JPS5823400B2 - ホエ−からシアリン酸を抽出する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酪農またはカゼイン工場ホエーからシアリン酸
を抽出する方法に関するものである。

酪農ホエーは黄色状液体で、その脂肪分を遠心分離によ
り除去した後生としてラクトース、蛋白質および無機塩
類より成ることは知られている。

酪農ホエーを浄化し含有する蛋白質を回収するための酪
農ホエーの処理は既に提案されている。

大量のホエーが酪農およびチーズ工場で製造されており
、酪農ホエーは乳を酵素処理し、特に慣例のレンネット
処理した後生成される。

かくして蛋白質はホエーから限外濾過により分離すべき
であることが提案された。

然し今日迄限外濾過は極めて興味ある特定の蛋白質また
は他の化合物を分離し製造するのには使用されていない
。

このことはシアリン酸、またはノイラミン酸と称される
酸の場合に然りである（例えばメルクルンデツクス、第
７版、第７１５頁参照）。

シアリン酸は動物炭水化物−蛋白質複合体中に存在する
ことは知られている。

事実この化合物は現在中域動物の顎下腺の如き天然原料
または卵から或いは合成により得られる。

これに関する文献としては「メンズ・オブ・バイオケミ
カル・アナリシス」第７巻（１９６０）第１９９〜２２
０頁、（インターサイエンス、ジョン・ライレイ・サン
ズ）に記載されているエム・ダブリュー・ホワイトハウ
スおよびエフ・シリケン「アイソレーション・アンド・
デターミネーション・オブ・ノイラミン酸（シアリック
）アシツズ」がある。

シアリン酸のこれ等既知製造方法は極めて経費がかかり
、これが製品の市場価格に関係する。

シアリン酸、特にＮＡＮＡの応用に関する文献としては
下記のものを挙げるこさができる：「コアギュレーショ
ン・オン・ミルク・ウィズ・レンネット：サイアンティ
フィック・アンド・テクニカル・アスペツク」ガルニエ
、モツコ、リバドーードウマ、モボアーアン ドゥヌト
リション。

アリマンテール、１９６８．２２ 、Ｂ４９５−Ｂ５５
２゜スベンネルホルム、エル、 Ａｃｔａ Ｓｏｃ
Ｍｅｄ。

アップサリエンシス６１．７５（１９５６）。

Ａｒｋｉｖ、Ｋｅｍｉ、、１０，５７７（１９５６）。

ワレン エル、、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２３３
。

１９７１（１９５９）。

ワーナー アイ、およびエル、オデイン、Ａｃｔｏ、Ｓ
ｏｃ、アップサリエンシス５７，２３０（１９５２）。

アミノフ、ディー、（１９６１）ＢｉｏｃｈｅｍＪ、８
１，３８４ 「ザ・センシテイビテイ・オン・ザ・ノイラミノシジツ
ク・リンケージ・イン・ムコーサブスタンシズ・トアズ
・アシッド・アンド・トアズ・ノイラミニダーゼ・ギボ
ンズ」バイオケミストリイ・ジャーナル（１９６３）
８９，３８０゜「ストラフチャー・スタディース・オン
・ザ・ミクソパイラス・ヘマグルチネーション・インヒ
ビクー・オン・ヒユーマン・エリスロサイテス」ラルフ
エッチ、カサンおよびリチャード ジエイ、ウインズ
ラー。

ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリイ（１
９６３）第２３８巻扁１、第２１頁。

「スタディーズ・オン・ザ・ノイラミニダーゼ・オン・
インフルエンザ・バイアラス■ アジショナル・プロパ
ティーズ・オン・ザ・エンチームズ・フロム・ザ・エイ
シャル・アンドＰＲ８・ストレインズ」マックス イー
、ラフエルマン、ジェオ。

アール、ミツチェル・シュネアーおよびワニー・ダブリ
ュ、ウィルソンＪ、Ｒ，アーカイブス・オン・バイオケ
ミストリイ・アンド・バイオフィジックス１０３（１９
６３，）４２４〜４３０゜シアリン酸の他の用途はこの
化合物に関する文献に記載されている。

