関節リウマチ患者の疾患寛解に関して十分な効能を示す生物学的製剤はなく、応答の欠如または喪失は依然として問題である。
複数の疾患因子を標的化することは、例えば、異なる治療標的に結合する２つの別々の生物学的製剤、例えば抗体の共投与またはコンビナトリアルな使用によって達成される。しかしながら、別々の生物学的製剤の共投与またはコンビナトリアルな使用は、実用面と商業面両方の視点から問題がある可能性がある。例えば、別々の製品の２回の注射は、患者にとってより不便でより苦痛を伴う処置レジメンをもたらし、これは、コンプライアンスに負の影響を与える可能性がある。２つの別々の製品の単回注射に関して、両方の製品の必要な濃度での許容可能な粘性と好適な安定性を可能にする配合物を提供することは、難しいかまたは不可能であり得る。加えて、共投与および共配合物は、２つの別々の薬物の生産を必要とすることから、全体コストを増加させる可能性がある。
別々の生物製剤、例えば抗体の共投与またはコンビナトリアルな使用に関連するこのような制限に対処するための１つの戦略として、２つの異なる抗原に結合することができる二重特異性抗体が示唆されてきた。
二重特異性抗体構築物が複数の様式で提唱されている。例えば、二重特異性抗体様式は、２つの抗体の化学的コンジュゲーションまたはそれらの断片を含んでいてもよい（非特許文献２６；非特許文献２７）。
しかしながら、このような二重特異性抗体様式のデメリットとしては、高濃度での高い粘性が挙げられる。これは、例えば皮下投与を難しくし、特異的結合および高親和性結合のためには各結合単位は２つの可変ドメインの相互作用を必要とするという点で、ポリペプチドの安定性および生産効率に意味を持つ。このような二重特異性抗体様式は、軽鎖の誤対合または重鎖の誤対合に関連するＣＭＣ（化学、製造および品質管理）問題につながる可能性も潜在的にある。
これまでのところ、臨床にたどり着いたＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を標的化する多重特異性、例えば二重特異性抗体構築物はない。
ＥＰ ０２５７４０６ ＥＰ ０３２５４７４ ＥＰ ０４１１９４６ ＥＰ ０３１２９９６ ＥＰ ０４０９６０７ ＥＰ ０５７２１１８ ＷＯ ０８／０２００７９
ＧＢＤ ２０１５、Ｌａｎｃｅｔ． ２０１６年１０月８日；３８８（１００５３）：１５４５～１６０２頁 Ｋｌａｒｅｓｋｏｇ，Ｃａｔｒｉｎａら、Ｌａｎｃｅｔ． ２００９年２月２１日；３７３（９６６４）：６５９～７２頁 Ｓｍｏｌｅｎ，Ａｌｅｔａｈａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｉｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ． ２０１８年２月８日；４：１８００１頁 ＢａｒｔｏｋおよびＦｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２０１０年１月；２３３（１）：２３３～５５頁 Ｈｉｒａｎｏら、１９８５、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２：５４９０～４頁 Ｙａｍａｓａｋｉら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：８２５～８頁 Ｔａｇａら、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８： ５７３～８１頁 ＩｓｈｉｈａｒａおよびＨｉｒａｎｏ、２００２、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１５９２：２８１～９６頁 Ｋｌｅｉｎら、１９９１、Ｂｌｏｏｄ、７８：１１９８～２０４頁 Ｓａｉｔｏら、１９９３、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６３：２１７～２２３頁 Ｗｏｏら、２００５、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ． ７：１２８１～８頁 Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら、２００５、Ｂｌｏｏｄ １０６：２６２７～３２頁 Ｉｔｏら、２００４、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２６：９８９～９６頁 Ｃｈｏｙら、２００２、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ４６：３１４３～５０頁 Ｂａｔａｉｌｌｅら、１９９５、Ｂｌｏｏｄ ８６：６８５～９１頁 Ｅｍｉｌｉｅら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８４：２４７２～９頁 Ｂｅｃｋら、１９９４、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３０：６０２～５頁 Ｗｅｎｄｌｉｎｇら、１９９３、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２０：２５９～６２頁 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００４、２２／１４Ｓ：２５６０頁 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００４、２２／１４Ｓ：２６０８頁 Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、２００４、１１１：５９２～５頁 Ｂｅｃｋｅｒら ２００４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２１：４９１～５０１頁 Ｄｏｇａｎｃｉら、２００５、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１５：３１３～２５頁 Ｎｏｗｅｌｌら、２００３、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１：３２０２～９頁 Ａｔｒｅｙａら、２０００、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：５８３～８頁 Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５．２２９（４７０８）：８１～８３頁 Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８７．１３９（７）：２３６７～２３７５頁
現在、関節リウマチ患者は利用可能な標準的治療処置に依然として不適切に応答するため、ＲＡを処置する改善された薬剤に対する満たされていない医学的な必要性が残っている。
発明者らは、特に関節リウマチ（ＲＡ）のような炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための新規の改善された薬剤を開発した。これらの薬剤は、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを含む２つまたは複数の疾患因子を標的化する。これらの因子は、炎症性疾患、および特にＲＡに関連する生物学的メカニズムを媒介している。
発明者らは驚くべきことに、単一の薬剤を用いたＩＬ－６およびＴＮＦ－αの二重標的化は、同じ適応症に対する単一特異性薬剤療法が十分に有効ではない可能性がある関節リウマチ患者において有効な処置を与える可能性を有することを見出した。
発明者らは、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを同時に特異的に標的化する二重特異性または多重特異性ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）構築物）が、単一特異性抗ＴＮＦ－αまたは単一特異性抗ＩＬ－６ポリペプチドと比較して関節リウマチの症状を調節する効率を向上させることを見出した。このようなポリペプチド（例えばＩＳＶＤ構築物）は、効率的に生産し（例えば微生物宿主で）、都合よく投与することができた。さらに、このようなポリペプチド（例えばＩＳＶＤ構築物）は、処置しようとする対象における既存の抗体（すなわち、抗体構築物による最初の処置の前に対象に存在する抗体）への反応性が制限されることを示すことができた。一部の実施形態においてこのようなポリペプチド（例えばＩＳＶＤ構築物）は、連続処置の回数が制限され、故にタイミングの間隔を十分にあけられるように、処置しようとする対象において十分に長い半減期を示す。
本開示のポリペプチド（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）構築物）は、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、少なくとも１つのＩＳＶＤはＴＮＦ－αに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＩＬ－６に特異的に結合する。一部の実施形態によれば、ＴＮＦ－αに結合する少なくとも１つのＩＳＶＤはヒトＴＮＦ－α（ｈＴＮＦ－α）に特異的に結合し、ＩＬ－６に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ－６（ｈＩＬ－６）に特異的に結合する。
一部の好ましい実施形態によれば、本開示のポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、血清タンパク質、例えばヒト血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり得る。
本開示のポリペプチドを発現することが可能な核酸分子、核酸または核酸分子を含むベクター、およびポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物も提供される。一部の実施形態において、組成物は医薬組成物である。
本開示によるポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含む（非ヒト）宿主または宿主細胞も提供される。
さらに、本開示によるポリペプチドを生産する方法であって、少なくとも：
ａ．好適な宿主細胞もしくは（非ヒト）宿主生物中で、または別の好適な（例えば無細胞）発現系中で、核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ．本開示によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む前記方法が提供される。
さらに、本開示は、医薬としての使用のための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もしくはベクターを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、ＲＡのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患の処置における使用のためである。
加えて、ＲＡのような炎症性疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の本開示によるポリペプチドまたは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法が提供される。一部の実施形態において、本方法は、１つまたはそれ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。
さらに、ＲＡのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための医薬（医薬組成物のような）の調製における本開示のポリペプチドまたは組成物の使用が提供される。
特に、本開示は以下の実施形態を提供する：
実施形態１．医薬としての使用のための、ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは 配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有する ＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
第１、第２および第３のＩＳＶＤは、場合により、Ｎ末端から開始する順番で含まれる、ポリペプチドまたは組成物。
実施形態２．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態１に記載の使用のための組成物。
実施形態３．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
実施形態１または２に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態４．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１～３のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、実施形態１～４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態６．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１～５のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態７．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態６に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態８．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態６～７のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態９．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態８に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１０．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含む、実施形態９に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１１．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、実施形態９～１０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１２．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態９～１１のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１３．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、実施形態９～１２のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１４．ポリペプチドは、そのＣ末端に１～５個のアミノ酸残基の伸長、好ましくは単一のアミノ酸残基の伸長を有し、アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、好ましくはグリシンまたはアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、より好ましくはアラニンおよびグリシン、最も好ましくはアラニンから独立に選択される、実施形態１～１３のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１５．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１～１４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１６．ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１～１５のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１７．関節リウマチのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患の処置における使用のため、実施形態１～１６のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態１８．少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤはＩＬ－６に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤはＩＬ－６に結合し、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤはＴＮＦ－αに結合し、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
該ＩＳＶＤは、場合により、Ｎ末端から開始する順番で含まれる、ポリペプチド。
実施形態１９．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
実施形態１８に記載のポリペプチド。
実施形態２０．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１８または１９のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態２１．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、実施形態１８～２０のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態２２．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１８～２１のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態２３．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態２２に記載のポリペプチド。
実施形態２４．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態２２～２３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
実施形態２５．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態２４に記載のポリペプチド。
実施形態２６．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含む、実施形態２５に記載のポリペプチド。
実施形態２７．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、実施形態２５～２６のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態２８．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態２５～２７のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態２９．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、実施形態２５～２８のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態３０．ポリペプチドは、そのＣ末端に１～５個のアミノ酸残基の伸長、好ましくは単一のアミノ酸残基の伸長を有し、アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、好ましくはグリシンまたはアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、より好ましくはアラニンおよびグリシン、最も好ましくはアラニンから独立に選択される、実施形態１８～２９のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態３１．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１８～３０のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態３２．配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１８～３１のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態３３．実施形態１８～３２によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
実施形態３４．実施形態３３による核酸を含む宿主または宿主細胞。
実施形態３５．実施形態１８～３２によるポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、実施形態３３による核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ）実施形態１８～３２によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法。
実施形態３６．少なくとも１つの実施形態１８～３２のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３３による核酸を含む組成物。
実施形態３７．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態３８．関節リウマチのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の、実施形態１８～３２のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態３６～３７のいずれかに記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態３９．炎症性疾患および／または自己免疫疾患は関節リウマチである、実施形態３７に記載の方法。
実施形態４０．関節リウマチのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための医薬組成物の調製における、実施形態１８～３２のいずれかに記載のポリペプチドまたは実施形態３６～３７のいずれかに記載の組成物の使用。
実施形態４１．炎症性疾患および／または自己免疫疾患は関節リウマチである、実施形態４０に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。
実施形態４２．少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
ＩＳＶＤは、場合により、Ｎ末端から開始する順番で含まれる、ポリペプチド。
実施形態４３．医薬としての使用のための、ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号１５０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１５１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号１５３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１５４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１５５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
第１、第２および第３のＩＳＶＤは、場合により、Ｎ末端から開始する順番で含まれる、ポリペプチドまたは組成物。
実施形態４４．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号１５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
実施形態４３に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態４５．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号１４８と９０％を超える配列同一性を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号１４９と９０％を超える配列同一性を有する、
実施形態４３または４４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態４６．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号１４８のアミノ酸配列を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号１４９のアミノ酸配列を有する、
実施形態４３～４５のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態４７．医薬としての使用のための、ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号１６０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１６１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号１５０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１５１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含み、
第１、第２および第３のＩＳＶＤは、場合により、Ｎ末端から開始する順番で含まれる、ポリペプチドまたは組成物。
実施形態４８．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号１５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
実施形態４７に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態４９．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号１５９と９０％を超える配列同一性を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号１４８と９０％を超える配列同一性を有する、
実施形態４７または４８のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５０．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号１５９のアミノ酸配列を有し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号１４８のアミノ酸配列を有する、
