JPS597435B2 - アシルポリアミンアミドヒドロラ−ゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規酵素アシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼに関するものである。

更に詳しくはアシルポリアミンのアミド結合を開裂加水
分解し遊離のポリアミンを生成せしめる作用を有する酵
素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼを提供する。

また、酵素アシルアミンアミドヒドロラーゼの製造方法
を提供する。

プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンなどのポリ
アミンは細菌から高等動物、人間に至るまで広く生体中
に存在し、細胞増殖に関与している。

１９７１年のラッセル等の研究［キャンサー・リサーチ
３１巻１５５５〜１５５８（１９７１）］以来、癌と体
液中のポリアミン濃度との相関性が注目され、多くの研
究が成されてきた。

これらの研究によれば、ポリアミンは生体中において蛋
白合成、核酸合成の盛んな組織に多く谷まれ、核酸代謝
、細胞増殖に深いかかわりを持つとされている。

細胞増殖が盛んである癌細胞を有する癌患者の場合、血
液、尿等の体液中のポリアミン量が健康人に比し増大し
ていることが多くの実例について明らかにされつつある
。

従って、尿、血液等体液中のポリアミンの測定は癌の診
断法として有望な臨床検査法になり得る可能性を有する
。

従来の癌診断法はレントゲン検査、組織学的検査、内視
鏡検査、胃カメラ検査等種々の検査法が行なわれてきた
が、いずれも早期診断には不十分なものがあり、新しい
簡便な癌の早期診断法の開発が望まれている。

その意味で体液中のポリアミンレヘルに着目した新しい
癌診断システムの開発に大きな期待が寄せられている。

従来、生体中のポリアミンの定量法としては、高速液体
クロマトグラフイー、酵素法等多くの方法が提案されて
きた。

生体試料中のポリアミンを分析する場合の問題点として
、ポリアミンが生体中で多くの場合遊離の形で存在せず
、ポリアミン複合体として存在することがあげられる。

ポリアミン複合体の実体は必ずしも明らかではないが、
このポリアミン複合体に関する１，２の報告がある。

マーモードらのジャーナル オブ ファーマスーテイカ
ル サイエンス（Ｊ ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
＆ｉｅｎｃｅ） 、６ ７巻、１２号、１６７１−３（
１９７８）によれば人尿中のポリアミンはアセチルフト
レシン、アセチルスペルミジン、アセチルスペルミンの
ようなアセチルポリアミンとして存在し、またチャンら
は（Ｗ．Ｙ．Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ）クリニカ ヒミカ
アクク（Ｃｌ ｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔ
ａ）９１巻、２３３−２４１ （１ ９７９）の中で人
の羊水中のポリアミンがペプチドと共有結合したポリア
ミン複合体として存在することを報告している。

従って、ポリアミン複合体はポリアミンきアセチルある
いはペプチド等のアシル基とのアミド結合体、即ちアシ
ルポリアミンを主成分とするものであると言える。

ところが尿中のポリアミンを定量する場合、定量法が液
体クロマトグラフイーであれ、酵素法であれ分析に製き
立ってアシルポリアミンを分解し、ポリアミンを遊離の
形にするための前処理が必要である。

従来前処理として通常とられてきた手段は塩素加水分解
法である。

その一例を示すと尿と同量の濃塩酸を加えガラスアンプ
ルに封じ、１２０℃で３時間加熱するというような方法
ばとられてきた。

しかし、このような前処理は操作が繁雑である土に危険
であり、その後の定量法自体がいかにすぐれたものであ
っても，この前処理工程が生体試料中のポリアミン分析
の隘路になっていると云える。

本発明者らは、操作がより簡便ですぐれた生体試料中の
ポリアミンの分析法を確立するために、従来の塩酸分解
法に替わるよう簡便な前処理方法を見い出すべく鋭意研
究を重ねてきた。

その結果アシルポリアミンのアミド結合を開裂加水分解
し遊離のポリアミンを生成せしめる作用を有する新規な
酵素、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼを見い出し
た。

該酵素を分離・精製しその性質を明らかにしたのは本発
明者らが初めてである。

即ち、本発明は、下起理化学的性質を有し且つアシルポ
リアミンのアミド結合を開裂加水分解し遊離のポリアミ
ンを生成せしめる作用を有する酵素アシルポリアミンア
ミドヒドロラーゼである。

■ 基質特異性：アセチルプトレシン，アセチルスペル
ミン及びペンゾイルプトレシンに対して作用を示す。

■ 至通ＰＨ；ＰＨ７．２〜７．８ ■ 安定ＰＨ範囲；ＰＨ６．５〜８．５ ■ 作用適温の範囲；３０〜４０℃ ■ 温度安定の範囲；３５℃までは安定 ■ １泪害剤，金属イオンの影智；ＰＣＭＢ．０−フエ
ナンスロリン， Ｚｎイオン，Ｎｉイオンによって明害
される。

