JPS6011892B2 - インタ−フエロン誘起剤の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は植物の組織から単離されたインターフェロン（
以下ＩＦという）譲起剤の製法に関する。

本発明は、優れたＩＦ譲起活性を有する物質が、キク科
ベニバナ属に属する各種植物またはその変員の組織に含
まれ、そしてこの活性物質を単に安価に単離することが
できるという知見に基いている。従って本発明の目的は
、優れたＩＦ談起活性と低い毒性とをもちかつ簡単に安
価に製造することのできるＩＦ誘起剤の製法を提供する
ことにある。

本発明により、無定形白色状粉末の状態において安定で
ＩＦ誘起活性および下記の理化学的特性を有する物質が
提供される。

凶 理化学的特性 【１｝ 元素分析 Ｈ：６．５４±０．３％、Ｃ：４１．９±０．３％、Ｎ
：２．３９±０．３％、Ｐ：０．２８±０．０３％【２
’分子量約１０万なし、し約３００万（主として約５０
万ないし１００万）〔スピンコ・モデルＥ分析用超遠心
機（米国べックマン社製）使用の超遠心法、アミコン限
外炉過機およびＸＭ５０、ＸＭＩＯＯＡおよびＸＭ３０
Ｇ戸過膜（米国アミコン社製）ＵＫＩ０、ＵＫ５０およ
びＵＫ２０の戸過膜（東洋炉紙製）使用の限外炉過法、
およびセフアデックスＧ−２００（スエーデン国、ファ
ーマシア・ファイン・ケミカルＡＢ製）使用のゲル炉過
法により測定〕｛３｝ 融点または分解点 融点不明確。

約２２０ｑｏで炭化する。■ 紫外線吸収スペクトル 第１図の通り（０．１ＮＮａＯＨ中で測定したが「水ま
たはＩＮＮａＯＨ中でも変化しなかった）で約２５０お
よび２８０の仏に肩を示す。

（５ー 赤外線吸収スペクトル第２図の通り（ＫＢｒ法
） ■ 各種溶剤中の溶解性 水に溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸
化アンモニウム等のアルカリ性水溶液にとくによく溶解
する。

メタノール、エタノール、フ。ロィぐノール「 ブタノ
ール、アセトン、クロロホルム、エーテルに難溶である
。‘７’呈色反応 ニンヒドリン反応、フェノール／硫酸反 応、フオリン試薬およびディツトマー反応に陽‘性。

ェルソン・モーガン反応に陰性。

【８｝ 性質 酸性 ■ 主な化学組成 …アミノ酸 オキシプロリン （１５．６１±０．４％）アス
パラギン酸 （５．５１±０．４％）スレオニ
ン （１０．９０±０．４％）セリン
（９．６４土０．４％）グルタミン酸
（３．９６土０．４％）プロリン
（４．２７±０．４％）グリシン （９
．０９±０．４％）アラニン （８．２
４土０．４％）バリン （４．０４±０
．４％）イソロイシン （５．５９土０．４
％）ロイシン （２．５６±０．４％）フ
エニールアラニン （１．３２±０．４％）リジン
（２．１８土０．４％）アルギニン
（１．２４±０．４％）チロシン
（１．９４±０．４％）ヒスチジン
（０．９３±０．４％）アンモニア （１２・
９８土０．４％）（磯塩酸で１１０ｑＣで４錨時間減圧
下に加水分解後、米国テクニコン社製、テクニコン・ア
ミノ酸オ−トアナライザーＮＣ−１型で分析した） ‘ｏ｝糖 アラビノース （９．３８±０，６％）ガラク
トース （２０．９８±０．６％）グルコース
（６４．９８±０．６％）マンノース
（３．２６±０．６％）キシロース
（１．４０±０．６％）（０．１Ｎ硫酸で８０℃で
２０分間およびＩＮ硫酸で１００ｏｏで２時間それぞれ
加水分解後、米国テクニコン社製、テクニコン糖オート
アナライザーＮ−１型で分析した）肌 比旋光度 〔Ｑ〕容＝十６３０〜十６９ｏ平均＋６６ｏ（濃度０．
４９％、０．１ＮＮａＯＨ中）｛Ｂ｝ 生物学的特性 ｍ ｍ誘起活性 本発明によるＩＦ誘起剤の試料を用いて試験動物の細胞
および血清中にＩＦを議起し、その活性を後記試験例記
載の方法で測定した結果は第１表および第２表の通りで
、ＩＦ譲超活性が認められた。