他の点では、糖蛋白質を得ることができることは該糖蛋
白質を化粧品組成物に用いることができるので有利であ
る。

本発明の目的はシアリン酸、更に特にＮ−アセチルノイ
ラミン酸（ＮＡＮＡと略記する）をグリコペプチドおよ
び糖蛋白質より成る蛋白質分と一緒に極めて安価に得る
ことができる酪農ホエーの処理方法を得んとするにある
。

従って本発明は酪農ホエーの限外濾過によりホエーを処
理し、シリアン酸を抽出する方法に関するもので、 （ａ） 分子量で約１０，０００〜５０，０００のカ
ットオフを有する膜で酪農ホエーを限外濾過し主として
ラクトース、無機塩類およびグリコペプチドを含有する
Ｅ液および就中シアリン酸を含む蛋白質を含有する残留
物を得、 （ｂ） 上記残留物の蛋白質を凝結し第１蛋白質沈澱
と第１上澄み液を得これを分離、回収し、（ｃ） 上
記上澄み液を、第２上澄み液および第２蛋白質沈澱を形
成し得る条件下で燐タングステン酸で処理し、第２沈澱
を分離、回収し、 （ｄ） 第２沈澱を加水分解し、第３沈澱および第３
上澄み液を得、これを分離、回収し、 （ｅ） 上記第３上澄み液を、それ自体既知の処理工
程即ち中和し、この上澄み液を陽イオン樹脂上に通し、
陰イオン樹脂１−を通してシアリン酸を固定し、このよ
うに固定した酸を溶離し、凍結乾燥し得る極めて純粋な
シアリン酸を回収する工程を含む方法により、処理して
含有されるシアリン酸を抽出することを特徴とする。

本発明の方法の出発原料として、酪農またはカゼイン工
場ホエーを用いるが、これはすべての反部動物（牛、山
羊、雌羊、水牛等）の乳から、特に乳を酵素転換した後
得られ、特に牛または羊の乳をレンネット処理した後得
られるものである。

また保存中普通脱水される如く、脱水された酪農または
カゼイン工場ホエーを使用することもでき、乾燥生成物
は使用前液体ホエーをつくる工程でこれに添加される水
を有する。

上記（ａ）工程において、酪農またはカゼイン工場ホエ
ーは約ｉ ｏ、ｏ ｏ ｏ〜５０，０００の分子量で表
わされる平均カットオフを有する膜で限外濾過する。

この点に関して、現在市場で入手することができるかま
たは上記条件を満足し得るすべての形態の膜を使用する
ことができる。

有機または無機の膜を使用することができ、或いはセラ
ミック若しくは金属スクリーンも使用することができる
。

かかる膜はラクトース分子、無機塩類およびグリコペプ
チドを通過させ、蛋白質を残留させる。

実際には工業上必要なため、次の処理で限外濾過のＦ液
を回収するのが有利である。

限外沢過の実際の条件は普通の条件で、当業者に各場合
につき採用される。

例えばホエーを膜に直角に十分な速度、２．９６気圧（
３バール）の範囲の圧力下で流し、膜と接触する生成物
を、限外濾過の進行を知ることができる残留物の蛋白質
分が最適になるまで再循環する。

一例として約１５．０００のカットオフを有するフラン
ス国のローヌポーラン社により製造されている膜「ＩＲ
ＩＳ３０４２Ｊを上記会社により市販されている限外濾
過モジュールで用いる。

米国アミコン社から市販されるダイヤフロ（ＤＩＡＦＬ
Ｏ）膜、例えばダイヤフロＸＮ５０（カットオフ５０，
０００ ）、ダイヤフロＰＭ３０（カットオフ３０，０
００ ）およびダイヤフロＰＭ１０またはＵＭ（カット
オフ１０，０００ ）を用いることもできる。

当業者はこれ等の膜製造業者により出版されている技術
書類により、膜の構造に対する必要な知識および使用方
法を知ることができるであろう。

次の処理中限外濾過ろ液を約１０００〜５０００の範囲
の分子量で表わされるカットオフ、例えば４０００のカ
ットオフを有する膜を用い更に限外沢過するのが有利で
ある。