酸素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼの理化学的性
質は以下に述べるとおりである。

本酵素の活性測定は、１００ｆｆｌＭＩＪン酸緩衝液（
ｐＨ８．０ ） ２．Ｏｒｎｌ， ２ ５ ０ ｍＭア
７セチルプトレシン０．２ｍｌ、酵素溶液０． ０ ５
ｍｌを混合し、２５０゜Ｃで２０分間反応させ直ちに
沸騰水中に１０分間浸漬して反応を停止させ、生成した
プトレシンをプトレシンオキシダーゼ・アッセイ法によ
り定量する。

即ち、反応混合液を１ ０ ０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で希釈し、その２． ０ ｍｌに０．１
％０−アミンベンズアルデヒド麹液０．２ｒｕｌとプト
レシンオキシダーゼ（２０ｕ／ｒＩＬｌ）０．０５ｒＩ
ｌｌを添加し、″混合して３０℃で１時間反応させ４
３ ５ ｎｍの吸光度（Ａ４ ３ ５ ）を測定する。

プトレシンオキシダーゼ・アツセイ液中のプトレシン濃
度は次式により求められる。

プトレシン（μｍｏ ｌ ｅＡｌ） ＝ Ａ ４ ３
５ ／ ２． １酵素活性は１０分間に１μｍｏｌｅの
プトレシンを生成する酵素活性を１単位（ｌｕ．）とす
る。

また酵素比活性は、２ ８ ０ ｎｍにおける吸光度（
Ａ２８０）が１．０のときタンパク質が１．０′ＩＩｔ
≠ｌであるとして求めた、単位タンパク量当りの活性（
ｕ ．／ＩＩＩ９）とする。

１．基質特異性 ２ ５ ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相
対活性は、アセチルプトレシンに対する活性を１００と
して表示すると第１表のようになる。

２，至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは７．２〜７．８にある。

（第１図） ３．至適作用温度 本酵素の至適作用温度は３０〜４０℃である。

（第２図） ４．安定性 本酵素はｐＨ ６． ５〜８，５で安定であるが最も安
定なｐＨは７．５付近である。

（第３図）温度に対しては３５℃までは安定であるが、
それ以上の温度では活性が低下し、６０℃では１０分間
でほとんど失活する。

（第４図）また、２ ０ ｍＭリン酸バツファ一（ｐＨ
７．２）中でｔマ５℃で２週間以上安定であり、さらに
−２０℃で凍結保存すれば１ケ月以上安定である。

５．阻害剤等の影響 第２表に示されるように、本酵素は銅、亜鉛、マンガン
、コバルト、ニッケル等の金属イオンやパラクロロメル
クリベンゾエート（以下ＰＣＭＢと略記する）、ヨード
アセトアミド、Ｏ−フエナンスロリンによって阻害され
るがエチレンジアミンテトラアセテート（以下ＥＤＴＡ
と略記する）、アジ化ナトリウム、β−メルカプトエタ
ノール等によっては阻害されない。

またスペルミジン、スペルミン、アセチルスペルミン等
によっても阻害されない。

５，５′−ジチオビス（２−ニトロペンゾエート）（以
下ＤＴＮＢと略記する）及びジピリジルは酵素反応を活
性化する。

６． Ｋｍ値 アセチルプトレシンに対する本酵素のＫｍ値は２．Ｏ
Ｘ １ ０−３Ｍである。

またアセチルスペルミジン及びペンゾイルプトレシンに
対してはそれぞれ１．１ ｘ １ ０−３． ６．７
ｘ １ ０−”Ｍである。

７．分子量 酵素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼの分子量はセ
フアクリルＳ−３００によるゲルロ過法により約５ ２
，０ ０ ０と推定された。

またＳＯＳ−ポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動法に
より約５１，０００と推定された。

これらのことから酵素アシルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼはサブユニット構造を有さないモノマー酵素である
ことが推定される。

８．等電点 酵素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼをアンホライ
ン存在下で電気泳動を行い、等電点を測定したところ４
．５付近であることが推定された。

本発明における酵素アシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは上述のような諸性質を有するものであるが特にその
基質特異性においてアシルアミノ酸をほとんど分解せず
、アシルプトレシン、アシルスペルミジン等のアシルポ
リアミンに特異的に作用することが特徴としてあげられ
る。

また本酵素は至適ｐＨ範囲が７．５〜８．０にあり安定
ｐＨ範囲が６．５〜８．５にあることも特徴である。

本発明における酵素アシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは、多くの微生物及び動物臓器にその給源を求めるこ
とができる。

アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ生産菌の例として
は以下に記す多くの菌株をあげることができる。