実施形態４７～４９のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５１．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態４３～５０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５２．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態５１に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５３．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態５２に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５４．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含む、実施形態５３に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５５．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、実施形態５３または５４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５６．ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態５３～５５のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５７．ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、実施形態５３～５６のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５８．ポリペプチドは、そのＣ末端に１～５個のアミノ酸残基の伸長、好ましくは単一のアミノ酸残基の伸長を有し、アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、好ましくはグリシンまたはアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、より好ましくはアラニンおよびグリシン、最も好ましくはアラニンから独立に選択される、実施形態４３～５７のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態５９．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１４７と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態４３～４６のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態６０．ポリペプチドは、配列番号１４７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態４３～４６のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態６１．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１５８と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態４７～５０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態６２．ポリペプチドは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態４７～５０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態６３．関節リウマチのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患の処置における使用のための、実施形態４３～６２のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
実施形態６４．実施形態４３～６３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
実施形態６５．実施形態６４に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。
実施形態６６．実施形態４３～６３のいずれかに記載のポリペプチドを生産する方法であって、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞または宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、実施形態６４に記載の核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ）実施形態４３～６３のいずれかに記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法。
実施形態６７．実施形態４３～６３に記載の少なくとも１つのいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態６４に記載の核酸を含む組成物。
実施形態６８．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態６７に記載の組成物。
実施形態６９．関節リウマチのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の、実施形態４３～６３のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態６７もしくは６８のいずれかに記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態７０．炎症性疾患および／または自己免疫疾患は関節リウマチである、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１．関節リウマチのような炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための医薬組成物の調製における、実施形態４３～６３のいずれかに記載のポリペプチドまたは実施形態６７もしくは６８のいずれかに記載の組成物の使用。
実施形態７２．炎症性疾患および／または自己免疫疾患は関節リウマチである、実施形態７１に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。
ＨＳＡにより捕獲されたＦ０２７２０１０６２への組換え溶解性ｈＴＮＦ－αおよびｈＩＬ－６の同時の結合を示すセンサーグラムである。 Ｇｌｏ 応答（商標）ＨＥＫ２９３＿ＮＦκＢ－ＮＬｕｃＰレポーターアッセイにおけるＩＳＶＤ Ｆ０２７２０１０６２による溶解性ヒトおよびカニクイザルＴＮＦ－αの阻害を示す代表的なグラフ（表１１の実験ｎ３）であり、参照抗ＴＮＦ－α ｍＡｂ、ＩＲＲ０００９６は、陰性対照ＩＳＶＤである。 ＩＬ－６誘導ＴＦ－１増殖アッセイにおけるＩＳＶＤ Ｆ０２７２０１０６２による溶解性ヒトおよびカニクイザルＩＬ－６の阻害を示す代表的なグラフ（表１２の実験ｎ３）であり、参照抗ＩＬ－６ ｍＡｂ１およびｍＡｂ２、ＩＲＲ０００９６は、陰性対照ＩＳＶＤである。ＬＣＩ＝下限信頼区間、ＵＣＩ＝上限信頼区間。 ９６個のヒト血清サンプル中に存在する既存の抗体の、抗ＩＬ－６／抗ＴＮＦ－α二重特異性ＩＳＶＤ Ｆ０２７２０１０６２および対照ＩＳＶＤ Ｆ０２７３０１１８６への結合を示す箱ひげ図である。 コラーゲン誘導関節炎モデルにおける進行性関節炎を示す図である。Ｎ＝１３匹のオスＤＢＡ／１マウスを、０日目および２１日目に１００μｇアジュバントＩＩ型コラーゲンで２回免疫感作した。マウスを２２日目から始めて週２回、腹腔内注射によって示された化合物で処置した。処置は５６日目後に中止した。関節炎の臨床徴候および症状についてマウスをスコア化した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、疾患経過にわたって選択された日の処置対陰性対照の比較による２元配置ＡＮＯＶＡである。 コラーゲン誘導関節炎モデルの関節炎スコア経時的曲線下面積を示す図である。ＡＵＣは、２１日目から５６日目の処置期間、５７日目から９１日目のオフ処置期、および試験期間全体について別々に計算した。個々の値および平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、処置対陰性対照の比較による１元配置ＡＮＯＶＡである。 コラーゲン誘導関節炎モデルの９１日時点の血漿中抗ＩＩ型コラーゲン抗体を示す図である。ＩＩ型コラーゲン特異的力価は、ＩＩ型コラーゲンコートプレートでＥＬＩＳＡによって決定した。個々の値および平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、処置対陰性対照の比較による１元配置ＡＮＯＶＡである。 コラーゲン誘導関節炎モデルの９１日時点の後肢中足骨関節の組織学スコアを示す図である。後肢を組織検査用に処理し、切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびに軟骨プロテオグリカン可視化用のサフラニンＯで染色した。スコアの盲検評価を２名により別々に行った。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、組織検査評価の４つの側面全てに関する処置対陰性対照の比較による２元配置ＡＮＯＶＡである。 抗ＩＬ－６、抗ＴＮＦおよび両方の組み合わせで処置したコラーゲン誘導関節炎マウス肢からのＲＮＡｓｅｑを示す図である。Ａ）アイソタイプ処置対照マウスと比較した９１日目の有意な脱制御転写物（ＦＣ＞１．２）のベン図。Ｂ）ＣＩＡにおける主な上方および下方制御パスウェイ（左）ならびに抗ＴＮＦおよび抗ＩＬ－６併用による処置後（右）。 図９－１の続き。 関節リウマチ（ＲＡ）の定量的システム薬理学（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）モデルを示す図である。モデルは、抗ＴＮＦ－アルファコンパレーターおよび抗ＩＬ－６コンパレーターで処置後の関節リウマチ疾患スコアＤＡＳ２８－ＣＲＰをシミュレートし、低用量のＦ０２７２０１０６２でも改善された臨床的効能（ＤＡＳ２８－ＣＲＰに基づく）を示す。 関節リウマチ（ＲＡ患者）由来の線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）と健康なドナー由来のＴ細胞との共培養を示す図である。共培養ならびにＩＬ－１７Ａ、ｓＩＬ－６Ｒおよび抗ＣＤ３による刺激は、ＲＡ患者由来のヒト関節における公開されているレベルに類似したレベルのＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を誘導する。 Ｆ０２７２０１０６２とのＲＡ－ＦＬＳ／Ｔ細胞共培養におけるＭＭＰ１分泌の相加的阻害を示す図である。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、多重特異性ＩＳＶＤの陰性対照である。コンパレーター抗体およびそれらの組み合わせは陽性対照として使用される。抗ＴＮＦ－α処置に応答するドナーのみが選択されている。組み合わせは、総用量の組み合わせ（例えば、２００ｎＭ抗ヒトＴＮＦ－α＋２００ｎＭ抗ヒトＩＬ－６）を反映する。Ｆ０２７２０１０６２およびＦ０２７２００９２６は、抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物である。平均±ＳＥＭ、８種の異なるＴ細胞ドナー、３回の技術的反復が示されている。 Ｆ０２７２０１０６２とのＲＡ－ＦＬＳ／Ｔ細胞共培養におけるＧ－ＣＳＦ分泌の相加的阻害を示す図である。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、多重特異性ＩＳＶＤの陰性対照である。コンパレーター抗体およびそれらの組み合わせは陽性対照として使用される。組み合わせは、総用量の組み合わせ（例えば、２００ｎＭ抗ヒトＴＮＦ－α＋２００ｎＭ抗ヒトＩＬ－６）を反映する。Ｆ０２７２０１０６２およびＦ０２７２００９２６は、抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物である。抗ＴＮＦ－α処置に応答するドナーのみが選択されている。平均±ＳＥＭ、８種の異なるＴ細胞ドナー、３回の技術的反復が示されている。 Ｆ０２７２０１０６２とのヒトアデノイド培養におけるＣＸＣＬ１３の相加的阻害を示す図である。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、Ｆ０２７２０１０６２（抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物）の陰性対照である。コンパレーター抗体およびそれらの組み合わせは陽性対照として使用される。組み合わせは、総用量の組み合わせ（例えば、２００ｎＭ抗ヒトＴＮＦ－α＋２００ｎＭ抗ヒトＩＬ－６）を反映する。平均±ＳＥＭ、４～７種の異なるドナー、２回の技術的反復が示されている。 ２００ｎＭのＦ０２７２０１０６２とのヒトアデノイド培養におけるＣＸＣＬ１３の相加的阻害を示す図である。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、Ｆ０２７２０１０６２（抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物）の陰性対照である。コンパレーター抗体およびそれらの組み合わせは陽性対照として使用される。組み合わせは、総用量の組み合わせ（２００ｎＭ抗ヒトＴＮＦ－α＋２００ｎＭ抗ヒトＩＬ－６）を反映する。平均±ＳＥＭ、７種の異なるドナー、２回の技術的反復が示されている。統計は、１元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定である。＊＊ｐ＜０．０１。＊＊ｐ＜０．００１。 ヒト全血アッセイにおける抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物のＴＮＦ－α依存的効能を示す図である。ＳＥＢ刺激全血におけるＭＣＰ－１阻害のＩＣ５０が示されている。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物の陰性対照である。抗ｈＴＮＦ－αコンパレーター抗体は陽性対照として使用される。以下の抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤを評価した：Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１、Ｆ０２７２０１０６２。平均±ＳＥＭ、７種の異なるドナーが示されている。 ヒト全血アッセイにおけるＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物のＴＮＦ－α依存的効能を示す図である。ＳＥＢ刺激全血におけるＣＣＬ４の用量依存的阻害が示されている。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物の陰性対照である。抗ｈＴＮＦ－αコンパレーター抗体は陽性対照として使用される。Ｆ０２７２０１０６２は多重特異性抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤである。平均±ＳＥＭ、７種の異なるドナーが示されている。 ヒト全血アッセイにおける抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物のＴＮＦ依存的効能を示す図である。ＳＥＢ刺激全血におけるＣＣＬ４阻害のＩＣ５０が示されている。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物の陰性対照である。抗ｈＴＮＦ－αコンパレーター抗体は陽性対照として使用される。Ｆ０２７２０１０６２は多重特異性抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤである。平均±ＳＥＭ、７種の異なるドナーが示されている。 ヒトＲＡ－ＦＬＳ（関節リウマチ患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞）における抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物のＩＬ－６依存的効能を示す図である。アイソタイプ対照に対して正規化されたＶＥＧＦ－Ａ分泌の阻害％が示されている。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物の陰性対照である。抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体（陽性対照）および以下の抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ：Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１、Ｆ０２７２０１０６２による用量依存的阻害。２つの異なる継代で試験した平均±ＳＥＭ、３種の異なる関節リウマチドナーが示されている。 ヒトＲＡ－ＦＬＳ（関節リウマチ患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞）における抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物のＩＬ－６依存的効能を示す図である。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、コンパレーター抗体の陰性対照としての役割を果たす。ＩＳＶＤアイソタイプ対照は、抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物の陰性対照である。抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体は陽性対照として使用される。抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体（陽性対照）および以下の抗ＴＮＦ－α／ＩＬ－６ ＩＳＶＤ：Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１、Ｆ０２７２０１０６２のＶＥＧＦ－ＡのＩＣ５０が示されている。２つの異なる継代で試験した平均±ＳＥＭ、３種の異なる関節リウマチドナーが示されている。 Ｔｇ１９７ ｈＴＮＦ－α誘発関節炎モデルにおけるＦ０２７２０１０６２の効能を示す図である。経時的関節炎スコア。８匹のＴｇ１９７マウス（オス４匹およびメス４匹）を、示された化合物の腹腔内注射によって５週間にわたり週２回処置した。関節炎スコアを週１回モニターした。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、週ごとの処置対陰性対照の比較による２元配置ＡＮＯＶＡである。 Ｔｇ１９７ ｈＴＮＦ－α誘発関節炎モデルにおけるＦ０２７２０１０６２の効能を示す図である。関節炎スコア経時的曲線下面積。個々の値および平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、処置対陰性対照の比較による１元配置ＡＮＯＶＡである。 足首関節（１匹あたりｎ＝２）の組織検査スコアに関するＴｇ１９７ ｈＴＮＦ－α誘発関節炎モデルにおけるＦ０２７２０１０６２の効能を示す図である。試験終了時の屠殺の際、両方の後肢を組織検査用に処理し、足首関節切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。切片スライドを判読し、盲検的にスコア化した。個々の値および平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、処置対陰性対照の比較による１元配置ＡＮＯＶＡである。 ＩＬ－６誘導ハプトグロビン分泌を示す図である。Ｎ＝８匹のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスに、示された化合物を注射した。８時間後、示された２５μｇ／ｋｇ組換えヒトＩＬ－６をマウスに腹腔内注射した。１６時間後、マウスを採血し、蛍光測定ビーズアッセイを使用して血漿をハプトグロビンについて分析した。個々の値および平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、処置対陰性対照の比較による１元配置ＡＮＯＶＡである。 ｈＩＬ－６トランスジェニックマウスにおける脾腫を示す図である。５７～７１日齢のＮ＝６～７匹のオスおよびメスのヘミ接合Ｃ．Ｂ６－Ｔｇ（Ｈ２－Ｌ－ＩＬ６）１Ｋｉｓｈ／Ｊマウスを、示された化合物による腹腔内注射で２週間の間、週２回処置した。屠殺時に、脾臓を除去し、重量を記録した。野生型同腹仔動物は対照としての役割を果たした。個々の値および平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、処置対陰性対照の比較による１元配置ＡＮＯＶＡである。 ｈＩＬ－６トランスジェニックマウスにおける高ガンマグロブリン血症を示す図である。５７～７１日齢のＮ＝６～７匹のオスおよびメスのヘミ接合Ｃ．Ｂ６－Ｔｇ（Ｈ２－Ｌ－ＩＬ６）１Ｋｉｓｈ／Ｊマウスを、示された化合物による腹腔内注射で２週間の間、週２回処置した。屠殺時にマウスを採血し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプ免疫グロブリンの両方を化学発光ビーズアッセイによって測定した。ｗｔ同腹仔動物由来の血漿は、対照としての役割を果たした。個々の値および平均±ＳＥＭが示されている。統計解析は、処置対陰性対照の比較による１元配置ＡＮＯＶＡである。 非ヒト霊長類におけるＦ０２７２０１０６２の単一用量薬物動態を示す図である。示された濃度および投与経路での非ヒト霊長類における単一用量投与後のＦ０２７２０１０６２の血清濃度プロファイル（１群あたりｎ＝３匹のオスのナイーブカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））赤い破線は、３群全てにおけるＡＤＡの確認された存在を示す。 Ｆ０２７２０１０６２アミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
本開示は、関節リウマチ（ＲＡ）のような炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための新規のタイプの薬物を提供する。
発明者らは、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を同時に標的化するポリペプチドが、単一特異性抗ＴＮＦ－αまたは抗ＩＬ－６ポリペプチドと比較して、インビトロおよび／またはインビボで関節リウマチの症状を調節する効率の向上をもたらすことを見出した。前記ポリペプチドは、効率的に生産することができる（例えば微生物宿主で）。さらに、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象における既存の抗体（すなわち、抗体構築物による最初の処置の前に対象に存在する抗体）への反応性が制限されることを示すことができた。一部の実施形態において、このようなポリペプチドは都合よく投与され、連続処置の回数が依然として制限され、故にこれらの処置がタイミングの間隔を都合よくあけられるように、処置しようとする対象において十分に長い半減期を示し得る。
ポリペプチドは少なくとも二重特異性であるが、例えば、三重特異性、四重特異性または五重特異性であってもよい。さらに、ポリペプチドは少なくとも３価であるが、例えば４価、５価または６価などであってもよく、好ましくは４価である。
用語「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」、または「五重特異性」は全て用語「多重特異性」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、または５種の異なる標的分子に結合することを指す。用語「２価」、「３価」、「４価」、「５価」、または「６価」は全て用語「多価」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、または５種の結合単位（ＩＳＶＤのような）の存在を示す。例えば、ポリペプチドは、三重特異性４価、例えば４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであってもよく、この場合、１つのＩＳＶＤはヒトＴＮＦ－αに結合し、２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ－６に結合し、１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミンに結合する（例えば、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２）。このようなポリペプチドは、例えば２つのＩＳＶＤがヒトＩＬ－６上の２つの異なるエピトープと結合する場合、同時にバイパラトピックであり得る。用語「バイパラトピック」は、同じ標的分子の２つの異なる部分（例えば、エピトープ）に結合することを指す。
用語「第１のＩＳＶＤ」、「第２のＩＳＶＤ」、「第３のＩＳＶＤ」などは、本明細書で使用される場合、１つ、２つ、３つなどのＩＳＶＤの存在のみを示すが、好ましくは、互いに対するＩＳＶＤの相対的な位置も示し、番号付けは、本開示のポリペプチドのＮ末端から開始される。したがって「第１のＩＳＶＤ」は、好ましくは、「第２のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近く、それに対して「第２のＩＳＶＤ」は、「第３のＩＳＶＤ」などよりＮ末端に近い。したがって、Ｃ末端から考える場合、ＩＳＶＤの配置は逆である。番号付けは絶対ではなく、少なくとも３つのＩＳＶＤの相対的な位置を示すに過ぎないことがあるため、ＴＮＦ－αまたはＩＬ－６に結合する他の結合単位／ビルディングブロック、例えば追加のＩＳＶＤ、または別の標的に結合するＩＳＶＤがポリペプチド中に存在し得ることは排除されない。さらに、番号付けは、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがその間に配置され得る可能性を排除しない。例えば、下記でさらに記載されるように（特に、セクション５．３「（インビボでの）半減期の延長」を参照）、ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに結合する別のＩＳＶＤをさらに含んでいてもよく、これも、例えば「第１のＩＳＶＤ」と「第２のＩＳＶＤ」との間に配置されていてもよい。
上記の観点から、本開示は、少なくとも１つのＩＳＶＤがＴＮＦ－αに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤがＩＬ－６に特異的に結合する、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドを提供する。
ポリペプチドの構成要素、例えばＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上の好適なリンカー、例えばペプチド性リンカーによって互いに連結されていてもよい。
２またはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのリンカーの使用は当業界において周知である。例示的なペプチド性リンカーは、表Ａ－５に示される。使用されることが多いペプチド性リンカーのクラスの１つは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして公知である。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、通常、ＧＧＧＧＳ（配列番号６５）モチーフ（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを有し、ｎは、１、２、３、４、５、６、７またはそれより多くであり得る）などのペプチドモチーフの１つまたはそれ以上の反復を含む。このようなＧＳリンカーの一部の使用されることが多い例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号６８）１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７～１３６９；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４）２７（１０）：３２５～３３０が参照される。
本開示のポリペプチドでは、一部の実施形態において、ポリペプチドの構成要素を互いに連結するために、９ＧＳリンカーの使用が選択される。
一実施形態において、ＴＮＦ－αに特異的に結合するＩＳＶＤは、ポリペプチドのＣ末端に位置する。発明者らは、驚くべきことに、このような立体配置は、化合物の効力を有意に増加させることも、溶解性および発現レベルのような化合物の最適な生産に重要ないくつかの特徴を改善することもできることを見出した。
また、一実施形態において、ＩＬ－６に特異的に結合するＩＳＶＤの１つは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＮ末端に位置する。
したがって、一部の実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下を含むかまたはそれからなる：ＩＬ－６に特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、本明細書で定義される増加した半減期を有するポリペプチドを提供する任意選択の結合単位、ＩＬ－６に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、およびＴＮＦ－αに特異的に結合する第３のＩＳＶＤ。好ましい実施形態において、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する結合単位はＩＳＶＤである。
一部の実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下を含むかまたはそれからなることが提供される：ＩＬ－６に特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、リンカー、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＩＬ－６に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、リンカー、およびＴＮＦ－αに特異的に結合するＩＳＶＤ。一部の実施形態において、リンカーは９ＧＳリンカーである。
ポリペプチドのこのような立体配置は、生産収率の増加、優れたＣＭＣ特性、ならびに最適化された機能性および免疫応答のモジュレーションに関するより強い効力をもたらすことができる。
したがって、一部の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１２０ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１３０ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１４０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１４５ｍｇ／ｍｌの溶解性を示す。
