JPS6050438B2

JPS6050438B2 - ポリアミンの遊離化方法

Info

Publication number: JPS6050438B2
Application number: JP55053752A
Authority: JP
Inventors: 昌人岡田; 佳典吉村
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1980-04-23
Filing date: 1980-04-23
Publication date: 1985-11-08
Also published as: JPS56151494A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はアシルポリアミンの加水分解によるポリアミン
の遊離化方法に関する。

より詳しくは、アシルポリアミン分解能を有する微生物
の菌体、該菌体から得られる粗酵素抽出液若しくは精製
酵素又は動物臓器から得られるアシルポリアミン分解能
を有する粗酵素抽出液若しくは精製酵素をアシルポリア
ミンに作用させることを特徴とするポリアミンの遊離化
方法である。プトレシン、スペルミジンおよびスペルミ
ンなどのポリアミンは細菌から高等動物、人間に至るま
て広く生体中に存在し、細胞増殖に関与している。

１９７１年のラツセル等の研究〔キヤンサー・リサーチ
３１巻１５５５〜１５５８（１９７１）〕以来、癌と体
液中のポリアミン濃度との相関性が注目され、多くの研
究が成されてきた。

これらの研究によれば、ポリアミンは生体中において蛋
白合成、核酸合成の盛んな組織に多く含まれ、核酸代謝
、細胞増殖に深いかかわりを持つとされている。細胞増
殖が盛んである癌細胞を有する癌患者の場合、血液、尿
等の体液中のポリアミン量が健康人に比し増大している
ことが多くの実例について明らかにされつつある。従つ
て、尿、血液等体液中のポリアミンの測定は癌の診断法
として有望な臨床検査法になり得る可能性を有する。

従来の癌診断法はレントゲン検査、組織学的検査、内視
鏡検査、胃カメラ検査等種々の検査法が行なわれてきた
が、いずれも早期診断には不十分なものであり、新しい
簡便な癌の早期診断法の開発が望まれている。

その意味で体液中のポリアミンレベルに着目した新しい
癌診断システムの開発に大きな期待が寄せられている。
従来、生体中のポリアミンの定量法としては、高速液体
クロマトグラフィー、酵素法等多くの方法が提案されて
きた。

生体試料中のポリアミンを分析する場合の問題点として
、ポリアミンが生体中で多くの場合遊離の形で存在せず
、ポリアミン複合体として存在することがあげられる。
ポリアミン複合体の実体は必ずしも明らかではないが、
このポリアミン複合体に関する１、２の報告がある。マ
ーモードらのジャーナル牙ブフアルマソイテイカル
サイエンス（Ｊ、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃ
ｉｅｎｃｅ）、第６７巻１訝１６７１〜３（１９７
８）によれば、人尿中のポリアミンはアセチルプトレシ
ン、アセチルスペルミジン、アセチルスペルミンのよう
なアセチルポリアミンとして存在し、またチヤンらはク
リニカヒミカアクタ（ｃｌｉｎｉｃａｃｈｉｍｉｃ
ａ）Ａｃｔａ）、第９１巻２３３〜２４１（１９７９
）の中で、人の羊水中のポリアミンがペプチドと共有結
合したポリアミン複合体として存在することを報告して
いる。従つて、ポリアミン複合体はポリアミンとアセチ
ルあるいはペプチド等のアシル基とのアミド結合体、即
ちアシルポリアミンを主成分とするものであるといえる
。

１ところが、尿中のポリアミンを定量する場合定量法
が液体クロマグラフイーであれ、酵素法であれ分析に先
き立つてアシルポリアミンを分解し、ポリアミンを遊離
の形にするための前処理が必要である。

従来前処理として通常とられてきた手段は塩酸加水分解
法である。

その一例を示すと尿と同量の濃塩酸を加えガラスアンプ
ルに封じ１２０℃で３時間加熱するというような方法が
とられてきた。しかしこのような前処理は操作が繁雑で
ある上に危険であり、その後の定量法自体がいかにすぐ
れたものであつてもこの前処理工程が生体試料中のポリ
アミン分析の隘路になつていると云える。本発明者らは
、操作がより簡便ですぐれた生体試料中のポリアミンの
分析法を確立するために従来の塩酸分解法に替わるより
簡便な前処理方法を見出すべく鋭意研究を重ねてきた。
その結果特定の属に属し、アシルポリアミン分解能を有
する微生物の菌体、該菌体から得られる粗酵素抽出液若
しくは精製酵素又は動物臓器から得られるアシルポリア
ミン分解能を有する粗酵素抽出液若しくは精製酵素をア
ミルポリアミンに作用せしめることによりポリアミンを
遊離化できること、更にこれを尿中のポリアミン複合体
からのポリアミンの遊離化に適用できることを見出し、
本発明を完成させるに至つた。本発明に用いられるアシ
ルポリアミン分解能を有する微生物としては、エシエリ
ヒア属、エンテロパクター属、セラチア属、バチルス属
、アグロバクテリウム属、ミクロコッカス属、スタフイ
ロコツカス属、アルスロバクター属、シユウドモナス属
、キサントモナス属、プロテウス属、プレビバクテリウ
ム属、アスベルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属
、ムコール属、ペリキユラリア属、トリコフイトン属、
フザリウム属、ノイロスポラ属、モナスカス属、ピリキ
ユラリア属、クラドスポリウム属、サツカロミセス属、
サツカロミコプシス属、シゾサツカロミセス属、ピヒア
属、ハンゼヌラ属、クリユイベロミセス属、デバリオミ
セス属、クリプトコツカス属、クレツケラ属、ビツケル
ハミア属、キヤンデイダ属、ロドトルラ属、トリコスポ
ロン属、シテロミセス属、エンドミセス属、ロドスポリ
デイウム属、ストレプトミセス属、アクチノミセス属、
ノカルデイア属、ミコバクテリウム属、ストレプトバー
テイシラム属、ミクロモノスポラ属、アクチノプラネス
属、ミクロポリスポラ属、スピリロスポラ属またはスト
レプトスポランギウム属に属する微生物があげられ、こ
れらのうち特にシユウドモナス属、プロテウス属、リゾ
プス属、フザリウム属、ロドトルラ属、トリコスポロン
属、ストレプトミセス属、ノカルデイア属又はストレプ
トバーテイシラム属に属する微生物が好ましく用いられ
る。

