JPS625407B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は植物の組織から単離されたインターフ
エロン（以下IFという）誘起活性物質に関す
る。本発明は、優れたIF誘起活性を有する物質
が、シソ科シソ属に属する各種植物またはその変
員の組織に含まれ、そしてこの活性物質を簡単に
安価に単離することができるという知見に基いて
いる。 従つて本発明の目的は、優れれたIF誘起活性
と低い毒性とをもちかつ簡単に安価に製造するこ
とのできるIF誘起活性物質を提供することにあ
る。 本発明により、無定形白色状粉末の状態におい
て安定でIF誘起活性および下記の理化学的特性
を有する物質が提供される。 (A) 理化学的特性 (1) 元素分析 Ｈ：8.5−8.7％，Ｃ：48.8−49％， Ｎ：6.3−6.5％，Ｐ：1.0−1.1％ (2) 分子量 約10万ないし約300万（主として約50万ない
し100万） 〔スピンコ・モデルＥ分析用超遠心機（米国
ベツクマン社製）使用の超遠心法、アミコン限
外過機およびXM50、XM100AおよびXM300
過膜（米国アミコン社製）UK10、UK50お
よびUK200過膜（東洋紙製）使用の限外
過法、およびセフアデツクスＧ−200（スエ
ーデン国、フアーマシア・フアイン・ケミカル
AB製）使用のゲル過法により測定〕 (3) 融点または分解点 融点不明確。約220℃で炭化する。 (4) 紫外線吸収スペクトル 第１図の通り（0.1N NaOH中で測定した
が、水または1N NaOH中でも変化しなかつ
た） (5) 赤外線吸収スペクトル 第２図の通り（KBr法） (6) 各種溶剤中の溶解性 水に溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化アンモニウム等のアルカリ性水溶
液にとくによく溶解する。メタノール、エタノ
ール、プロパノール、ブタノール、アセトン、
クロロホルム、エーテルに難溶である。 (7) 呈色反応 ニンヒドリン反応、フエノール／硫酸反応お
よびデイツトマー反応に陽性。フオリン試薬お
よびエルソン・モーガン反応に陰性。 (8) 性 質 酸 性 (9) 主な化学組成 (イ) アミノ酸 オキシプロリン （3.2±0.3％） アスパラギン酸 （9.3±0.3％） スレオニン （6.1±0.3％） セ リ ン （4.3±0.3％） グルタミン酸 （7.6±0.3％） プロリン （4.0±0.3％） グリシン （10.0±0.3％） アラニン （10.3±0.3％） バ リ ン （6.6±0.3％） イソロイシン （5.4±0.3％） ロイシン （8.6±0.3％） チロシン （微 量） フエニールアラニン （2.0±0.3％） リ ジ ン （3.9±0.3％） ヒスチジン （1.3±0.3％） アルギニン （3.4±0.3％） アンモニア （13.4±0.3％） （6N塩酸で110℃で48時間減圧下に加水分解
後、米国テクニコン社製、テクニコン・アミ
ノ酸オートアナライザーNC−１型で分析し
た） (ロ) 糖 アラビノース （47.09±0.3％） ガラクトース （25.66±0.3％） グルコース （20.62±0.3％） マンノース （4.64±0.3％） キシロース （1.99±0.3％） （0.1N硫酸で80℃で20分間および1N硫酸で
100℃で２時間それぞれ加水分解後、米国テ
クニコン社製、テクニコン糖オートアナライ
ザーＮ−１型で分析した） (10) 比旋光度 〔α〕^２５ _Ｄ＝−75゜〜−82゜平均−79゜ （濃度0.47％，0.1N NaOH中） (B) 生物学的特性 (1) IF誘起活性 本発明によるIF誘起活性物質の試料を用い
て試験動物の細胞および血清中にIFを誘起
し、その活性を後記試験例記載の方法で測定し
た結果は第１表および第２表の通りで、IF誘
起活性が認められた。

【表】 ２羽のウサギを用いて、後記試験例１(b)記載
の方法で得た結果は第２表の通りで、２羽とも
に投与後２時間で最大の活性に達した。

【表】 後記試験例記載の方法により、本発明による
IF誘起剤の作用で試験動物の体内にIFが誘起
されたことが認められる。 (2) IF誘起活性の安定性 本発明によるIF誘起活性物質の試料（各１
mg）を水（各１ml）に溶解し、100℃で所定時
間または所定温度で１時間それぞれ加熱した