一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、ヒト血清中の既存の抗体による結合の低減を示す。この目的を達成するために、一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中（好ましくはポリペプチドのＣ末端に位置する少なくともＩＳＶＤ中）、または各ＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を有する。別の実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在する、天然に存在しない、またはその混合物のいずれかの１～５個のアミノ酸の伸長、例えばＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）伸長を有する。ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＴＶＳＳ（配列番号８１）であってもよい。別の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中（好ましくはポリペプチドのＣ末端に位置する少なくともＩＳＶＤ中）、または各ＩＳＶＤ中に、１１０位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を有する。別の実施形態において、ＩＳＶＤは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中（好ましくはポリペプチドのＣ末端に位置する少なくともＩＳＶＤ中）、または各ＩＳＶＤ中に、１１２位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）。一部の実施形態において、単一のアラニンを付加した後、ポリペプチドのＣ末端が、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号９０）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号９１）、ＶＱＶＳＳＡ（配列番号９２）、ＶＴＶＫＳＡ（配列番号９３）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号９４）、ＶＫＶＫＳＡ（配列番号９５）、ＶＫＶＱＳＡ（配列番号９６）、ＶＱＶＫＳＡ（配列番号９７）、またはＶＱＶＱＳＡ（配列番号９８）を有するように、ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＫＶＳＳ（配列番号８２）、ＶＱＶＳＳ（配列番号８３）、ＶＴＶＫＳ（配列番号８４）、ＶＴＶＱＳ（配列番号８５）、ＶＫＶＫＳ（配列番号８６）、ＶＫＶＱＳ（配列番号８７）、ＶＱＶＫＳ（配列番号８８）、またはＶＱＶＱＳ（配列番号８９）である。一実施形態において、配列はＶＫＶＳＳＡである（配列番号９１）。別の実施形態において、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）、場合により、少なくとも１つのＩＳＶＤ中（好ましくはポリペプチドのＣ末端に位置する少なくともＩＳＶＤ中）に、１１０位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）、好ましくはＫ（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を有し、天然に存在する、天然に存在しない、またはそれらの混合物のいずれかの１～５個のアミノ酸の伸長、例えばＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）伸長を有する（ポリペプチドのＣ末端が、例えば配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号９０）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号９１）、またはＶＱＶＳＳＡ（配列番号９２）を有するように）。これに関するさらなる情報については、各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる、例えばＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５を参照されたい。伸長に使用されるアミノ酸残基は、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、より好ましくはグリシンおよびアラニン、最も好ましくはアラニンから独立に選択される。好ましくは、伸長は単一のアミノ酸残基からなる。
一実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、４つのＩＳＶＤのＣＤＲは、それぞれ下記のセクション「５．１免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「５．３（インビボにおける）半減期の延長」に記載の項目Ａ～Ｄ（またはＫａｂａｔの定義を使用する場合、Ａ’～Ｄ’）で定義された通りであり、特に：
・ＩＬ－６に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－６に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＴＮＦ－αに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；ならびに
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し、
または代替としてＫａｂａｔの定義を使用する場合：
・ＩＬ－６に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－６に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；
・ＴＮＦ－αに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有し；ならびに
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。
一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
本開示のポリペプチドは、一部の実施形態において、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、ヒトＴＮＦ－αおよびヒトＩＬ－６に対して少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより多い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
５．１ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）は、「単一可変ドメイン」と同義的に使用され、これは、免疫グロブリン分子であって、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、それにより形成されるものを定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）またはその断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ）とは別に設定している。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨとＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与することになり、すなわち合計６つのＣＤＲが、抗原結合部位形成に関与することになる。
上記の定義を考慮すれば、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子；当業界において公知）の、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、例えばジスルフィドで連結されたＦｖまたはｓｃＦｖ断片、もしくはこのような従来の４鎖抗体由来のダイアボディ（全て当業界において公知）の抗原－結合ドメインは通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとみなされないが、これは、これらの場合では、抗原のそれぞれのエピトープに結合することは通常、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインによって起こるのではなく、一対の（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインによって、すなわち連帯してそれぞれの抗原のエピトープに結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬ対によって起こるためである。
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合せずに抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ、単一のＶＨＨまたは単一のＶＬドメインによって形成される。
したがって、単一の抗原結合単位（すなわち、機能的な抗原結合単位を形成するのに、単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位）を形成することが可能である限りは、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ－配列）もしくはその好適な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ－配列またはＶＨＨ配列）もしくはその好適な断片であり得る。
免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、例えば重鎖ＩＳＶＤであってもよく、例えばＶＨ、ＶＨＨ、例えばラクダ化ＶＨまたはヒト化されたＶＨＨなどであってもよい。一部の実施形態によれば、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、ラクダ化ＶＨまたはヒト化ＶＨＨを含むＶＨＨである。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体または重鎖抗体由来であってもよい。
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（またはｄＡｂとして使用するのに好適なアミノ酸配列）、もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書で定義される通りであり、その例としては、これに限定されないが、ＶＨＨが挙げられる）；他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれか１つのあらゆる好適な断片であり得る。
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（例えばＶＨＨ、例えばヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨなど）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である。
「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても公知であり、これは元々、「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠失した抗体」の；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６～４４８、１９９３）免疫グロブリンの可変ドメインと結合する抗原として説明されていた。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体（本明細書では「ＶＨドメイン」と称される）に存在する重鎖可変ドメインおよび従来の４鎖抗体（本明細書では「ＶＬドメイン」と称される）に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために選択された。ＶＨＨのさらなる説明のために、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総論（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７～３０２頁、２００１）、および一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ ＢｒｕｓｓｅｌのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９およびＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１およびＷＯ０２／４８１９３；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６およびＷＯ０３／０５５５２７；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．およびＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．のＷＯ０３／０５０５３１；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ＣａｎａｄａによるＷＯ０１／９０１９０；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；ならびにＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７およびＷＯ０６／１２２８２５が参照され、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
典型的には、免疫グロブリンの生成は、実験動物の免疫化、免疫グロブリンを生産する細胞を融合してハイブリドーマを作り出すこと、および望ましい特異性に関してスクリーニングすることを含む。代替として、免疫グロブリンは、ナイーブまたは合成ライブラリーを、例えばファージディスプレイによってスクリーニングすることによって生成してもよい。
免疫グロブリン配列、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の生成は、様々な出版物で広範囲に説明されており、その中でもＷＯ９４／０４６７８、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら １９９３およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら ２００１（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７～３０２頁、２００１）を例示することができ、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる。これらの方法において、前記標的抗原に対する免疫応答を誘導するために、ラクダ科動物が標的抗原で免疫化される。前記免疫化から得られたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのレパートリーはさらに、標的抗原と結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓに関してスクリーニングされる。
これらの例において、抗体の生成は、免疫化および／またはスクリーニングのために精製した抗原を必要とする。抗原は、天然源から精製してもよいし、または組換え体生産の過程で精製してもよい。
免疫グロブリン配列の免疫化および／またはスクリーニングは、このような抗原のペプチド断片を使用して実行することができる。
マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ科動物免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列が使用される。本開示はまた、完全ヒト、ヒト化またはキメラ配列も含む。例えば、本開示は、ラクダ科動物免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ科動物免疫グロブリン配列、またはラクダ化ドメイン抗体、例えば、Ｗａｒｄらによって記載されるようなラクダ化ｄＡｂを含む（例えばＷＯ９４／０４６７８およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．、３３９：２８５～２９０頁、１９９４およびＰｒｏｔ． Ｅｎｇ．、９：５３１～５３７頁、１９９６を参照、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。さらに、本開示はまた、例えば多価および／または多重特異性構築物を形成する融合した免疫グロブリン配列（１つまたはそれ以上のＶＨＨドメインを含有する多価および多重特異性ポリペプチドならびにそれらの調製については、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ． ２７６、１０． ７３４６～７３５０頁、２００１、ならびに例えばＷＯ９６／３４１０３およびＷＯ９９／２３２２１も参照され、これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる）、ならびにタグまたは他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射化学物質などを含む免疫グロブリン配列も使用し、これらは本開示の免疫グロブリン配列から誘導可能である。
「ヒト化ＶＨＨ」は、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」されている、すなわち、前記天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の（特にフレームワーク配列中の）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、ヒトからの従来の４鎖抗体（例えば上記で示された）からのＶＨドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってヒト化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書および文献（例えば、参照によってその全体を組み入れるＷＯ２００８／０２００７９）のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。ここでも注目すべきことに、このようなヒト化ＶＨＨは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。
「ラクダ化ＶＨ」は、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、すなわち、従来の４鎖抗体からの天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインにおける対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってラクダ化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書や文献（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に記載のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。このような「ラクダ化」置換は、ＶＨ－ＶＬの境界を形成する、および／またはそこに存在するアミノ酸位置に、および／または本明細書で定義されるようないわゆるラクダの特徴的な残基に挿入され得る（例えばＷＯ９４／０４６７８ならびにＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４および１９９６）、上記を参照）。一部の実施形態において、ラクダ化ＶＨを生成または設計するための出発材料または開始点として使用されるＶＨ配列は、哺乳動物からのＶＨ配列、またはヒトのＶＨ配列、例えばＶＨ３配列である。しかしながら、注目すべきことに、このようなラクダ化ＶＨは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。
１つまたはそれ以上の免疫グロブリン配列は、互いにおよび／または他のアミノ酸配列に連結されて（例えばジスルフィド架橋を介して）、同様に有用であり得るペプチド構築物（例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ構築物、「ダイアボディ」および他の多重特異性構築物）を提供できることに留意すべきである。例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎによる総論、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６～３６頁が参照される。一般的に、ポリペプチドが対象への投与を意図される場合（例えば、予防、治療および／または診断目的で）、ポリペプチドは、前記対象には天然に存在しない免疫グロブリン配列を含み得る。
免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の構造の非限定的な例は、４つのフレームワーク領域（「ＦＲ」）からなるとみなすことができ、４つのＦＲは、当業界および本明細書ではそれぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）；「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）；「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）；および「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）と呼ばれ；これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）によって遮られ、３つのＣＤＲは、当業界および本明細書ではそれぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）；「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）；および「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）と呼ばれる。
ＷＯ０８／０２００７９（参照によって本明細書に組み入れる）の５８頁および５９頁の段落ｑ）でさらに記載されるように、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２０００（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０（１～２）：１８５～１９５頁；例えばこの出版物の図２を参照）の論文でラクダ科動物からのＶＨＨドメインに適用されている通り、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１）によって付与されたＶＨドメインの一般的な番号付けに従って番号付けすることができる。注目すべきことに、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインに関して当業界において周知の通り、ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変化することがあり、Ｋａｂａｔの番号付けによって示されたアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる１つまたはそれ以上の位置が実際の配列において占有されていなくてもよいし、または実際の配列がＫａｂａｔの番号付けによって許容される数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）。これは、一般的に、Ｋａｂａｔによる番号付けは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号付けに対応していてもよいし、または対応していなくてもよいことを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、通常、１１０～１２０の範囲となり、１１２～１１５となることが多い。しかしながら、注目すべきことに、それより短い配列およびそれより長い配列も、本明細書に記載される目的にとって好適であり得る。
本出願において、別段の指定がない限り、ＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２０１０年編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｍａｒｔｉｎ、第３章、３３～５１頁）に記載されたように、ＡｂＭの番号付けに従って決定された。この方法によれば、ＦＲ１は、１～２５位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は、２６～３５位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、３６～４９位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ２は、５０～５８位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は、５９～９４位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は、９５～１０２位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は、１０３～１１３位にアミノ酸残基を含む。
ＣＤＲ領域の決定は、異なる方法に従って行ってもよい。ＫａｂａｔによるＣＤＲ決定において、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は、１～３０位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は、３１～３５位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は、３６～４９位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は、５０～６５位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は、６６～９４位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は、９５～１０２位にアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は、１０３～１１３位にアミノ酸残基を含む。
このような免疫グロブリン配列において、フレームワーク配列は、あらゆる好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的な教本、および本明細書で述べられたさらなる開示および先行技術に基づき当業者には明らかであろう。
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列または免疫グロブリンフレームワーク配列から得られた（例えば、ヒト化またはラクダ化によって）フレームワーク配列（の好適な組合せ）であり得る。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）および／または重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列またはＶＨＨ配列）から得られたフレームワーク配列であり得る。一実施形態において、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列から得られたフレームワーク配列（それにおいて、前記フレームワーク配列が、場合により、部分的または完全にヒト化されていてもよい）であるか、または従来のラクダ化ＶＨ配列（本明細書で定義される通り）であるかのいずれかである。
特に、本明細書で開示される通りＩＳＶＤ配列に存在するフレームワーク配列は、ＩＳＶＤ配列が、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、例えばヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨを含むＶＨＨになるように、特徴的な残基（本明細書で定義される通り）の１つまたはそれ以上を含有していてもよい。このようなフレームワーク配列の一部の非限定的な例（その好適な組合せ）は、本明細書に記載のさらなる開示から明確になるであろう。