第１表 ２頭のウサギを用いて、後記試験例記載の方法で得た結
果は第２表の通りで、２頭ともに投与後２時間で最大の
活性に達した。

第２表 後記試験例記載の方法により、本発明によるＩＦ譲起剤
の作用で試験動物の体内にＩＦが誘起されたことが認め
られる。

２）ぽ誘起活性の安定性 本発明によるび誘起剤の試料（各１の夕）を水（各１の
【）に溶解し、１００℃で所定時間または所定温度で１
時間それぞれ加熱した後、各試料を試験例１記載のィン
・ビートロ法に準じて活性を測定した結果は第３表およ
び第４表の通りであって、本発明によるＩＦ譲起剤は熱
に安定であることが認められた。

第３表 （注）加熱時間：１時間 第４表 （注） 加熱温度１００℃ （３｝ 急性毒性 オスおよびメスのマウス（ｄｄｙ系、５週令、体重２０
土１夕、各群１０匹）を試験動物とした。

生理的食塩水に溶解した本発明によるＩＦ誘起剤を、マ
ウス腹腔内または経口投与した結果、ＬＤ５。値は＞１
．５夕／ｋｇ（腹腔）および＞１０タ′ｋ９（経口）で
あり、メスとオスとの間に著差はなかった。【４｝ 抗
腫湯活性 マウス（ｄｄｙ系、５週令、体重２０±１夕、各群１０
匹）を試験動物とし、Ｓ−１８０ザルコーマ固型腫湯（
２×２×２帆）またはヱーリッヒ腹水がん（２．５×１
ぴ個）をマウスの豚喬に移植し、２４時間後に本発明に
よるＩＦ誘起剤（０．２雌含有）水溶液を各マウスに毎
日１回経口投与し、１４日間続けた。

抗腫蕩性が認められた。上記の特性から、本発明による
物質は、アミ／酸、糖、リン酸を主体とする分子量約１
０万から約３００万（主として約５０万から約１００方
）の高分子を有し、リン酸を含有する糖と蛋白質の複合
体であると思われる。

またこの物質によって動物の体内または試験管内に誘起
されたＩＦは、トリプシン（０．０８％、３７０、２時
間）で失活するばかりでな〈、動物種特異性とウイルス
種非特異Ｉ性とを有しているので、本物質は一般に認め
られているｍ誘起剤の定義に該当する物質であることが
わかった。本発明による物質と同様な理化学的および生
物学的特性を有する物質は知られていないから、本物質
は新規物質であり、新親び誘起剤である。

すなわち公知のフイトヘマグルチニン、アメリカヤマゴ
ボウ・マイトージエンおよびコンカナバリンＡのような
植物凝集素は公知文献の記載によると、分子量１０方以
上の蛋白質で、５６００で１時間または６０００で５時
間加熱すると、ＩＦ誘起活性を失なうばかりでなく、こ
れらのＩＦ誘起活性は非常に弱い。これに対して、本発
明によるＩＦ誘起剤は、化学組成が異なる点、１０００
０で数時間加熱しても安定である点、およびＩＦ誘起活
性が高い点等において植物凝集素と区別される。次に当
帰の根から得られた公知のＩＦ誘起剤は１０万以上の高
分子物質で、１００ｑｏで１時間加熱しても失活しない
が、その化学組成（ヘキソース、４８％、ウロン酸４０
％、蛋白質５％）および赤外線吸収スペクトルが異なる
ことによって、本発明によるＩＦ誘起剤と区別される。
またクワの根皮から得られたＩＦ誘起剤は、分子量２万
以上（主に６万以上）で１−３結合グルコース（ヘキソ
ース９６％を含む）を主体としているから、本発明によ
るＩＦ譲起剤と区別される。

本発明によるＩＦ誘起剤の製造原料であるキク料ベニバ
ナ属植物に含有されるカルタミン、カルタモン、ネオカ
ルタミン等はＩＦ誘起活性を有しない低分子物質で、本
発明によるＩＦ誘起剤と理化学的特性が異なっている。
本発明によるＩＦ誘起剤は、公知の植物の組織から単離
されたＩＦ誘起剤よりも優れたＩＦ誘起活性を有し、動
物に経口投与した場合の急性毒性は非常に低く、抗腫傷
活性を有しているので、ヒトおよび動物における発がん
型ウイルスのようなウイルス感染症の予防および治療用
として期待される。

