JPS6044918B2 - 微生物による多糖類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、有胞子乳酸菌によつて製造される多糖類及び
それを製造する方法に関し、詳しくは中温性有胞子乳酸
菌によつて製造される新規な水溶性フルクタン及びそれ
を製造する方法に関する。

ブドウ糖等を代謝して消費糖の５０％以上を乳酸に変え
る、いわゆる乳酸菌は内生胞子を形成しないとされて来
た。代謝形式では乳酸菌と変らない’が分類学上からは
内生胞子形成菌であるバチラセー （Ｂａｃｉｌｌａｃ
ｅａｅ）に属する細菌は有胞子乳酸菌と呼ばれている。
有胞子乳酸菌には５０゜Ｃに生育の適温を有し、右旋性
の乳酸をつくる好熱菌の一群と、左旋性ない門しラセミ
乳酸をつくり生育の適温が４５℃以下の中温性有胞子乳
酸菌として分類されている。

有胞子酸菌の中にもバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生産するレバン、又は乳酸
菌のうちにもロイコノストツク メセンテロイフデス（
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）
、ロイコノストツク デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓｔｏｃｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）等が多糖類を生産
することは知られているが、有胞子乳酸菌か多糖類を生
産する報告は未だ知られていない。

夕 本発明者らは、本発明者らが分離同定した中温性有
胞子乳酸菌１托株中のバチルス レボラクチクス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｌａｅｖＯｌａｃｔｉｃｕｓ）に属する４
株が後に述べる条件下で不溶性のグルカンを生成し、そ
れと共に溶液中に水溶性のフルクタンを生成すること、
及びこれらの４株と共に他のバチルスレボラクチス、バ
チルス ラセミラクチクス（Ｂ．ｒａｃｅｍｉｌａｃｔ
ｉｃｕｓ）及びスプロラクトバチルス（ＳｐＯｒＯＩａ
ｃｔＯｂａｃｉｌｌＬｌｓ）属の菌株等の１１株が水溶
性のフルクタンを生成すること、これらのグルカン及び
フルクタンが上記の従来からの有胞子細菌又は乳酸菌か
ら生産した多糖類と異なる多糖類であり、かつ水溶性の
フルタン及び不溶性のグルカンから水解した水溶性多糖
類はデキストラン類似の物性を示し、代用血漿としての
使用可能性を示すと共に若干の制癌性を示し薬剤原料た
り得ることを発見し本発明を完成した。

すなわち、第一に中温性乳酸菌のうちカタラーゼを有し
左旋性の乳酸を生産するバチルス レボラクチクス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｌａｅｖＯｌａｃｔｉｃＬｌｓ）に属す
るＭ−４，−６６，−６８及び−７１株の４株は炭素源
と，して蔗糖を含む培地で２００Ｃ〜４０℃好ましくは
３００Ｃ前後て培養すると水溶性多糖類を生成するが、
接種に胞子から発芽増殖したばかりの菌体を用いると、
不溶性の多糖類をつくり、又増殖後既に不溶性の多糖類
そのものを生成した培地を種母として二接種して蔗糖培
地に継代培養したときも同様に不溶性の多糖類をつくる
と共に液中に水溶性ゾル状の多糖類を生成していること
を見出した。

さらにこの不溶性グルカンに０．１Ｎ硫酸を加えて２紛
間沸騰湯煎上で加水分解すると、セフアデ３ツクスＧ−
２００（架橋デキストランゲル）で！ろ過したとき、Ｋ
ｄが０になる程度の高分子量のままで水溶性となる。

この不溶性多糖類を１Ｎの硫酸で５時間沸騰湯煎上で加
水分解してペーパークロマトグラフイ一３により又、Ｔ
ＭＳ化してガスクロマトグラフイ一によりぶどう糖のみ
のピークを得、実質的にぶどう糖のみにより構成された
グルカンであることが確認された。