ここでも、本明細書において免疫グロブリン配列に関して一般的に記載される通り、また、前述のもののいずれかの好適な断片（または断片の組合せ）、例えば、好適には１つまたはそれ以上のフレームワーク配列が隣接する、および／またはそれを介して連結された１つまたはそれ以上のＣＤＲ配列を含有する断片（例えば、これらのＣＤＲおよびフレームワーク配列は、断片がそれから得られた完全サイズの免疫グロブリン配列において生じ得る同じ順番で）を使用することも考えられる。
しかしながら、注目すべきことに、開示は、ＩＳＶＤ配列（またはそれを発現させるのに使用されるヌクレオチド配列）の起源にも、ＩＳＶＤ配列またはヌクレオチド配列が生成される（または生成された）または得られる方法にも限定されない。したがって、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）であってもよいし、または合成もしくは半合成の配列であってもよい。具体的な、ただし非限定的な態様において、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）または合成もしくは半合成の配列であり、その例としては、これらに限定されないが、「ヒト化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列（例えば部分的または完全にヒト化されたマウスまたはウサギ免疫グロブリン配列、特に、部分的または完全にヒト化されたＶＨＨ配列）、「ラクダ化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列、加えて、親和性成熟（例えば、合成、ランダムまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列から得られた断片を組み合わせること、オーバーラップするプライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、および当業者周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似の技術；または前述のもののいずれかのあらゆる好適な組合せなどの技術により得られた免疫グロブリン配列が挙げられる。
同様に、ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列または合成もしくは半合成の配列であってもよく、例えば、好適な天然に存在するテンプレートからＰＣＲによって単離される配列（例えば細胞から単離したＤＮＡまたはＲＮＡ）、ライブラリー（特に、発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、天然に存在するヌクレオチド配列に突然変異を導入すること（それ自体公知のあらゆる好適な技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用して）によって調製されるヌクレオチド配列、オーバーラップするプライマーを使用するＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体公知のＤＮＡ合成のための技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。
上述したように、ＩＳＶＤは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）およびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．、Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏｍｐａｎｙの登録商標である）の一般的な説明については、以下のさらなる説明、および本明細書において引用された先行技術が参照される。しかしながら、この点において、この説明および先行技術は、主として、いわゆる「ＶＨ３クラス」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（すなわち、ＤＰ－４７、ＤＰ－５１またはＤＰ－２９などのＶＨ３クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））を説明したものであることに留意すべきである。しかしながら、本開示は、その最も広い意味で、一般的にあらゆるタイプのＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を使用することができ、例えば参照によってその全体を組み入れるＷＯ２００７／１１８６７０に記載の、例えばいわゆる「ＶＨ４クラス」に属するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（すなわち、ＤＰ－７８などのＶＨ４クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））も使用することに留意すべきである。
一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（特にＶＨＨ配列、例えば（部分的に）ヒト化ＶＨＨ配列およびラクダ化ＶＨ配列など）は、フレームワーク配列（ここでも本明細書にさらに記載される通り）の１つまたはそれ以上における１つまたはそれ以上の「特徴的な残基」（本明細書に記載される通り）の存在によって特徴付けることができる。したがって、一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列と定義することができ、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、特徴的な残基の１つまたはそれ以上は、さらに本明細書で定義される通りである。
詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列は、さらに本明細書で定義される通りである。
より詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し：
Ｋａｂａｔの番号付けに従って１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８位におけるアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が、以下の表Ｘに記載した特徴的な残基から選択される。
本明細書において示されるＦＲは、場合により本明細書に記載の特定の位置にアミノ酸を有する、表Ａ－２（またはＫａｂａｔの番号付けの表Ａ－２．１）に示されたＦＲから、好ましくは同じクローン（すなわち、同じ行に示されたＦＲ）から好適には選択することができる。
一部の実施形態において、１１位における特徴的な残基はＬである。一部の実施形態において、３７位における特徴的な残基はＦ（１）またはＹである。一部の実施形態において、４４位における特徴的な残基はＧ（２）またはＱ（３）である。一部の実施形態において、４５位における特徴的な残基はＬ（２）またはＲ（３）である。一部の実施形態において、４７位における特徴的な残基はＦ（１）、Ｌ（１）またはＷ（２）である。一部の実施形態において、８３位における特徴的な残基はＫである。一部の実施形態において、８４位における特徴的な残基はＰである。一部の実施形態において、１０３位における特徴的な残基はＷである。一部の実施形態において、１０４位における特徴的な残基はＧである。一部の実施形態において、１０８位における特徴的な残基はＱまたはＬである。
さらに、１位にＮ末端グルタミン酸（Ｅ）を有するＩＳＶＤがポリペプチドのＮ末端に位置する場合、グルタミン酸は、好ましくはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。故に、例えば、配列番号３、４または５がポリペプチドのＮ末端にあるならば、１位におけるＥはＤに変更される。逆に、例えば、配列番号２がポリペプチドのＮ末端に存在しないならば、１位におけるＤはＥに変更される。
本開示はとりわけ、ＴＮＦ－αまたはＩＬ－６に特異的に結合することができるＩＳＶＤを使用する。本開示に関して、特定の標的分子「に結合すること」は、抗体およびそのそれぞれの抗原に関して理解される当業界における通常の意味を有する。
本開示のポリペプチドは、ＴＮＦ－αに結合する１つまたはそれ以上のＩＳＶＤ、およびＩＬ－６に結合する２つまたはそれ以上のＩＳＶＤを含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、ＴＮＦ－αに結合する１つのＩＳＶＤ、およびＩＬ－６に結合する２つのＩＳＶＤを含んでいてもよい。
一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＳＶＤは、その標的分子を機能的にブロックすることができる。例えば、標的化部分は、ＴＮＦ－αとＴＮＦＲ（ＴＮＦ受容体）との相互作用をブロックすることができ、またはＩＬ－６とＩＬ－６Ｒ（インターロイキン６受容体）との相互作用をブロックすることができる。したがって、一実施形態において、本開示のポリペプチドは、ＴＮＦ－αに特異的に結合し、ＴＮＦＲとのその相互作用を阻害する少なくとも１つのＩＳＶＤ、およびＩＬ－６に特異的に結合し、ＩＬ－６Ｒとのその相互作用を機能的にブロックする２つのＩＳＶＤを含む。したがって、好ましい実施形態において、本開示のポリペプチドは、ＩＬ－６に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含み、そのうちの１つは、ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの相互作用を機能的にブロックする。
本開示で使用されるＩＳＶＤは、ポリペプチドがＴＮＦ－αおよびＩＬ－６に特異的に結合することができるように、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる本開示のポリペプチドの一部を形成する。
したがって、本開示のポリペプチドで使用される少なくとも３つのＩＳＶＤの標的分子は、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６である。その例は、哺乳動物ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６である。ヒトＴＮＦ－α（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１３７５）およびヒトＩＬ－６（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０５２３１）が使用されるが、他の種からのバージョン、例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル（本明細書では「カニクイザル」としても言及される）、またはラクダ科動物、例えばラマもしくはアルパカからのＴＮＦ－αおよびＩＬ－６も本開示に適している。
本開示で使用できるＴＮＦ－αまたはＩＬ－６に特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、以下の項目Ａ～Ｃに記載される通りである：
Ａ．ヒトＩＬ－６に特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
ヒトＩＬ－６に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に構築物１７Ｃ０４に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ａで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物１７Ｃ０４の全長アミノ酸配列を有する（配列番号２、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。
また、一実施形態において、ヒトＩＬ－６に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ａで定義された通りである。一部の実施形態において、ＩＬ－６に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
ＩＬ－６に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ａ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、一部の実施形態において、ＩＳＶＤは、ヒトＩＬ－６に対して構築物１７Ｃ０４の少なくとも半分の結合親和性、好ましくは少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
Ｂ．ヒトＩＬ－６に特異的に結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
ヒトＩＬ－６に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に６Ｂ１２構築物に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｂで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物６Ｂ１２の全長アミノ酸配列を有する（配列番号４、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。
また、一実施形態において、ヒトＩＬ－６に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ｂで定義された通りである。一部の実施形態において、ＩＬ－６に結合するＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。
ＩＬ－６に結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｂ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、一部の実施形態において、ＩＳＶＤは、ヒトＩＬ－６に対して構築物６Ｂ１２の少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
Ｃ．ヒトＴＮＦ－αに特異的に結合し、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
ヒトＴＮＦ－αに特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に構築物６Ｃ１１に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｃで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物６Ｃ１１の全長アミノ酸配列を有する（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。
また、一実施形態において、ヒトＴＮＦ－αに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ｃで定義された通りである。一部の実施形態において、ＴＮＦ－αに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。
ＴＮＦ－αに特異的に結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｃ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、ＩＳＶＤは、ＴＮＦ－αに対して構築物６Ｃ１１の少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
一部の実施形態において、上記の項目Ａ～Ｃで定義されるＩＳＶＤのそれぞれは、本開示のポリペプチドに含まれる。一部の実施形態において、上記の項目Ａ～Ｃで定義されるＩＳＶＤのそれぞれを含む本開示のこのようなポリペプチドは、ヒトＴＮＦ－αおよびヒトＩＬ－６に対して、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドの少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより多くの結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
上記の項目Ａ～Ｃで言及される配列番号は、ＡｂＭの定義によるＣＤＲの定義（表Ａ－２を参照）に基づく。Ｋａｂａｔ定義により同じＣＤＲを定義する配列番号（表Ａ－２．１を参照）は、同様に、上記の項目Ａ～Ｃで使用することができることに留意する。
したがって、ＡｂＭの定義を使用して上述したように本開示で使用できるＴＮＦ－αまたはＩＬ－６に特異的に結合する具体的なＩＳＶＤは、下記の項目Ａ’～Ｃ’に記載の通りＫａｂａｔ定義を使用して記載することもできる：
Ａ’．ヒトＩＬ－６に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号３７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
ヒトＩＬ－６に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物１７Ｃ０４に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ａ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物１７Ｃ０４の全長アミノ酸配列を有する（配列番号２、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。
Ｂ’．ヒトＩＬ－６に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３９のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号３９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
ヒトＩＬ－６に特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物６Ｂ１２に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｂ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物６Ｂ１２の全長アミノ酸配列を有する（配列番号４、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。
Ｃ’．ヒトＴＮＦ－αに特異的に結合し、
ｉ．配列番号３６のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４０のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号４０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号４０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
ヒトＴＮＦ－αに特異的に結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物６Ｃ１１に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｃ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物６Ｃ１１の全長アミノ酸配列を有する（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。
第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と同一な、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を掛けることによって計算することができ、この場合、第１のアミノ酸配列と比較した場合の第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の欠失、挿入、置換または付加のそれぞれは、単一のアミノ酸残基（すなわち単一の位置）における差としてみなされる。
通常、上記で概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１の」アミノ酸配列として取り扱われることになり、その他のアミノ酸配列が「第２の」アミノ酸配列として取り扱われることになる。
「アミノ酸の差異」は、本明細書で使用される場合、参照配列に相対する単一のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を指す。一部の実施形態において、アミノ酸の差異は、置換である。所与の参照配列とのより少ないアミノ酸の差異が一般的に好ましい。例えば、ＣＤＲが所与の配列番号と２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、１つのアミノ酸の差異が好ましい。
一部の実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換である。一部の実施形態において、このような保存的置換は、以下のグループ（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換されている置換である：（ａ）小さい脂肪族の、非極性の、またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負電荷を有する残基およびその（非荷電性）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族の、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。
一部の実施形態において、保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙへの、またはＳｅｒへの；ＡｒｇからＬｙｓへの；ＡｓｎからＧｌｎへの、またはＨｉｓへの；ＡｓｐからＧｌｕへの；ＣｙｓからＳｅｒへの；ＧｌｎからＡｓｎへの；ＧｌｕからＡｓｐへの；ＧｌｙからＡｌａへの、またはＰｒｏへの；ＨｉｓからＡｓｎへの、またはＧｌｎへの；ＩｌｅからＬｅｕへの、またはＶａｌへの；ＬｅｕからＩｌｅへの、またはＶａｌへの；ＬｙｓからＡｒｇへの、Ｇｌｎへの、またはＧｌｕへの；ＭｅｔからＬｅｕへの、Ｔｙｒへの、またはＩｌｅへの；ＰｈｅからＭｅｔへの、Ｌｅｕへの、またはＴｙｒへの；ＳｅｒからＴｈｒへの；ＴｈｒからＳｅｒへの；ＴｒｐからＴｙｒへの；ＴｙｒからＴｒｐへの；および／またはＰｈｅからＶａｌへの、Ｉｌｅへの、またはＬｅｕへの置換。
５．２ 特異性
用語「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、特定の結合単位、例えばＩＳＶＤが十分に高い親和性で結合することができる、同じ生物からの抗原などの異なる標的分子の数を指す（下記を参照）。「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、本明細書において、「選択性」、「選択的に結合する」または「選択的な結合」と同義的に使用される。実施形態によれば、結合単位、例えばＩＳＶＤは、その指定された標的に特異的に結合する。
結合単位の特異性／選択性は、親和性に基づいて決定することができる。親和性は、分子相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、一般的に、モル／リットル（またはＭ）の単位を有するＫＤ、または解離定数によって示される。親和性はまた、１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）－１（またはＭ－１）の単位を有する会合定数、ＫＡとして表すこともできる。
親和性は、部分と標的分子上の結合部位との間の結合強度の尺度であり：ＫＤ値が低いほど、標的分子と標的化部分との間の結合強度はより強くなる。
典型的には、本開示で使用される結合単位（例えばＩＳＶＤ）は、１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満、例えば１０－７～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満、より具体的には例えば１０－８～１０－１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）（すなわち、１０５～１０１２リットル／モルまたはそれより多く、例えば１０７～１０１２リットル／モルまたはそれより多く、より具体的には例えば１０８～１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ））でその標的に（室温で）結合する。
一般的に、１０－４モル／リットルより大きいあらゆるＫＤ値（または１０４リットル／ｍｏｌより低いあらゆるＫＡ値）が、非特異的な結合を示すとみなされる。
生物学的な相互作用のＫＤ、例えば、特異的とみなされる免疫グロブリン配列の抗原への結合のＫＤは、典型的には、１０－５モル／リットル（１００００ｎＭまたは１０μＭ）～１０－１２モル／リットル（０．００１ｎＭまたは１ｐＭ）またはそれ未満の範囲内である。
したがって、特異的／選択的な結合は、同じ測定方法、例えばＳＰＲを使用した場合、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）は、ＴＮＦ－αおよび／またはＩＬ－６に１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、関連するサイトカインに１０－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合することを意味し得る。ＴＮＦ－αに関連するサイトカインの例は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬである。ＩＬ－６に関連するサイトカインの例は、ＩＬ－６ファミリーメンバーＩＬ－１１、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ－１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、およびＩＬ－２７である。故に、一実施形態において、ポリペプチド中に含まれる少なくとも１つのＩＳＶＤは、ＴＮＦ－αに１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、同じ種のＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬに１０－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合し、ポリペプチド中に含まれる少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＩＬ－６に１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、同じ種のＩＬ－１１、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ－１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ＩＬ－２７に１０－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合する。
故に、一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、ヒトＴＮＦ－αおよびヒトＩＬ－６に対して少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
特定の種からの特定の標的への特異的結合は、結合単位が、異なる種からの類似した標的にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。例えば、ヒトＴＮＦ－αへの特異的結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザルからのＴＮＦ－αにも特異的に結合する可能性があることを排除しない。同様に、例えば、ヒトＩＬ－６への特異的結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）からのＩＬ－６にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。
結合単位の、その指定された標的への特異的な結合は、それ自体公知のあらゆる好適な方式、これらに限定されないが、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびにそれ自体当業界において公知のそれらの様々な改変法；加えて本明細書で述べられる他の技術で決定することができる。
解離定数は、当業者には明らかであろうが、実際の解離定数であってもよいし、または見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定するための方法は、当業者には明らかであり、その例としては、下記で述べられる技術が挙げられる。この点において、１０－４モル／リットルまたは１０－３モル／リットルより大きい（例えば１０－２モル／リットルの）解離定数を測定できない可能性があることも明らかであろう。場合により、当業者には明らかであろうが、（実際の、または見かけの）解離定数は、［ＫＤ＝１／ＫＡ］という関係によって、（実際の、または見かけの）会合定数（ＫＡ）に基づき計算することができる。