本発明により提供されるＩＦ誘起剤の製造方法は、キク
科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）ベニバナ属（Ｃａｎｈａｍ
雌）またはその変員に属しかつＩＦ誘起活性物質を含有
する植物の組織から、上記活性物質を抽出し、抽出物か
らこれを回収することを特徴としている。

本発明の方法に使用される植物は世界各国に豊富に栽培
または自生している植物で、自然または人工的に突然変
異体や雑壁のような変員（Ｖａｒｉａｎｔ）を形成する
傾向がある。

各国産の多くのベニバナ属植物およびそれらの変員を本
発明の目的に実用できることがわかった。下記の植物は
例示にすぎない。ベニバナ（Ｃａ比ｈａｍ船ｔｉｎｃｔ
ｏｒｉｕｓＬｉｎｎｅ）アレチベニバナ（Ｃａれｈａｍ
順ｌａｎａｔ順Ｌｉｎｎｅ）Ｃａｎｈａｍ順 ａｒｂｏ
ｒｅＳＣｅｎＳＣａｒｔｈａｍ低 ｂａｅｔｊＣ聡 Ｎ
ｙｍａｎベニバナは黄および紅色素の原料として、また
食用油の原料として長年の間各国で栽培され、日本およ
び中国では薬草として用いられている。

本発明の方法の原料として新鮮な植物を用いてもよいが
、保存上および抽出効率の点から乾燥し套警護串墨ら義
、蚤釜藁雲容至るき霞富豪湊袋隼音てもよい。抽出は一
般に水で任意温度（たとえば室温から抽出混合物の沸騰
まで）で行なうことができる。

本発明による物質はアルカリ性の水溶液（例、ｐＨ７−
１０）によく溶けるので、公知の緩衝液や水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム等を用いて
、抽出時に水のｐＨを調整するとよい。抽出時間は任意
であるが、室温では通常１一５日である。抽出温度が高
いと抽出時間は短縮される（たとえば４０−１００午０
で３０分から６時間）。本発明の方法によって、植物の
組織に含まれた活性成分の大部分（場合により９０％以
上）を抽出することができる。所望により、抽出時に適
当な防腐剤を加えることもできる。抽出は連続式でもバ
ッチ式でもよい。抽出水と原料との比は任意である。ま
たは、メタノール、エタノ−ル、ブロパノール、ブタノ
ール「ジメチルスルフオキシド、アセトンのような親水
性有機溶剤の適当な濃度（たとえば２０−８０％）で植
物組織から活性物質を抽出してもよい。この場合温度と
時間は任意でよい（たとえば４０−８０ｑｏで４時間な
いし２日間）。炉過、圧搾または遠心分離のような常法
により、抽出液から植物の残澄を除去し、こうして得ら
れた抽出液から低分子物質、色素等の不活性成分を除き
、活性成分を回収する。 このための実用的な方法の例
は次の通りである。凶 本発明によるＩＦ誘起剤の活性
成分は、分子量約１０万以上約３００万以下（主として
約５０万なし・し１００万）の物質を含む部分に存在す
るから、分画分子量１０万以上の物質を分別できる適当
な膜を用いた眼外炉過法で上燈液を処理する。

限外炉過の圧力はたとえば０．１一５ｋ９／地とするこ
とができる。こうして得られた活性部分を集めて、凍結
乾燥すると褐色の粉末が得られる。

‘Ｂ｝ 抽出液を所望により減圧下で濃縮し、親水性有
機溶剤（たとえばメタノール、エタノール、プロパノー
ル、ブタノール、アセトン等）を抽出液またはその濃縮
液に適当な濃度（たとえば４０−７帆八％）になるよう
に加えると、活性成分を含む沈殿物が生じるので、これ
を減圧下に乾燥すると、褐色の粉末が得られる。

に’上記の有機溶剤の代わりに、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、セチルトリメチルアンモニウムプロミ
ドのようなアンモニウム塩または塩化亜鉛、塩化鋼のよ
うな無機金属塩を適当な濃度（たとえば２０‐５肌／ｖ
％）になるように加えると、活性成分を含む沈殿物が生
じるので、沈殿物をたとえばセルロースチューブで透析
するか、分画分子量１万の膜で限外炉過するかにより脱
塩後、乾燥すると、褐色の粉末が得られる。