エシエリヒア・コリＢＩＦＯ１３１６′８、エンテロバ
クター・クロアケＩＡＭ１２２１、セラチア・マルセス
センスＩＦＯＯ３０５４、バチルス・ズブチリスＩＦＯ
３０２６、アグロバクテリウム・リゾゲネスＩＦＯ１３
２５７、ミクロコツカス・ロゼウスＩＦＯ３７６４、ミ
クロコツカス・ロゼウスＩＦＯ３７６８、スタフイ口コ
ツカス・アウレウスＩＦＯ１２７３２，アルスロバクタ
ー・シンプレツクスＩＦＯ１２０６９、シュウドモナス
・イオジウムＩＦ０３５５８、シュウドモナス・オバリ
スＩＦ０３７３８，シュウドモナス・アエルジノサＩＦ
Ｏ３４４５、シュウドモナス・オーレオファシエンスＩ
ＦＯ３５２１、シュウドモナス・クロロラフイスＩＦＯ
３９０４，シュウドモナス・デニトリフイキャンスＩＦ
Ｏ１３３０２、キサントモナス・カンペストリスＩＦＯ
１３５５１、プロテウス・レットゲリＩＦＯ１３５０１
、プレビバクテリウム・アンモニアゲネスＩＦＯ１２０
７２、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ６６６ １、アス
ペルギルス・テレウスＩＦＯ６１２３、ペニシリウム・
クリソゲナムＩＦＯ４６２６、リゾプス・デレマーＩＦ
Ｏ５４０６、ムコール・ジャバニクスＩＦＯ４５７０、
ペリキュラリア・フィラメントサ■ＦＯ８９８５、トリ
コフイトン・メンタグロフイテスＩＦＯ５８０９、フザ
リウム・オキシスポラムＩＦＯ７１９０、ノイロスポラ
・クラサＩＦ０３０２１６、モナスカス・アンカＩＦＯ
６ ５ ４ ０、サツ力口マイセス・セレビシエＩＦＯ
０２５９、サツカロミセス・セレビシエＩＦＯ２１６、
サツカロミコプシス・カブシュラリスＩＦＯＯ６７２、
シゾサン力ロミセス・ポンベＩＦＯＯ３４６、ピヒア・
メンプラネファシエンスＩＦ’００１２８、ピヒア・ピ
ッケルハミＩＦＯ１２７８、ハンゼヌラ・サターナスＩ
ＦＯＯ１１７、ハンゼヌラ・アノマラＩＦＯＯ５６９、
クリュイベロミセス・ラクチスＩＦＯ１０９０、デバリ
オミセス・グロボザスＩＦＯＯ７９４、クリプトコツカ
ス・ネオフオーマンスＩＦＯＯ４１０、クレツケラ・マ
グナＩＦＯＯ８６８、ピッケルハミア・フルオレセンス
ＩＦＯＯ８６８、キャンデイダ・リポリテイカＩＦＯＯ
７１７、キャンデイダ・アルビキャンスＩＦＯＯ５７９
、ロドトルラ・グルチニスｖａｒ−ダイレネンシスＩＦ
ＯＯ４１５、ロドトルラ・グルチニスｖａｒ ．ルシタ
ニカ■ＦＯ０６８８、トリコスポロン・クタネウムＩＦ
Ｏ１１９８、シテロミセス・マツリテンシスＩＦＯ０９
５４、エンドミセス・オペテンシスエＦＯ１２０１、ロ
ドスポリジウム・トルロイデスＩＦＯ０５５９、ストレ
フトミセス・アベラニウスＩＦＯ１３４５１、ストレフ
トミセス・アベラニウスＲ−２０、ストレプトミセス・
グリシウスＩＦＯ１２８７５、ストレプトミセス・ケリ
カラーＩＦＯ１２８５４、ストレプトミセス・ヒグロス
コピクスＩＦＯ１３４７２、ストレプトミセス・フラジ
−ｒ−ＩＦＯ１２７７３，ストレフトミセス・アルプス
ＩＦＯ１３０１４，ストレプトミセス・ラベンジュレＩ
ＦＯ１２７８９、ストレプトミセス・ビリドク口モゲネ
スＩＦＯ１３３４７、ストレプトミセス・オーレオファ
シエンスＩＦ０１２８４３、アクチノミセス・フルオレ
センスＩＦ０１２８６１、ノカルディア・エリスロポリ
スＩＦＯ１２６８２、ノカルディア・コラリナＩＦ０３
３３８、ストレプトパーティシラム・ヒロシメンセＩ
Ｆ ０ １２７８５、ミコバクテリウム・フレイＩＦＯ
１３１６０また酵素アシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼの給源としての動物臓器の例としては、牛、豚、にわ
とり等の肝臓、じん臓、すい臓、心臓等をあげることが
できる。