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体公知の様々な技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術を介して測定することができる（例えばＯｂｅｒら、２００１、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１５５１～１５５９を参照）。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、この場合、一方の分子がバイオセンサーチップに固定され、他方の分子が流動条件下で固定された分子上を通過することで、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、したがってＫＤ（またはＫＡ）値が得られる。これは、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して実行することができる。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９～２６）、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０～６２７）、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５～１３１）、およびＪｏｈｎｓｓｏｎら（１９９１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８～２７７）を参照されたい。
生体分子の相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技術は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えばＡｂｄｉｃｈｅら、２００８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：２０９～２１７を参照）。用語「バイオレイヤー干渉法」または「ＢＬＩ」は、本明細書で使用される場合、２つの表面：内部参照層（参照ビーム）およびバイオセンサーチップ上の固定されたタンパク質の層（シグナルビーム）から反射した光の干渉縞を分析する、標識なしの光学技術を指す。バイオセンサーのチップに結合した分子の数の変化は、波長シフト（ｎｍ）として報告される干渉縞におけるシフトを引き起こし、その規模が、バイオセンサーチップ表面に結合した分子の数の直接の尺度である。相互作用はリアルタイムで測定できるため、会合および解離速度ならびに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＵＳＡの一部門）を使用して実行することができる。
代替として、親和性は、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）プラットフォーム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｂｏｉｓｅ、ＵＳＡ）を使用する反応速度論除外アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＫｉｎＥｘＡ）（例えばＤｒａｋｅら、２００４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２８：３５～４３を参照）で測定することができる。用語「ＫｉｎＥｘＡ」は、本明細書で使用される場合、改変されていない分子の真の平衡結合親和性および速度論を測定するための溶液ベースの方法を指す。抗体／抗原複合体の平衡化溶液を、抗原（または抗体）でプレコーティングされたビーズを有するカラム上に通過させることで、遊離の抗体（または抗原）をコーティングされた分子に結合させることができる。このようにして捕獲された抗体（または抗原）の検出は、抗体（または抗原）と結合する蛍光標識したタンパク質を用いて達成される。
ＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化された生物学的な分析および迅速なサンプルの回転のためのプラットフォームを提供する（Ｆｒａｌｅｙら、２０１３、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ５：１７６５～７４）。
５．３ （インビボにおける）半減期の延長
ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでいてもよく、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した（インビボにおける）半減期を有するポリペプチドを提供する。インビボにおける半減期の延長は、例えば、ポリペプチドが、投与された後、哺乳動物、例えばヒト対象において増加した半減期を有することを意味する。半減期は、例えばｔ１／２ベータとして表することができる。
基、残基、部分または結合単位のタイプは、一般的に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択することができる。
より具体的には、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、または血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧに結合することができる結合単位からなる群から選択することができる。一部の実施形態において、結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができる。一部の実施形態において、結合単位はＩＳＶＤである。
例えば、ＷＯ０４／０４１８６５（参照によってその全体を組み入れる）は、血清アルブミンに結合する（および特にヒト血清アルブミンに対する）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）であって、前記タンパク質の半減期を増加させるために他のタンパク質（例えば、望ましい標的に結合する１つまたはそれ以上の他のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））に連結することができるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を記載している。
国際出願ＷＯ０６／１２２７８７（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）は、（ヒト）血清アルブミンに対する多数のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を記載している。これらのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）としては、Ａｌｂ－１（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号５２、参照によってその全体を組み入れる）およびそれらのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ－８（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号６２、参照によってその全体を組み入れる）と称されるＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）が挙げられる。これらもまた、治療用タンパク質およびポリペプチドならびに他の治療的な実体または部分の半減期を延長するのに使用することができる。
さらに、ＷＯ２０１２／１７５４００（参照によってその全体を組み入れる）は、Ａｌｂ－２３と称されるＡｌｂ－１のさらに改善されたバージョンを記載している。
一実施形態において、ポリペプチドは、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－３、Ａｌｂ－４、Ａｌｂ－５、Ａｌｂ－６、Ａｌｂ－７、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－９、Ａｌｂ－１０およびＡｌｂ－２３から選択される血清アルブミン結合部分を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＷＯ２０１２／１７５４００の７～９頁に示されているＡｌｂ－８もしくはＡｌｂ－２３、またはそのバリアント、およびＷＯ２０１２／１７５７４１、ＷＯ２０１５／１７３３２５、ＷＯ２０１７／０８０８５０、ＷＯ２０１７／０８５１７２、ＷＯ２０１８／１０４４４４、ＷＯ２０１８／１３４２３５、ＷＯ２０１８／１３４２３４（これらの各々は参照によってその全体を本明細書に組み入れる）に記載されるアルブミンバインダーを含む。血清アルブミンバインダーの一部の非限定的な例は、表Ａ－４にも示される。一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、項目Ｄに記載のさらなる構成要素を含む：
Ｄ．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３；
を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列を有する。
ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２に構築物ＡＬＢ２３００２に関して示されている１つもしくはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｄで定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物ＡＬＢ２３００２の全長アミノ酸配列を有する（配列番号３、表Ａ－１およびＡ－２を参照）。
項目Ｄはまた、Ｋａｂａｔ定義を使用して以下のように記載することもできる：
Ｄ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号３４のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３８のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号３８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するＣＤＲ３；
を含むＩＳＶＤ。
一部の実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号３４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号３８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列を有する。
ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤの非限定的な例は、表Ａ－２．１に構築物ＡＬＢ２３００２に関して示されている１つもしくそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有し（前述の項目Ｄ’で定義されたＣＤＲに加えて）、例えばＩＳＶＤは、構築物ＡＬＢ２３００２の全長アミノ酸配列を有する（配列番号３、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）。
また、一実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは前述の項目Ｄで定義された通りである。一部の実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｄ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、ＩＳＶＤは、ヒト血清アルブミンに対して構築物ＡＬＢ２３００２の少なくとも半分の結合親和性、少なくとも同じ結合親和性、またはさらにより高い結合親和性を有し、ここで結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
ヒト血清アルブミンに結合するこのようなＩＳＶＤがＣ末端の位置を有する場合、該ＩＳＶＤはＣ末端アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）伸長を示し、配列番号５２、５３、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および６３から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。一実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端の位置とは別の位置を有し（すなわち、本開示のポリペプチドのＣ末端のＩＳＶＤではない）、配列番号３、５０、５１、５４、および５６から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。
５．４ 核酸分子
本開示のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。
「核酸分子」（「核酸」と同義的に使用される）は、ヌクレオチド配列を形成するためにリン酸主鎖を介して互いに連結されたヌクレオチド単量体の鎖である。核酸は、例えばポリペプチドの発現および／または生産のために、宿主細胞または宿主生物を形質転換／トランスフェクトするのに使用することができる。生産目的のための好適な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。本開示のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞も、本開示に包含される。
核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであってもよいし、ＰＮＡのような（例えば化学的に）修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。核酸は、一本鎖であってもよいし、または二本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、本開示のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡであってもよい。
本開示の核酸は、それ自体公知の方式で調製するかまたは得てもよいし、および／または好適な天然源から単離してもよい。天然に存在する（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供されるように、部位特異的変異誘発に供してもよい。また当業者には明らかであろうが、核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば標的化部分をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、例えば１つまたはそれ以上のリンカーをコードする核酸も、好適な方式で一緒に連結されていてもよい。
核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、その例としては、これらに限定されないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つまたはそれ以上の天然に存在する配列および／または合成配列（または２つまたはそれ以上のそれらの一部）を組み合わせること、短縮化された発現産物の発現をもたらす突然変異の導入；１つまたはそれ以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を使用して容易に消化および／またはライゲートすることができるカセットおよび／または領域を作り出すため）、ならびに／または１つまたはそれ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入を挙げることができる。
５．５ ベクター
本開示のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。本明細書で使用されるベクターは、遺伝物質を細胞に運ぶのに好適な媒体である。ベクターとしては、裸の核酸、例えばプラスミドまたはｍＲＮＡ、またはより大きい構造に埋め込まれた核酸、例えばリポソームもしくはウイルスベクターが挙げられる。
ベクターは、一般的に、場合により、１つまたはそれ以上の調節エレメント、例えば１つまたはそれ以上の好適なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに連結された少なくとも１つの核酸を含む。ベクターは、発現ベクターであり得、すなわち、好適な条件下で、例えばベクターが（例えばヒト）細胞に導入されたときに、コードされたポリペプチドまたは構築物を発現させるのに好適なベクターであり得る。ＤＮＡベースのベクターの場合、これは通常、転写のためのエレメントの存在（例えばプロモーターおよびポリＡシグナル）および翻訳のためのエレメントの存在（例えばコザック配列）を含む。
一部の実施形態において、ベクター中において、前記少なくとも１つの核酸および前記調節エレメントは、互いに「作動可能に連結」しており、これは、一般的に、それらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターがコード配列の転写および／または発現を開始させるかまたはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することができる場合、コード配列に「作動可能に連結している」とみなされる（ここで前記コード配列は、前記プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）。一般的に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結している場合、それらは同じ方向となり、また通常は同じリーディングフレーム内にある。それらはまた通常は本質的に連続しているが、これもまたそうである必要はない場合もある。
一部の実施形態において、ベクターのいずれの調節エレメントも、それらが意図した宿主細胞または宿主生物においてそれらの意図した生物学的機能を提供できるようなものである。
例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターは、意図した宿主細胞または宿主生物において「作動可能である」はずであり、これは、例えば前記プロモーターが、ヌクレオチド配列、例えばそれに作動可能に連結したコード配列の転写および／または発現を開始させること、またはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することが可能であるはずであることを意味する。
５．６ 組成物
本開示はまた、少なくとも１つの本技開示のポリペプチド、本開示のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、またはこのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む組成物も提供する。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含んでいてもよく、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む。
５．７ 宿主生物
本開示はまた、本開示のポリペプチド、本開示のポリペプチドをコードする核酸、および／または本開示のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞または宿主生物にも関する。
好適な宿主細胞または宿主生物は当業者に明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物である。具体的には例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。一部の実施形態において、宿主は、ピチア・パストリスである。
５．８ ポリペプチドの方法および使用
本開示はまた、本開示のポリペプチドを生産するための方法も提供する。本方法は、宿主細胞または宿主生物を、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合により、それに続いて、１つまたはそれ以上の単離および／または精製工程を含んでいてもよい。
具体的には、本方法は、：
ａ）好適な発現系中（好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の発現系中）で、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合により、それに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製すること
を含んでいてもよい。
生産目的のための好適な宿主細胞または宿主生物は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。具体的な例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌またはピチア・パストリスが挙げられる。一部の実施形態において、宿主は、ピチア・パストリスである。
記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物－例えば該ポリペプチドまたはこれを含む組成物－は、医薬として有用である。
したがって、本開示は、医薬としての使用のための、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を提供する。
また、炎症性疾患および／または自己免疫疾患の（予防的または治療的な）処置における使用のための、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物も提供される。
さらに、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置する（予防的および／または治療的な）方法であって、医薬的に活性な量の、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法が提供される。
さらに、医薬組成物、例えば、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための医薬組成物の調製における、記載される本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本開示のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物の使用が提供される。
炎症性疾患および／または自己免疫疾患は、例えば、関節リウマチ、化膿性汗腺炎およびサルコイドーシスであってもよい。好ましくは、炎症性疾患および／または自己免疫疾患は関節リウマチである。
「対象」は、本開示に関して言及される場合、あらゆる動物であってもよく、例えば哺乳動物であってもよい。哺乳動物のなかでも、ヒトと非ヒト動物との区別がなされる場合がある。非ヒト動物は、例えばコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコ）、家畜（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはブタ動物）、または一般的に調査目的および／または抗体生産のために使用される動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、またはラクダ科動物、例えばラマまたはアルパカ）であり得る。
予防および／または治療目的に関して、対象は、あらゆる動物であってもよく、より具体的には、あらゆる哺乳動物、例えばヒト対象であってもよい。
物質（例えばポリペプチド、核酸分子およびベクターなど）または組成物は、あらゆる好適な投与経路によって、例えば経腸（例えば経口または直腸）または非経口（例えば皮膚上、舌下、頬側、経鼻、関節内、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、真皮下、または経粘膜）投与によって対象に投与することができる。非経口投与、例えば筋肉内、皮下または皮内投与が使用されてもよい。一部の実施形態において、皮下投与が使用される。
有効量の記載されるポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は、意図した処置結果を提供するために、対象に投与することができる。
１つまたはそれ以上の用量が投与されてもよい。１つより多くの用量が投与される場合、用量は、ポリペプチド、組成物、核酸分子またはベクターの作用を最大化するために、好適な間隔で投与されてもよい。
６．１ 実施例１：野生型抗ＩＬ－６ ２価またはバイパラトピックＩＳＶＤ構築物の生成およびインビトロ特徴付け
１価抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ ＩＬ６００６Ｂ０６、ＩＬ００６Ｂ１２、ＩＬ６００７Ｇ０４、ＩＬ６００７Ｇ０５、ＩＬ６００７Ｇ０９、ＩＬ６０１０Ａ０６、ＩＬ６０１３Ｆ１２およびＩＬ６０１７Ｃ０４（ＷＯ２００７１０４５２９に記載）は、ＴＦ－１増殖アッセイで調べた場合、抗ＩＬ－６参照ｍＡｂ １（ＩＬ－６に対するベンチマークモノクローナル抗体）と比較して有意なＩＬ－６遮断能力を示さなかった。効力を改善しようと、抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤをバイパラトピックＩＳＶＤ構築物にフォーマットした。構築物のビルディングブロックを、柔軟な３５ＧＳまたは９ＧＳ（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーによって遺伝子的に連結させた。ＩＳＶＤは、大腸菌でＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６タグ付きタンパク質として発現させた。発現は自己誘導により行い、３０℃でオンにし続けた。細胞培養物を回転後、ペレットを凍結解凍してペリプラズム抽出物を調製し、ｄＰＢＳに再懸濁した。これらの抽出物を、Ｎｉｃｋｅｌ ＩＤＡ／ＮＴＡカラム（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ － Ａｔｏｌｌ）を使用する固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の出発材料として使用した。ＩＳＶＤを２００ｍＭ酢酸Ｎａ ｐＨ４でカラムから溶出し、ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８で中和し、その後ｄＰＢＳに対して脱塩した。
抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤの阻害効力を、ＴＦ－１細胞のＩＬ－６媒介増殖をモニターする細胞ベースのアッセイで決定した。この目的を達成するために、１０％ＦＢＳおよび１％ピルビン酸Ｎａが補充されたＲＰＭＩ １６４０、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）でＴＦ－１細胞を培養した。ＴＦ－１細胞を、１ウェルあたり１２．５００細胞で増殖培地に植え付けた。精製抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤまたは参照化合物の希釈系列を添加した。３７℃で３０分のインキュベーション後、７５ｐＭのヒトＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２００－ＩＬ－２００｜２０６－ＩＬ）を添加した。７２時間後、ＴＦ－１細胞の増殖を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７１）を用いて決定した。
いくつかのバイパラトピック構築物はヒトＩＬ－６に対する改善された効力を示し、抗ｈＩＬ－６参照ｍＡｂ １の効力と同じような効力に達した（表１）。
加えて、柔軟な３５ＧＳ（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーによって遺伝子的に連結された２価抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤを生成し、ＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－６誘導ｐＳＴＡＴ３生成をモニターする第２の細胞ベースのアッセイでそれらの効力を評価した。この目的を達成するために、Ｇｌｕｔａｍａｘ＋および１０％熱不活性化ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地でＴＨＰ－１細胞を培養した。白色９６ウェルプレートに植え付ける前に、培地をＨＢＳＳに交換し、細胞を１００．０００細胞／ウェルの密度で植え付けた。精製抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤの希釈系列または参照抗ＩＬ－６ ｍＡｂ１を、３００ｐＭ ｈＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２００－ＩＬ－２００｜２０６－ＩＬ）と一緒に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞をスピンダウンし、溶解した。溶解した細胞上清１６μｌを、ｐＳＴＡＴ３および全ＳＴＡＴ３に対するＨＴＲＦ検出抗体ミックスと混合した（ＰＨＯＳＰＨＯ－ＳＴＡＴ３（ＴＹＲ７０５）ＫＩＴ、Ｃｉｓｂｉｏ ＃６２ＡＴ３ＰＥ）。このキットを使用して、ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）を、１つはＥｕ３＋クリプテートで標識（ドナー）され、２番目はｄ２で標識（アクセプター）された２つの異なる特異的抗体を使用するサンドイッチアッセイ形式で検出した。色素が近接している場合、光源によるドナーの励起はアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こし、今度は特定の波長（６６５ｎｍ）で蛍光を発する。特定のシグナルは、ｐＳＴＡＴ３に正比例して変調する。ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でｐＳＴＡＴを６６５ｎｍの吸光度を測定し、全ＳＴＡＴ３を６２０ｎｍの吸光度を測定して定量化した。