以上のようにして抽出液を処理することによって、原料
中の活性成分の大部分（場合により９０％以上）を回収
することができる。

しかし、得られた乾燥粗粉末中の不活性成分の含有量は
凶の方法が最低である。また風の方法は操作が簡単で費
用が安く短時間に行なうことができる。しかも凶の方法
で得られた粗粉末を動物に多量に経口投与しても著しい
副作用は認められないことがわかった。次に、この粗粉
末を、たとえばゲル炉過剤またはイオン交換剤を用いる
カラムクロマトグラフィーのような常法によって精製す
る。

ゲル炉過剤を用いた場合は適当な緩衝液で溶出してもよ
いが、通常は水で溶出すればよい。イオン交換剤を用い
た場合は適当な緩衝液で溶出する。実用的なゲル炉過剤
の例は、セフアデックスＧ−５０からＧ−２００まで、
セフアローズ２Ｂから８Ｂまで、セフアクリルＳ一２０
０またはＳ一３００（スエーデン国、ファーマシア・フ
ァイン・ケミカルＡＢ製）、バイオゲルＰ−３０力）ら
Ｐ−３００まで、バイオゲルＡ（米国、バイオラード・
ラボラトリース製〉、サガバック（英国、セラバック・
ラボラトリース製）等である。イオン交換剤の実用的な
例は、ＤＥＡＥセフアデツクスＡ−２５およびＡ−５０
（ＣＩ−型）、ＱＡＥセフアデックスＡ−２５およびＡ
−５０（ＣＩ−型）、ＣＭセフアデツクスＣ−２５およ
びＣ−５０（Ｎが型）、ＳＰセフアデツクスＣ−２５お
よびＣ−５０（Ｎａ＋型）、ＤＥＡＥセフアセル（ＣＩ
−型）、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−船（ＣＩ−型）、
ＣＭセファロースＣＬ一般（Ｎａ十型）（スェーデン国
、ファーマシア・ファイン・ケミカルＡＢ製）等である
。適当なアニオンまたはカチオンィオン交換セルロース
を用いて粗粉末を精製することもできる。

こうして得られたものは、多少の不純物を含んでいるが
、ＩＦ誘起剤として実用することができる。所望により
、上記の精製工程を組合わせることによって、不純物を
さらに除去することもできる。実施例 １ 乾燥したベニバナ（Ｃａｎｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒ
ｉｕｓＬｉｎｎｅ）の花（２ｋ９）を水洗した後、水（
４０そ）中に常温で３日間放置することにより抽出し、
これを遠心処理（６００仇．ｐ．ｍ．、２０分間）して
、抽出液と残澄に分け、磯笹を水（各１０夕）で２回洗
浄し、洗液を抽出液に合わせた。

こうして得られた抽出液をＵＤ‐６型限外炉過器（バイ
オエンジニアリングＫ．Ｋ．、東京）でＵＫ−２００限
外炉過膜（分画分子量２０方、東洋炉紙社製）を用いて
限外炉過した（圧力３ｋ９′の）。残留物を集めて凍結
乾燥し、褐色粉末（８９．４６夕）を得た。この粉末（
２夕）を水（５の【）に溶解し、その水溶液をセフアデ
ツクスＧ一２００（フアーマシア・フアイン・ケミカル
ＡＢ、スウーデン国）を充填したカラム（４．５×７０
肌）に添加し、水（６００の【）で溶出し、溶出液を各
３の‘の区分に分け、２５亀から５申蚤までの区分を合
わせて凍結乾燥し、白色状粉末（１５５．０４雌）を得
た。さらに精製するために、この粉末（１００の夕）を
０．０１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０、１＝０．
０１）（５の‘）に溶解し、ＤＥＡＥセフアデツクスＡ
−５０（フアーマシア・フアイン・ケミカルＡＢ、スェ
ーデン国）を充填したカラム（２．５×７０弧）に添加
し、０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ９．０、０．９
Ｍ食塩を含む、３００叫）で綾出し、熔出液を各３の上
の区分に分け、１句電から２７番までの区分を合わせた
。この溶液をＵＫ−１叩艮外炉過膜（分画分子量１万、
東洋炉紙社製）を用いた限外炉過により脱塩後、凍結乾
燥し、不定形な白色状粉末（７２．３の９）を得た。こ
のものの理化学的および生物学的特性は前記の通りであ
る。これを第１の白色状粉末と比べると、ＩＦ譲起活性
はおよそ同じであるが、不純物の量が減少した。高純度
であることが超遠心法および竜気泳動によって確認され
た。比較のために各工程で得られた物質のＩＦ誘起活性
を後記試験例１記載のィン・ビトロ法で測定した結果は
第５表の通りであった。