例えばダイヤフロＵＭ２（カットオフ１０００）の名称
で市販されている膜を使用することができる。

この付加的限外濾過により例えば人間の食糧および動物
の飼料用の付加的栄養素として価値ある生成物であるグ
リコペプチドを含有する残留物が得られる。

この残留物は実際に使用し得るグリコペプチドのシロッ
プを得るために濃縮することが必要で、上記付加的限外
濾過から得られるＰ液は濃縮後回収し得るラクトースを
主成分として含有する。

更にグリコペプチドの形態で回収する代りに残留物を処
理してここに記載する条件と同様の条件下でシアリン酸
を抽出することができる。

（ａ）工程で得られる残留物はシアリン酸、更に特にＮ
ＡＮＡを含有する。

該残留物を次の（ｂ）工程で処理する前に、その蛋白質
濃度を調整するのが有利で、これは普通残留物を乾燥物
質分が約１０％になるまで稀釈することを意味する。

（ｂ）工程を行う間可溶性蛋白質の選択的変性を熱凝結
ｌこより実施する。

この様にしてアルブミンおよびグロブリンが沈澱し、糖
蛋白質であるペプトンプロテアーゼが上澄み液中に残留
する。

この処理の条件はシアログリコプロテイン以外の蛋白質
の沈澱を得るに十分な温度に十分な時間加熱することを
含む。

適当な熱処理条件は、例えば温度が９５℃で時間が３０
分である。

これより低い温度を使用する場合には、これに対応して
処理時間を長くすべきである。

この様にして回収し得る蛋白質の沈澱および次の処理工
程で処理するＮＡＮＡを含有する上澄み液が得られる。

分離を容易にするため生成物を例えば冷却器において普
通の温度である４℃の温度まで冷却する。

次いで上澄み液と蛋白質沈澱を任意適当な方法、好まし
くは遠心分離により分離する。

（ｂ）工程で得られる上澄み液を、尚含有される全蛋白
質を沈澱させ得る薬剤と接触させる。

この目的のため燐タングステン酸を用い、蛋白質を沈澱
させるために知られている試剤、トリクロル酢酸は上澄
み液中の蛋白質の一部を沈澱させるだけであるので現在
の方法の必要条件には適さない。