２価構築物は１価抗ＩＬ－６ ＩＳＤＶと比較して効力が有意に増加しなかったが、バイパラトピック抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤは１価または２価構築物と比較して有意な効力増加を示した（表２）。
この運用から、１１種のバイパラトピック抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤを選択して抗ＴＮＦ－α ＩＳＶＤに連結した：ＩＬ６０１３Ｆ１２－ＩＬ６００６Ｂ０６、ＩＬ６００６Ｂ０６－ＩＬ６０１７Ｃ０４、ＩＬ６０１３Ｆ１２－ＩＬ６００７Ｇ０９、ＩＬ６００６Ｂ０６－ＩＬ６００６Ｂ１２、ＩＬ６００６Ｂ０６－ＩＬ６０１０Ａ０６、ＩＬ６０１７Ｃ０４－ＩＬ６００７Ｇ０９、ＩＬ６００６Ｂ１２－ＩＬ６０１３Ｆ１２、ＩＬ６０１０Ａ０６－ＩＬ６００７Ｇ０９、ＩＬ６００６Ｂ１２－ＩＬ００７Ｇ０９、ＩＬ６００７Ｇ０９－ＩＬ６００６Ｂ１２またはＩＬ６０１７Ｃ０４－ＩＬ６００６Ｂ１２。
６．２ 実施例２：抗ＩＬ－６ １価ＩＳＶＤの配列最適化
抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ ＩＬ６００６Ｂ１２およびＩＬ６０１７Ｃ０４をさらに配列最適化した。
配列最適化は、ＩＳＶＤの１つまたはそれ以上（望ましい）特性を改善するために、配列中の１つまたはそれ以上の特定のアミノ酸残基の交換を必要とする。
このような配列最適化のいくつかの例は、本明細書においてさらなる説明で述べられ、例えば、限定されないが、以下が挙げられる：
ヒト化と呼ばれるプロセスである、ヒトＶＨ３－ＪＨ生殖系列コンセンサス配列とより同一のＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）配列を得るための親野生型Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）配列における置換。この目的を達成するために、いわゆる特徴的な（ｈａｌｌｍａｒｋ）残基を除いて、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とヒトＶＨ３－ＪＨ生殖系列コンセンサスで異なるＦＲの特定のアミノ酸を、タンパク質構造、活性および安定性がインタクトに保たれるような方法でヒトカウンターパートに変更した。
ラクダ化として定義される、ＩＳＶＤの安定性を増加させるためのラマ生殖系列に対する置換。この目的を達成するために、親野生型Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）アミノ酸配列を、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）のラマＩＧＨＶ生殖系列アミノ酸配列（ラマＩＧＨＶ生殖系列に対するＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）のＢｌａｓｔＰ分析からのトップヒットとして同定された）と整列させた。
長期安定性もしくは保存下の特性を改善する置換、望ましい宿主細胞もしくは宿主生物における発現レベルを増加させる置換、および／またはやはり望ましい宿主細胞もしくは宿主生物に応じて（望ましくない）翻訳後修飾（グリコシル化またはリン酸化のような）を除去もしくは低減する置換。Ｎ末端ピログルタミン酸形成を避けるために、標準的にはＥ１Ｄ突然変異が、効力または安定性に影響を与えることなく多価ＮａｎｏｂｏｄｙのＮ末端ビルディングブロックに導入される。したがって、ビルディングブロックの配列最適化の間は、Ｅ１Ｄ突然変異は一貫して導入されない。
任意の天然に存在する既存の抗体活性の結合を最小限にするための、１１位でのＶａｌへのおよび８９位でのＬｅｕへの突然変異。
抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ ＩＬ６００６Ｂ１２の配列最適化は、親ＩＳＶＤ ＩＬ６００６Ｂ１２と比較して５つのアミノ酸置換（すなわちＬ１１Ｖ、Ｓ５２ａＧ、Ｓ６０Ａ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）を含む、最終的な配列最適化バリアントＦ０２７２０１０４０をもたらした。抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ ＩＬ６０１７Ｃ０４の配列最適化は、親ＩＳＶＤ ＩＬ６０１７Ｃ０４と比較して６つのアミノ酸置換（すなわちＥ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｄ１６Ｇ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）を含む、最終的な配列最適化バリアントＦ０２７２００９２１をもたらした。
配列最適化バリアントを、ＰＣＲオーバーラップ伸長法を使用してオリゴヌクレオチドから組み立てた。バリアントを大腸菌で発現させ、ＩＭＡＣおよび脱塩によって精製した。Ｆ０２７２０１０４０をそのｈＩＬ－６結合能について表面プラズモン共鳴によって評価し、Ｆ０２７２００９２１をその中和活性についてＴＦ１増殖アッセイで評価した。両方のバリアントの単量体挙動を、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によってモニターした。バリアントの熱安定性を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用したサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）で試験した。このアッセイでは、親ＩＳＶＤおよびそれらのバリアントをｓｙｐｒｏオレンジの存在下、異なるｐＨでインキュベートし、温度勾配を適用した。ＩＳＶＤが変性し始めるとｓｙｐｒｏオレンジが結合し、測定される蛍光が突然増加し、そのため、特定のｐＨについての融解温度を決定することができる。結果を表３および表４に要約する。
Ｆ０２７２０１０４０は、親ＩＳＶＤ ＩＬ００６Ｂ１２と比較してＳＰＲでＩＬ－６への結合の類似した解離速度を示した。Ｆ０２７２０１０４０のＴｍは、親ＩＳＶＤ ＩＬ００６Ｂ１２より７℃高かった。Ｆ０２７２０１０４０のフレームワーク領域におけるフレームワーク同一性％は、ＡｂＭ定義（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ２ ｂｙ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、２０１０を参照されたい）に基づくと８８％であり、Ｋａｂａｔの定義に基づくと８６％であった。
ＴＦ１増殖アッセイでのＦ０２７２００９２１の効力は、ＷＴ配列と比較して類似していた。Ｆ０２７２００９２１のＴｍは、親ＩＳＶＤ Ｆ０２７２００９２１より１℃低かった。Ｆ０２７２００９２１のフレームワーク領域におけるフレームワーク同一性％は、ＡｂＭ定義に基づくと８８％であり、Ｋａｂａｔの定義に基づくと８６％であった。
６．３ 実施例３：多重特異性ＩＳＶＤ構築物生成
ＴＮＦαおよびＩＬ－６に結合するＩＳＶＤ含有ポリペプチドＦ０２７２０１０６２（配列番号１）の同定は、データ駆動型多重特異性操作およびフォーマット化戦略から得られ、その中には３つの抗ＴＮＦα ＶＨＨビルディングブロック（ＴＮＦ０６Ｃ１１（ＷＯ２０１７０８１３２０）、ＴＮＦ０１Ｃ０２（ＷＯ２０１５１７３３２５、配列番号３２７）およびＶＨＨ＃３（ＷＯ２００４０４１８６２））、および６つの抗ＩＬ－６ ＶＨＨビルディングブロック（ＩＬ６００６Ｂ０６、ＩＬ００６Ｂ１２、ＩＬ６００７Ｇ０４、ＩＬ６００７Ｇ０５、ＩＬ６００７Ｇ０９、ＩＬ６０１０Ａ０６、ＩＬ６０１３Ｆ１２およびＩＬ６０１７Ｃ０４、ＷＯ２００７１０４５２９）および抗ＨＳＡ ＶＨＨビルディングブロックＡＬＢ２３００２（ＷＯ２０１７１３４２３４、配列番号１０／ＷＯ２０１８１３１２３４を参照されたい）が含まれた。ビルディングブロックの異なる位置／方向を適用し、異なるパラメーター（効力、交差反応性、発現など）にとって重要であることを証明した。全ての構築物でビルディングブロック間のリンカーを９ＧＳに保って、既存の抗体の結合をできる限り最小限にした。
８７個の構築物を含むパネル（表６）を、小さいスケールの生産のためにピチア・パストリスで形質転換した。ＩＳＶＤ発現の誘導は、メタノールの段階的な添加によって生じた。分泌されたＩＳＶＤを含む清澄化培地を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介した精製とそれに続く脱塩の出発材料として使用した。精製したサンプルを、発現評価および機能的特徴付けに使用した。後者に関して効力は、インビトロでのＴＦ－１細胞のＴＮＦα誘導ＮＦκＢ活性化の阻害およびＩＬ－６誘導増殖の阻害をアッセイして決定した（実施例８および９に記載の通り）。
加えて、ＩＳＶＤ発現レベルを清澄化培地でモニターした。構築物を以下の発現レベル基準に従って分類した：低＝＜５０μｇ／ｍｌ、中程度＝５１～１００μｇ／ｍｌ、高＝＞１０１μｇ／ｍｌ（表６）。
一部の構築物は、原子価、使用するＩＳＶＤビルディングブロック、およびＩＳＶＤビルディングブロックの相対的な位置に応じて損なわれた効力および発現を示した。抗ＴＮＦａ ＩＳＶＤ ＴＮＦ００６Ｃ１１、２価ＴＮＦ００１Ｃ０２および２価ＶＨＨ＃３Ｅを含む二重特異性ＩＳＶＤは、参照抗ＴＮＦａ ｍＡｂ（ＴＮＦ－アルファに対するベンチマークモノクローナル抗体）に類似した効力を示したのに対し、１価ＴＮＦ００１Ｃ０２を含むＩＳＶＤは、参照抗ＴＮＦａ ｍＡｂより効力が５～２５倍低かった。２価ＶＨＨ＃３Ｅを含む全てのＩＳＶＤは低い発現レベルを示し、それ故に除外した。
抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ ＩＬ６００６Ｂ０６を含む全ての二重特異性ＩＳＶＤは損なわれた効力を示し、６Ｂ０６－６Ｂ１２の組み合わせは成績が最も低かった。抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ ＩＬ６０１３Ｆ１２を含む二重特異性ＩＳＤＶは全て、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させると分解を示し、それ故に製造することができなかった。バイパラトピック抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ １０Ａ０６－７Ｇ０９、１７Ｃ０４－７Ｇ０９、１７Ｃ０４－６Ｂ１２、６Ｂ１２－７Ｇ０９および７Ｇ０９－６Ｂ１２を含む残りの二重特異性ＩＳＶＤは、概して抗ＩＬ－６参照ｍＡｂ １に類似した効力を示したが、７Ｇ０９－６Ｂ１２に関してカニクイザルＩＬ－６に対する交差反応性は大きく損なわれた。
その後、大きなパネルを、標的（ヒトおよびカニクイザル）の両方に対して効力があることが証明され、予備的収量推定値に基づく高い発現レベルの可能性を有する７つのＩＳＶＤ構築物：Ｆ０２７２００８０９、Ｆ０２７２００８１２、Ｆ０２７２００８１７、Ｆ０２７２００９２７、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１およびＦ０２７２０１０６２からなる、多重特異性構築物のより小さなパネルに縮小した。３つの追加のＩＳＶＤ構築物、Ｆ０２７２００９２５、Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９を、主にそれらの高い発現レベルの可能性に基づき選択した。しかしながら、後者３つの構築物は１つの標的に高い効力を示したが、他の標的に対しては中間の効力しかなかった（表７ａ）。
ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２００９２７およびＦ０２７２００９２５の立体配置を表７ｂに示す。
表７ｃおよび７ｄは、それぞれ、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２００９２７およびＦ０２７２００９２５の各個々のビルディングブロックの配列を示す。
表７ｅ、７ｆ、７ｇおよび７ｈは、各個々のビルディングブロックＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２００９２７およびＦ０２７２００９２５に存在する３つのＣＤＲ領域および４つのフレームワーク領域の配列を示す（両方ともＡｂＭおよびＫａｂａｔの番号付けによる）。最後に、表７ｉは、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２００９２７およびＦ０２７２００９２５の完全アミノ酸配列を示す。
１１種のＩＳＶＤ構築物を含むパネルのピチア・パストリスでのより大規模な２Ｌおよび５Ｌ生産を、発現収量決定、生物物理学的特性の評価のために行った。高い発現収量ならびに十分な溶解性および生物物理学的安定性を得るために、抗ＩＬ－６ビルディングブロックおよび抗ＴＮＦ－αビルディングブロックの特定の組み合わせが必要であることが実証された。これは表８に例示されている。例えば、３位における１つのビルディングブロックを除いて組成物中の極めて類似した構築物Ｆ０２７２０１０６２およびＦ０２７２００８１２は、有意に異なる発現プロファイルおよび溶解性プロファイルを示した。
最終的に、効力およびＣＭＣ特性（例えば溶解性および発現）の良好な成績の組み合わせにより、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２をさらなる特徴付けのために選択した。
実施例４：多重特異性ＩＳＶＤ構築物：ＴＮＦ－α、ＩＬ－６および血清アルブミンに対する結合親和性
ヒトおよびカニクイザルＴＮＦ－αおよびＩＬ－６、ならびにヒト、カニクイザルおよびマウス血清アルブミン（ＳＡ）に対するＦ０２７２０１０６２の、平衡解離定数（ＫＤ）として表される親和性は、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ）での溶液中親和性測定により定量化した。
ＫＤ制御測定で、ＴＮＦ－αまたはＩＬ－６（１．３μＭ～０．１ｐＭの範囲）またはヒトもしくはカニクイザルＳＡ（１３μＭ～１ｐＭの範囲）もしくはマウスＳＡ（１３３μＭ～３０ｐＭの範囲）の連続希釈物、および固定量のＦ０２７２０１０６２（ＴＮＦ－αの場合８０ｐＭ、ＩＬ－６の場合は２０ｐＭ、ヒトおよびカニクイザルＳＡの場合は３００ｐＭ、ならびにマウスＳＡの場合は６００ｐＭ）を混合して相互作用させ、平衡に達するまで４８時間もしくは７２時間のいずれか（ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの場合）または２時間（ＳＡの場合）インキュベートした。
受容体制御測定で、ＴＮＦ－αまたはＩＬ－６（１．３μＭ～０．１ｐＭの範囲）またはヒトおよびカニクイザルＳＡ（１３μＭ～１ｐＭの範囲）もしくはマウスＳＡ（１３３μＭ～３０ｐＭの範囲）の連続希釈物、および固定量のＦ０２７２０１０６２（ＴＮＦアルファの場合は３０ｎＭ、ＩＬ－６の場合は５ｎＭ、ヒトおよびカニクイザルＳＡの場合は１μＭ、ならびにマウスＳＡの場合は２μｍＭ）を混合して相互作用させ、平衡に達するまで４８時間もしくは７２時間のいずれか（ＩＬ－６およびＴＮＦαの場合）または２時間（ＳＡの場合）インキュベートした。
ビオチン化ヒトＴＮＦ－α／ＩＬ－６／血清アルブミンを、ビーズのカラムを含有し、平衡化した溶液から遊離のＦ０２７２０１０６２を捕獲するための分子プローブとして使用されたＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ＣＤの微細構造に捕獲した。ＴＮＦ－α／ＩＬ－６／血清アルブミンおよびＦ０２７２０１０６２の混合物（遊離のＴＮＦ－α／ＩＬ－６／血清アルブミン、遊離のＦ０２７２０１０６２およびＴＮＦ－α／ＩＬ－６／血清アルブミン－Ｆ０２７２０１０６２複合体を含有する）を、ビーズを通って流動させ、遊離のＩＳＶＤ構築物濃度に比例する小さいパーセンテージの遊離のＦ０２７２０１０６２を捕獲した。次いで蛍光標識した抗ＶＨＨ抗体、ＡＢＨ００８６－Ａｌｅｘａ６４７を注入して全ての捕獲されたＦ０２７２０１０６２を標識し、過量の蛍光プローブを濯ぎ落とした後、蛍光の変化を決定した。一連の希釈物のフィッティングを、Ｇｙｒｏｌａｂ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して行い、ＫＤおよび受容体によれば制御される曲線を分析して、ＫＤ値を決定した。結果（表９）は、多重特異性ＩＳＶＤ構築物が、ヒト／カニクイザルＩＬ－６およびヒト／カニクイザルＴＮＦ－αと高親和性で結合することを実証している。
６．４ 実施例５：膜結合ＴＮＦαへの多重特異性ＩＳＶＤ構築物の結合
膜結合ＴＮＦαへのＦ０２７２０１０６２の結合を、ヒト膜ＴＮＦαを発現するＨＥＫ２９３Ｈ細胞に対するフローサイトメトリーを使用して実証した。簡単に言えば、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドで細胞を固定した（膜結合ＴＮＦαの検出を高めるために）。その後、細胞を１×１０４細胞／ウェルの密度で植え付け、Ｆ０２７２０１０６２または抗ＴＮＦα参照ｍＡｂの、１００ｎＭから開始して０．５ｐＭまでの希釈系列と共に、３０μＭ ＨＳＡの非存在または存在下、室温で２４時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、その後、インキュベートしｄ ｗｉｔｈ ａｎ 抗ＶＨＨ ｍＡｂ（ＡＢＨ００１１９）と共に４℃で３０分間インキュベートし、再び洗浄し、ヤギ抗マウスまたは抗ヒトＰＥ標識抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。サンプルを洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３が補充された１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液をｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０値を計算した。Ｆ０２７２０１０６２および抗ＴＮＦα参照ｍＡｂのＥＣ５０値は同等である（表１０）。
６．５ 実施例６：多重特異性ＩＳＶＤ構築物はＴＮＦ－αおよびＩＬ－６に選択的に結合する
ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６関連ヒト標的への結合の非存在を、ＳＰＲ（Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６）により評価した。ＩＬ－６関連サイトカインまたはｇｐ１３０受容体を共有するサイトカインとして、ヒトＩＬ２３、ＩＬ２７、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）およびＩＬ１１を評価した。ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ヒトＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬを、ＴＮＦαの関連サイトカインとして試験した。
この目的を達成するために、活性化についてはＥＤＣ／ＮＨＳを８０秒間注入し、非活性化については１ＭエタノールアミンＨＣｌを１５０秒間注入するアミンカップリングを使用して（ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット。カタログ番号１７６－２４１０）、標的をＧＬＣセンサーチップに２５μｇ／ｍＬで２００秒間固定した。活性化、非活性化およびリガンド注入中の流速を３０μｌ／分に設定した。１０ｍＭ酢酸固定緩衝液のｐＨは、各リガンドのｐＩから約１．５を引いて選択した。次に、３００ｎＭのＦ０２７２０１０６２を２分間注入し、４５μＬ／分の流速で６００秒間解離させた。ランニング緩衝液として、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。陽性対照として、０．３μＭ α－ＩＬ１１ Ａｂ、α－ＯＳＭ Ａｂ、α－ＣＮＴＦ Ａｂ、α－ＩＬ２７ Ａｂ、α－ＩＬ２７Ａ Ａｂ、α－ＩＬ２３ ｐ１９ Ａｂ、α－ｈＦＡＳＬ Ａｂ、０．３ μＭ α－ｈＴＮＦβ Ａｂ、０．５μＭ α－ｈＬＩＧＨＴ Ａｂ、０．３μＭ α－ｈＴＬ－１Ａ Ａｂおよび０．５μＭ α－ｈＲＡＮＫＬ ＶＨＨを注入した。
Ｆ０２７２０１０６２と陽性対照間の固定化標的との相互作用を、結合時のチップ上の質量変化の結果として生じる屈折率の増加を検出して測定した。
陽性対照は全て、それらのぞれぞれの標的に結合しなかった。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２の、ヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＴＮＦ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭおよびＩＬ１１への結合は検出されなかった。
６．６ 実施例７：多重特異性ＩＳＶＤ構築物のｈＩＬ－６、ｈＴＮＦａおよびＨＳＡへの同時結合
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ＋装置を使用して、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２が、組換え溶解性ｈＴＮＦ－αおよびｈＩＬ－６に同時に結合できるかどうかを決定した。この目的を達成するために、ＨＳＡをアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップに約１６００ＲＵのレベルに固定化した。ＡＬＢ２３００２ビルディングブロックによりＩＳＶＤ構築物を捕獲するために、１００ｎＭのＦ０２７２０１０６２を１０μΙ／分で２分間、ＨＳＡ表面に注入した。その後、１００ｎＭのｈＩＬ－６、ｈＴＮＦ－αもしくはｈＯＸ４０Ｌか、または１００ｎＭ ＩＬ－６＋１００ｎＭ ＴＮＦα、１００ｎＭ ＩＬ－６＋１００ｎＭ ＯＸ４０Ｌもしくは１００ｎＭ ＴＮＦ－α＋１００ｎＭ ＯＸ４０Ｌの混合物のいずれかを、４５μｌ／分の流速で２分間注入し、その後、６００秒の解離工程を行った。４５μｌ／分で２分のＨＣＩ（１００ｍＭ）の注入によりＨＳＡ表面を再生した。センサーグラム（図１）は、ＨＳＡでの捕獲後の応答単位の増加：ｈＴＮＦ－αのみからは約１５０ＲＵの増加、ｈＩＬ－６のみからは約１２０ＲＵの増加、ならびにＩＬ－６およびＴＮＦ－α混合物については約３４０ＲＵの増加によって示されるように、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２がｈＩＬ－６およびｈＴＮＦ－αと同時に結合できることを実証している。
６．７ 実施例８：インビトロでのＴＮＦ－α誘導ＮＦｋＢ活性化の多重特異性ＩＳＶＤ構築物阻害
ＨＥＫ２９３＿ＮＦκＢ－ＮＬｕｃＰ細胞は、ＮＦκＢ依存性プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼをコードするレポーター構築物で安定にトランスフェクトされたＴＮＦ受容体発現細胞である。細胞と溶解性ヒトおよびカニクイザルＴＮＦ－αとのインキュベーションは、ＮＦκＢ媒介ナノルシフェラーゼ遺伝子発現をもたらした。ナノルシフェラーゼ発光を、溶解緩衝液と１：５０の比で混合し細胞に添加したＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を使用して測定した。サンプルを振盪機で５分混合して完全溶解を得た。Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＨＥＫ２９３＿ＮＦκＢ－ＮＬｕｃＰ細胞を、底面が透明な白色組織培養（ＴＣ）処理９６ウェルプレートの通常の増殖培地に２００００細胞／ウェルで植え付けた。Ｆ０２７２０１０６２または抗ＴＮＦ－α参照ｍＡｂの希釈系列を２５ｐＭヒトまたは７０ｐＭカニクイザルＴＮＦ－αに添加し、３０μＭ ＨＳＡの存在下、細胞と共に３７℃で５時間インキュベートした。
Ｆ０２７２０１０６２は、参照化合物抗ｈＴＮＦ－α ｍＡｂと同等の５３ｐＭ（ヒトＴＮＦ－αに関して）および１５８ｐＭ（カニクイザルＴＮＦ－αに関して）の平均ＩＣ５０で、濃度依存的にヒトおよびカニクイザルＴＮＦ－α誘導ＮＦκＢ活性化を阻害した（表１１、図２）。陰性対照ＩＳＶＤ、ＩＲＲ０００９６は阻害を示さなかった。
６．８ 実施例９：ＴＦ－１細胞のＩＬ－６誘導増殖の多重特異性ＩＳＶＤ構築物阻害
Ｆ０２７２０１０６２の阻害効力を、ＴＦ－１細胞のＩＬ－６媒介増殖をモニターする細胞ベースのアッセイで決定した。この目的を達成するために、１０％ＦＢＳおよび１％ ピルビン酸Ｎａを添加したＲＰＭＩ １６４０、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）でＴＦ－１細胞を培養した。ＴＦ－１細胞は、１ウェルあたり１２．５００細胞で増殖培地に植え付けた。精製抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤまたは参照化合物の希釈系列を添加した。３７℃で３０分インキュベーション後、７５ｐＭのヒトＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２００－ＩＬ－２００｜２０６－ＩＬ）またはカニクイザルＩＬ－６（Ｅｖｏｔｅｋ、カタログ番号ＡＰＰ－７６３４）を添加した。７２時間後、ＴＦ－１細胞の増殖を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７１）を用いて決定した。
Ｆ０２７２０１０６２は、抗ＩＬ－６参照ｍＡｂ １と同等および抗ＩＬ－６参照ｍＡｂ ２より良い３４ｐＭ（ヒトＩＬ－６に関して）および５６ｐＭ（カニクイザルＩＬ－６に関して）の平均ＩＣ５０で、濃度依存的にＴＦ－１細胞のヒトおよびカニクイザルＩＬ－６誘導増殖を阻害した（表１２、図３）。
６．９ 実施例１０：既存の抗体への多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合
ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２の既存の抗体反応性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して正常なヒト血清（ｎ＝９６）で評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として使用し、実験を２５℃で行った。
ＩＳＶＤを、チップ上に固定されたＨＳＡへの、ＡＬＢ２３００２ビルディングブロックの結合を介してチップ上に捕獲した。ＨＳＡを固定するために、ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μΙ／分）で活性化し、ＨＳＡを、ｐＨ４．５のＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中の１００μｌ／ｍｌで注入して、およそ２５００ＲＵの固定レベルにした。固定した後、表面をエタノールアミンＨＣｌ（流速３０μΙ／分）で不活性化した。
その後、ＩＳＶＤ構築物を、ＨＳＡ表面上に４５μｌ／分で２分にわたり注入して、ＩＳＶＤ捕獲レベルをおよそ８００ＲＵにした。既存の抗体を含有するサンプルを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）で１：１０希釈し、その後、４５μｌ／分で２分にわたり注入し、それに続き、後続の４００秒の解離工程を行った。各サイクルの後（すなわち新しいＩＳＶＤ捕獲および血液サンプル注入工程の前に）、ＨＳＡ表面を、ＨＣｌ（１００ｍＭ）の４５μｌ／分で２分の注入で再生した。１）ＩＳＶＤ－ＨＳＡ解離および２）参照リガンドレーンへの非特異的な結合を引くことによる二重の参照の後、既存の抗体結合を示すセンサーグラムを得た。１２５秒（会合終了から５秒後）に報告ポイントを設定することによって、既存の抗体の結合レベルを決定した。参照ＩＳＶＤの１２５秒での結合レベルに対する既存の抗体結合におけるパーセンテージの低減を計算した。
４価のＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２は、各ビルディングブロックにおける突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９ＬならびにＣ末端アラニンの導入によって既存の抗体結合の低減のために最適化されたことから、既存の抗体への結合は、対照の最適化されていない５価のＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１８６と比較してより実質的に少ないことが示される（図４）。
