JPS6046959B2 - 微生物による多糖類の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は有胞子乳酸菌によつて製造される多糖類及びそ
れを製造する方法に関し、詳しくは中温性有胞子乳酸菌
によつて製造される新規な不溶性グルカン、及びそれを
氷解した可溶化グルカン、及びそれを製造する方法に関
する。

ブドウ糖等を代謝して消費糖の５０％以上を乳酸に変え
る、いわゆる乳酸菌は、内生胞子を形成しないとされて
来た。

代謝形式では乳酸菌と変らないが、分類学上からは内生
胞子形成菌であるバチラセー（Ｂａｃｌｌｌａｃｅａｓ
）に属する細菌は有胞子乳酸菌と呼はれている。有胞子
乳酸菌には５０℃に生育の適温を有し、右旋性の乳酸を
つくる好熱菌の一群と、左旋性ないしラセミ乳酸をつく
り生育の適温が４５℃以下の中温性有胞子乳酸菌として
分類されている。有胞子細菌の中にもバチルス スフチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生産する
レバン、又は乳酸菌のうちにもロイコノストツク メセ
ンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック デキストラニカム
（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）
等が多糖類を生産することは知られているが、有胞子乳
酸菌か多糖類を生産する報告は未だ知られていない。

本発明者らは、本発明者らは分離同定した中温性有胞子
乳酸菌１托株中のバチルス レボラクチクス（Ｂａｃｊ
ｌｌｕｓｌａｓｖＯｌａｃｕｓ）に属する４株が後に述
べる条件下で不溶性のグルカンを生成し、それと共に溶
液中に水溶性のフルクタンを生成すること及びこれらの
４株と共に他のバチルス レボラクチス、バチルス ラ
セミラクチクス（Ｂ．ｒａｃｅｍｉｌａｃｔｕｃｕｓ）
及びスプロラクトバチルス（ＳｐＯｒＯｌａｃｔＯｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属の菌株等の１１株が水溶性のフルクタ
ンを生成すること、これらのグルカン及びフルクタンが
上記の従来からの有胞子細菌又は乳酸菌から生産した多
糖類と異なる多糖類であり、かつ水溶性のフルタン及び
不溶性のグルカンから水解した水溶性多糖類はデキスト
ラン類似の物性を示し、代用血漿としての使用可能性を
示すと共に若干の制癌性を示し薬剤原料たり得ることを
発見し本発明を完成した。

すなわち、第一に中温性乳酸菌のうちカタラーゼを有し
左旋性の乳酸を生産するバチルス レボラクチクス（Ｂ
ａｃｊｌｌｕｓｌａｅｖＯｌａｃｔｉｃｕｓ）に属する
Ｍ−４、−６ｅＫ−６８及ひ−７１株の４株は炭素源と
して蔗糖を含む培地て２０℃〜４０℃好ましくは３０゜
Ｃ前後て培養すると水溶性多糖類を生成するが、接種に
胞子から発芽増殖したばかりの菌体を用いる５と、不溶
性の多糖類をつくり、又増殖後既に不溶性の多糖類その
ものを生成した培地を種母として接種して燃糖培地に継
代培養したときも同様に不溶性の多糖類をつくると共に
液中に水溶性ゾル状の多糖類を生成していることを見出
した。

さらにこの不溶性グルカンに０．１Ｎ硫酸を加えて２紛
間沸騰湯煎上で加水分解すると、セフアデツクスＧ−２
００（架橋デキストランゲル）でｐ過したとき、Ｋｄが
Ｏになる程度の高分子量のままて水溶性となる。

従つて、本発明の不溶性グルカ３ンの分子量は、少なく
とも約２０万以上であることが明らかである。この不溶
性多糖類を１Ｎの硫酸で５時間沸騰湯煎上で加水分解し
てベーパークロマトグラフィーにより又、ＴＭＳ化して
ガスクロマトグラフィー４によりぶどう糖のみのピーク
を得、実質的にぶどう糖のみにより構成されたグルカン
であることが確認された。