燐タングステン酸処理の条件は重要なものでなく、周囲
温度で操作するのが好ましい。

この処理は酸性媒質中で、例えば硫酸の存在下で行うこ
とができる。

燐タングステン酸の濃度は予備実験により決定すること
ができる。

１特（こ上澄み液１１当り約５ｇの燐タングステン酸を
使用し、これより多い分量でもよいが、多くしてもそれ
丈の利点が得られず費用が一層かかる。

燐タングステン酸の処理は上澄み液中の蛋白質の沈澱を
得るに十分長い時間行う。

前記条件下で例えばこの処理時間は、２５℃で数分間、
例えば５分間である。

燐タングステン酸による処理に続いて、蛋白質の沈澱を
任意適当な方法、例えば遠心分離により上澄み液から分
離する。

この様にして沈澱を回収し、上澄み液を放出する。

（ｄ）工程中（ｃ）工程で分離した沈澱を加水分解する
。

加水分解は酸、酵素または塩基９こよる方法で実施する
ことができるが、酸加水分解法を使用するのが好ましい
。

硫酸かまたは次の中和工程後容易に沈澱させることがで
きる塩を形成し得る他の任意の酸を使用するのが好まし
い。

このために塩化水素酸は除去するのが困難である塩素イ
オンを生ずるので好ましくない。

酸加水分解は高温度で行うのが有利であるが、約９８℃
より高くすべきではない。

この工程は例えば約９０℃で実施する。

酸は中程度の濃度、特に０．５Ｎ以下、例えば０．ＩＮ
で使用する。

加水分解は上記加水分解が完了するに十分な時間継続す
るが、これは普通約１時間である。

加水分解した生成物を冷却した後、沈澱と上澄み液が得
られ、これ等を任意の従来法、特に遠心分離により分離
する。

上記沈澱を除去し、一方上澄み液を回収する。

（ｅ）工程に対応する上記上澄み液の他の処理は、ＮＡ
ＮＭｒ−抽出することができる一定数の操作より成る。

酪農ホエーの処理におけるこの工程で、本発明はシアリ
ン酸を得るための既知方法を使用する。

上澄み液を先ず上澄み液中に尚存在する遊離のＳ０４
イオンを沈澱させるために中和する。

この工程は加水分解を硫酸で行う場合には硫酸イオンを
沈澱させるために過剰の水酸化バリウムを添加すること
により行うのが有利である。

過剰のバリウムイオンは、はぼ中和のｐＨが得られるま
で使用する。

このように形成された沈澱した塩、例えば硫酸バリウム
を次いで除去し、上澄み液を残す。

これを随意に濃縮し然る後樹脂カラムを流通させる。

陽イオン樹脂を用い上澄み液を脱塩する。

例えば「ダウエックス」という商品名で市場で入手し得
る樹脂、例えばＡＧ５０ＷＸ８Ｈを使用する。

陽イオン樹脂上を通した後、生＋ 放物を陰イオン樹脂カラムに通してＮＡＮＡを固定する
。

ダウエックスＡＧ１８ホーメートなる商品名で市場で入
手し得る樹脂を使用する。

次いでホーメート形の陰イオン樹脂を使用する場合には
、特に０．３Ｍギ酸の如ぎギ酸で溶離することにより、
カラムを蒸留水で洗浄した後陰イオン樹脂からＮＡＮＡ
が得られる。

最後に凍結乾燥により極めて純粋なＮＡＮＡ粉末が得ら
れる溶液を生成する。

（ｅ）工程を構成する操作は種々変えることができる。

例えば中和、硫酸バリウムの分離および上澄み液の浄化
の後最後に得られたものを乾燥することができる。

次いで得られた粉末を溶媒抽出、即ち粉末をＮＡＮＡが
溶解する溶媒、例えばエタノールまたはエタノール−水
混合物と混合する。

抽出したＮＡＮＡを溶媒の除去により単離する。

添付図面に本発明方法の工程を例示する。

原料に関する限り、酪農ホエーＢは乳Ａにレンネットを
添加することによるか、またはこの目的のため再水和す
る粉末ホエーＢ′から得る。

連続する工程は添付図面の通りである。

限外濾過１後、得られる涙液を付加的限外濾過１−２で
処理し、処理残留物はグリコペプチドを含有し、このグ
リコペプチドは本発明方法により得られる生成物の一つ
である。