これらの微生物の菌株としては、例えばエシエリヒア・
コリＢＩＦ′０１３１６８、エンテロパクター●クロア
ケＩＡＭｌ２２ｌ、セラチア、マルセスセンスＩＦＯＯ
３Ｏ５４、バチルス・ズブチリスＩＦＯ３Ｏ２６、アグ
ロバクテリウム・リゾゲネスＩＦＯｌ３２５７、ミクロ
コッカス・ロゼウスＩＦＯ３７６屯ミクロコッカス●
ロゼウスＩＦＯ３７６８、スタフイロコツカス●アウレ
ウスＩＦ′０１２７３２、アルスロバクター●シンプレ
ツクスＩＦ′０１２０６９、シユウドモナス・イオジウ
ムＩＦＯ３５５Ｆ３ｓシユウドモナス●オバリスＩＦ′
０３７３巳シユウドモナス●アエルジノサＩＦＯ３４４
＼シユウドモナス●オーレオフアシエンスＩＦ′０３５
２１、シユウドモナス・クロロラフイスＩＦＯ３９Ｏ４
、シユウドモナス・デニトリフイキヤンスＩＦ′０１３
３０２、キサントモナス・カンペストリスＩＦＯｌ３５
５ｌ、プロテウス・レツトゲＩ月ＦＯｌ３５Ｏｌ、プレ
ビバクテリウム●アンモニアゲネスＩＦＯｌ２Ｏ７２、
アスペルギルスニガー１Ｆ０６６６１、アスペルギル
ス●テレウスＩＦＯ６ｌ２λペニシリウム●クリソゲナ
ムＩＦ′０４６２６、リゾプス●デレマー１Ｆ０５４０
阪ムコール●ジヤバニクスＩＦＯ４５７ヘペリキユラリ
ア・フイラメントサＩＦＯ８９８５、トリコフイトン・
メンタグロフイテスＩＦＯ５８Ｏλフザリウム・オキシ
スポラムＩＦＯ７ｌ９Ｏｌピリキユラリア・オリゼー１
Ｆ′０５９９４、ノイロスポラ◆クラサＩＦＯ３Ｏ２ｌ
５．モナスカス●アンカＩＦＯ６５４Ｏｌクラドスポリ
ウム●ヘルバルムＩＡＭＦ５ｌ７、サッカロミセス●セ
レビシエＩＦＯＯ２５λサツカロミセス・セレビシエＩ
Ｆ′００２１６、サツカロミコプシス●カプシユラリス
■ＦＯＯ６７２、シゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯＯ
３４６、ピヒア、メンブラネフアシエンスＩＦＯＯｌ２
＆ピヒア、ビツケルハミイＩＦＯｌ２７Ｆ３ｓハンゼヌ
ラ・サターナスＩＦＯＯｌｌ７、ハンゼヌラ、アノマラ
ＩＦＯＯ５６９ｓクリユイベロミセス・ラクチスＩＦＯ
ｌＯ９ヘデバリオミセス・グロボザス［Ｆ′００７９４
、クリプトコツカスネオフオーマンスＩＦＯＯ４ｌヘ
クレツクラ●マグナＩＦ′００８６８、ビツケルハミア
・フルオレセンスＩＦ′００８６８、キヤンデイダ・リ
ポリテイカＩＦＯＯ７ｌ７、キヤンデイダ・アルビキヤ
ンスＩＦＯＯ５７ｇｓロドトルラ●グルチニスＶａｒ．
ダイレネンシスＩＦＯＯ４ｌ＼ロドトルラ●グルチニス
Ｖａｒ．ルシタニカＩＦＯｌｌｌｆ！Ｋトリコスポロン
・クタネウムＩＦＯｌｌ９＆シテロミセス・マツリテン
シスＩＦＯＯ９５４、エンドミセス・オベテンシスＩＦ
Ｏｌ２Ｏｌ、ロドスポリジウム・トルロイデスＩＦＯＯ
５５λストレプトミセス●アベラニウスＩＦＯｌ３４５
ｌ、ストレプトミセス●アベラニウスＲ−２０（微工研
菌寄第５４４３号）、ストレプトミセス・グリシウスＩ
ＦＯｌ２８７５、ストレプトミセ１ス・ケリカラー１Ｆ
０１２８５屯ストレプトミセス・ヒグロスコピクスＩＦ
Ｏｌ３４７２、ストレプトミセス◆フラジエＩＦＯｌ２
７７くストレプトミセス●アルプスＩＦＯｌ３Ｏｌ屯ス
トレプトミセス●ラベンジユレＩＦＯｌ２７８λストレ
プトミセス・ビリドクロ１モゲネス■ＦＯｌ３３４７、
ストレプトミセス・オーレオフアシエンスＩＦＯｌ２８
４ヌアクチノミセス・フルオレセンスＩＦＯｌ２８６ｌ
、ノカルデイア●エリスロポリス！ＦＯｌ２６８２、ノ
カルデイア・コラリナＩＦＯ３３３８、ストレプトバー
テイシラム、ヒロシ２メンセＩＦＯｌ２７８５、ミコバ
クテリウム・プレイＩＦＯｌ３ｌ６Ｏｌミコバクテリウ
ム・スメグマテイスＩＦＯ３ｌ５４、ミクロモノスポラ
・チヤルセＶａｒ．イズメンシスＩＦＯｌ２９８＆アク
チノプラネス・アルメニアクスＩＦＯｌ２５５＼ミク
ロポリスポラ●ケージアＩＦＯｌ２９９Ｏ、スピリロス
ポラ・アルビダＩＦＯｌ２２４８、ストレプトスポラン
ギウム●ロゼウムＩＦＯ３７７蒔があげられる。

