JPS6049866B2 - Ｎｅａおよびｎｅａ抗体の精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新生物の新規な胎児抗原物質ＮＥＡおよびその
抗体（以下それぞれＮＥＡおよびＮＥＡ抗体と称す）の
精製法に関する。

人間における新生物に固有の抗原物質を研究することは
、新生物の発生原因、予防、処理および診断法にとり重
要な課題である。

近年、新生物に固有の抗原性物質を探求する試みがなさ
れ、若干・の抗原物質が報告されている。例えば原発性
肝細胞癌に対するα−フエトプロテインあるいは腺癌に
対するカルシノエンブロニツク アンチゲン（ＣＥＡ）
などである。しかし、これらの抗原物質は、ある特定の
臓器、系統器官あるいは病理組織学形態の新生物に限定
されている。この理由から広範囲の諸種臓器および病理
組織学形態の新生物に共通した新生物固有の抗原物質の
存在を探求し、この抗原物質に対する固有の抗体を作製
し、さらにこの特異抗体を用いた抗原検出法を確立する
ことは人間に発生した諸種新生物の存在診断、予防、お
よび処置に活気的な進歩を促すことが期待される。本発
明者は、広範囲の諸種新生物に共通した固有の抗原物質
の存在を探求した結果、新規な抗原物質であるＮＥＡを
見い出した。

本発明のＮＥＡとはＮｅＯｐｌａｓｍｅｎｂｒｙＯｎｉ
ｃａｎｔｉｇｅｎの略称であり、本発明者が命名したも
のである。

ＮＥＡは次に示す性状を有している。

１ＮＥＡは、ＮＥＡに対する抗体を用いたウクタロニー
試験法で、胎児組織（主に小腸および大腸）、胎児血清
、羊水、胎便、諸種新生物（主に悪性新生物）組織、な
らびに当該患者血清および腹水中に存在する事が証明で
きる。

しか２し、ウクタロニー試験法では、新生物患者の非新
生物組織、正常人血清、非新生物患者の血清および腹水
にはＮＥＡの存在を証明する事ができない。さらに、Ｎ
ＥＡにに対する抗血清を非新生物２患者組織抽出抗原、
正常人血清、非新生物患者血清で中和吸収操作しても、
ＮＥＡ抗体活性の失活または減弱は認められず、胎児組
織抽出液、胎児血清、ある種の悪性新生物組織抽出液ま
たはその患者血清を用いた吸収操作により３ＮＥＡ抗体
活性は失活または減弱することがウクタロニー試験法で
証明される。

したがつてＮＥＡは、胎児および新生物に共通した特異
抗原である。

２ＮＥＡは、セルローズアセテート膜、ペビコ３ンＣ−
８７０（塩化ビニル、酢酸ビニル複合体）、寒天ゲル、
澱粉などを支持体とするＰＨ８．６．イオン強度０．０
２５〜０．１のバルビタール緩衝液を用いた電気泳動で
γグロブリン分画に泳動され、既知の免疫グロブリン（
免疫グロブリンＧ，４，Ａ，Ｍ，ＤおよびＥ）、その他
の血清γグロブリンと免疫学的に異なる事が、ウクタロ
ニー試験法、免疫電気泳動法で証明される。

３ＮＥＡの吸光係数は、Ｅ？？（２８０ｎ１μ）＝０．
９３６である。

なお蛋白量は牛血清アルブミンを標準としてローリー法
（ＬＯｗｒｙ法）によつて測定した。４ＮＥＡは、セフ
アデツクスＧ−２００（商標フアルマシア社）を用いた
カラムクロマトグラフィーによる分子量測定の決果、分
子量１０００００±２００００の蛋白質である。

５ＮＥＡは、塩基性陰イオン交換体を用いたクロマトグ
ラフィーによりイオン強度０．０５，ＰＨ７．０の緩衝
液で展関すると免疫グロブリンＧとともにイオン光換体
に吸着されずに溶出される性状を有する。