６．１０ 実施例１１：マウス抗ＴＮＦ－αおよび抗ＩＬ－６代理抗体の組み合わせによるマウスコラーゲン誘導関節炎の長期寛解の持続
関節リウマチは、末梢関節を攻撃する破壊性自己免疫疾患である。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルはびらん性疾患を再現している。関節の成分に対する免疫応答を誘発するために、感受性ＤＢＡ／１マウスを、１００μｇアジュバントニワトリＩＩ型コラーゲンで２回免疫化した。ＩＩ型コラーゲンに対して開始された免疫応答は内因性関節軟骨に広がり、臨床的に明らかな関節炎をもたらす。２１日目の２回目の免疫化後、進行性関節炎は、足首および肢の腫脹、紅斑、および時として関節強直により明白になった。関節炎の重症度を、下の表１３に詳しく述べる採点システムによって各四肢について臨床的に評価した。
疾患の重症度および進行に対するＴＮＦおよびＩＬ－６遮断併用の影響を評価するために、Ｎ＝１３の免疫化したオスのＤＢＡ／１マウスを、マウスＴＮＦ、マウスＩＬ－６、または両方の組み合わせに対する遮断抗体で処置した。マウスは、初回免疫化後２２日時点で開始し、５５日目まで継続する週２回の腹腔内注射により処置した。図５に示すように、臨床的関節炎は２１日目以降徐々に発生した。抗ｍｕＴＮＦまたは抗ｍｕＴＮＦおよび抗ｍｕＩＬ－６の組み合わせのいずれかで処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体または抗ｍｕＩＬ－６単独で処置したマウスより関節炎の進行が遅く、重症度が低かった。５５日目の処置中止により、抗ｍｕＴＮＦ単独で処置したマウスでは疾患のリバウンドが観察可能であり、アイソタイプ対照または抗ｍｕＩＬ－６と同等の重症度レベルにすぐに達した。しかしながら、抗ｍｕＴＮＦおよび抗ｍｕＩＬ－６の両方の組み合わせで処置したマウスは関節炎の進行に逆戻りせず、処置の中止にもかかわらず応答を維持した。図６は、試験期間全体、処置期間、およびオフ処置期間に関する関節炎スコア経時的曲線下面積の分析を示す。後者は併用処置によって有意に抑制され、疾患進行に対する影響の持続を示した。
このモデルでは、関節炎は、ＩＩ型コラーゲンワクチン接種に対する抗体応答によって開始された。９１日時点で、抗ＩＩ型コラーゲン抗体の血漿レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。図７に示すように、全ての処置が抗ＩＩ型コラーゲン抗体力価を低下させ、抗ｍｕＴＮＦおよび抗ｍｕＩＬ－６の両方で処置したマウスでは数値の低下が最大であった。
９１日目のマウスの屠殺後に後肢を回収し、中足骨関節を関節炎の組織学的評価用に処理した。ヘマトキシリンおよびエオシンならびにサフラニン－Ｏ染色切片の採点を、盲検法で４つの側面にわたり０～５のスケールで行った（表１４）。
図８に示すように、アイソタイプ対照抗体と比べて抗ｍｕＴＮＦおよび抗ｍｕＩＬ－６の組み合わせで処置したマウスにおいて、パンヌス形成および骨破壊の組織学スコアの統計的に有意な改善が達成された。
まとめると、これらのデータは、ＴＮＦおよびＩＬ－６炎症性経路の両方を遮断する併用処置の最も高い治療効力を示唆している。重要なことには、併用処置は、積極的処置の非存在下でも応答の持続をもたらした。
６．１１ 実施例１２：抗ＴＮＦ－アルファ、抗ＩＬ６および抗ＴＮＦ－アルファ／ＩＬ６併用で処置したＣＩＡ（コラーゲン誘導関節炎）モデルからのＲＮＡ－ｓｅｑデータ解析
ＣＩＡのマウス前肢組織サンプルからの全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、２×５１００万～６６００万リードのペアエンド配列決定を、ＡＴＬＡＳ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ、ベルリンにおいてＮｏｖａＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で行った。ＲＮＡ－ｓｅｑ生データのバイオインフォマティクス解析は、ＯｍｉｃＳｏｆｔスタジオソフトウェアパッケージバージョン１０．０１．１１８（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。マウスゲノムへのＲＮＡ－ｓｅｑリード（ｆａｓｔｑファイル）のマッピングを、参照ゲノムとしてマウスＢ．３８およびアライナーとしてＯＳＡ４を用いる遺伝子モデルとしてＯｍｉｃＳｏｆｔＧｅｎＣｏｄｅ．Ｖ１９を使用して行った。
発現変動遺伝子（ＤＥＧ）のベン図解析
図９（Ａ）のベン図は、ＣＩＡモデルにおける抗ＴＮＦ－アルファ、抗ＩＬ６および抗ＴＮＦ－アルファ／ＩＬ６併用処置から同定されたＤＥＧのオーバーラップを示す。ＤＥＧは、ＤＥＳｅｑ２統計的検定（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．、Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ． Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１４；１５（１２）：５５０頁）を使用して、標準的な従来の抗ＴＮＦ－アルファ抗体による処置（ｎ＝１３サンプル）、標準的な従来の抗ＩＬ６抗体（ＭＰ５－２０Ｆ３；ｎ＝１３）による処置、および抗ＴＮＦ－アルファ／抗ＩＬ－６抗体併用（ｎ＝１３）処置からのＲＮＡ－ｓｅｑサンプル群を、アイソタイプ処置からのサンプル（ＩｇＧ対照；ｎ＝１３）と比較して決定した。ｌｏｇ２倍変化＞１，２、およびＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ－ＦＤＲ）による補正ｐ値＜０，０５のＤＥＧを有意とみなした。ＤＥＧの数から、ベン図解析は、抗ＴＮＦ－アルファまたは抗ＩＬ－６による単一処置と比べて抗ＴＮＦ－アルファ／ＩＬ－６併用処置の相加効果を示している。
発現変動遺伝子（ＤＥＧ）のパスウェイマッピング
図９（Ｂ）のパスウェイマップは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＭｅｔａＣｏｒｅ（Ｃｌａｒｉｖａｔｅ）からの監修された統合型生物学的ナレッジベースを使用したＤＥＧの遺伝子セットエンリッチメント解析から、上位２０のカノニカルパスウェイを示す。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）からのＤＥＧは、ＤＥＳｅｑ２を使用して、アイソタイプ処置からのサンプル（ＩｇＧ対照群、ｎ＝１３）を、コラーゲン誘導関節炎を有さない未処置サンプル（ｎｏｎｅ群、ｎ＝４）と比較して決定した。抗ＴＮＦ－アルファ／ＩＬ－６併用処置からのＤＥＧは、ＤＥＳｅｑ２を使用して、抗ＴＮＦ－アルファ／ＩＬ－６からのサンプル（ＸＴ．３＋ＭＰ５－２０Ｆ３；ｎ＝１３）を、アイソタイプ処置からのサンプル（ＩｇＧ対照群、ｎ＝１３）と比較して決定した。両方のマップの代謝経路および免疫シグナル伝達経路は、種々の偽発見率（ＦＤＲ）でのコラーゲン誘導関節炎および抗ＴＮＦ－アルファ／ＩＬ６併用処置からの逆のスコアを示している。
６．１２ 実施例１３：関節リウマチの定量的システム薬理学（ＱＳＰ）モデルは、Ｆ０２７２０１０６２のより低用量での寛解増加を予測する（抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６参照ｍＡｂと比較して）
出願者は、血液および滑膜中の関連組織、細胞およびメディエーターを検討する関節リウマチ（ＲＡ）の専用定量的システム薬理学モデルを開発した。生物学的相互作用の含められた機序的詳細を、社内および公開されている外部ソースの両方からの広範囲のインビトロデータを用いてパラメーター化した。その後、モデルを試験し、メトトレキサート、ＪＡＫ阻害剤、抗ＩＬ－６Ｒ、抗ＩＬ－６、抗ＴＮＦ処置を用いた様々な研究からの臨床データにより検証した。
このモデルに基づき、滑膜における疾患活性の低下の結果としてのＤＡＳ２８－ＣＲＰの低下を、５２週の処置期間にわたる中程度から重度の関節リウマチを有する平均的患者についてシミュレートした。ナノボディＦ０２７２０１０６２は、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６に同時に結合することができ、２週間おきの用量２０ｍｇによる単剤療法と比較して、ＤＡＳ２８－ＣＲＰのより高度の低下を達成し、参照患者が２４週間後にＤＡＳ２８－ＣＲＰ寛解を達成すると予測した。ナノボディシミュレーションは、動物およびインビトロデータから予測されたヒト薬物動態を検討した。標的結合については、細胞アッセイからのインビトロＩＣ５０データを、抗ｈＴＮＦおよび抗ｈＩＬ－６コンパレーターｍＡｂに関する公開されている標的結合パラメーターと一緒に使用して、該ナノボディの標的結合パラメーターを計算した（図１０）。
６．１３ 実施例１４：ヒトＲＡ－ＦＬＳ／Ｔ細胞共培養モデルにおけるＭＭＰ－１およびＧ－ＣＳＦに対する抗ＴＮＦ－αおよび抗ＩＬ－６の相加的有効性
患者の関節におけるＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の濃度を模倣する関節リウマチのインビトロモデルを開発した。簡単に言えば、関節リウマチ患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞（ＲＡ－ＦＬＳ）を、健康なヒトドナー由来のＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養した。追加の刺激は、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の内因性分泌を誘導した。抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６参照ｍＡｂによる処置は、ＭＭＰ－１およびＧ－ＣＳＦの分泌を部分的に低下させたが、併用およびＦ０２７２０１０６２はより強い最大の阻害を達成した。
以下に、ＩＬ－６トランスシグナル伝達を反映するアッセイの詳細なプロトコールを記載する：
ＲＡ－ＦＬＳを、９６ウェルフォーマットで増殖サプリメントを含む滑膜細胞基礎培地（Ｐｅｌｏｂｉｏｔｅｃｈ）に １０．０００細胞／ウェルの密度で植え付けた。翌日、ＰＢＭＣを健康なヒトドナーの血液からフィコール勾配遠心分離を使用して単離した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＰＢＭＣから磁気分離を使用して単離した（ネガティブ選択）。
ＲＡ－ＦＬＳ培地を、アイソタイプ対照、コンパレーター抗体およびＩＳＶＤをそれぞれの濃度（２００ｎＭからの１：１０希釈、６種類の濃度、３連）で含む培地に交換した。ＩｇＧ１アイソタイプ対照はコンパレーター抗体に対する陰性対照として使用し、一方、ＶＨＨ ＩＲＲ００１１９はＩＳＶＤアイソタイプ陰性対照として使用した。抗ヒトＴＮＦ－αおよび抗ヒトＩＬ－６参照抗体はコンパレーターとして使用した。さらに、総用量の両方のコンパレーターの組み合わせを、相加的有効性を示すために追加の陽性対照として使用した。以下のＩＳＶＤ構築物：Ｆ０２７２００９２６およびＦ０２７２０１０６２をこのモデルで評価した。全ての構築物のプレート内の位置を３連間で変えてプレート効果を回避した。
その後、１００．０００ ＣＤ４＋ Ｔ細胞（増殖サプリメントを含む滑膜細胞基礎培地の）をＦＬＳに添加した。最後に、この共培養物を、１００ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ－１７Ａ、１００ｎｇ／ｍｌ ｓＩＬ－６Ｒおよび１００ｎｇ／ｍｌ溶解性抗ＣＤ３で４８時間刺激した。４８時間後、細胞を遠心分離し、上清を回収し、－２０℃で保存した。ＭＭＰ－１およびＧ－ＣＳＦレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用して測定した。抗ｈＴＮＦ－αコンパレーターｍＡｂに反応しないドナーは除外した（ＩＳＶＤ構築物の相加的有効性および二重標的化を証明する可能性がない）。
ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の内因性分泌を、ＩＬ－１７Ａ、ｓＩＬ－６Ｒおよび抗ＣＤ３で４８時間刺激後に測定した。刺激した共培養物は、ＴＮＦ－α（刺激なしは検出限界以下）およびＩＬ－６の分泌の増加を誘導した。刺激した共培養物は、４．４ｐｇ／ｍｌ ＩＬ－６および７９７７ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αを分泌した（８名のドナーの平均値、図１１）。これらの値は、種々の刊行物から収集したヒト関節リウマチの関節からの中央値：２４±２１ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－ａおよび１３４００±１２７００ｐｇ／ｍｌ ＩＬ－６と同等であった。
ＭＭＰ－１およびＧ－ＣＳＦに対するＩＳＶＤ効能の評価のために、１名のドナー由来のＲＡ－ＦＬＳを、８名の異なるヒトドナーＴ細胞と共にインキュベートした。発明者らは、ＭＭＰ－１分泌に対する両方のアイソタイプ対照の用量依存的効果を観察しなかった。抗ｈＴＮＦ－α参照ｍＡｂは、ＭＭＰ－１分泌を部分的に低下させた。抗ｈＩＬ－６参照ｍＡｂは、抗ｈＴＮＦ－αコンパレーターｍＡｂより有効であったが、両方の抗体の組み合わせは最も高い効能を示した。ＩＳＶＤ構築物は両方とも、コンパレーター抗体の組み合わせ（２００ｎＭ Ａｂ１＋２００ｎＭ Ａｂ２を投与）と同様に有効であり、用量依存的効果を示した（図１２、ドナー８名）。同様の結果がＧ－ＣＳＦについて得られた（図１３、ドナー８名）。
６．１４ 実施例１５：ヒトアデノイドモデルにおけるＣＸＣＬ１３に対する抗ＴＮＦ－αおよび抗ＩＬ－６の相加的有効性
発明者らは、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）および胚中心Ｂ細胞からなるヒト咽頭扁桃（アデノイド）モデルにおいてＦ０２７２０１０６２の相加的有効性を評価した。簡単に言えば、発明者らは、凍結保存リンパ球と共に高密度リンパ系凝集培養を行った。この培養物を変異百日咳毒素で刺激して、ＡＩＭ（活性化誘導マーカー）応答を誘導した（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．ら ２０２０ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｂａｓｅｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｔ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ． ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ５３、１０２６８４、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｂｉｏｍ．２０２０．１０２６８４）。抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６参照ｍＡｂによる処置はＣＸＣＬ１３の分泌を部分的に低下させたが、併用およびＦ０２７２０１０６２はより強い最大の阻害を達成した。
以下に、詳細なプロトコールを記載する：
手術からのアデノイド組織を、ＲＰＭＩ培地（サプリメントを含まない）に４℃で回収した。組織は、手術後、以下のようにさらに処理した。アデノイド由来組織および細胞を、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏウシ胎児血清、適格性確認済み、熱不活性化）およびサプリメント（０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２．５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢ、０．３μｇ／ｍｌチカルシリン、０．０１μｇ／ｍｌクラブラン酸）を含有するＲＰＭＩ培地（ｌ－グルタミンを含む）で培養した。組織をＰＢＳで２回洗浄し、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏウシ胎児血清、適格性確認済み、熱不活性化）およびサプリメント（０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２．５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢ、０．３μｇ／ｍｌチカルシリン、０．０１μｇ／ｍｌクラブラン酸）を含有するＣＭＴ培地（ＲＰＭＩ培地（ｌ－グルタミンを含む）を含む皿で切開した。血まみれの焼灼組織は廃棄した。残りの組織および切断培地は、ＣＭＴ培地に沈めた４０μｍ細胞ストレーナを通じてシリンジプランジャーで機械的に破壊しながら常に漉した。次いで、懸濁細胞をＣＭＴ培地で洗浄し（５００×ｇ、５分）、カウントし、凍結保存用に１２．５～１００ Ｍｉｏ細胞／ｍｌで１０％ＤＭＳＯ／９０％ＦＣＳに吸い上げた。
実験当日、凍結保存アデノイド懸濁細胞を解凍し、次いで９６Ｕウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルで培養した。細胞は刺激しないままか、または１μｇ／ｍｌ最終濃度で百日咳毒素変異体（ＰＴ；酵素的に不活性な点変異体、高度精製および低内毒素検査済み、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｖｉａ Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて刺激した。示されている場合、培養物を以下の化合物で処置した：それぞれの濃度（２００ｎＭからの１：１０希釈、４～５種類の濃度、２連）のアイソタイプ対照、コンパレーター抗体およびＩＳＶＤ。ＩｇＧ１アイソタイプ対照はコンパレーター抗体に対する陰性対照として使用し、一方、ＶＨＨ ＩＲＲ００１１９はＩＳＶＤアイソタイプ陰性対照として使用した。抗ヒトＴＮＦ－αおよび抗ヒトＩＬ－６参照抗体はコンパレーターとして使用した。さらに、総用量の両方のコンパレーターの組み合わせを、相加的有効性を示すために追加の陽性対照として使用した。以下のＩＳＶＤ構築物：Ｆ０２７２０１０６２をこのモデルで評価した。刺激１８時間後、細胞を遠心分離し、上清を回収し、－２０℃で保存した。ＣＸＣＬ１３レベルを決定しＥＬＩＳＡによって決定した。
ＭＭＰ－１およびＧ－ＣＳＦに対するＩＳＶＤ効能の評価のために、最大７名のアデノイドドナーを評価した（試験濃度に応じて）。抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６参照ｍＡｂは、ＣＸＣＬ１３分泌を部分的に低下させた。抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６の両方の組み合わせは、百日咳毒素に誘導されたＣＸＣＬ１３の増加を用量依存的に完全に阻害した。Ｆ０２７２０１０６２は、両方のコンパレーター抗体の組み合わせと同様に有効であった（図１４、ドナー４～７名）。
高濃度での最大効能（２００ｎＭに関して利用可能な７名のドナー全員のデータ）に集中するため、発明者らは次いで、単一特異性抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体と対比したコンパレーター抗体の組み合わせおよびＦ０２７２０１０６２の相加効果を、一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ補正を用いて評価した。Ｆ０２７２０１０６２は、等モル用量（２００ｎＭ）の抗ｈＴＮＦ－αコンパレーター抗体（ｐ値：０．０００２）および抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体（ｐ値：０．００７７）より有意に有効であった。Ｆ０２７２０１０６２と２００ｎＭ抗ｈＴＮＦ－α参照抗体および２００ｎＭ抗ｈＩＬ－６参照抗体の組み合わせの間に、有意差および僅差はなかった（図１５、ドナー７名）。
６．１５ 実施例１６：ヒト全血アッセイにおける種々のＩＳＶＤ構築物の抗ＴＮＦ－α効能
発明者らは、より生理的状態であるヒト全血でＴＮＦ－ａを遮断する効能を分析した。ヒト全血をＳＥＢで刺激して内因性ＴＮＦ－ａを分泌させ、種々の濃度の抗ｈＴＮＦ－ａ参照抗体、種々のＩＳＶＤおよび対応するアイソタイプ対照で処置した。
詳細には：健康なヒトドナーからの血液を、抗凝固薬としてヘパリンＮａ ［１７ＩＵ／ｍｌ］の存在下でバキュテナー採血管（ＢＤ ＃３６８４８０）に吸引した。ＳＥＢをストック溶液［１ｍｇ／ｍｌ］として滅菌水で再構成し、ＳＥＢを含むワーキング溶液を調製した。陰性ＩｇＧ１対照抗体、抗ｈＴＮＦ－αコンパレーター抗体（陽性対照）、陰性対照ＶＨＨ ＩＲＲ００１１９および多重特異性抗ＴＮＦ－α／抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１およびＦ０２７２０１０６２のワーキング溶液を調製した。
培地［ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ製）＋１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ製；注文番号Ｈ３６６７）＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ］中、１３ｐＭ～２００ｎＭ最終濃度の抗体およびＩＳＶＤ構築物の系列希釈を、９６ウェルＶ底マイクロプレートに１０μＬで添加した。培地のＳＥＢ１０μｌを、９６ウェルプレートのヒト血液と抗体またはＩＳＶＤ構築物とのプレインキュベーション混合物の各ウェルに添加した。最後に、ヒト血液８０μＬを各ウェルに添加した。サンプルを穏やかに混合し、プレートを滅菌蓋で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、９５％ｒＨで６時間インキュベートした。インキュベーション後、２００μｌ ＰＢＳを添加し、血液サンプルを２００×ｇで１５分間遠心分離した。血漿上清を採取し、ＥＬＩＳＡによるさらなる分析のために新しい９６ウェルマイクロプレートに－８０℃で保存した。ＭＣＰ－１のレベルを、ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者によって提供されたプロトコールに従い決定した。ＣＣＬ４レベルはＬｕｍｉｎｅｘ技術（Ｒ＆Ｄ）を使用して決定した。ＳｐｅｅｄのＸＬｆｉｔプログラムを、ドナーごとに図１６および図１８の用量反応曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の算出に使用した。７名のドナー全員の幾何平均が報告されている。示されたデータは、７名のヒト血液ドナーに基づく。
ヒト全血と陰性対照ＩｇＧ１アイソタイプ抗体または陰性対照ＶＨＨ ＩＲＲ００１１９とのインキュベーションは、ＳＥＢ誘導ＭＣＰ－１放出の阻害を全くもたらさなかった（データ未掲載）。対照的に、ヒト全血と単一特異性抗ＴＮＦ－αモノクローナル参照抗体とのインキュベーションは、ＳＥＢ誘導ＭＣＰ－１放出の強い阻害を誘導し、ＩＣ５０は２．８ｎＭであった（図１５）。ヒト全血と多重特異性抗ＴＮＦ－α／抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２とのインキュベーションは、同程度までＭＣＰ－１分泌を阻害し、ＩＣ５０は３．２ｎＭであった。多重特異性抗ＴＮＦ－α／抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１は、それぞれ８．９ｎＭ、１ｎＭ、３．８ｎＭ、４．１ｎＭおよび３．５ｎＭのＩＣ５０値でＭＣＰ－１放出を阻害した（図１６）。本明細書に報告されているＩＣ５０値は幾何平均に基づくが、図１６は７名のドナー全員の平均を示す。
抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体はＭＣＰ－１の阻害を全く誘導せず、該アッセイがもっぱらＴＮＦ－αに依存することを証明した。これは、抗ｈＴＮＦ－α単独との関連における抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体による相加的有効性の欠如によってさらに強化される（図１６）。
ＴＮＦ－ａに対する効能を、第２のケモカイン読み出し、ＣＣＬ４を使用してさらに評価した（図１７および１８）。分析は、コンパレーター抗体およびＩＳＶＤ構築物としてのＦ０２７２０１０６２に的を絞った。ヒト全血と単一特異性抗ＴＮＦ－αモノクローナル参照抗体とのインキュベーションは、ＳＥＢ誘導ＣＣＬ４放出の強い用量依存的阻害を誘導し、ＩＣ５０は０．９６ｎＭであった（図１７および１８）。ヒト全血と多重特異性抗ＴＮＦ－α／抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２とのインキュベーションは、ＣＣＬ４分泌を同程度まで阻害し、ＩＣ５０は０．９２ｎＭであった（図１７および図１８）。本明細書に報告されているＩＣ５０値は幾何平均に基づくが、図１８は７名のドナー全員の平均を示す。
抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体は、ＣＣＬ４の阻害を全く誘導せず、該アッセイがもっぱらＴＮＦ－αに依存することを証明した（図１７）。これは、抗ｈＴＮＦ－α単独との関連における抗ｈＴＮＦ－αおよび抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体による相加的有効性の欠如によってさらに強化される（図１７および図１８）。
６．１６ 実施例１７：関節リウマチ患者由来のヒト線維芽細胞様滑膜細胞における種々のＩＳＶＤ構築物のＩＬ－６効能
発明者らは、関節リウマチ患者由来の初代線維芽細胞様滑膜細胞（ＲＡ－ＦＬＳ）においてＩＬ－６を遮断する効能を分析した。ＲＡ－ＦＬＳを、ＩＬ－１７Ａおよび溶解性ＩＬ－６Ｒ（膜結合ＩＬ－６Ｒが欠如しているため）で刺激した。ＴＦ－１増殖アッセイとは対照的に、それによってこのＦＬＳアッセイはＩＬ－６トランスシグナル伝達を反映する。ＲＡ－ＦＬＳはヒトＴＮＦ－αを分泌せず、それによって該システムはもっぱらＩＬ－６に依存する。刺激したＲＡ－ＦＬＳを、次いで、種々の濃の抗ｈＩＬ－６参照抗体、種々のＩＳＶＤおよび対応するアイソタイプ対照で処置した。
より詳細なプロトコール：
ＲＡ－ＦＬＳを、９６ウェルフォーマットで増殖サプリメントを含む滑膜細胞基礎培地（Ｐｅｌｏｂｉｏｔｅｃｈ）に１０．０００細胞／ウェルの密度で植え付けた。翌日、ＲＡ－ＦＬＳ培地を、アイソタイプ対照、コンパレーター抗体およびＩＳＶＤ ｉｎ それぞれの濃度（２００ｎＭからの１：１０希釈、６種類の濃度、２連）を含む培地に交換した。ＩｇＧ１アイソタイプ対照はコンパレーター抗体に対する陰性対照として使用し、一方、ＶＨＨ ＩＲＲ００１１９はＩＳＶＤアイソタイプ陰性対照として使用した。抗ヒトＩＬ－６参照抗体はコンパレーターとして使用した。以下のＩＳＶＤ構築物：Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１およびＦ０２７２０１０６２をこのモデルで評価した。
全ての構築物のプレート内の位置を２連間で変えてプレート効果を回避した。最後に、ＲＡ－ＦＬＳを、１００ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ－１７Ａおよび１００ｎｇ／ｍｌ ｓＩＬ－６Ｒで２４時間刺激した。２４時間後、細胞を遠心分離し、上清を回収し、－８０℃で保存した。ＶＥＧＦ－Ａレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用して測定した。測定は、３名の異なる関節リウマチドナーにおいて、ドナーごとに２つの異なる継代で行った。
ＲＡ－ＦＬＳと陰性対照ＩｇＧ１アイソタイプ抗体または陰性対照ＶＨＨ ＩＲＲ００１１９とのインキュベーションは、ＩＬ－１７Ａ／ｓＩＬ－６Ｒ誘導ＶＥＧＦ－Ａ分泌を遮断しなかった（データ未掲載）。対照的に、ＲＡ－ＦＬＳと単一特異性抗ＩＬ－６参照抗体とのインキュベーションは、ＩＬ－１７Ａ／ｓＩＬ－６Ｒ誘導ＶＥＧＦ－Ａ放出の強い用量依存的阻害を誘導し、ＩＣ５０は０．６７ｎＭであった（図１９および図２０）。ＲＡ－ＦＬＳと多重特異性抗ＴＮＦ－α／抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２０１０６２とのインキュベーションは、ＶＥＧＦ－Ａ分泌をわずかに低い程度まで阻害し、ＩＣ５０は２ｎＭであった。多重特異性抗ＴＮＦ－α／抗ＩＬ－６ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７２００９２６、Ｆ０２７２０１０２９、Ｆ０２７２０１０６０、Ｆ０２７２０１０６１は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、１．４ｎＭ、２．９ｎＭおよび２．７ｎＭのＩＣ５０値でＶＥＧＦ－Ａ放出を阻害した（図２０）。本明細書に報告されているＩＣ５０値は幾何平均に基づくが、図２０は全てのドナーおよび継代の平均を示す。
抗ｈＴＮＦ－αコンパレーター抗体は、ＶＥＧＦ－Ａの阻害を全く誘導せず、該アッセイがもっぱらＩＬ－６に依存することを証明した（図１９）。これは、抗ＩＬ－６単独との関連における抗ｈＴＮＦ－ａおよび抗ｈＩＬ－６コンパレーター抗体による相加的有効性の欠如によってさらに強化される（図１９）。
６．１７ 実施例１８：ヒトＴＮＦ－αトランスジェニックＴｇ１９７多発性関節炎モデルにおけるＦ０２７２０１０６２の評価。