これらの菌株のうちシユウドモナス・オバリスＩＦＯ３
７３８、シユウドモナス・デニトリフイキヤンスＩＦＯ
ｌ３３Ｏ２、プロテウス・レツトゲ１月ＦＯｌ３５Ｏｌ
、リゾプス・デレマー１Ｆ０５４０６、フザリウム●オ
キシスポラムＩＦＯ７ｌ９Ｏ、ロドトルラ◆グルチニス
Ｖａｒ．ルシタニカＩＦＯＯ６８８、トリコスポロン・
クタネウムＩＦＯｌｌ９８、ストレプトミセス・アベラ
ニウスＲ一２０１ノカルデイアエリスロポリスＩＦＯ
ｌ２６８２、ノカルデイア・コラリナＩＦＯ３３３８ｓ
ストレプトバーテイシラム・ヒロシメンセＩＦＯｌ２７
８５等が好ましく用いられる。上記菌株のうち本発明者
らが新たに分離した菌−株であるストレプトミセス・ア
ベラニウスＲ−２０について、その菌学的性質を以下に
詳述する。

（１）形態本菌株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸より気
菌糸を伸長し、その先端は直線状ないし波状を呈す。

輪生分枝を示さず、菌核等の特殊器官の形成は認められ
ない。成熟した胞子鎖は１Ｃ＠以上の胞子の連鎖を認め
、胞子の大きさは０．６〜１．１×１〜１．９ミクロン
の円筒形状で、胞子の表面は平滑である。り各種培地に
おける生育状態および生理的性質培養は特に記載のない
ものは３０℃で行なつた。

また、以下のいずれの培地でも、溶解性色素の生産は認
められなかつた。１シユクロース・硝酸塩寒天発育は認められない。

２グルコース●アスパラギン寒天発育はオリーブ灰色、気菌糸は明るい茶灰色を呈す。

３グリセリン・アスパラギン寒天発育は明るいオリーブ色、気菌糸は明るい灰色。

４スターチ・無機塩寒天発育は灰味オリーブ色、気菌糸は明るいオリーブ灰色を
呈する。

培養後５日目ごろよりスターチの水解が認められる。５
チロシン寒天発育は灰味オリーブ色、気菌糸は灰味黄茶色。

６栄養寒天明るいオリーブ灰色に発育し、気菌糸の着生は認められ
ない。

７イースト・麦芽寒天発育は灰味黄茶色て、茶灰色の気菌糸を着生する。

８オートミル寒天発育は灰味オリーブ色、気菌糸は明るい灰色。

９グルコース●ペプトン●ゼラチン穿刺培養気菌糸の
着性は認められない。

培養後９日目ごろよりゼラチンの液化が認められる。

１０脱脂粉乳気菌糸の着生は認められない。

培養後９日目ごろより淡いクリーム色に変化し、さらに
培養後１６日目ごろよりうす黄茶色に変化するとともに
脱脂粉乳の凝固を示す。

１１メラニン様色素の生成チロシン寒天およびペプトン・イースト・鉄寒天のいず
れの培地においてもメラニン様色素の生成は認められな
い。

１２プリドハム・ゴ下ソーブ寒天での炭素源の利用性Ｄ
−グルコース●シユクロースをよく利用し、Ｄ−フラク
トースも利用するが、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ
−マンニトールは利用しない。

１３最適生育温度マルトース・イースト寒天（ＰＨ７．Ｏ）を用いて６
℃、１２ＰＣ１１９℃、２６℃、３５℃、４０℃、４３
℃の各温度での試験の結果、１７７Ｃ〜３５℃で生育可
能であるが、２６℃付近が最適温度と思われる。

以上の結果を総括すると、本菌株はストレプトマイセス
属に属し、菌糸の先端は直線状・波状を示し、胞子の表
面は平滑である。

種々の培地て明るいオリーブ色〜灰味オリーブ色の発育
上に明るいオリーブ灰色〜茶灰色の気菌糸を着生し、溶
解性色素およびメラニン様色素は認められない。蛋白分
解力およびスターチ水解性を有する。炭素源としてはＤ
−グルコース、シユクロース、Ｄ−フラクトースを利用
する。これらの性状より、類似する既知菌種をＩＳＰ（
ＩｎｔｅｒｎａｔｉＯｎａｌＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓ
ＰｒＯｊｅｃｔ）により検索すると、最も近縁菌として
ストレプトミセス・アベラネウス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙ
ｃｅｓａＶｅｌｌａｎｅｌｌＳ）が挙げられる。

本菌株はＩＳＰ記載のストレプトミセス・アベラネウス
の諸特徴をすべて満たしてい．る。また、バージエイの
記載（ＢｅｒｇｅｙｓＭａｎｕａｌＯｆＤｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉＯＩＯｇｙ．．８ｔｈＥｄ
．）でも胞子鎖の形態が０ｐｅｎ１００ｐ．．ｃ０ｉ１
又はＨＯＯｋｓに属するという点で若干の差異が認めら
れるが、その他の点では本菌株はストレプトミセス・ア
ベラネウ、スの諸特徴をすべて満たしている。従つて本
菌株をストレプトミセス●アベラネウスに属する菌株と
同定し、ストレプトミセス・アベラネウス◆Ｒ−２０（
ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓａｖｅｌｌａｎｅｕｓＲ−２
０）と命名した。なおこの菌体はＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃ
ｅｓ・ＡｖｅｌｌａｎｅｕｓＲ−２０として、微生物工
業技術研究所に寄託されている。（微工研菌寄第５４４
３号）本発明て用いられる動物臓器としては、牛、豚、
にわとり等の動物の肝臓、じん臓、膵臓、心臓等があげ
られるが、特ににわとり、豚の肝臓が好ましく用いられ
る。上記の各微生物を培養するにあたつて使用する培地
としては、炭素源、窒素源、無機塩その他の栄養源を加
えた合成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である
。