同時に生成した水溶性のゾル状の多糖類は、それにエタ
ノールとエチルエーテルの等４量混合物を加えて沈殿さ
せて０．１Ｎの硫酸で１０分間沸騰湯煎上で加水分解し
てペーパークロマトグラフイ一により、又ＴＭＳ化して
ガスクロマトグラフイ一により果糖のみのピークを得、
実質的に果糖のみにより構成されたフルクタンであるこ
とが確認された。註 ペーパークロマトグラフイ一に使
用した泊紙、東洋炉紙ＮＯ．５Ｏ、使用溶剤は次のとお
り、検出はフタール酸アニリン（ａ）ｎ−プロパノール
：酢酸エチル：水＝１４：２：７（ｂ）ｎ−ブタノール
：酢酸：水＝６０：１５：２５（ｃ）ｎ−ブタノールリ
エタノール：水＝４： １：５（上層使用）（ｄ）フエ
ノール：１％アンモニア水＝４：１なお、第１図にガス
クロマトグラフイ一の結果を水溶性多糖類水水解物のク
ロマトグラムで示す。

図中、１はｎ−エイコサン、４はＴＭＳ−フラグドーズ
のそれぞれピークを示し、該当糖以外の糖を含んでいな
いことを示している。

なお、水溶性多糖類が不溶性多糖類の低次の重合物でな
く、別個の重合物であるることは意外であつた。

さらに、この４４菌株Ｍ−４，−６６，−６８及び−７
１株は種母をグルコースで培養して主培地の炭素源を蔗
糖とすれば、全く不溶性の多糖類を生成せす、水溶性の
多糖類のみを生成し、その場合の水溶性の多糖類は、上
記の不溶性の多糖類とともに併産されるフルクタンと全
く同一の多糖類であつた。

さらに発明者らが分離同定した中温性有胞子乳酸菌１托
株中、次の菌株が蔗糖培地中にゾル状の水溶性多糖類を
単独に生産することが確認された。

註 上記のうち バチルス レボラクチクス Ｍ−４はＡＴＣＣバチルス
レボラクチクス Ｍ−１はＡＴＣＣバチルス レボラ
クチクス Ｍ−７は微研菌寄第５４４＊印の４株は上記
のように培養の条件によつて不溶性の多糖類を生産し、
条件によつては水溶性の多糖類のみを生産する菌株てあ
る。

上記の表に記載されたｂ株は、蔗糖を含む培地に接種し
て、２０゜Ｃ〜４０゜Ｃ好ましくは３０゜Ｃで培養する
と、水溶性多糖類のみをつくる。

この水溶性多糖類を０．１Ｎの硫酸で１０分間沸騰湯煎
上で加水分解してペーパークロマトグラフイ一により、
又、ＴＭＳ化してガスクロマトグラフイ一により、第１
図に示された果糖のみのピークと同一のピークを得て、
上記のバチルス レボラクチクスがグルカンとともに生
産する実質的にフルクタンのみにより構成されたフルク
タンと同一物であることが確認された。

次に、この場合の水解物のペーパークロマトグラフイ一
の結果を示す。

一呆発ｉ）イ▲多糖類の製造に用いる中温性有胞子乳酸
菌は、次のような性質のものである。

共通性質顕微鏡的所見：０．３〜１．０Ｘ１．７〜５．
０ミクロンの桿菌。

単独又は短連鎖をなし、周毛により運動する。胞子は０
．９〜１．５×１．２〜２．１ミクロンの楕円形で、細
胞の一端もしくは一端近くに着生する。グラム染色：陽
性寒天上集落：発酵性炭素源を含まない寒天培地には全
く又は殆んど生育しない、発酵性炭素源を含む寒天培地
上の集落は白色ないし無色半透明のの凸円状で、広がる
ことはない。

肉汁培養：発酵性炭素源を含まない培地には、全く又は
殆んど生育しない。

発酵性炭素源を含む場合は混個又は沈殿を生じ、菌膜を
形成することはなく、酸を生成する。リトマス・ミルク
：不変又はおそくなつて辛うａじて酸を生成し、ペプト
ン化することはない。