酵素アシルボリアミンアミドヒドロラーゼは上記例示し
た多くの給源から製造することができるが、ストレプト
ミセス属に属する菌株を用いるのが好ましい。

特に本発明者等が分離したストレプトミセス１アベラニ
ウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｅｌａ−ｎｅ
ｕｓ） Ｒ − ２ ０菌〔微工研菌寄第５４４３号（
Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ Ａ． ５ ４ ４ ３ ）が好
ましく用いられる。

このストレフトミセス・アベラニウスＲ−２０菌の菌学
的性質は以下に示す通りである。

（１）形態 本菌株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸より気菌糸を伸長
し、その先端は直線状ないし波状を呈す。

輪生分枝を示さず、菌核等の特殊器管の形成は認められ
ない。

成熟した胞子鎖は１０個以上の胞子の連鎖を認め、胞子
の大きさは０．６〜１．ＩＸ１〜１．９ミクロンの円筒
形状で、胞子の表面は平滑である。

（２）各種培地における生育状態および生理的性質培養
は特に記載のないものは３０℃で行った。

また、以下のずれの培地でも、溶解性色素の生産は認め
られなかった。

■ シュクロース・硝酸塩寒天 発育は認められない。

■ グルコース・アスパラギン寒天 発育はオリーブ灰色、気菌糸は明るい茶灰色を呈す。

■ グリセリン・アスパラギン寒天 発育は明るいオリーブ色、気菌糸は明るい灰色。

■ スターチ・無機塩寒天 発育は灰味オリーブ色、気菌糸は明るいオリーブ灰色を
呈する。

培養後５日目ごろより、スクーチの氷解が認められる。

■ チロシン寒天 発育は灰味オリーブ色、気菌糸は灰味黄茶色。

■ 栄養寒天 明る脊オリーブ灰色に発育し、気菌糸の着生は認められ
ない。

■ イースト・麦芽寒天 発育は灰味黄茶色で、茶灰色の気菌糸を着生する。

■ オートミール寒天 発育は灰味オリーブ色、気菌糸は明るい灰色。

■ グルコース・ペプトン・ゼラチン穿刺培養気菌糸の
着生は認められない。

培養後９日目ごろよりゼラチンの液化が認められる。

［相］ 脱脂粉乳 気菌糸の着生は認められない。

培養後９日目ごろより淡いクリーム色に変化し、さらに
培養後１６日目ごろよりうすい黄茶色に変化するととも
に脱脂粉乳の凝固を示す。

０ メラニン様色素の生成 チロシン寒天およびペプトン・イースト・鉄寒天のいず
れの培地においてもメラニン様色素の生成は認められな
い。

＠ プリドハム・ゴドリーブ寒天での炭素源の利用性 Ｄ−グルコース、シュクロースをよ， ＜ 利用し、Ｄ
−フラクトースも利用するが、Ｄ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフイノ
ース、Ｄ−マンニトールは利用しない。

［相］ 最適生育温度 マルトース・イースト寒天（ｐＨ７．０）を用いて６℃
、１２℃、１９℃、２６°０１３５℃、４０℃、４３℃
の各温度での試験の結果、１２゜Ｃ〜３５℃で生育可能
であるが、２６°Ｃ付近が最適温度と思われる。

以上の結果を総括すると、本菌株はストレプトミセス属
に属し、菌糸の先端は直線状・波状を示し、胞子の表面
は平滑である。

種々の培地で明るいオリーブ色〜灰味オリーブ色の発育
上に明るいオリーブ灰色〜茶灰色の気菌糸を着生し、溶
解性色素およびメラニン様色素は認められない。

蛋白分解力およびスターチ氷解性を有する。

炭素源としてはＤ−グルコース、シュクロース、Ｄ−フ
ラクトースを利用する。

これらの性状より、類似する既知菌種をＩＳＰ（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐ
ｒｏｊｅｃｔ）により検索すると最も近縁菌としてスト
レプトミセス・アベラニウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ａｖｅｌ ｌａｎｅｕｓ）が挙げられる。

本菌株はＩＳＰ記載のストレプトミセス・アベラニウス
の諸特徴をすべて満たしている。

また、バージエイの記載（Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ ， ８ ｔｈ Ｅｄ．）でも胞子鎖の形態
がオープン ループコイル（ｏｐｅｎｌｏｏｐ ＋ ｅ
ｏｉ ｌ）又はフソクス（ｈｏｏｋｓ）に属するという
点で若干の差異が認められるが、その他の点では、本菌
株はストレプトミセス・アベラニウスの諸特徴をすべて
満している。

従って本菌株をストレプトミセス・アベラニウスに属す
る菌株と固定し、ストレプトミセス・アベラニウス・Ｒ
−２０（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｌ ｌａｎ
ｅｕｓ Ｒ − ２ ０ ）と命名した。

アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ生産菌の培養にあ
たって使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機塩
その他の栄養源を加えた合成培地又は天然培地のいずれ
でも使用可能である。