炭素源としてはグルコース、シユクロース、フラクトー
ス、グリセロール、スターチ等の一般的に使用されるも
のでよい。窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウムノ等の無機窒素化合物あるいはペプトン、肉工
キズ、コーンスチープリカー、酵母工キズ、アスパラギ
ンアミノ酸類等の有機窒素化合物を用いる。無機塩とし
てはリン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム等を使・用し、他に消泡剤とし
てアデカノールＬＧ−８０５等の界面活性剤を必要に応
じて添加する。また酵素生産誘導物質（インデューサー
）としてアチチルプトレシン、ベンゾイルプトレシン等
のアシルポリアミンを培地中に添加しておくことが重要
であ”る。アシルポリアミンは最初から培地に加えてお
いてもよいし、培養途中て添加してもよい。また酵母工
キズ、ビタミン、ヌクレオチドなど生育促進に必要な微
量成分を必要に応じて添加する。培地の形態は液体、固
体のいずれでもよい。また培養の方法は静置培養、振と
う培養、通気攪拌培養のいずれでもよいが、大量培養に
は通気攪拌による液体培養が適している。培養温度は１
２〜３５℃、好ましくは２６〜３０℃て行なう。本発明
方法を実施するに際しては、大別して（１）菌体を用い
る方法、（２）菌体を破砕して得た粗酵素抽出液あるい
はこれから精製した酵素を用いる方法、（３）動物臓器
から得た粗酵素抽出液あるいはこれから精製した酵素を
用いる方法がある。

このうち（１）菌体を用いる方法には、培養物をそのま
ま用いる、培養物から遠心分離して分離した菌体を用い
る、凍結融解処理した菌体を用いる等の態様が含まれる
。また、菌体を用いる方法の場合には少量のトルエンの
ような有機溶媒や界面活性剤等を添加すると反応の進行
を円滑に行わせる効果がある。以上の諸方法のうち、ア
シルポリアミンの存在下に培養して得た菌体を分離し、
超音波等により細胞を破砕し得られた粗酵素抽出液を硫
安分画、透析、カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過等
により精製した酵素標品を用いるのが好ましい。

このような標品の例としてストレプトミセス・アベラニ
ウスＲ−２０が生産したアシルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼを精製した酵素標品をあげることができる。アセ
チルプトレシン０．１％を含む培地にストレプトミセス
●アベラニウスＲ−２０を接種し２０′ジヤーフアーメ
ンターにて３０℃、１濁間培養した後、培養液から菌体
を分離し、ダイノミルにて菌体を破砕し、得られた粗酵
素抽出液を、硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロース、ヒドロ
キシアパタイトカラムクロマトグラフィー・セフアデツ
クスＧ−２００ゲル濾過等により精製したアシルポリア
ミンアミドヒドロラーゼの理化学的性質は次の通りであ
る。尚、本酵素の活性測定は１００ｒｎ，Ｍリン酸緩衝
液（ＰＨ８．Ｏ）２．０ｍ１、２５０７ｎＭアセチルプ
トレシン０．２ｍｔ１酵素溶液０．０５ｍ１を混合し、
２５℃で２紛間反応させ直ちに沸騰水中に１吟間浸漬し
て反応を停止させ、生成したプトレシンをプトレシンオ
キシダーゼ・アツセイ法により定量する。

即ち、反応混，合液を１００７ｎ，Ｍリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ８．Ｏ）で希釈し、その２．０ｍ１に０．１％０−ア
ミノベンズアルデヒド溶液０．２ｍ１とプトレシンオキ
シダーゼ（２０ｕＩｍｔ）０．０５ｍｔを添加し、混合
して３０℃で１時間反応させ４３５ｎｍ．の吸光度（Ａ
４３５）を測定する。プトレシ５ンオキシダーゼ●アツ
セイ液中のプトレシン濃度は次式により求められる。プ
トレシン（μＭＯｌｅｌｍｌ）＝Ａ４３５／２．１酵素
活性は１紛間に１μＭＯｌｅのプトレシンを生成する酵
素活性を１単位（１ｕ．）とする。

また酵素比活性は、２８０ｒ１ＴｒＬ，における吸光度
（Ａ２８Ｏ）が１．０のときタンパク質が１．０ｍｇＩ
ｍｔであるとして求めた単位タンパク量当りの活性（Ｕ
．ｌｍｇ）とする。１基質特異性２５７７１．Ｍの濃度における各基質に対する本酵素の
相対活性は、アセチルプトレシンに対する活性を１００
として表示すると第１表のようになる。

至適ＰＨ本酵素の至適ＰＨは７．２〜７．８にある（第１図）。

至適作用温度本酵素の至適作用温度は３０〜４０℃であ
る（第２図）。

安定性本酵素はＰＨ６．５〜８．５で安定であるが最も安定な
ＰＨは７．５ｆｔ近である（第３図）。

温度に対しては３５℃までは安定であるが、それ以上の
温度では活性が低下し、６０℃では１紛間でほとんど失
活する（第４図）。また、２０ｍＭリン酸バッファー（
ＰＨ７．２）中では５℃で２週間以上安定であり、さら
に−２０℃で凍結保存すれば１ケ月以上安定てある。）
阻害剤等の影響第２表に示されるように本酵素は銅、亜鉛、マンガン、
コバルト、ニッケル等の金属イオンやパラクロロメルク
リベンゾエート（以下ＰＣＭＢと略記する）、ヨードア
セトアミド、０ーフエナンスロリンによつて阻害される
がエチレンジアミンテトラアセテート（以下ＥＤＴＡと
略記する）、アジ化ナトリウム、β−メルカプトエタノ
ール等によつては阻害されない。

またスペルミジン、スペルミン、アセチルスペルミン等
によつても阻害されない。５・５″ージチオビス（２−
ニトロベンゾエート）（以下ＤＴＮＢと略記する）及び
ジピリジルは酵素反応を促進する。

７Ｋｍ値アセチルプトレシンに対する本酵素のＫｍ値は２．０×
１０−３Ｍである。

またアセチルスペルミジン及びベンゾイルプトレシンに
対しては、それぞれ１．１×１０−３、６．７×１０−
５Ｍである。本発明において、菌体、粗酵素抽出液ある
いは精製酵素をアシルポリアミンに作用させる方法は特
に限定されず、これらをアシルポリアミンを含む溶液に
加える方法が一般に採用される。また、菌体、粗酵素抽
出液あるいは精製酵素を通常用いられる菌体、酵素の固
定化方法により固定化したものを用いることもできる。
アシルポリアミンを分解して遊離のポリアミンを生成せ
しめる反応の反応条件としては反応液のＰＨ６．５〜９
．甫に７〜８が好ましい。