後、各試料を試験例１記載のイン・ビトロ法に
準じて処理した結果は第３表および第４表の通
りであつて、本発明による誘起活性物質は熱に
安定であることが認められた。

【表】

【表】 (3) 急性毒性 オスおよびメスのマウス（ddy系、５週令、
体重20±１ｇ、各群10匹）を試験動物とした。
生理的食塩水に溶解した本発明によるIF誘起
物質を、マウス腹腔内または経口投与した結
果、LD50値は560mg／Kg（腹腔）および＞４
ｇ／Kg（経口）であり、メスとオスとの間に著
差はなかつた。 (4) 抗腫瘍活性 マウス（ddy系、５週令、体重20±１ｇ、各
群10匹）を試験動物とし、Ｓ−180ザルコーマ
固形腫瘍（２×２×２mm）またはエーリツヒ腹
水がん（2.5×10⁶個）をマウスの腋窩または腹
腔に移植し、24時間後に本発明によるIF誘起
物質（0.2mg含有）水溶液を各マウスに毎日１
回経口投与し、14日間続けた結果、抗腫瘍活性
が認められた。 上記の特性から、本発明による物質は、アミノ
酸、糖、リン酸を主体とする分子量約10万から約
300万（主として約50万から約100万）の高分子を
有し、リン酸を含有する糖と蛋白質の複合体であ
ると思われる。またこの物質によつて動物の体内
または試験管内に誘起されたIFは、トリプシン
（0.08％、37℃、２時間）で失活するばかりでな
く、動物種特異性とウイルス種非特異性とを有し
ているので、本物質は一般に認められているIF
誘起剤の定義に該当する物質であることが分つ
た。 本発明による活性物質と同様な理化学的および
生物学的特性を有する物質は知られていないか
ら、本物質は新規物質であり、新規IF誘起物質
である。すなわち公知のフイトヘマグルチニン、
アメリカヤマゴボウ・マイトジエンおよびコンカ
ナバリンＡのような植物凝集素は公知文献の記載
によると、分子量10万以上の蛋白質で、56℃で１
時間または60℃で５時間加熱すると、IF誘起活
性を失なうばかりでなく、これらのIF誘起活性
は非常に弱い。これに対して、本発明によるIF
誘起剤は、化学組成が異なる点、100℃で数時間
加熱しても安定である点、およびIF誘起活性が
高い点等において植物凝集素と区別される。次に
当帰の根から得られた公知のIF誘起剤は10万以
上の高分子物質で、100℃で１時間加熱しても失
活しないが、その化学組成（ヘキソース、48％、
ウロン酸40％、蛋白質５％）および赤外線吸収ス
ペクトルが異なることによつて、本発明による
IF誘起活性物質と区別される。 またクワの根皮から得られたIF誘起剤は、分
子量２万以上（主に６万以上）で１−３結合グル
コース（ヘキソース96％を含む）を主体としてい
るから、本発明によるIF誘起物質と区別され
る。 本発明による活性物質の製造原料であるシソ科
シソ属植物に含有されるペリルアルデヒド、α−
ピネン、ｌ−リモネン、ペリラケトン、ナギナタ
ケトン、シソニン、ｐ−クマリン酸エステル、ジ
ヒドロペリル・アルコール、ｌ−メントール等は
IF誘起活性を有しない低分子物質で、本発明に
よるIF誘起活性物質と理化学的特性が異なつて
いる。 次に米国特許3773924号および同3884845号また
は特許公開公報昭53−121919号記載の、公知の
IF誘起剤は植物の組織から単離されたものでな
く、それらの理化学的特性は本発明によるIF誘
起活性物質のものと異なつている。 本発明によるIF誘起活性物質は、公知の植物
の組織から単離されたIF誘起剤よりも優れたIF
誘起活性を有し、動物に経口投与した場合の急性
毒性は非常に低く、抗腫瘍活性を有しているの
で、ヒトおよび動物における発がん型ウイルスの
ようなウイルス感染症の予防および治療用として
期待される。 本発明により提供されるIF誘起活性物質の製
造方法は、シソ科（Labiatae）シソ属（Perilla）
またはその変員に属しかつIF誘起活性物質を含
有する植物の組織から、上記活性物質を抽出し、
抽出物からこれを回収することを特徴としてい
る。 本発明の方法に使用される植物は世界各国に豊
富に産する１年草で、自然または人工的に突然変
異体や雑種のような変員（Variant）を形成する
傾向がある。各国産の多くのシソ属植物およびそ
れらの変員を本発明の目的に実用できることがわ
かつた。下記の植物は例示にすぎない。 シソ（P.frutescens Britton var.crispa Dec.f.