炭素源としてはグルコース、シュクロース、フラクトー
ス、グリセロール、スターチ等の一般的に使用されるも
のでよい。

窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等
の無機窒素化合物あるいはペプトン、肉エキス、コンス
チーフリカー、酵母エキス、アスパラギン等の有機窒素
化合物を用いる。

無機塩としてはリン酸１カリウム、リン酸２カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等を使用し、他に消
泡剤としてアデカノールＬＧ−８０５等の界面活性剤を
必要に応じて添加する。

また酵素生産誘導物質（インデューサー）としてアセチ
ルプトレシン、ペンゾイルプトレシン等のアシルポリア
ミンを培地中に添加しておくことが望ましい。

アセチルプトレシンは最初から培地中に加えておいても
よいし、菌体の増殖途中で添加してもよい。

アセチルプトレシンの添加量は０．０５％以上で酵素生
産誘導効果を示すが、好ましくは０．１〜０．３％であ
る。

培養はｐＨ５〜８の範囲で可能であるが、ｐＨ７〜８の
範囲で行なうのがより望ましい。

ジャーファーメンターによる培養を行なう際には、初期
ｐＨを７、０〜８．０、望ましくは７．０にしておけば
よいが、培養中にｐＨ５以下にならないようにすること
が必要である。

また培養温度は１２〜３５℃の範囲で可能であるが、望
ましくは２６〜３０℃である。

培養には酸素の供給が必要で、通気攪拌を行なう必要が
ある。

ジャーファーメンターでの培養時間は通常１６〜２４時
間であるが、高活性な菌体を得るには菌体増殖が静止期
（Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）に達しているこ
とが望ましい。

アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ生産菌を培養した
後、酵素を回収するに際し、ストレプトミセス・アベラ
ニウスＲ−２０の場合には酵素は主に菌体内にあるので
、先ず培養液から菌体を分離する。

この菌体もしくは界面活性剤、リゾチーム等による処理
物を酵素剤とすることもできるが、菌体を破砕して粗酵
素液とすることもでき、また硫安分画、透析、カラムク
ロマトグラフイー、ゲル濾過等により精製した酵素剤と
することもできる。

本発明の酵素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼの使
用形態としては精製酵素に限らず、微生物の培養物、生
菌体、凍結融解菌体、歯体破砕物、粗酵素抽出液また酵
素を精製する際の途中段階の標品等のいずれを用いても
よい。

酵素又は菌体を水不溶性の担体に担持せしめ固定化酵素
、固定化酌体の形態で用いることも可能である。

本発明の酵素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼは水
性媒体中でアシルポリアミンに作用せしめ、アシルポリ
アミンを加水分解して遊離のポリアミンを生成せしめる
のに用いられるが、′特に人の体液、例えば尿中のアシ
ルポリアミンを分解してポリアミンを遊離化せしめるた
めに用いられる。

酵素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼを作用させる
際の反応条件としては、反応液のｐＨ ６． ５〜８．
５、特に７〜８が好ましい。

反応温度は通常５０℃以下で適宜選択されるが、好まし
くは２５〜３５℃が選ばれる。

この反応をアセチルプトレシンの場合について示すと次
のようになる。

本酵素を作用せしめる対象である基質としてのアシルポ
リアミンに関しては本酵素の基質特異性の項で述べたが
、アシルポリアミンのポリアミン側の例としてはプトレ
シン、スペルミジン、スペルミンがあげられる。

アシル基については広い範囲から選ぶことができ例えば
アセチル基、ベンゾイル基等の有機酸残基、グリシル基
、アラニル基等のアミノ酸残基等があげられる。

本発明における酵素アシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼを人の体液、例えば尿に作用させてポリアミンを遊離
化せしめる方法は、体液中のポリアミンを分析する際の
前処理方法として従来の塩酸分解法に替る極めて簡便で
すぐれた方法である。

酵素アシルポリアミンアミドヒドロラーゼを作用せしめ
ポリアミンを遊離化させた後の体液中のポリアミンの分
析には、高速液体クロマトグラフイー、酵素法等公知の
ポリアミン定量法を用いることができる。

次に実施例により本発明を説明するが、本発明Ｏｉこれ
らの実癩例に限定されるものではない。

実施例 １ （菌の培養、酵素の精製） ストレプトミセス・アベラニウスＲ−２０（微生物保管
委託申請書受理番号第５４４３号）を、アセチルプトレ
シン０．１％、グルコース０．５％、ペプトン０．４％
、酵母エキス０．２％、食塩０．２％（ｐＨ７．０）の
培地１０．４を２０ｔ容ジャーファーメンターに仕込み
１２１℃、１５分滅菌したものに植菌し、３０℃で１８
時間培養した。