反応温度は通常関℃以下で適宜選択されるが、好ましく
は２５〜３５℃が選ばれる。本発明方法の対象であるア
シルポリアミンとしては、ポリアミン側がプトレシン、
スペルジン、スペルミンであるようなアシルポリアミン
、またはアシル基がアセチル基、ベンゾイル基等の有機
酸残基、グリシル基、アラニル基等のアミノ酸残）基、
ペプチド残基であるようなアシルポリアミンがあげられ
る。これらアシルポリアミンが人の尿、血液等の体液中
に存在する楊合にも本発明方法を実施することができる
。従つて、本発明のポリアミンを遊離化せしめる門方法
は、体液中のポリアミンを分析する際の前処理方法とし
て従来の塩酸分解法に替る極めて簡便な方法を提供する
ものである。

ポリアミンを遊離化させた後の体液中ポリアミンの分析
には、高速液体クロマトグラフィー、酵素法等公知のポ
リア１ミン定量法を用いることができる。次に実施例に
より本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限
定されるものではない。

実施例１〜５９グルコース０．５％、肉工キズ０．２％
、ペプトン０．４％、酵母工キズ０．２％、食塩０．２
％、アセチルプトレシン０．１％（ＰＨ７．Ｏ）の培地
各１０ｍｔを大型試験管に分注し、１２１℃、１紛間殺
菌したものに各種微生物を斜面培養から１白金耳接種し
、３０゜Ｃ１２４〜４？盪培養した。

培養終了後、遠心分離により菌”体を集め、０．８５％
食塩水で洗浄した後、１００Ｔｎ，Ｍリン酸緩衝液５ｍ
１に懸濁して−５℃の冷却下で超音波処理（２０ｋＣ１
５分）した。この超音波処理液を遠心分離して酵素抽出
液を得た。酵素抽出液０．２ｍｔに１００ＴｒＬＭリン
酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１．８ｍ１、０．１％オルソア
ミノベンズアルデヒド０．２ｍＬ１プトレシンオキシタ
ーゼ０．０５ｍ１（２５Ｕ．）及び１０７ｎＭアセチル
プトレシン０．２ｍｔを加えて３０℃で３０分間反応さ
せ４３５ｎｒｒ１，の吸光度を測定した。即ち、酵素抽
出液をアセチルプトレシンに作用させてプトレシンを遊
離化せしめる反応と、生成したプトレシンをプトレシン
オキシダーゼを用いて酵素的に定量するための反応を同
時に行なう方法をとつた。結果を第３表に示す。表中の
生成プトレシン（μＭＯｌｅ）は、３０゜Ｃ１３紛間の
反応で、０．２ｍｔの粗酵素抽出液の作用により生成し
たプトレシン量であり、培地１ｍ１当りの活性とは、粗
酵素抽出液の酵素活性を元の培養液の１ｍｔ当りに換算
したものである。実施例６０〜７３アセチルプトレシン０．５％、塩化アンモニウム０．３
％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸一カリウム０．
１％、リン酸二カリウム０．１％、塩化ナトリウム０．
２％、酵母工キズ０．０２％の培地（ＰＨ７．Ｏ）１０
ＴＩＬＬを使用する以外は実施例１〜５９と同様の方法
て試験した。

その結果は第４表に示すとおりであつた。実施例７４〜
８０にわとりの肝臓、牛の肝臓、膵臓、心臓、豚の肝臓
、膵臓、心臓各々新鮮な臓器を冷凍したもの各３０ｙを
ナイフでスライスし、５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．
Ｏ）１５０ｍ１に懸濁し、ミキサーで破砕した後、遠心
分離により上澄をとり、これを粗酵素液とした。

アセチルプトレシンの加水分解反応は、粗酵素液０．１
ｍｔを用い、１７ＴＬ．Ｍプトレシン溶液２．３５ｍ１
中で行なつた。生成する遊離のプトレシンは、プトレシ
ンオキシダーゼを用いる酵素法により行ない、アセチル
プトレシンの加水分解反応と酵素アツセイとが同時に行
なわれるような反応系で実施した。又この場合の酵素ア
ツセイはプトレシンの酸化により生成する過酸化水素を
パーオキシダーゼ／４−アミノンチピリン／ジクロルフ
エノール系で比色定量する方法をとつた。反応液のＰＨ
は８．０１３０℃で２時間反応を行なつた。結果を第５
表に示す。実施例８１グルコース０．５％、ポリペプト
ン０．８％、酵母工キズ０．２％、食塩０．１％、アセ
チルプトレシン０．１％、アデカノールＬＧ−８０５０
．０１％を含む培地（ＰＨ７．Ｏ）１０′を２０ｅジヤ
ーフアーメンターに仕込み、１２１℃、１紛間滅菌した
。