第５表 実施例 ２ 乾燥したァレチベニバナ（Ｃａ九ｈａｍｕｓｌａ似ｔａ
船Ｌｉｎｎｅ）の花（ｌｋ９）を水洗した後、これに水
２０夕を加え、室温に２時間放置後、１００００で２時
間加温抽出した。

その後、実施例１の方法に準じて精製した。この精製物
（７０．３の９）の理化学的および生物学的特性は、実
施例１によって得られたものの特性と大差はなかった。
試験例 １ ＩＦ誘起剤によるＩＦ譲起の方法およびＩＦ活性の測定
（参考文献：Ｙ．Ｋｏｊｉｍａ、Ｋｉｔａｓａｔｏ〜Ｃ
ｈ．、Ｅｘｐ．、Ｍｅｄ．、４３：３ｉｌ９７０）‘ａ
’ィン・ビトロ法による『の誘起方法ウサギ（体重約ｌ
ｋｇ、ニュージーランドホワイト種、ＳＰＦ）を全採血
して殺し、隅豚、骨髄およびリンパ節細胞を採取し、混
合細胞１０７／泌を含む細胞浮遊液をつくり、各浮遊液
区分（１泌）に、本発明の実施例１記載の方法で得られ
たＩＦ誘起剤１０、１、０．１、０．０１ムタ／の【を
それぞれ加え、２５℃で２独時間培養後、各培養液を遠
心処理してその上燈液をとり、『活性測定用に供した。

（ｂ｝ ィン・ビボ法による『の誘起方法実施例１記載
の方法で得られたＩＦ誘起剤の水溶液（５００ムタ／協
）２私をウサギ（体重約ｌｋ９、ニュージーランドホワ
イト種、ＳＰＦ）の耳静脈に注射し、１、２、４、６時
間後に採血（２地）し、その血清をＩＦ活性測定用に供
した。

‘ｃ｝ ＩＦ活性の測定 上記｛ａ｝（ｂー法ともに、産生された『活性の測定は
、ウサギ腎株化細胞（ＲＫ−１３）を用いた５０％ブラ
ック半減法で行なわれる。

まず予めシャーレに準備しておいた上記細砲の単層培養
上に、上記【机ｂ｝法で得られた適当に稀釈した『試料
溶液を加え、３７ｏ０で１夜培養後、水庖性口内炎ウイ
ルス（Ｖｅｓｉｃ山ａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒ瓜
）を攻撃用ウイルスとし、そのブラックの減少率を指標
としてＩＦ活性を測定した。なお、ＩＦ活性の単位はＩ
Ｆ無処置細胞におけるブラック数の５０％を示す稀釈の
逆数として表現される。試験例 ２ＩＦ誘起剤であるこ
との証明方法 上記‘秋ｂ｝の方法で産生されたＩＦ試料は、同動物種
のウサギＲＫ−１孫曲胞上で水庖性口内炎ウイルスの増
殖を抑制するほか、ワクシニアウィルス（Ｖａｃｃｉｎ
ｉａｖｉｍｓ）の増檀も抑制するが、動物菌の異なるマ
ウスのＬ細胞では水庖性口内炎ウイルスの増殖を抑制し
ない。

また０．０８％トリブシンを３７０で２時間作用させる
と、そのＩＦ活性は失活する。試験例 ３ 露気泳動 鏡気泳動は東洋科学産業■製（東京）の装置（ＡＥ一Ｚ
型）を用い、厚さ３肌のポリアクリルアマィドゲルのプ
レートと０．３Ｍホウ酸緩衝液（冊８．４）とを用いて
行なった。

その結果、単一のバンドを示し、電気漆動的に本発明の
物質が均一であることが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による物質の紫外線吸収スペクトル、第
２図は赤外線吸収スペクトルを示す。 第２図第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）ベニバナ属（Ｃａ
   ｒｔｈａｍｕｓ）に属しかつインターフエロン誘起活性
   物質を含有する植物またはその変員の組織から上記活性
   物質を抽出し、抽出物からこれを回収することを特徴と
   するインターフエロン誘起剤の製法。 ２ 抽出液に親水性有機溶剤を加えることにより活性物
   質を回収する特許請求の範囲第１項による方法。 ３ 抽出液にアンモニウム塩または無機金属塩を加える
   ことにより活性物質を回収する特許請求の範囲第１項に
   よる方法。 ４ 水性抽出液から限外濾過によって活性物質を回収す
   る特許請求の範囲第１項による方法。