同一組成の培地を含む５００ｒｒＬｌ容坂ロフラスコで
培養した培養液をシードとし、接種量は５係とした。

ジャーファーメンター培養は攪拌回転数６ ０ ０ ｒ
ｐｍ，通気量１ｖｖｍ で行ない、初発ｐＨ７とし、
培養中のｐＨの下限が５．０以下にならぬように調整し
た。

培養終了後、遠心分離により集菌した菌体１４４ｇ（湿
重量）を０．ＯＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁
し、ダイノミルにて細胞を破砕し、遠心分離により土清
として粗酵素抽出液１，６２５ｒｒＬｌを得た。

この粗酵素抽出液は蛋白質５０ｇを含み、酵素活性は３
０，０００単位であった。

粗酵素抽出液に硫酸アンモニウム７６７ｇ（７０％飽和
）を加え、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して、同緩衝液に対
して２４時間透析した。

透析内液は３ ０ ０ｗＬｌで、２４ｇの蛋白質を含み
、酵素活性は２５，０００単位であった。

この透析内液を、予じめ１ ０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース力ラ
ム（４．５ｘ４５ｃ＊）に吸着させ、食塩（ ０． １
〜０． ５ Ｍ ）を含む上記緩衝液で濃度勾配溶出を
行なった。

活性画分を集め、硫安沈殿（７０％飽和）後、１ ０
ｍＭ ’）ン酸緩衝液に対して透析して、７０ＴＬｌの
酵素溶液を得た。

この酵素溶液は蛋白質２，５００ｍｙを含み、酸素活性
は２４，０００単位であった。

この酵素溶液を、２ ０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ−セファデツクスＡ−５０カラム（ １
．７ Ｘ ２ ４ｃｒｒＬ）に吸着させ、０〜０．４Ｍ
の食塩濃度勾配をもつ上記緩衝液で溶出した。

活性画分を集め硫安沈殿（７０％飽和）により濃縮して
、２７．５ｒｒＬｌの酵素標品を得た。

本酵素標品は蛋白質４５７■を含み、酵素活性は１１，
０００単位であった。

この酵素標品を、２ｍＭ ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７．２
）で調製したヒドロキシアパタイト力ラム（１．２Ｘ２
０ ｃｒｒＬ）により精製した。

活性画分の大部分はカラムを通過した。

不純蛋白質のほとんどが吸着され、５〜５０ｍＭの濃度
勾配をもつリン酸緩衝液で溶出された。

ここに得られた酵素標品（６４Ｕｌｌ）は１６．６７Ｉ
ＩＪ１の蛋白質を含み、その酵素活性は２，８００単位
であった。

本標品を飽和硫安溶液に対して透析・沈殿させて濃縮し
れ後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で調製した
セファデツクスＧ−２００カラム（１．７Ｘ５５ｃｒｒ
Ｌ）でゲル濾過することにより精製した。

精製パターンを第５図に示した。こうして得られた精製
酵素標品（４０ｍｌ）は９．２ｍ９の蛋白質を含み、そ
の酵素活性は１，０１６単位であった。

（本酵素の作用） 前記で得られたアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ標
品を用いて、アシルポリアミンに対する本酵素の作用を
調べた。

第３表に示す１０ｍＭアシルポリアミンを基質として０
．５ｒｒＬｌ採り、１００ｍリン酸緩衝液（． ｐＨ７
．８ ） １．３ ５ＴＬｌを加え、さらに上記の酵素
標品０．０５ｍｌを添加して、３０℃で反応させた後、
５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）０．１ｍｌを添加して
反応を停止させた。

反応混合液を高速液体クロマトグラフイーで分析した結
果、それぞれのアシルポリアミンに対応する、遊離ポリ
アミンの唯一のピークが新たに出現した。

その遊離ポリアミンの定量結果を第３表に示した。

さらに同反応混合液をシリカゲルの薄層プレート上にス
ポットし、メチルセロソルブ：プロピオン酸：水（食塩
飽和）＝１ ４ ： ３ ： ３の展開溶媒でクロマト
クラフイー（ＴＬＣ）を行ない、ニンヒドリン発色を行
なうと、それぞれのアシルポリアミンに対応する遊離ポ
リアミンのスポットのみが新しく出現した。

そのＲｆ値を第３表に併記した。

尚、アセチルプトレシン、スペルミジンのＲｆ値はそれ
ぞれ０．５０、０，２４であった。

また、１． ２ ５ ｍＭアセチルプトレシン０． ２
ｒｆＬｌＫ，前記酵素標品を各種濃度（ １ ， ２
， ５ ｕ．／ ２．５ｒＩＬｌ）に添加し、１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で全量が２．５ｒＩＬ
ｌになるようにした混合液を３０℃で１５．３０．６０
分間反応させた後、直ちに沸騰水中に１０５間浸漬して
反応を停止させ、生成したプトレシンを高速液体クロマ
トグラフイーにより定量した結果を第６図に示した。