これにストレプトミセス・アベラニウスＲ−２０（微工
研菌寄第５４４３号）を上記と同一組成の培地で５００
ｍＬ坂ロフラスコて培養したものを種菌として接種し、
攪拌回転数６００ｒ′Ｐｍｌ通気量１ｖｖｍで、３０゜
Ｃ、２橋間培養し、湿菌体１８０ｑを得た。湿菌体１５
０ｙをイオン交換水４００ｍ１に懸濁し超音波て細胞を
破砕し、遠心分離により上澄として粗酵素抽出液４２０
ｍ１を得た。この粗酵素液５００μ′を用い、２５０ｒ
ｒＬＭアセチルプトレシン０．２ｍ１、１００ｗＬＭリ
ン酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）２．０ｍＬからなる反応液に
添加し、２５゜Ｃで２０分間反応させた。反応液は沸と
う水浴中に１紛間浸漬することにより反応を停止させた
後、生成した遊離のプトレシンをプトレシンオキシダー
ゼを用いる酵素法により定量した。即ち、反応液を希釈
し、その２．０ｍＬに０．１％ｏ−アミノベンツアルデ
ヒド溶液０．２ＴＩ１１１プトレシンオキシ，ダーゼ（
２５ＵＩｍ１）０．０５ｍＬを添加し３０゜Ｃ１１時間
インキュベートした後、４３５ｎ７ｎの吸光度を測定し
た。なお、定量にあたつては基質溶液０．２ｍＬを加え
ない以外は全く同じ操作をしたものをコントロールとし
てそノの吸光度を差し引いた。その結果２吟の反応で３
６ｐｍ０１ｅの遊離プトレシンが生成した。（転化率７
２％）これは粗酵素液の酵素活性として３６Ｕ１ｍＬ（
３６μＭＯｌｅｌｍｉｎＩＴｎｔ）に相当する。実施例
８２実施例８１において、ストレプトミセス●アベラニ
ウスＲ−２０を倍養した菌体から得た粗酵素抽出液に硫
酸アンモニウムを加え、７０％飽和とし、生じた沈殿を
遠心分離により集め（１０ｎ１．Ｍリン酸緩衝液に懸濁
し、同緩衝液に対し２＠間透析した。

フ透析内液を予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．２）
で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（４．５×４
５ｃｍ）に吸着させ、食塩（イ）．１〜０．５Ｍ）を含
む上記緩衝液で濃度勾配溶出を行なつた。活性画分を集
め再度硫安（７０％飽和）沈殿、透析を同様に行つた後
、透析内液を２ＴｒＬ．Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．２）
で調製したヒドロキシアパタイトカラム（１．２Ｘ２０
ＣＴｆ１）を通して精製した。活性画分を硫安沈殿、透
析により濃縮した後、２０ｍ，Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７
．２）で調製したセフアデツクスＧＴ−２００カラム（
１．７×５５ｃｍ）のゲル濾過により精製した。精製パ
ターンを第５図に示した。このようにして、たん白質１
２．５ｍ９を含む精製酵素溶液５０ｍ１を得た。この精
製酵素液５００μｅを用いた他は実施例８１と全く同様
にアセチルプトレシンの加水分解反応を行なつた。２紛
間の反応で生成した遊離のプトレシンは２９μＭＯｌｅ
（転化率５６％）であつた。

これは精製酵素溶液の酵素活性としては２８ＵＩｍｔに
相当し、又比活性１１２Ｕ１ｍ９−たん白質に相当する
。実施例８３実施例８２て得られた精製酵素溶液５００
Ｐｅを用い、各種アシルポリアミンの１００ｗ１，Ｍ溶
液０．５ｎｔ１０．ＩＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．８）１
．３５ｍｔから成る反応液に添加し、３０℃で１紛間〜
６紛間反応を行なつた。

５０％トリク山レ酢酸０．１Ｔｎｔを添加して反応を停
止させた後、生成した遊離のポリアミンを高速液体クロ
マトグラフィーにより定量した。

結果を第６表に示す。また、１．２５ｍＭアセチルプト
レシン０．２ｍ１に前記精製酵素を各種濃度（１、２、
３ｕ．／２．５ｍｔ）に添加し、１００ＴｒＬＭリン酸
緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）で全量が．２．５ｍ１になるよう
にした混合液を３０℃で１５、３０、６紛間反応させた
後、直ちに沸騰水中に１吟間浸漬して反応を停止させ、
生成したプトレシンを高速液体クロマトグラフィーによ
り定量した。その結果を第６図に示す。実施例８４実施例８２で得られた精製酵素溶液５００Ｐｅを用い１
００７ｎＭアセチルプトレシン溶液０．５ｍｔ１１００
７７１．Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．８）１．３５ｍ１か
ら成る反応液に添加し各温度で３紛間反応を行なつた。

生成した遊離のプトレシンは実施例８１と同じ酵素法で
定量した。結果を第７表に示す。実施例８５尿２０ｍ１を採取し、１Ｎ苛性ソーダにて、ＰＨを７．
８７に調整した後、実施例８２で得た精製酵素溶液１ｍ
１（酵素活性２８ＵＩｍｔ）を加え、３０゜Ｃで１時間
インキュベートした。

反応液を濾過後、濾液をカチオン交換樹脂バイオレツク
ス７００．５ｍ１のカラムに通過させ、次に０．２Ｎク
エン酸ナトリウム溶液（ＰＨ７．０）約２０ｍ１でカラ
ムを洗浄した後、０．５Ｎ塩酸溶液で溶出し、溶出液４
ｍ１を得た。この溶出液中のプトレシンを高速液体クロ
マトグラフィーにて分析したところプトレシン濃度は９
８．０μＭであつた。これは尿試料中のプトレシン濃度
１９．６μＭに相当する。尚、尿試料２０ｍ１の代りに
１０μＭアセチルプトレシン２０ｍ１を用いた他は、上
記と全く同じ操作を行ない０．５Ｎ塩酸溶出液４ｍ１を
得、高速液体クロマトグラフィーにてプトレシン濃度の
分析を行なつたところ４９．０μＭであつた。この値は
元の試料中でのアセチルプトレシンとしての濃度９．８
μＭに相当する。これは本実施例における途中の操作の
妥当性を示すものである。比較例１実施例８５に用いたと同じ尿試料２０ｍ１について酵素
溶液を添加しない以外は実施例８５と全く同じ操作を行
なつて０．５Ｎ塩酸溶出液４ｍ１を得た。

この溶液中のプトレシン濃度は高速液体クロマトグラフ
ィーにより分析したところ８．２μＭであつた。これは
尿中のプトレシン濃度として１．６μＭに相当する。本
比較例により実施例８５で用いた尿試料中に存在する遊
離のプトレシン濃度は１．６μＭと低く、大部分が複合
体として存在し、それが酵素の作用によつて遊離化した
ことが分る。比較例２実施例８５て用いたと同じ尿試料
１０ｍ１に濃塩酸１０ｍＬを加えガラスアンプルに封じ
１２００Ｃで３時間加熱処理した。