同時に生成した水溶性のゾル状の多糖類は、それにエタ
ノールとエチルエーテルの等量混合物を加えて沈殿させ
て０．１Ｎの硫酸で１０分間沸騰湯煎上で加水分解して
ベーパークロマトグラフィーにより、又ＴＭＳ化してガ
スクロマトグラフィーにより果糖のみのピークを得、実
質的に果糖のみにより構成されたフルクタンであること
が確認された。註 ベーパークロマトグラフィーに使用
したｐ紙、東洋ｐ紙ＮＯ．５Ｏ、使用溶剤は次のとおり
、検出はフタール酸アニリン（ａ）ｎ−プロパノールニ
酢酸エチルニ水＝１４：２：７（ｂ）ブタノールニ酢酸
：水＝６０：１５：２５（ｃ）ｎ−ブタノールニエタノ
ールニ水＝４：１：５（上層使用）（ｄ）フエノールニ
１％アンモニア水＝４：１なお、第１図にガスクロマト
グラフィーの結果を第１図Ａ．．Ｂに示す。

Ａは不溶性多糖類水解物、Ｂは水溶性多糖類水解物のク
ロマトグラムを示す。図中、１はｎ−エイコサン、２は
ＴＭＳ−α−グルコース、３はＴＭＳ−β−グルコース
、４はＴＭＳ−フラクトースのそれぞれピークを示し、
該当糖以外の糖を含んでいないことを示している。

なお、水溶性多糖類が不溶性多糖類の低次の重合物でな
く、別個の重合物であることは意外であつた。

さらに、この４菌株Ｍ−４、−６巳一錫及び−７１株は
種母をグルコースで培養して主培地の炭素源を蔗糖とす
れば、全く不溶性の多糖類を生成せず、水溶性の多糖類
のみを生成し、その楊合の水？性の多糖類は、上記の不
溶性の多糖類とともに併産されるフルクタンと全く同一
の多糖類であつた。

本発明による多糖類の製造に用いる中温性有胞子乳酸菌
は、次のような性質のものである。

共通性質顕微鏡的所見：０．３〜１．０×１．７〜５．
０ミクロンの桿菌。

単独又は短連鎖をなし、周毛により運動する。胞子は０
．９〜１．５×１．２〜２．１ミクロンの楕円形で、細
胞の一端もしくは一端近くに着近くに着生する。グラム
染色：陽性 寒天上集落：発酵性炭素源を含まない寒天培地には全く
又は殆んど生育しない。

発酵性炭素源を含む寒天培地上の集落は白色ないし無色
半透明の凸円状で、広がることはない。肉汁培養：発酵
性炭素源を含まない培地には、成く又は殆んど生育しな
い。

発酵性炭素源を含む場合は混個又は沈殿を生じ、菌膜を
形成することはなく、酸を生成する。リトマス・ミルク
ニ不変又はおそくなつて辛うじて酸を生成し、ペブトン
化することはない。

ゼラチンニ液化しない。硝酸塩の還元、インドール生成
、硫化水素の生成かいずれも陰性。

生育温度：２０〜４０ーＣ 炭素源の利用性：Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトール、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、マルトースから酸
を生成し、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロースからは酸
を生成せず、ラクトースからは酸を生成しないか、或は
緩慢に生成する。

蔗〃糖、イヌリン、殿粉等からの酸生成は株によつて異
なる。その他の性質：ブドウ糖を嫌気的に代謝して、消
費糖の７０％以上を乳酸に変え、嫌気的にガスを発生す
ることはない。

ＤＮＡの工含量は、４５〜４６％。各菌株の個別性質は
次のとおりである。

バチルス レボラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｅｖ
Ｏｌａｃｔｉｃｕｓ） ：カタラーゼを持ち、非水溶性
多糖類を作る株としては、Ｍ−６６．Ｍ−４、Ｍ−６狐
Ｍ−７１がある。

この中、バチルス レボラクチクスＭ−４はＡＴＣＣ第
２３５４９として寄託されている。バチルス ラセミラ
クチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｒａｃｅｍｉｌａｃｔｉｃ
ｕｓ） ：カタラーゼを持ち、ラセミ乳酸を作る。

水溶性多糖類を作るものにＭ−１４がある。スポロラク
トバチルス レブス （ＳｐＯｒＯｌａｃｔＯｂａｃｉｌｌＬ］Ｓｌａｅｖｕ
ｓ） ：カタラーゼを持たす、左旋性乳酸を作る。

水溶性多糖類を作るものにＭ−８７、Ｍ−臥Ｍ−１１屯
Ｍ−１１８がある。スボロラクトバチルス ラセミクス
（ＳｐＯｒＯｌａｃｔＯｂａｃｉｌｌｕｓｒａｃｅｍｉ
ｃｕｓ） ：カタラーゼを持たす、ラセミ乳酸を作る。