これらの結果よりアシルポリアミンが本酵素により加水
分解されてアシルポリアミンに対応するポリアミンが遊
離することが確認された。

（本酵素の基質特異性） 前記で得られた酵素標品を用いて基質特異性を調べた。

第４表に示す基質をそれぞれ２５μｍｏｌｅ含む０．
１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を１
．３ ９−１ ３．９ ｕ．添加し、０． ９ ５ ｒ
ｕｌにしたものを３０℃下で２０分〜１５０分間反応さ
せた。

反応は０．０５ｄの５０％（Ｗ／Ｖ）｝リクロ口酢酸を
加えることによって停止させた。

沈殿したタンパク質を４，０ ０ ０ ｒｐｍ下で１０
分間遠心して除去した後、高速液体クロマトグラフイー
により脱アシル化して遊離した化合物を分析、定量した
。

また相対活性を求めた。

これらの結果を第４表に併記した。

尚、相対活性の表示はアセチルプトレシンを加水分解し
てプトレシンを遊離する速度を１００％とした。

（本酵素の至適作用ｐＨ） 前記で得られた酵素標品を用い、本酵素の至適作用ｐＨ
を調べた。

５０ｍＭアセチルプトレシン０．２ｒｕｌと１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ５．３ ， ５．６，５．９ ，
６．４ ， ６．９ ， ７．５ ， ８．０ ）また
は１００７７１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．２ ，
７．６ ， ８．１ ， ９．０）２． Ｏ ｒｎｌ
の混合液に上記の酵素標品０．０５ｗＬｌをそれぞれ添
加して、２５℃で２０分間反応させた後、直ちに沸騰水
中に１０分間浸漬して反応を停止させた。

その反応混合液中に生成したプトレシンをプトレシンオ
キシダーゼ・アツセイ法により定量して、酵素活性を求
め、最高の酵素活性を１００係とした相対活性は第１図
に示す通りであった。

第１図から明らかなように本酵素の至適作用ｐＨが７．
２〜７．８の範囲にあることがわかる。

（至適作用温度） 前記で得られた酵素標品により、本酵素の至適作用温度
を調べた。

１０ｍＭアセチルプトレシン０．２ｍｌと１ ０ ０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０ ） ２．ＯｒｒＬｌの
混合液に上記の酵素標品０．０５ｒｒＬｌを添加して、
１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，６０ ．
７０℃の各温度でそれぞれを５．１０，２０ ．４０分
間反応させた後、直ちに沸騰水中に１０分間浸漬して反
応を停止させた。

その反応混合液中に生成したプトレシンをプトレシンオ
キシダーゼ・アツセイ法により定量したとこ１ろ、第２
図に示す結果が得られた。

第２図より萌）らかなように本酵素の至適作用温度は３
０〜４０℃であった。

（本酵素のｐＨ安定性） 前記で得られた酵素標品を用いて、本酵素のｐＨに対す
る安定性を調べた。

１００ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ５．３ ， ５．６
， ５．９ ， ６．４ ， ６。

９ ， ７．５ ，８．０）または１ ０ ０ ｍＭ
｝リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．２ ， ７．６ ， ８
．１ ， ９．０ ） ０．８ｍｌと上記の酵素標品０
．２ｒ／Ｌｌを混合し、２５℃で１時間放置した後、そ
れぞれの酵素溶液の酵素活性を測定し、最高の酵素活性
を１００％とした相対活性を調べたところ、第３図に示
す通りであった。

第３図より明らかなように本酵素はｐｈ１ ７． ５付
近で最も安定であった０ （本酵素の熱安定性） 前記で得られた酵素標品を用いて、本酵素の熱に対する
安定性を調べた。

１ ０ ０ ｍＭ ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７．８ ）
２．ＯｒＩ′Ｌｌと上記の酵素標品０．０５ｒｒＬｌを
混合し、１０，２０，２５，３０，３５，４０，４５
，５０ ，６０ ．７０℃の各温度で１０分間維持した
後、２５℃でそれぞれの酵素活性を測定した。

この温度処理を行なわなかった酵素標品の活性を１００
％とした相対活性を調べたところ第４図に示す通りであ
った。

第４図から明らかなように本酵素はｐＨ７．８において
３５℃まで安定である。

実施例 ２ グルコース０．５％、ペフトン０．４％、ｅｉ−ｃキス
０．２％、食塩０．２％を含む培地（ｐ｝ｉ７．０）に
第５表に示すアシルポリアミンを添加し、１ＯｒｆＬｌ
づつを大型試験管に分注し、１２１℃，１５分間殺菌し
たものにストレプトミセス・アベラニウスＲ一２０（微
生物保管委託申請書受理番号第５４４：ｌ．号）を接種
し、３０℃で４０時間培養した。

培養終了後、遠心分離により菌体を集め、０、８５チ食
塩水で洗浄した後、１ ０ ０ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液
５ｒｒＬｌに懸濁して−５℃の冷却下で超音波処理（２
０ｋｃ，５分）した。