purpurea Makino）、 アオジソ（P.frutescens Britton var.crispa
Dec.f.viridis Makino）、 カタメンジソ（P.frutescens Britton var.crispa
Dec.f.discolor Makino）、 チリメンジソ（P.frutescens Britton var.crispa
Dec.f.crispa Makino）、 チリメンアオジソ（P.frutescens Britton var.
crispa Dec.f.viridis−crispa Makino）、 トラノオジソ（P.frutescens Britton var.
hirtella Makino et Nemoto）、 エゴマ（P.frutescens Britton）、 レモンエゴマ（P.citriodora Nakai） （学名は村越三千男、牧野富太郎、原色植物大
図鑑、北隆館、1955、刈米達夫、木村康一、薬
用植物大事典、広川書店、1974および刈米達夫、
木村雄四郎、最新和漢薬用植物、広川書店、1978
による）。 ここに例示した植物は毒性が低く、たとえばシ
ソ、アオジソ、チリメソジソ、レモンエゴマは日
本、中国その他の国で栽培されているが、その訳
は、これらの葉および種子がたとえば食品、漢方
薬、香料の原料等として長年の間用いられてきた
からである。シソ科シソ属に属しかつ本発明によ
るIF誘起活性物質を含む植物のすべての組織を
本発明の方法に用いることができるので、豊富な
原料の安価な供給に何の問題もない。 種子は活性が弱く、また根は土を除去するのに
手数がかかるので、葉と茎とを用いるのが実際的
である。葉と茎とに含まれた活性成分の量はほと
んど同じである。組織の各部分に含まれる活性成
分の量は、植物の開花前と開花後と著しい変化が
ない。 新鮮な原料を用いてもよいが、保存上および抽
出効率の点から乾燥した原料を用いるのが有利で
ある。乾燥方法は任意で自然乾燥や熱風乾燥でも
よい。使用前に水洗してもよい。 抽出は一般に水で任意温度（たとえば室温から
抽出混合物の沸とうまで）で行なうことができ
る。本発明による物質はアルカリ性の水溶液
（例、PH７−10）によく溶けるので、公知の緩衝
液や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化
アンモニウム等を用いて、抽出時に水のPHを調製
するとよい。抽出時間は任意であるが、室温では
通常１−５日である。抽出温度が高いと抽出時間
は短縮される（たとえば45−80℃で、撹拌下30分
から６時間）。本発明の方法によつて、植物の組
織に含まれた活性成分の大部分（場合により90％
以上）を抽出することができる。しかし抽出温度
が高くなると共に色素のような不必要な成分の抽
出量も増加するので、温度をあまり高くすること
は避けねばならない。所望により、抽出時に適当
な防腐剤を加えることもできる。抽出は連続式で
もバツチ式でもよい。抽出水と原料との比は任意
である。 過、圧搾または遠心分離のような常法によ
り、抽出液から植物の残渣を除去し、こうして得
られた抽出液から低分子物質、色素等の不活性成
分を除き、活性成分を回収する。このための実用
的な方法の例は次の通りである。 (A) 本発明によるIF誘起活性成分は、分子量約
10万以上約300万以下（主として約50万ないし
100万）の物質を含む部分に存在するから、分
画分子量10万以上の物質を分別できる適当な膜
を用いた限外過法で上澄液を処理する。限外
過の圧力はたとえば0.1−５Kg／cm²とするこ
とができる。 こうして得られた活性部分を集めて、凍結乾