ゼラチン：変化しない。硝酸塩の還元、インドール生成
、硫化水素の生成はいずれも陰性。

生育温度：２０〜４０゜Ｃ 炭素源の利用性：Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、マルトースから酸
を生成し、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロースからは酸
を生成せず、ラクトースからは酸を生成しないか、或は
緩慢に生成する。

蔗′糖、イヌリ八殿粉等からの酸生成は株によつて異な
る。その他の性質：ブ下ウ糖を嫌気的に代射して、消費
糖の７０％以上を乳酸に変え、嫌気的にガスを発生する
ことはない。

ＤＮＡ（７）ＧＯ含量は、４５〜４６％。各菌株の個別
的性質は次のとおりである。

バチルス レボラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｅｖ
Ｏｌａｃｔｊｃｕｓ） ：カタラーゼを持ち、左旋性乳
酸を作る。

水溶性多糖類のみを作る株としては Ｍ−１，Ｍ−７，
Ｍ−１０４，Ｍ−１０＼非水溶性多糖類を作る株として
は、Ｍ−６６，Ｍ−４，Ｍ−６８，Ｍ−７１がある。こ
の中、バチルス レボラクチクス Ｍ−４はＡＴＣＣ２
３５４９、バチルス レボラクチクス Ｍ−１はＡＴＣ
Ｃ２３４９敦及びバチルス レボラクチクス Ｍ−７は
微工研菌寄第５４４として、それぞれ寄託されている。

バチルス ラセミラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｒａｃ
ｅｍｉｌａｃｔｉｃｕｓ）：カタラーゼを持ち、ラセミ
乳酸をつくる。

水溶性多糖類をつくるものにＭ−１４（微工研菌寄第５
４６号）がある。スポロラクトバチルス レブス （ＳｐＯｒＯＩａｃｔＯｂａｃｉＩｌｕｓｌａｅｖｕｓ
） ：カタラーゼを持たす、左旋性乳酸をつくる。

水溶性多糖類をつくるものに、Ｍ−８７，Ｍ−８８，Ｍ
−１１８がある。スポロラクトバチルス ラセミクス（
ＳｐＯｒＯｌａｃｔＯｂａｃｉｌｌＬｌｓｒａＣｅＰｉ
ＣＬｌＳ） ：カタラーゼを持たず、ラセミ乳酸をつく
る。

水溶性多糖類をつくるものに、Ｍ−８６，Ｍ−１０３が
ある。本発明のこれらの多糖類と有胞子細菌ないしは乳
酸菌がつくる既知の代表的な多糖類との概括的な性質を
比較すると、次のとおりに性質を異にし、本発明の多糖
類がこれらのものと異質の多糖類であることは明白であ
る。次に本発明の多糖類の製造方法を述べる。

これらの中温性有胞子乳酸菌を用いて本発明の多糖類を
製造するための炭素源としては、蔗糖のみが有効でその
の他の糖類、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−
フラグドーズ、Ｄヱグルコース＋Ｄ−フラグドーズ、麦
芽糖、乳糖、トレハロース、ラフイノース、メリシトー
ス、イヌリン、デキストリン、可溶性殿粉、ラムノース
、α−メチルグリコシド、マンニトール、ソルビトール
、グルコン酸ナトリウム等の通常のオリゴ糖、多糖類、
単糖類、糖誘導体、多価アルコール類等の全ての糖が本
発明の多糖類の生成原料たり得ず、転化糖も不可であり
、キシロースを添加したものは非常に不良であつた。

蔗糖の添加速度％は１％〜１０％（重／容、以下・特に
断り無き限り％は重／容％をいう）の範囲が適当で特に
不溶性のグルカン生成には２〜８％、フルクタン生成に
は２〜４％の濃度が好ましく、１０％以上はむしろ不適
であつた。