この超音波処理液を遠心分離して酵素抽出液を得た。

それぞれの酵素抽出液のアシルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼ活性を測定し、酵素比活性を求めその結果は第５
表のとおりであった。

用途例 １ 尿２０ｒｄを採取し、ＩＮ苛性ソーダにてｐＨを７．８
に調製した後、実癩例１で得た酵素標品１ｒｒＬｌ（酵
素活性２ ５． ４ ｕ ／ｒｕｌ！ ）を加え、３０
℃で１時間インキユベートした。

反応液を濾過後、濾液をカチオン交換樹脂バイオレツク
ス７００．５ｒＩＬｌのカラムに通過させ、次に０．２
Ｎクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）約２０ｒＩＬ
ｌでカラムを洗浄した後、０．５Ｎ塩酸溶液で溶出し溶
出液４ｍｌを得た。

この溶出液中のプトレシンを高速液体クロマトグラフイ
ーにて分析したところ、プトレシン濃度は９８０μＭで
あった。

これは尿試料中のプトレシン濃度１９．６μＭに相当す
る。

用途例 ２２ 用途例１とは異なる尿試料２０ｍｌにＩＭトリスー塩酸
緩衝液（１）Ｈ８．Ｏ ） ３．０ｍｌを加えてｐＨ調
整（ｐＨ７．８）Ｌた後、実癩例１で得た酵素標品１ｒ
Ｉｌｌを加え３０℃で１時間インキユベートした。

反応液にＩＮ塩酸を加えｐＨを６．０に調整した後、カ
チオン交換樹脂バイオレツクス７ ０ ， ０．５ｒＩ
ｌｌにかけ、水２０ｍｌにて洗浄後、０．５Ｎ塩酸４．
Ｏ ｒｎｌにて溶出する。

溶出液に２ＭトｌＪス溶液１．２ｍｌを加えｐＨを８，
０に調整した後、酵素法にてポリアミンの分析を行った
。

すなわち１． Ｏ ｍｌｐＨ調整後の溶出液、０．５ｍ
ｌ Ｏ．ＩＭ｝リスー塩酸緩衝液（ ２ ０ ｐ９パー
オキシダーゼ）、１２０μｇ４−アミンアンチヒリン、
１６μｇ２，４−ジクロ口フェノールを含む）、０、０
５ｒＩ′Ｌｌプトレシンオキシダーゼ（１単位）から成
る反応液を３０℃で１時間インキユベートした後、５
１ ４ Ｈｍに泊ける吸光度を測定する。

５ １ ４ ｎｍにおける吸光度：ＯＤ５１４は０．５
３ ７であった。

この方法によるポリアミン量は次式に従って算出される
。

ポリアミン量（μＭ）＝４ ２．９ Ｘ Ｏ Ｄ，１４
測定された尿試料中のポリアミン量は２３μＭであった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素溶液を各ｐＨで、２５゜Ｃ、２０分間酵素
反応したときの相対活性を示す。 緩衝液はｐＨ５．３〜８０は１００ｍＭリン酸緩衝液、
ｐＨ７．２〜９．０は１００ｍＭト’Ｊスー塩酸緩衝液
。 第２図は酵素溶液を各温度で５．１０，２０．４０分間
反応させたときの生成プトレシン量を示す。 第３図は、酵素溶液を各ｐＨで２５℃、１時間放置後の
相対活性を示す。 緩衝液はｐＨ ５． ３〜８．０は１００７７１Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ７．２ 〜９．０は１００ｍＭトリスー
塩酸緩衝液。 第４図は、酵素溶液を各温度で１０分間維持後の残存活
性を相対活性として示す。 第５図は、本酵素のセファデツクスＧ−２００処理によ
る精製パターンを示す。 第６図は、１００μＭアセチルプトレシンの本酵素によ
る加水分解によって生じたプトレシン濃度の経時変化を
示す。 酵素使用量は１，２，５ｕ．／２．５ｍｌである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記理化学的性質を有し且つアシルポリアミンのア
   ミド結合を開裂加水分解し遊離のポリアミンを生成せし
   める作用を有する酵素アシルポリアミンアミドヒドロラ
   ーゼ。 ■ 基質特異性；アセチルプトレシン，アセチルスペル
   ミジン及びペンゾイルプトレシンに対して作用を示す。 ■ 至適ＰＨ；ＰＨ７．２〜７．８ ■ 安定ＰＨ範囲；ＰＨ６．５〜８．５ ■ 作用適温の範囲；３０〜４０℃ ■ 温度安定性の範囲；３５℃までは安定■ 明害剤，
   金属イオンの影響；ＰＣＭＢ，０−フエナンスロリン＋
   Ｚｎイオン，Ｎｉイオンによって明害される。