燥すると褐色の粉末が得られる。 (B) 抽出液を所望により減圧下で濃縮し、親水性
有機溶剤（たとえばメタノール、エタノール、
プロパノール、ブタノール、アセトン等）を抽
出液またはその濃縮液に適当な濃度（たとえば
40−70w／ｖ％）になるように加えると、活性
成分を含む沈殿物が生じるので、これを減圧下
に乾燥すると、褐色の粉末が得られる。 (C) 上記の有機溶剤の代わりに、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、セチルトリメチルアン
モニウムブロミドのようなアンモニウム塩また
は塩化亜鉛、塩化銅のような無機金属塩を適当
な濃度（たとえば20−50w／ｖ％）になるよう
に加えると、活性成分を含む沈殿物が生じるの
で、沈殿物を脱塩後乾燥すると、褐色の粉末が
得られる。 以上のようにして抽出液を処理することによつ
て、原料中の活性成分の大部分（場合により90％
以上）を回収することができる。しかし、得られ
た乾燥粗粉末中の不活性成分の含有量は(A)の方法
が最低である。また(A)の方法は操作が簡単で費用
が安く短時間に行なうことができる。しかも(A)の
方法で得られた粗粉末を動物に多量に経口投与し
ても著しい副作用は認められないことがわかつ
た。 次に、この粗粉末を、たとえばゲル過剤また
はイオン交換剤を用いるカラムクロマトグラフイ
ーのような常法によつて精製する。ゲル過剤を
用いた場合は適当な緩衝液で溶出してもよいが、
通常は水で溶出すればよい。イオン交換剤を用い
た場合は適当な緩衝液で溶出する。 実用的なゲル過剤の例は、セフアデツクス
G50からＧ−200まで、セフアローズ2Bから6Bま
で、セフアクリルＳ−200またはＳ−300（スエー
デン国、フアーマシア・フアイン・ケミカルAB
製）、バイオゲルＰ−30からＰ−300まで、バイオ
ゲルＡ（米国、バイオラード・ラボラトリース
製）、サガバツク（英国、セラバツク・ラボラト
リース製）等である。イオン交換剤の実用的な例
は、DEAEセフアデツクスＡ−25およびＡ−50
（Cl^-型）、QAEセフアデツクスＡ−25およびＡ−
50（Cl^-型）、CMセフアデツクスＣ−25およびＣ
−50（Na⁺型）、SPセフアデツクスＣ−25および
Ｃ−50（Na⁺型）、DEAEセフアセル（Cl^-型）、
DEAEセフアロースCL−6B（Cl^-型）、CMセフ
アロースCL−6B（Na⁺型）（スエーデン国、フア
ーマシア・フアイン・ケミカルAB製）等であ
る。 適当なアニオンまたはカチオンイオン交換セル
ロースを用いて粗粉末を精製することもできる。 こうして得られた物は、わずかな不純物を含ん
でいるが、IF誘起剤として実用することができ
る。所望により、上記の精製工程を組合わせるこ
とによつて、不純物をさらに除去することもでき
る。 実施例 １ 乾燥したシソの葉（１Kg）を水洗した後、水
（20）中に常温で３日間放置することにより抽
出し、これを遠心処理（6000r.p.m.、20分間）し
て、抽出液と残渣に分け、残渣を水（各５）で
２回洗浄し、洗液を抽出液に合わせた。こうして
得られた抽出液をUD−６型限外過器（バイオ
エンジニアリングK.K.、東京）でUK200限外
過膜（分画分子量20万、東洋紙製）を用いて限
外過した（圧力３Kg／cm²）。残留物を集めて凍
結乾燥し、褐色粉末（8.813ｇ）を得た。この粉
末（1.5ｇ）を水（５ml）に溶解し、その水溶液
をセフアデツクスＧ−200（フアーマシア・フア
イン・ケミカルAB、スエーデン国）を充填した
カラム（4.5×70cm）に添加し、水（600ml）で溶