その他微生物の培養に用いられる栄養素はすべて用いら
れるが、窒素源としては酵母工キズ、ペプトン等の有機
態の窒素が好ましい結果を与え、補助的に無機窒素源を
用いることがある。

特に酵母工キズ、無機塩類としても通常の微生物の培養
に用いれるりん酸マグネシウム等が必要で通常は市販の
ソルトミクスチユアを用いれば十分である。培養温度は
２０〜４０℃好ましは３０℃前後がよくＰＨは４〜８の
範囲でよく、ＰＨ４以下は多糖類は生成せず炭酸カルシ
ウムで中和するとグルカンの生成には好ましくなく、フ
ルクタンの生成には好結果をもたらした。

しかし余リアルカリ側になると乳酸の生成に傾き、多糖
類の生成には好ましくない。通気は、当初の菌体の生成
には好ましい結果をもたらすが、本発明の多糖類の生成
には僅か行うか又は静置発酵で可能である。バチルス
レボラクチスの場合、Ｍ−４，−６６，−６８又は−７
１を用い、種母をぶどう糖培地に値え継いだものを種母
に用いるとグルカンを生成しなくなるので、グルカンの
生成のためには胞子から発芽した新しい種母を使うか、
又は種母寒天培地上でゲル状グルカンを生成させて、そ
れを種母培地として液体培地に接種、蔗糖培地に継代培
養すると不溶性グルカンが得られる。

これに対しｂて、本発明の上記の乳酸菌によるフルクタ
ンの生成の楊合は、上記のような生産株を蔗糖培地で培
養すれば無条件でフラグタンを形成する。しかし不溶性
多糖類を生産する上記の菌株から可溶性の多糖類のみを
生産するには、ぶどう糖培地で継代１培養した種母を用
いればむい。いずれも接種培養後３〜１０日位で培地中
に生成し、不溶性のグルカン生成の場合は培地一杯にゲ
ル固状の塊状物を生成し、液から分離し洗浄することに
よつて得られ、後にゾル状の重合物による粘ちような液
が残１る。固状の塊状物は流水で洗浄して硫酸で軽く水
解すると（イ）．１Ｎ，１０分〜２紛間沸騰水上）粘性
のないサラサラとした液になるので、遠沈して菌体を除
いて透析し、凍結乾燥する。このものは純白な綿状の物
質であり、吸湿性は無いが極めて水２に溶け、水に溶け
るとサラサラした透明な液となるので精製も容易である
。精製には溶媒、添加による沈殿、水による溶解を反覆
する。沈殿のための溶媒はエタノールとエチルエーテル
またはメタノールとエチルエーテルとの等量混合物が用
いらこれる。不溶性の多糖類の収量は水解物として回収
して対糖約２５％で糖濃度８％の場合は２０ｇＩ０であ
る。後に残つた粘ちような液は固状のグルカンの低重合
物ではなく、フルクタンであることは先に述べたとおり
である。フルクタンのみを生産する上記のバチルス レ
ボラクチスの４株、バチルス ラセミラクチクスの１株
、スポロラクトバチルス レブスの４株、スポロラクト
バチルス ラセミクスの２株、１１株の場合及び不溶性
多糖類生産のバチルス レボラクチスをぶどう糖培地で
継代培養した種母を蔗糖培地で培養した場合に生成する
水溶性の多糖類の生成も３〜１０日位で蓄積され、以後
増加しないことが確認され、水に溶けたまま遠心分離し
て菌体を除いた後、透析と溶媒添加による沈殿、水に溶
解を反覆して精製することがてきる。

沈殿させるために用いる溶媒としてはアセトンが適して
居り、透析とアセトン沈殿を繰り返して精製し、凍結乾
燥する。この水溶性多糖類の収量は少く、対塘数％であ
る。上記のようにして得られたフルクタンの精製品の物
理的性質は次のとおりである。