工程４（分離）の後で糖蛋白質を含有する上澄み液が得
られ、これ等の糖蛋白質は他の制置ある生成物である。

工程６において、ＰＴＡは燐タングステン酸を表わす。

最終工程（凍結乾燥２１）でＮＡＮＡが得られ、これは
本発明により得られる目的の生成物である。

本発明の実施例につき説明する。

実施例 １ ｉｏｏｏｚの牛乳を慣例の方法でレンネット処理し、９
００１の酪農ホエーを得た。

これ等９００１のホエーをロース・ポーラン社により市
場で入手し得る１ ５，０００カツトオフを有するＩＲ
ＩＳ３０４２膜を備えた限外濾過モジュールを流通させ
た。

ホエーを２．９６気圧（３バール）の圧力で且つほぼ周
囲温度で上記モジュールに導入した。

グリコペプチドを含有するろ液８７０１を得た。

この涙液を３０００のカットオフを有する膜を備えた限
外濾過モジュールに入れた。

この付加的限外濾過により得た残留物を濃縮し、これか
らグリコペプチドを主成物とする乾燥物質分３０％を有
するシロップ３７００ｇを得ることができた。

第１限外濾過から得られる残留物は約１００ｇのＮＡＮ
Ａを含有する乾燥物質分２０％を有する蛋白質の濃縮物
であった。

この残留物を乾燥物質分１０％になるまで稀釈し、次い
で９８℃で３０秒間加熱することにより蛋白質を凝結し
た。

次いで生成物を４℃に冷却し、しかる後遠心分離し、約
５１のＮＡＮＡに相当する６０％の初期容量に等しい容
積を有する上澄み液を得た。

この上澄み液に５９／ｌの割合で燐タングステン酸を添
加することにより上澄み液を処理し、かきまぜ乍ら反応
を２５℃で５分間継続した。

生成した沈澱を分離し、上澄み液を除去した。

沈澱は２２ｙのＮＡ、ＮＡを含有した。

上記沈澱を０．Ｉ Ｎ硫酸を用い９０℃の温度で６０分
間酸加水分解した。

沈澱の分離を容易にするため、生成物を４°Ｃに冷却し
、遠心分離を用い沈澱を上澄み液から分離した。

沈澱を除去し、約２０ｇのＮＡＮＡを含有する上澄み液
を用い処理を継続した。

この上澄み液に水酸化バリウムの飽和水溶液を添加する
ことにより中性ｐＨが得られるまで上澄み液を中和し、
過剰の硫酸イオンを硫酸バリウムの形態で沈澱させた。

次いで溶液を浄化し、硫酸バリウムを除去した。

保存した上澄み液は１９！！のＮＡＮＡを含有した。

上記上澄み液を例えば真空下（２０〜３０關Ｈｇの圧力
）、４５℃の温度で容積を１／４〜１／６に減すること
により濃縮した。

この様にして得た濃縮溶液を脱塩するために、この溶液
をダウエックスＡＧ５０ＷＸ８Ｈの商品名で市場で入手
し得る陽イオン樹脂力士 ラムに通した。

上記カラムの出口で、ＮＡＮＡを固定するため溶液をダ
ウエックスＡＧＩＸ８ホーメートの陰イオン樹脂カラム
に通した。

次いで２回蒸留した水を陽イオン樹脂を有するカラムを
洗浄するのに用い、ＮＡＮＡを０．３Ｍのギ酸により溶
離した。

陰イオン樹脂上に固定した７０％のＮＡＮＡを同様に回
収した。

ギ酸溶液の凍結乾燥により９９％以上の純度を有するＮ
ＡＮＡ粉末１３Ａを得た。

ＮＡＮＡの生成量は本発明の製造方法の興味ある経済性
を示した。

実施例 ２ 実施例１の処理条件と同様の条件で処理した。

但し１０００１の雌羊の乳を出発物質として用い、著し
く類似した結果、即ち９９％以上の純度を有するＮＡＮ
Ａ粉末を得た。

実施例 ３ 実施例１と同様に操作し、９９％以上の純度を有するＮ
ＡＮＡ粉末を得た。

但し脱脂乳粉末の再生により得た脱脂乳液を出発原料と
して用いた。

そのために５０ｋｇの脱脂乳粉末を利用し、これを９０
０４の脱脂乳液が得られる様に稀釈した。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明方法によりホエーを処理する工程図で
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 酪農またはカゼイン工場ホエーからシアリン酸を抽
   出するに当り、ホエーを分子量で１０，０００〜５０，
   ０００のカットオフを有する膜を通し限外濾過しラクト
   ース、無機塩およびグリコペプチドを主成分とするｐ液
   と蛋白質およびシアリン酸を含有する残留物を得、上記
   残留物の蛋白質を凝結し第１蛋白質沈澱と第１上澄み液
   を得、この上澄み液を分離、回収し、上記第１上澄み液
   を、第２上澄み液および第２蛋白質沈澱を形成し得る条
   件下で燐タングステン酸で処理し、第２沈澱を分離し、
   回収し、この第２沈澱を加水分解し第３沈澱および第３
   上澄み液を得、第３上澄み液を分離し、回収し、この上
   澄み液を、既知の方法即ち中和し、この上澄み液を陽イ
   オン樹脂上に通し、陰イオン樹脂上を通してシアリン酸
   を固定し、このように固定した酸を溶離し、凍結乾燥し
   得る極めて純粋なシアリン酸を回収することを含む方法
   により、処理して含有されるシアリン酸を抽出すること
   を特徴とするホエーからシアニン酸を抽出すル方法０