出し、溶出液を各３mlの区分に分け、27番から50
番までの区分を合わせて凍結乾燥し、白色状粉末
（117mg）を得た。さらに精製するために、この粉
末（100mg）を0.01Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.0、Ｉ＝0.01）（５ml）に溶解し、DEAEセフア
デツクスＡ−50（フアーマシア・フアイン・ケミ
カルAB、スエーデン国）を充填したカラム（2.5
×70cm）に添加し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（PH9.0、0.5M食塩を含む、300ml）で溶出し、溶
出液を各３mlの区分に分け、15番から25番までの
区分を合わせた。この溶液を脱塩後、凍結乾燥
し、不定形な白色状粉末（58.9mg）を得た。この
ものの理化学的および生物学的特性は前記の通り
である。これを第１の白色状粉末と比べると、
IF誘起活性はおよそ同じであるが、不純物の量
が減少した。高純度であることが超遠心法および
電気泳動によつて確認された。 比較のために各工程で得られた物質のIF誘起
活性を後記試験例１記載のイン・ビトロ法で測定
した結果は次表の通りであつた。

【表】 実施例 ２ 乾燥したエゴマの葉（１Kg）を水洗した後、こ
れに水20を加え室温に２時間放置後、1N水酸
化ナトリウムを加えてPHを8.5に調整した。次に
これを65℃で２時間加温抽出した。その後、実施
例１の方法に準じて精製した。 この精製物（54.5mg）の理化学的および生物学
的特性は、実施例１によつて得られたものの特性
と大差はなかつた。 実施例 ３−８ シソ、エゴマ、アオジソ、カタメンジソ、チリ
メンジソ、チリメンアオジソ、トラノオジソ、レ
モンエゴマの種子、葉および茎部を別々に乾燥し
た後、実施例１記載の方法に準じて処理し、得ら
れた産物および実施例１、２の産物のIF誘起活
性を試験例１(a)記載の方法（イン・ビトロ法）に
よつて測定した結果を第６表に示す。

【表】

【表】 得られた各産物の理化学的および生物学的特性
は実施例１の方法で得られた産物のものと実質的
に同一であつた。 試験例 １ IF誘起剤によるIF誘起の方法およびIF活性の
測定（参考文献：Y.Kojima，Kitasato Arch.，
Exp.，Med.，43：35，1970） (a) イン・ビトロ法によるIFの誘起方法 ウサギ（体重約１Kg、ニユージーランドホワイ
ト種、SPF）を全採血して殺し、脾臓、骨髄およ
びリンパ節細胞を採取し、混合細胞10⁷／mlを含
む細胞浮遊液をつくり、各浮遊液区分（１ml）
に、本発明の実施例１記載の方法で得られたIF
誘起剤10、１、0.1、0.01μｇ／mlをそれぞれ加
え、25℃で24時間培養後、各培養液を遠心処理し
てその上澄液をとり、IF活性測定用に供した。 (b) イン・ビボ法によるIFの誘起方法 実施例１記載の方法で得られたIF誘起剤の水
溶液（500μｇ／ml）２mlをウサギ（体重約１
Kg、ニユージーランドホワイト種、SPF）の耳静
脈に注射し、１、２、４、６時間後に採血（２
ml）し、その血清をIF活性測定用に供した。 (c) IF活性の測定 上記(a)(b)法ともに、産生されたIF活性の測定
は、ウサギ腎株化細胞（RK−13）を用いた50％
プラツク半減法で行なわれる。まず予めシヤーレ
に準備しておいた上記細胞の単層培養上に、上記
(a)(b)法で得られた適当に稀釈したIF試料溶液を
加え37℃で１夜培養後、水疱性口内炎ウイルス
（Vesicular stomatitis virus）を攻撃用ウイルス