精製法 培養液→遠心分離→上澄液をアセトン沈殿→溶解→アセ
トン沈殿→溶解→透析→凍結乾燥→カラムクロマトグラ
フイ一→（ＤＥＡＥ−セルロース（ＰＨ８．Ｏ）及びセ
フアローズ ２Ｂ）→凍結乾燥１．元素分析（パーキン
ーエレマ一社製２旬型元素 分析装置）２．分子
量 セフアローズＣＬ−？でもＫａｖ＝ｏに流出 し、分
子量は２０×１Ｃｆ′以上である。

そのパターンを第２図に示す。３．融点 （本微量融点測定装置罐−５２） １８３〜１８６℃ ４．比旋光度 （ＰＯ−Ｂ型日立旋光計）〔α〕飢＝−４８の０．１
％水溶液５．紫外線吸収スペクトル （島津ダブルビーム分光光度計砥−２００Ｓ）０．１
％水溶液末端吸収のみ ６．赤外線吸収スペクトル （ＥＰＩ−Ｓ？ 日立赤外線分光光度計）ＫＢｒタブ
レツト、そのスペクトル図はフラノ −ス型吸収を示す
。

（第３図）７．溶解性 水 〉１００ｍ９１ｍ１
メタノール 不 溶 エタノール
不 溶 プロパノール
不溶 クロロホルム 不
溶 アセトン 不 溶８．
呈色反応 沃度殿粉反応 一
フエーリング反応 一 アニ
リン−フタレート反応 一 アルカリ性硝
酸銀反応 一 オルシノール法（ペン
トース） − フロログルシノール一塩酸法（
ペント一 ス）
一 Ｄｉｓｈｅ′ ＳＣａｒｂａｚＯｌｅ法（酸性糖）
− Ｄｉｓｈｅ２ｓ（デオキシ糖）
− エルソンモルガン法 一 アンス
ローン法 十 フエノール硫酸法
十９．塩基性、酸性、中性の別
（ＴＯＡＵＭ−５ＡＰＨメーター） １％水溶液 ２０℃ ＰＨ６．７９〜４．１３中性 １０．物質の色：白色粉末、臭い、味無し１１．粘度
オスワルド粘度計（２０±０．１ Ｃ） １％
１５．０６ミリポイズ参考デキストラン
１％液分子量１０万〜２０万１３．６１２０万〜３０万
１４．５９ ５０万 １６．１９ ２０万 １８．８１ 水 １０．０９固有
粘度 ０．２９（２５±０．０７Ｃ）即ち
、本発明の水溶性多糖類は、フラクトフラノースの重合
体である事が現段階においてはつきりしている。

本発明の水溶性多糖類について抗腫瘍性を試験した結果
を次に示す（両者の毒性は１２ｍ９／マウス（５００ｍ
９１ｋ９）において殆んど認められなかつた）試験用マ
ウスはＩＣＲマウス♀５週令、チヤールスリバ社から入
手、４日間前飼育２４±１ｇで使用。

上記のＩＣＲマウスに１週毎に継代されている癌ノセン
タ一譲受ストレインマウスからＳａｒｃＯｍａ一１８０
腹水を採取し、８Ｘ１σ／ｍｌの細胞浮遊液として、Ｉ
ＣＲマウスの右そけい部皮下に２×１σ／０．２５ｍ１
／マウス移殖した。

治療は腫瘍移植後１日後から各使用量を生理的食塩本０
．２５ｍＬに溶がし、１日１回腹腔内注射によつて連続
１０日間投与し、各週固体の腫瘍面積（長径Ｘ短径）、
５週目の最終日に固体を摘出して抑制率を算出した。

その結果を次の第 表に示す。この結果から適量投与（
水溶性多糖類２．４ｍ９／マウス不溶性多糖類水分解６
ｍ９／マウス）に対する抑制率６０％であつた。実施例
１ バチルス レボラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｅｖ
Ｏｌａｃｔｉｃｕｓ）の内、非水溶性及び水溶性多糖類
を生産する能，力がある株Ｍ−４株ＡＴＣＣ２３６４９
を用いる。