Ｆ０２７２０１０６２を、ＴＮＦ誘発性進行性多発性関節炎のＴｇ１９７マウスモデル（Ｋｅｆｆｅｒ，Ｊ．ら Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ： ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． ＥＭＢＯ Ｊ（１９９１） １０、４０２５～４０３１頁）でプロファイリングした。これらのマウスでは、改変ヒトＴＮＦ－α遺伝子を導入遺伝子としてマウスに挿入した。ヒト遺伝子は、転写されたｍＲＮＡをより安定にするように改変され、故に四肢全てにおいて１００％浸透率でＴＮＦ－αの過剰発現および自発性進行性関節炎をもたらした。徴候および症状は約６週齢で明白になり、未処置の場合、約１０週齢以降からの有意な瀕死および死亡に至るまで絶えず増加した。関節炎重症度を、詳細な下の表１５に詳述される採点システムによって臨床的に評価した。
関節炎は、ヒトＴＮＦαの阻害を対象とする治療剤による処置に感受性であった（Ｓｈｅａｌｙ，Ｄ． Ｊ．ら Ａｎｔｉ－ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｌｌｏｗｓ ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｊｏｉｎｔ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． 関節炎 Ｒｅｓ ４（２００２）、Ｒ７、ｄｏｉ：１０．１１８６／ａｒ４３０）。
用量依存的効能を確立する目的で、種々の用量のＦ０２７２０１０６２を、関節炎の徴候および症状が明白な６週齢の動物（１群あたりｎ＝８匹）に週２回の腹腔内注射によって治療的に投与した。ヒト骨髄腫血清（ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＃ＢＥ０２９７）から精製したヒトＩｇＧ１を陰性対照として使用し、抗ヒトＴＮＦ参照ｍＡｂを陽性対照として使用して関節炎を抑制した。加えて、抗ｈＴＮＦ単一特異性ナノボディＲＡ１５６２７５６９を第２の陽性対照として使用した。Ｆ０２７２０１０６２は、それぞれ３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ体重の４つの異なる用量強度で投与した。１１週齢まで治療を継続した。臨床的関節炎スコアを週に１回決定した。図２１に示すように、Ｆ０２７２０１０６２による治療は、経時的に臨床的関節炎スコアの用量依存的抑制をもたらした。ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体で治療した動物は、１１週目まで１．５７１±０．１０８６の平均関節炎スコアを展開した。抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂおよび抗ｈＴＮＦナノボディＲＡ１５６２７５６９は関節炎進行を抑制し、１１週目の平均スコアは、それぞれ０．５１５６±０．０８９８および０．２３４４±０．０１５６であった。Ｆ０２７２０１０６２の漸増用量は関節炎進行を低下させ、１１週目の平均スコアは、１．２０３±０．０９４３（３ｍｇ／ｋｇ）、０．８２１４±０．１６１（１０ｍｇ／ｋｇ）、０．３３９３±０．０５９２（３０ｍｇ／ｋｇ）、および０．２５±０．０５７９（１００ｍｇ／ｋｇ）であった。統計解析は時間および治療に関する２元配置ＡＮＯＶＡによって行い、ボンフェローニ補正群間比較を行った（図２１）。
Ｔｇ１９７関節炎モデルにおける関節炎の全体的な抑制は、曲線下面積によって分析した（ＡＵＣ、図２２）。３ｍｇ／ｋｇより大きなＦ０２７２０１０６２の用量は、１元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ補正群間比較によって分析した場合、抗ｈＴＮＦ参照ｍＡｂおよび抗ｈＴＮＦナノボディＲＡ１５６２７５６９と同程度まで関節炎進行を有意に抑制した。
治療終了時に、後肢足首関節を組織検査用に処理し、切片を、表１６に概説した採点システムを用いて関節炎の構造的徴候について評価した。
組織学的採点の結果を図２３に示す。構造的関節炎および関節破壊は、より高用量でのＦ０２７２０１０６２によって有意に抑制された。
結論として、結果は、抗ｈＴＮＦ参照ｍＡｂおよび抗ｈＴＮＦナノボディＲＡ１５６２７５６９と同程度の、Ｆ０２７２０１０６２による関節炎の徴候および症状の用量依存的抑制ならびに構造的進行の阻害を実証する。
６．１８ 実施例１９：インビボモデルでのｈＩＬ－６誘導ハプトグロビンにおけるＦ０２７２０１０６２の評価
インビボでのＩＬ－６の阻害を、薬力学的マウス機序モデルで調査した。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスにＦ０２７２０１０６２、参照抗ｈＩＬ－６ ｍＡｂ、またはビヒクルを腹腔内経路により注射した。８時間後、マウスにＰＢＳまたは組換えヒトＩＬ－６ ２５μｇのいずれかを注射した。１６時間後、マウスを採血し、血漿を調製した。ＩＬ－６誘導急性期反応物質ハプトグロビンを、蛍光ビーズ結合アッセイによって血漿サンプルで測定した。図２４に示すように、Ｆ０２７２０１０６２の１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ用量は両方とも、参照抗ｈＩＬ－６ ｍＡｂと同様にＩＬ－６誘導血漿ハプトグロビンを十分に抑制した。
６．１９ 実施例２０：ｈＩＬ－６トランスジェニック脾腫モデルにおけるＦ０２７２０１０６２の評価
ＩＬ－６のインビボ阻害を、ｈＩＬ－６ 過剰発現のトランスジェニックマウスモデルでさらに試験した。Ｃ．Ｂ６－Ｔｇ（Ｈ２－Ｌ－ＩＬ６）１Ｋｉｓｈ／Ｊ株（Ｓｕｅｍａｔｓｕ Ｓら、１９９２：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｔ （１２；１５） ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８９（１）：２３２～５頁）は、Ｈ－２Ｌｄ主要組織適合性プロモーターの制御下でヒトＩＬ－６を過剰発現する。およそ７～１０週齢で、形質細胞増加症のようなリンパ増殖性変化、およびその後の高グロブリン血症が明白になる（Ｓｕｅｍａｔｓｕ Ｓら、１９８９： ｌｇＧｌ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８６（１９）：７５４７～５１頁）。
約２～２．５月齢のオスおよびメスのヘミ接合Ｃ．Ｂ６－Ｔｇ（Ｈ２－Ｌ－ＩＬ６）１Ｋｉｓｈ／Ｊマウスを、Ｆ０２７２０１０６２、参照抗ｈＩＬ－６ ｍＡｂ、または非特異的対照ナノボディで週３回、腹腔内注射によって治療した。２週間後、マウスを屠殺し、脾腫および高ガンマグロブリン血症を決定した。非トランスジェニック野生型同腹仔マウスは、対照としての役割を果たした。
Ｆ０２７２０１０６２ および抗ｈＩＬ－６参照ｍＡｂは両方とも、このモデルにおいて脾腫を有意に減少させる（図２５）。形質細胞増加症の抑制と一致して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの血漿レベルもＦ０２７２０１０６２および抗ｈＩＬ－６ ｍＡｂ治療によって抑制される（図２６）。
６．２０ 実施例２１：非ヒト霊長類におけるＦ０２７２０１０６２の単一用量薬物動態
試験の目的は、非ヒト霊長類における単一用量投与後のＦ０２７２０１０６２の薬物動態を調査することであった。この非ＧＬＰ試験のために、合計９匹のオスのナイーブカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用した。表１７のスキームに従って動物に投与した。
遠心分離（約１５００ｇ、４℃で１０分間）の前に、血液を室温で維持して凝固させた（最大９０分）。得られた血清を標識ポリプロピレンチューブに移し、≦－６５℃に設定した冷凍庫で保存した。開発した検証されていない一般的ＥＬＩＳＡ方法を使用してサンプルを測定した。
薬物動態プロファイルを図２７に示す。ＩＶ投与後、クリアランスは０．２７３Ｌ／時間／ｋｇであり、分布容積（Ｖｓｓ）は０．０４６４ Ｌ／ｋｇであった。薬物動態はＡＤＡに影響された。全ての投与前ナイーブＡＤＡ陰性動物は、３６０時間および６７２時間時点で試験陽性であった。
７ 産業上の利用可能性
本明細書に記載されるポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクターおよび組成物は、例えば炎症性疾患および／または自己免疫疾患に罹っている対象の処置において使用することができる。
本明細書で論じられた出版物は、本出願の出願日の前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書では、本発明が先行発明によるそのような公開に先行する資格がないという承認として解釈されるべきものではない。本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されているが、さらなる変更が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内の公知のまたは通常の習慣の範囲に入り、上に記載され以下の添付の特許請求の範囲の通りの本質的な特徴に適用されるような本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または応用を含むことを意図すると理解される。

Claims (26)

  1. ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれはＶＨＨであり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
    ａ）第１のＩＳＶＤはＩＬ－６に結合し、
    ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
    ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
    ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
    ｂ）第２のＩＳＶＤはＩＬ－６に結合し、
    ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
    ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
    ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
    ｃ）第３のＩＳＶＤはＴＮＦ－αに結合し、
    ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
    ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
    ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、前記ポリペプチドまたは組成物。
  2. 少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、および／もしくはアジュバントをさらに含む医薬組成物である、請求項１に記載のポリペプチドまたは組成物。
  3. さらに１つまたはそれ以上の薬理活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む、請求項２に記載のポリペプチドまたは組成物。
  4. ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
    ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を有し；および
    ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、
    請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
  5. ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
    ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を有し；および
    ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
  6. 前記ＩＳＶＤは１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物であって、前記ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分構造または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分構造または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分構造または結合ユニットを有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、前記ポリペプチドまたは組成物。
  8. 前記１つまたは複数の他の基、残基、部分構造または結合単位は、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている、請求項７に記載のポリペプチドまたは組成物。
  9. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分構造または結合単位は、血清アルブミンまたは血清免疫グロブリンに結合することができる結合単位からなる群から選択される、請求項７または８に記載のポリペプチドまたは組成物。
  10. 前記血清アルブミンはヒト血清アルブミンであるか、または前記血清免疫グロブリンはＩｇＧである、請求項９に記載のポリペプチドまたは組成物。
  11. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、請求項１０に記載のポリペプチドまたは組成物。
  12. ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
    ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
    ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
    ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    を含む、請求項１１に記載のポリペプチドまたは組成物。
  13. 前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有する、請求項１１または１２に記載のポリペプチドまたは組成物。
  14. ポリペプチドは、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
    かまたはそれからなる、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
  15. 医薬としての使用のための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
  16. 炎症性疾患および／または自己免疫疾患の処置における使用のための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。
  17. 炎症性疾患および／または自己免疫疾患は関節リウマチである、請求項１６に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
  18. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  19. 請求項１８に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。
  20. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
    ａ）請求項１８に記載の核酸を発現させる工程を含む、前記方法。
  21. 請求項２０に記載の方法であって、ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製する工程が続く、前記方法。
  22. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチド、または請求項１８に記載の核酸を含む、組成物。
  23. 請求項２２に記載の組成物であって、少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含む医薬組成物である、前記組成物。
  24. 請求項２３に記載の組成物であって、１種またはそれ以上の医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物をさらに含む医薬組成物である、前記組成物。
  25. 炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための医薬組成物の調製における、請求項１～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  26. 炎症性疾患および／または自己免疫疾患は関節リウマチである、請求項２５に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL318433A (en) 2014-05-16 2025-03-01 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable complexes
EP4707303A2 (en) 2014-05-16 2026-03-11 Ablynx NV Improved immunoglobulin variable domains
AR131494A1 (es) 2022-12-23 2025-03-26 Ablynx Nv Vehículos de conjugación a base de proteína
TW202448926A (zh) 2023-02-17 2024-12-16 比利時商艾伯霖克斯公司 結合新生兒fc受體之多肽
WO2025056575A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Novo Nordisk A/S Anti il-6 domain antibodies
WO2026047197A1 (en) 2024-08-30 2026-03-05 Sanofi Biotechnology Differential biomarkers for anti-interleukin-6 and anti-tumor necrosis factor-α treatment response in rheumatoid arthritis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007104529A2 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
WO2015173325A2 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
WO2017068186A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Ablynx Nv Gitr agonists

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3750106T3 (de) 1986-08-06 1999-04-22 Ajinomoto Co., Inc., Tokio/Tokyo Rekombinanter B-Zell-Differenzierungsfaktor.
JP2598666B2 (ja) 1987-10-19 1997-04-09 忠三 岸本 抗ヒトｂｃｄｆモノクローナル抗体
CA1341152C (en) 1988-01-22 2000-12-12 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human b cell stimulatory factor-2
ES2093017T3 (es) 1989-07-20 1996-12-16 Tadamitsu Kishimoto Anticuerpo contra el receptor de la interleuquina-6 humana.
JP2898064B2 (ja) 1989-08-03 1999-05-31 忠三 岸本 ヒトｇｐ１３０蛋白質
JPH05304986A (ja) 1992-04-28 1993-11-19 Tosoh Corp ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
ES2294799T3 (es) 1996-06-27 2008-04-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Moleculas de anticuerpos que interactuan especificamente con el sitio activo o hendidura de una molecula diana.
DK1027439T3 (da) 1997-10-27 2010-05-10 Bac Ip Bv Multivalente antigenbindende proteiner
AU3596599A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
EP1141711A1 (en) 1999-01-05 2001-10-10 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
DK1144616T4 (da) 1999-01-19 2009-03-30 Unilever Nv Fremgangsmåde til fremstilling af antistoffragmenter
CA2370351A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 Unilever Plc Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
WO2001040310A2 (en) 1999-11-29 2001-06-07 Unilever Plc Immobilisation of proteins using a polypeptide segment
ES2331051T3 (es) 1999-11-29 2009-12-21 Bac Ip B.V. Inmovilizacion de moleculas de union de antigenos de un dominio.
ES2324280T3 (es) 2000-03-14 2009-08-04 Unilever N.V. Dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos frente a lipasas dieteticas humanas y sus usos.
US20030190598A1 (en) 2000-05-26 2003-10-09 Jasmid Tanha Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
ATE513854T1 (de) 2000-12-13 2011-07-15 Bac Ip B V Proteinraster aus variablen domänen der schweren immunoglobulinkette von kamelen
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
EP1456410A2 (en) 2001-12-11 2004-09-15 AlgoNomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
EP1456237A2 (en) 2001-12-21 2004-09-15 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Method for cloning of variable domain sequences
CA2471645A1 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
WO2004041863A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
EP1558645B1 (en) 2002-11-08 2011-07-27 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies in pharmaceutical composition adapted for inhalation
JP2006517789A (ja) 2003-01-10 2006-08-03 アブリンクス エン．ヴェー． 治療用ポリペプチド、その相同物、その断片、および血小板媒介凝集の調節での使用
ATE485307T1 (de) 2003-11-07 2010-11-15 Ablynx Nv Camelidae schwere ketten antikörper vhhs gegen epidermalen wachstumfaktor rezeptor (egfr) und ihre verwendung
WO2006040153A2 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti -amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as alzheimer's disease
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
US8188223B2 (en) 2005-05-18 2012-05-29 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins
ES2694247T3 (es) 2005-05-20 2018-12-19 Ablynx N.V. NanobodiesTM mejorados para el tratamiento de trastornos mediados por agregación
AU2007237501A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Ablynx N.V. DP-78-like nanobodies
WO2008020079A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
EP2723771B1 (en) 2011-06-23 2019-09-11 Ablynx NV Serum albumin binding proteins
SG10201805064SA (en) 2011-06-23 2018-07-30 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
NO2768984T3 (ja) * 2015-11-12 2018-06-09
LT3374392T (lt) 2015-11-13 2022-01-25 Ablynx Nv Patobulinti serumo albuminą surišantys imunoglobulino kintami domenai
AU2016357460B2 (en) 2015-11-18 2023-07-27 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
EP3202788A1 (en) 2016-02-05 2017-08-09 MediaPharma S.r.l. Endosialin-binding antibody
RU2022101604A (ru) 2016-12-07 2022-03-29 Аблинкс Нв Улучшенные отдельные вариабельные домены иммуноглобулина, связывающиеся с сывороточным альбумином
WO2018131234A1 (ja) 2017-01-16 2018-07-19 株式会社村田製作所 ピエゾ抵抗素子、力学量検知センサおよびマイクロフォン
JP7219220B2 (ja) * 2017-01-17 2023-02-07 アブリンクス エン．ヴェー． 改善された血清アルブミン結合剤
IL267897B2 (en) 2017-01-17 2025-02-01 Ablynx Nv Improved serum albumin binders

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007104529A2 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
WO2015173325A2 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
WO2017068186A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Ablynx Nv Gitr agonists

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