水溶性多糖類を作るものにＭ−８ｅ１ＳＭ−１０３があ
る。本発明のこれらの多糖類と有胞子細菌ないしは乳酸
菌がつくる既知の代表的な多糖類との概括的な性質を比
較すると、次のとおりに性質を異にし、本発明の多糖類
がこれら公知のものと異質の多糖類てあることは明白で
ある。

次に本発明の多糖類の製造方法を述べる。

おれらの中温性有胞子乳酸菌を用いて本発明の多糖類を
製造するための炭素源としては、蔗糖のみが有効でその
他の糖類、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース、麦芽
糖、乳糖、トレハロース、ラフィノース、メリシトース
、イヌリン、デキストリン、可溶性殿粉、ラムノース、
ａ−メチルグリコシド、マンニトール、ソルビトール、
グルコン酸ナトリウム等の通常のオリゴ糖、多糖類、単
糖類、糖誘導体、多価アルコール類等の全ての糖が本発
明の多糖類の生成原料たり得ず、転化糖も不可であり、
キシローズを添加したものは非常に不良であつた。

蔗糖の添加濃度％は１％〜１０％（重／容、以下特に断
り無き限り％は重／容％をいう）の範囲が適当で特に不
溶性のグルカン生成には２〜８％、フルクタン生成には
２〜４％の濃度が好ましく、１０％以上はむしろ不適で
あつた。

その他微生物の培養に用いられる栄養素はすべて用いら
れるが、窒素源としては酵母工キズ、ペブトン等の有機
態の窒素が好ましい結果を与え、補助的に無機窒素源を
用いることがある。

特に酵母工キズ、無機塩類としても通常の微生物の培養
に用いられるりん酸マグネシウム等が必要で通常は市販
のソルトミクスチユアを用いれば十分てある。培養温度
は２０〜４０℃好ましくは３０℃前後がよくＰＨは４〜
８の範囲でよく、ＰＨ４以下は多糖類は生成せず炭酸カ
ルシウムで中和するとグルカンの生成には好ましくなく
、フルクタンの生成には好結果をもたらした。

しかし余りアルカリ側になると乳酸の生成に傾き、多糖
類の生成には好ましくない。通気は、当初の菌体の生成
には好ましい結果をもたらすが、本発明の多糖類の生成
には僅か行うか又は静置発酵て可能てある。バチルス
レボラクチスの場合、Ｍ−４、−６ｅＩＳ−６８又は−
７１を用い、種母をふどう糖培地に−植え継いだものを
種母に用いるとグルカンを生成しなくなるので、グルカ
ンの生成のためには胞子から発芽した新しい種母を使う
か、又は種母寒天培地上でゲル状グルカンを生成させて
、それを種母培地として液体培地に接種、蔗糖培地に継
代培．養すると不溶性グルカンが得られる。

これに対して、本発明の上記の乳酸菌によるフルクタン
の生成の場合は、上記のような生産株を蔗糖培地て培養
すれは無条件でフラクタンを形成する。しかし不溶性多
糖類を生産する上記の菌株から可溶性の！多糖類のみを
生産するには、ふどう糖培地て継代培養した種母を用い
ればよい。いずれも接種培養後３〜１０日位で培地中に
生成し、不溶性のグルカン生成の場合は培地一杯にゲル
固状の塊状物を生成し、液から分離し洗浄することによ
つて得ら・れ、後にゾル状の重合物による粘ちような液
が残る。固状の塊状物は流水で洗浄して硫酸て軽く水解
すると（イ）．１Ｎ，１０分〜２紛間沸騰水上）粘性の
ないサラサラとした液になるので、遠沈して菌体を除い
て透析し、凍結乾燥する。このものは純白な綿状の物質
であり、吸湿性は無いが極めて水に溶け、水に溶けると
サラサラした透明な液となるので精製も容易である。精
製には溶媒添加による沈殿、水による溶解を反覆する。
沈殿のための溶媒はエタノールとエチルエーテル又はメ
タノールとエチルエーテルとの等重混合物が用いられる
。不溶性の多糖類の収量は水解物として回収して、対糖
約２５％で糖濃度８％の場合は２０ｇ／ｆである。後に
残つた粘ちような液は、固状のグルカンの低重合物では
なく、フルクタンであることは先に述べたとおりである
。上記のようにして得られたグルカン水解物の精製品の
物理的性質は次のとおりてある。