として細胞に加え、37℃で１夜培養後、そのプラ
ツクの減少率を指標としてIF活性を測定した。
なお、IF活性の単位はIF無処置細胞におけるプ
ラツク数の50％を示す稀釈の逆数として表現され
る。 試験例 ２ IF誘起剤であることの証明方法 上記(a)、(b)の方法で産生されたIF試料は、同
動物種のウサギRK−13細胞上で水疱性口内炎ウ
イルスの増殖を抑制する他、ワクシニア ウイル
ス（Vaccinia Virus）の増殖も抑制するが、動物
種の異なるマウスのＬ細胞では水疱性口内炎ウイ
ルスの増殖を抑制しない。また0.08％トリプシン
を37℃で２時間作用させるとそのIF活性は失活
する。 試験例 ３ 電気泳動 電気泳動は東洋科学産業(株)製（東京）の装置
（AE−Ｚ型）を用い、厚さ３mmのポリアクリルア
マイドゲルのプレートと0.3Mホウ酸緩衝液（PH
8.4）とを用いて行なつた。その結果、単一のバ
ンドを示し、電気泳動的に本発明の物質が均一で
あることが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による物質の紫外線吸収スペ
クトル、第２図は赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 無定形白色状粉末の状態において安定であつ
   て、インターフエロン誘起活性および下記の理化
   学的性状を有する物質。 (イ) 元素分析 Ｈ：8.5−8.7％，Ｃ：48.8−49％， Ｎ：6.3−6.5％，Ｐ：1.0−1.1％ (ロ) 分子量 約10万から約300万まで（主として約50万か
   ら約100万まで） (ハ) 融点または分解点 融点不明確。約220℃で炭化する。 (ニ) 紫外線吸収スペクトル 第１図の通り（0.1N NaOH中で測定） (ホ) 赤外線吸収スペクトル 第２図の通り（KBr法） (ヘ) 溶剤に対する溶解性 水に溶解し、とくに水酸化カリウム、水酸化
   ナトリウム、水酸化アンモニウム等のアルカリ
   性水溶液によく溶解する。 メタノール、エタノール、プロパノール、ブ
   タノール、アセトン、クロロホルム、エーテル
   に難溶である。 (ト) 呈色反応 ニンヒドリン反応、フエノール／硫酸反応お
   よびデイツトマー反応に陽性。 フオリン試薬およびエルソン・モーガン反応
   に陰性。 (チ) 性 質 酸 性 (リ) 主な化学組成 (a) アミノ酸 オキシプロリン （3.2±0.3％） アスパラギン酸 （9.3±0.3％） スレオニン （6.1±0.3％） セ リ ン （4.3±0.3％） グルタミン酸 （7.6±0.3％） プロリン （4.0±0.3％） グリシン （10.0±0.3％） アラニン （10.3±0.3％） バ リ ン （6.6±0.3％） イソロイシン （5.4±0.3％） ロイシン （8.6±0.3％） チロシン （微 量） フエニールアラニン （2.0±0.3％） リ ジ ン （3.9±0.3％） ヒスチジン （1.3±0.3％） アルギニン （3.4±0.3％） アンモニア （13.4±0.3％） （テクニコン・アミノ酸オートアナライザー
   NC−１型で測定） (b) 糖 アラビノース （47.09±0.3％） ガラクトース （25.66±0.3％） グルコース （20.62±0.3％） マンノース （4.64±0.3％） キシロース （1.99±0.3％） （テクニコン糖オートアナライザーＮ−１型
   で測定） (ヌ) 比旋光度 〔α〕^２５ _Ｄ＝−75゜〜−82゜平均−79゜ （濃度0.47％，0.1N NaOH中）