アンプル開封後、減圧濃縮乾固し、再度１０ｍｔの水に
溶解し、濾過後、濾洗液をＰＨ７に調整した後実施例８
５と同様にバイオレツクス０．５ｍＬのカラム処理以下
の操作を行なつた。０．５Ｎ塩酸溶出液４ＴｎＬについ
て高速液体クロマトグラフィーによつてプトレシン濃度
を測定したところ５１．０μＭであつた。

これはもとの尿試料中での濃度としては２０．４μＭに
相当する。本比較例における尿−試料の塩酸分解処理は
、尿中のポリアミンを分析する際に従来から用いられて
きた通常の方法である。本比較例と実施例８５を比較す
れは本発明方法による尿の処理が、尿中のポリアミン複
合体を分解し、ポリアミンを遊離化せしめる方法として
極めて有効な方法であることが明らかである。実施例８
６尿試料２０ｍ１を採取し、１Ｎ苛性ソーダにてＰＨ７
．８に調整した後、実施例８２で得た精製酵素溶液１ｍ
Ｌを加え３０′Ｃにて１時間インキュベートした。

反応５液中のプトレシン、スペルミジンの分析を実施例
８５と同じ処理を行なつた後、高速液体クロマトグラフ
ィーにより行なつた。プトレシン、スペルミジンの尿中
での濃度は１５μＭ及び４．２μＭであつた。比較例３実施例８６と同じ尿試料について、酵素液を使用しない
以外は実施例８６と全く同じ操作を行なつたところ、プ
トレシン及びスペルミジンのいずれも検出されなかつた
。

実施例８７尿試料（実施例８５とは異なる）２０ｍ１を採取し、こ
れに１Ｍトリスバッファー（ＰＨ８．Ｏ）３．０ｍ１を
加え、実施例８２で得た精製酵素液１ｍ１を加え３０℃
で１時間インキュベートした。

反応液に１Ｎ塩酸を加えＰＨを６に調整した後、カチオ
ン交換樹脂バイオレツクス７００．５ｍ１にかけ、水２
０ｍ１にて洗浄後０．５Ｎ塩酸４．０ｍＬにて溶出し、
溶出液に△ひリス溶液１．２ｍ１を加えＰＨを８．０に
調整した後、酵素法にてポリアミンの分析を行なつた。
即ち、プトレシンオキシダーゼを用いる酵素法で、生成
する過酸化水素をパーオキシダーゼ／４−アミノアンチ
ピリン／ジクロルフエノール系による比色法で定量する
方法によつた。この方法で測定された尿中のポリアミン
濃度は２３μＭであつた。実施例８８（生菌体によるアセチルプトレシンの加水分解）実施例
１〜５９で使用した培地１０ｍ１に、各種微生物を３０
℃で２４〜４満間培養して得られた培養液１ｍ１を種と
して、５００ｍ１容坂ロフラスコに入れた同組成培地１
００ｍｔに接種し、３０℃で２４時間倍養した。

遠心分離により菌体を集め、水２００ｍ１で洗浄した後
、１００７ｎ．Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．８）５０ｍ１
に懸濁して菌体懸濁液を調製した。その５ｍ１に２５０
ｍＭアセチルプトレシン０．２ｍｔ（５０μＭＯｌｅ）
を添加し、３０℃で１時間反応させた後、遠心分離によ
り菌体を除いた。こうして得られた反応液中のプトレシ
ンをプトレシンオキシダーゼ●アツセイ法により定量し
た。尚、各々の菌体懸濁液について２５０Ｔｒ１．Ｍア
セチルプトレシン０．２ｍ１の代りに１００Ｔｒ１．Ｍ
リン酸緩衝液（ＰＨ７．８）０．２ｍ１を添加して同様
の操作を行つたものを対照にとり、その差をプトレシン
生成量とした。その結果を第８表に示す。実施例８９（
凍結処理菌体によるアセチルプトレシンの加水分解）実
施例８で得られた菌体懸濁液４０ｍ１を−２０℃の冷却
下で３日間充分に凍結させた後、室温で融解し、遠心分
離により集めた菌体を１００ｍ．Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ
７．８）４０ｍ１に再懸濁して凍結処理菌体懸濁液とし
た。

その１０ｍｔを用いて実施例羽と同等フの操作を行ない
、生成したプトレシンを定量した。その結果を第９表に
示す。実施例９０（有機溶媒、界面活性剤の添加効果）実施例８８と同様にして調製した、ストレプトミセス・
アベラニウスＲ−２０の菌体懸濁液２ｍｔを３組用意し
、第１咳に示す添加剤を夫々添加し、さらに２５０ｍ．
Ｍアセチルプトレシン０．２ｍｔ（５０μＭＯｌｅ）を
添加し、３０℃で１時間反応させた。

反応終了後、沸騰水中に１紛間浸漬して反応を停止させ
た後、遠心分離により菌体を除いて得られた反応液中の
プトレシンを実施例８８と同等の操作により定量した。
その結果を第１咳に示す。※ ノニオン系界面活性剤、
１％ＢＬ−９ＥＸ（商品名ＮｉｋｋＯｌ日光ケミカル社
製）