試験品の精製 水解物２０ｍ９１ｍ１０．１Ｎ硫酸（１００゜Ｃ５紛）
遠心分離→透析→凍結乾燥→カラムクロマトグラフィー
（ＤＥＡＥセルロース（ＰＨ８）及びセ７アロース（架
橋アガロース）（ＣＬ−６Ｂ）→凍結乾燥１元素分析（
バーキンーエレマー社製２（代）型元２分子量セフアロ
ーズＣＬ−ω及びセフアローズ（架橋アガロース）ＣＬ
−？によるゲル枦過法によつた。

そのパターンを第２図、第３図にそれぞれ示す。
６４０．０００４４．０００ その間に種々の分子量を有するものがあると思われる。

３融点（本微量融点測定装置狸−Ｓ２） ２１０〜２１５℃ 分解 ４比旋光度 （ＰＯ−Ｂ型 日立旋光計） １％水溶液 参考デキストラン（平均分子量１Ｃｇｊ〜２０万）５紫
外線吸収スペクトル（島津ダブルビーム 分光光度計（
ＵＶ−２００Ｓ）） １％水溶液 特別な吸収は見られない ６赤外線吸収スペクトル （ＥＰＩ−Ｓ？ 日立赤外分光光度計） ＫＢｒタブレット そのスペクトル図を第４図に示す。

７溶解性８呈色反応 ９塩基性，酸性，中性の別 （ＴＣＡＵＭ−５ＡｒＨメーター） １％水溶液 ２０℃ＰＨ６．
６５〜７．０１（中性）１０物質の色 白色粉末 臭い 味無し １１粘度 オストワルド粘度計（２０±０．１ Ｃ）１％
１２．７９ミリポイズ参考デキストラ
ン（１％液）分子量固有粘度 ０．２４（２５±０．０
２′Ｃ）上記精製品の構造を確かめるため水解物を次の
種々の製品で処理した結果を次の第３表に示す。

註） デキストラナーゼ（Ｅ，Ｃ３，２，ｌ，ｌｌ
）シグマ社Ｄ５８８４ＰＨ６．Ｏ，３７℃，１２時間
セルマーゼ（Ｅ，Ｃ，３，２，ｌ，４） シグ
マ社Ｃ７３７７ＰＨ５．Ｏ，３７）Ｃ，ｌ詩間 ア
ミログルコシーダーゼ（Ｅ，Ｃ３，２，ｌ，３）シグマ
社Ａ７２５５ＰＨ４．５，５５ｌＣ，ｌ詩間上記の結果
から、不溶性多糖類の加水分解物はぶどう糖がα−１，
６を主とする結合が殆んどで、若干β−１，４結合を有
しているものと考えられるアミラーゼ系のものは僅かに
作用し、αーグルコシダーゼは酵素量を多くした時に作
用すると思われる。

従つて、主な繰返し単位は と思われる、α−１，６結合を主とするホモグルカンで
ある。

しかしながら、加水分解前の重合物は全く水に不溶であ
り、上記の結合の他に、他の結合様式、フ例えばα−１
，３結合あたりが切れて上記の水解物の重合体を生ずる
ものと思われ、水解物はデキストランに類似した物性を
有し、分画によつて代用血漿としての用途が可能である
。

本発明の多糖類の水解物及ひ水溶性多糖類について抗腫
瘍性を試験した結果を次に示す（両者の毒性は１２ｍｇ
／マウス（５００ｍ９／Ｋ９）において殆んど認められ
なかつた。

）試験用マウスはＩＣＲマウス！？．５週令、チヤール
スリバー社から入手、４日間前飼育２４土１ｇで使用。

上記のＩＣＲマウスに１週毎に継代されている癌センタ
ー譲受ストレインマウスからＳａｒｃＯｍａ−１８０腹
水を採取し、８×１０３／ｍｌの細胞浮遊液として、Ｉ
ＣＲマウスの石そけい部皮下に２×ｌび／０．２５ゞｍ
ｌ／マウス移殖した。

治療は腫瘍移殖後１日後から各使用量を生理的食塩水０
．２５ｎＬに溶かし、１日１回腹腔内注射によつて連続
１０日間投与し、各週固体の腫瘍面積（長径×短径）、
５週目の最終田こ固体を摘出して抑制率を算出した。