ペプトン０．５％、酵母工キズ０．３％、りん酸２カリ
ウム０．０５％、蔗糖２％、寒天１．５％からなる斜面
培地にＭ−４の胞子を接種して３０℃で４日間培養する
と、半透明ゲル状非水溶性の多糖類塊を生ずる。

前記培地の寒天を除き、蔗糖を８％とした培地を作り、
１１０′Ｃに１紛間加熱滅菌したもの２０ｅに前記寒天
培地１００ｍＬから得られた半透明ゲル状非水溶性の多
糖類塊を無菌的に接種して、３０゜Ｃに５日間培養する
と、多糖類塊が大きく成長する。

これを、サランの布で戸し、沖液をイとする。この沖液
イを１００００ｒｐｍて３吟間遠心分離して菌体を除き
、常法によりプロナーゼ処理した後、活性炭素１０ｇを
加えて混合し、５゜Ｃに１２時間放置してから吸引沖過
し、沖液にアセトンを２０ｅ加えて沈殿を生せしめ、得
られた沈殿を純水５００ＴＬ１に溶解し、セロフアン袋
に入れて純水に対して、２４時透析し、、透析内液にア
セトンを５００ｒＩＬＬ加えて沈殿を生ぜしめ、沈殿部
分を少量の純水に溶かして凍結乾燥して、白色塊状の水
溶性多糖類（フルクタン）２４ｇを得た。このものの制
癌作用試験結果は先に述べたとおりである。

実施例−２ コーン ステイーブ りカーを固形分として、１％、り
ん酸第２アンモニウム０．０２％、蔗糖５％からなる液
体培地２０ｅに、バチルス レボラクチクス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｌａｅｖＯｌａｃｔｉｃｕｓ））Ｍ−１ＡＴＣ
Ｃ２３４９３を接種して３０′Ｃで２日培養した後、蔗
糖１ｋ９に純水２′を加えて溶かし、１１５℃に１紛加
熱して殺菌した液を加えて更に４日間、３０℃て培養し
て得た液を、実施例−１に於ける沖液イと同様に処理し
て水溶性多糖類（フルクタン）１５ｇを得た。

実施例−３ 実施例−２のバチルス レボラクチクス （ＢａｃｌｌｌｕｓｌａｅｖＯｌａｃｔｉｃｕｓ）Ｍ−
７微工研菌寄第５４４号を用いて同様に行つたところ、
水溶性多糖類（フルクタン）１７ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の水溶性多糖類フルクタン水解物のＴＭ
Ｓ誘導体のガスクロマトグラフイ一のパターンを示す、
第２図は同フルクタンのセフアロースＣＬ−？によるゲ
ル淵過パターン、第３図は同フルクタンの赤外線吸収ス
ベクトル（ＫＢｒタブレット）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、中温性有
   胞子乳酸菌に分類され、かつ、実質的に果糖のみからな
   る重合体であつて、下記の理化学的性質Ａ）分子量：２
   ０×１０＾６以上Ｂ）融点：１８３−１８６℃ Ｃ）比旋光度：〔α〕▲数式、化学式、表等があります
   ▼（０．１％水溶液）Ｄ）溶解性： 水＞１００ｍｇ／ｍｌ メタノール不溶 エタノール不溶 プロパノール不溶 クロロホルム不溶 アセトン不溶 Ｅ）固有粘度：０．２９（２５±０．０２℃）を有する
   多糖類を生産する能力がある微生物を蔗糖を含む栄養培
   地で培養し、培養物から該多糖類を採取することを特徴
   とする多糖類の製造法。 ２ 微生物がバチルスレボラクチクス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）Ｍ
   −４（ＡＴＣＣ２３５４９）、同Ｍ−１（ＡＴＣＣ２３
   ４９３）、同Ｍ−７（微工研菌寄第５４４号）またはバ
   チルスラセミラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｒａｃｅ
   ｍｉｌａｃｔｉｃｕｓ）Ｍ−１４（微工研菌寄第５４６
   号）である特許請求の範囲第１項記載の多糖類の製造法
   。