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素溶液を各ＰＨで２５℃、２吟間酵素反応し
たときの相対活性を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１エシエリヒア属、エンテロバクター属、セラチア属
、バチルス属、アグロバクテリウム属、ミクロコッカス
属、スタフイロコツカス属、アルスロバクター属、シユ
ウドモナス属、キサントモナス属、プロテウス属、ブレ
ビバクテリウム属、アスペルギルス属、ペニシリウム属
、リゾブス属、ムコール属、ペリキユラリア属、トリコ
フイトン属、フザリウム属、ノイロスポラ属、モナスカ
ス属、ピリキユラリア属、クラドスポリウム属、サツカ
ロミセス属、サツカロミコプシス属、シゾサツカロミセ
ス属、ピヒア属、ハンゼヌラ属、クリユイベロミセス属
、デバリオミセス属、クリプトコツカス属、クレツケラ
属、ビツケルハミア属、キヤンデイダ属、ロドトルラ属
、トリコスポロン属、シテロミセス属、エンドミセス属
、ロドスポリデイウム属、ストレプトミセス属、アクチ
ノミセス属、ノカルデイア属、ミコバクテリウム属、ス
トレプトバーテイシラム属、ミクロモノスボラ属、アク
チノプラネス属、ミクロポリスポラ属、スピリロスポラ
属およびストレプトスポランギウム属よりなる群から選
ばれた１種の属に属し、アシルポリアミン分解能を有す
る微生物の菌体、該菌体から得られる粗酵素抽出液若し
くは精製酵素又は動物臓器から得られるアシルポリアミ
ン分解能を有する粗酵素抽出液若しくは精製酵素をアシ
ルポリアミンに作用させることを特徴とするポリアミン
の遊離化方法。２微生物がエシエリヒア・コリＢＩＦＯ１３１６８、
エンテロバクター・クロアケＩＡＭ１２２１、セラチア
・マルセスセンスＩＦＯ０３０５４、バチルス・ズブチ
リスＩＦＯ０３０２６、アグロバクテリウム・リゾゲネ
スＩＦＯ１３２５７、ミクロコッカス・ロゼウスＩＦＯ
３７６４、ミクロコッカス・ロゼウスＩＦＯ３７６８、
スタフイロコツカス・アウレウスＩＦＯ１２７３２、ア
ルスロバクター・シンプレツクスＩＦＯ１２０６９、シ
ユウドモナス・イオジウムＩＦＯ３５５８、シユウドモ
ナス・オバリスＩＦＯ３７３８、シユウドモナス・アエ
ルジノサＩＦＯ３４４５、シユウドモナス・オーレオフ
アシエンスＩＦＯ３５２１、シユウドモナス・クロロラ
フイスＩＦＯ３９０４、シユウドモナス・デニトリフイ
キヤンスＩＦＯ１３３０２、キサントモナス・ガンペス
トリスＩＦＯ１３５５１、プロテウス・レツトゲリＩＦ
Ｏ１３５０１、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ＩＦＯ１２０７２、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ６６
６１、アスペルギルス・テレウスＩＦＯ６１２３、ペニ
シリウム・クリソゲナムＩＦＯ４６２６、リゾプス・デ
レマーＩＦＯ５４０６、ムコール・ジヤバニクスＩＦＯ
４５７０、ペリキユラリア・フイラメントサＩＦＯ８９
８５、トリコフイトン・メンタグロフイテスＩＦＯ５８
０９、フザリウム・オキシスポラムＩＦＯ７１９０、ピ
リキユラリア・オリゼーＩＦＯ５９９４、ノイロスポラ
・クラサＩＦＯ３０２１６、モナスカス・アンカＩＦＯ
６５４０、クラドスポリウム・ヘルバルムＩＡＭＦ５１
７、サツカロミセス・セレビシエＩＦＯ０２５９、サツ
カロミセス・セレビシエＩＦＯ０２１６、サツカロミコ
プシス・カプシユラリスＩＦＯ０６７２、シゾサツカロ
ミセス・ポンベＩＦＯ０３４６、ピヒア・メンプラネフ
ァシェンスＩＦＯ０１２８、ピヒア・ビツケルハミイＩ
ＦＯ１２７８、ハンゼヌラ・サターナスＩＦＯ０１１７
、ハンゼヌラ・アノマラＩＦＯ０５６９、クリユイベロ
ミセス・ラクチスＩＦＯ１０９０、デバリオミセス・グ
ロボザスＩＦＯ０７９４、クリプトコツカス・ネオフオ
ーマンスＩＦＯ０４１０、クレツケラ・マグナＩＦＯ０
８６８、ビツケルハミア・フルオレセンスＩＦＯ１１１
６、キヤンデイダ・リポリテイカＩＦＯ０７１７、キヤ
ンデイダ・アルビキヤンスＩＦＯ０５７９、ロドトルラ
・グルチニスｖａｒ．ダイレネンシスＩＦＯ０４１５、
ロドトルラ・グルチニスｖａｒ．ルシタニカＩＦＯ０６
８８、トリコスポロン・クタネウムＩＦＯ１１９８、シ
テロミセス・マツリテンシスＩＦＯ０９５４、エンドミ
セス・オベテンシスＩＦＯ１２０１、ロドスポリジウム
・トルロイデスＩＦＯ０５５９、ストレプトミセス・ア
ベラニウスＩＦＯ１３４５１、ストレプトミセス・アベ
ラニウスＲ−２０、ストレプトミセス・グリシウスＩＦ
Ｏ１２８７５、ストレプトミセス・ケリカラーＩＦＯ１
２８５４、ストレプトミセス・ヒグロスコピクスＩＦＯ
１３４７２、ストレプトミセス・フラジエＩＦＯ１２７
７３、ストレプトミセス・アルプスＩＦＯ１３０１４、
ストレプトミセス・ラベンジユレＩＦＯ１２７８９、ス
トレプトミセス・ビリドクカモゲネスＩＦＯ１３３４７
、ストレプトミセス・オーレオフアシエンスＩＦＯ１２
８４３、アクチノミセス・フルオレセンスＩＦＯ１２８
６１、ノカルデイア・エリスロポリスＩＦＯ１２６８２
、ノカルデイア・コラリナＩＦＯ３３３８、ストレプト
バーテイシラム・ヒロシメンセＩＦＯ１２７８５、ミコ
バクテリウム・フレイＩＦＯ１３１６０、ミコバクテリ
ウム・スメグマテイスＩＦＯ３１５４、ミクロモノスポ
ラ・チヤルセｖａｒ．イズメンシスＩＦＯ１２９８８、
アクチノプラネス・アルメニアクスＩＦＯ１２５５５、
ミクロポリスポラ・ケージアＩＦＯ１２９９０、スピリ
ロスポラ・アルビダＩＦＯ１２２４８、ストレプトスポ
ランギウム・ロゼウムＩＦＯ３７７６である特許請求の
範囲第１項記載の方法。３動物臓器が牛、豚又はにわとりの肝臓、じん臓、膵
臓又は心臓である特許請求の範囲第１項記載の方法。４アシルポリアミンが尿中のアシルポリアミンである
特許請求の範囲第１項記載の方法。