その結果を次の第４表に示す。この結果から適量投与（
水溶性多糖類２．４ｍ９／マウス不溶性多糖類水解物６
Ｔｎ９／マウス）に対する抑制率６０％であつた。実施
例１ バチルス レボラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｅｖ
Ｏｌａｃｔｉｃｕｓ）の内、非水溶性および水溶性多糖
類を生産する能力がある株Ｍ−４株ＡＴＣＣ２３５４９
を用いる。

ペフトン０．５％、酵母工キズ０．３％、りん酸２カリ
ウム０．０５％，蔗糖２％，寒天１．５からなる斜面培
地にＭ−４の胞子を接種して３０゜Ｃで４日間培養する
と、半透明ゲル状非水溶性の多糖類塊を生ずる。

前記培地の寒天を除き、蔗糖を８％とした培地を作り、
１１０℃に１紛間加熱滅菌したもの２０１に、前記寒天
培地１００ｍ１から得られた半透明ゲル状非水溶性の多
糖類塊を無菌的に接種して３０℃に５日間培養すると、
多糖類塊が大きく成長する。

これをサランの布で戸し、枦液をイとする。サランの布
の上に残つた塊状物を、そのままサランの布に包んで、
流水で１満間透析して洗浄すると純白塊となる。洗浄後
の塊状物に純水を加えて全量５′となし、これに純硫酸
２４．５ｇを加え、５０分間沸騰煎にかけると、透明の
液となるので、１００００ｒ′Ｐｍで連続遠心分離して
菌体を除く。その上澄液にメタノール５ｆ１エチルエー
テル５ｅの混合液を加え、一夜放置して上澄を傾瀉し去
り、沈殿部に純水２００ｍ１を加えて溶解し、セロファ
ン袋に入れて流水で１満間透析し、透析内液にメタノー
ル２００ｍ１、エチルエーテル２００ｍ１を加え、混合
して沈殿を生ぜしめて１００００ｒ″Ｐｍで３紛間遠心
分離し、竹殿部分を少量の水に溶解し、凍結乾燥して、
極めて水に溶けやすい白色塊状の可溶化多糖類（グルカ
ン）２１０ｇを得た。このものの制癌作用試験結果は先
に示したとおりであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の水不溶性多糖類グルカンの酸加水分解
物ＴＭＳ誘導体のガスクロマトグラムＡ、及びそれを共
に生産される多糖類フルクタンのＴＭＳ誘導体のガスク
ロマトグラムＢ１第２図は同酸加水分解物のセフアロー
スＣＬ−戊によるゲル沖過パターン、第３図は同ＣＬ−
２Ｂによるゲルろ過パターン、第４図は同赤外線吸収ス
ペクトル（ＫＢｒタブレット）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、α−１、
   ６結合を主とするグルコースのみからなる重合体であつ
   て、下記の理化学的性質Ａ 溶解性 水、エタノール、ジエチルエーテルに不溶Ｂ ０．１Ｎ
   硫酸による加水分解に対する性質（ａ）１５分間沸騰湯
   煎上での処理により、水溶性多糖類となる。 この多糖類はセフアデツクスＧ−２００（フアルマシヤ
   社商標：架橋デキストランゲル）で濾過したときｋｄ値
   が０である。（ｂ）（ａ）の多糖類を更に１００℃で５
   ０分間処理することにより（ｉ）分子量：約６４０００
   ０及び約４４０００に主なピークを有する多糖類となる
   （分子量は架橋アガロースゲルを用いて換算）。 （ｉｉ）融点：２１０−２１５℃で分解する（精製凍結
   乾燥品、以下同じ）。 （ｉｉｉ）比旋光度：〔α〕＿Ｄ＾２＾０１７５゜（ｃ
   ＝１％水）（ｉｖ）固定粘度：０．２４（２５±０．０
   ２℃）を有する多糖類を生産する能力がある微生物を蔗
   糖を含む栄養培地で培養し、培養物から該多糖類を採取
   することを特徴とする多糖類の製造方法。 ２ バチルス属に属する微生物がバチルス、レボラクチ
   ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｅｖｏ−ｌａｃｔｉｃｕｓ）
   Ｍ−４（ＡＴＣＣ２３５４９）である特許請求の範囲第
   １項記載の多糖類の製造方法。