６ＮＥＡの等電点はＰＨ９．ｌ〜９．４である。

７ＮＥＡは、ＰＨ７．Ｏ，２．６モル硫酸アンモニウム
溶液中で沈澱する性状を有する。

以上に述べたように、ＮＥＡは新生物の特異抗原であり
、血清中のＮＥＡの存在を調べる事により新生物の診断
を行なう事ができる。

したがつてＮＥＡおよびＮＥＡ抗体は、新生物の診断用
試薬として重要であるが、本発明は、このＮＥＡおよび
ＮＥＡ抗体の精製法てある。

本発明は、アフイニテイークロマトグラフイー法を用い
て、ＮＥＡおよびＮＥＡ抗体を精製する。すなわち、上
記の性状を有するＮＥＡまたはそれに対する抗体である
ＮＥＡ抗体の精製に際して、ＮＥＡ含有溶液をＮＥＡ抗
体と支持体との結合物に接触させるか、あるいはＮＥＡ
抗体含有溶液をＮＥＡと支持体との結合物に接触させ、
ついて支持体上に生成した抗原抗体複合体を解離してＮ
ＥＡまたはＮＥＡ抗体を回収する精製法てある。さらに
詳しく説明すると次のようになる。

まず、ＮＥＡまたはＮＥＡ抗体をセフアロース（商品名
、フアルマシア社）セフアデツクス（商品名、フアルマ
シア社）などの支持体に結合させる。結合物は、ＮＥＡ
またはＮＥＡ抗体の溶液中に、臭化シアンなどて活性化
した支持体を加え、低温にて攪拌すると得られる。得ら
れた結合物を分離剤として用いる。ＮＥＡを精製するに
は、支持体とＮＥＡ抗体の結合物を用い、ＮＥＡ抗体を
精製するには支持体とＮＥＡの結合物を用いる。ＮＥＡ
またはＮＥＡ抗体と支持体との結合物をカラムにつめ、
これに精製を目的とするＮＥＡまたはＮＥＡ抗体含有溶
液を流す。ＮＥＡまたはＮＥＡ抗体のみが支持体と結合
しているＮＥＡ抗体または、ＮＥＡと反応して複合体を
形成し、他の夾雑成分は流出する。次いで複合体を解離
して目的とするＮＥＡまたはＮＥＡ抗体を得る。複合体
の解離は、カラムにＰＨ約１０〜１２の水溶液を流す事
により達成できる。本発明の精製法によるとＮＥＡまた
は、ＮＥＡ抗体の高含量の原料は、もちろんのこと、低
含量の原料からも、高純度なものが得られる。

また本発明に用いるカラムは再成する事により繰返し用
いる事ができる。ＮＥＡおよびＮＥＡ抗体の他の精製方
法としては、硫安塩析法、ゲルＰ過法、電気泳動法、イ
オン交換樹脂等などの方法があげられるが、これらの精
製方法のみでは免疫学的に高純度なものを得るのは困難
てある。

本発明方法を単独または他の精製方法と併用することに
より免疫学的に高純度あるいは単一なものを得ることが
できる。前述したとおり、ＮＥＡは新生物関連抗原であ
り、血清等からのＮＥＡの検出法の確立は新生物の存在
診断、予防および処置に有用である。このような血清中
からの微量物質の検出には、抗原抗体反応を利用した免
疫学的な検出法が多用されているが、その検出試薬とし
ては、免疫学的に高純度のものが要求される。したがつ
て本発明方法で得られる免疫学的に高純度あるいは単一
なＮＥＡおよびＮＥＡ抗体はＮＥＡの検出試薬、特に免
疫学的検出試薬として有用てある。次に実施例および実
験例を示す。

実験例１ 癌組織からのＮＥＡの部分精製 凍結された１００ｙの乳癌摘出組織をサイの目に切りホ
モジナイザー中て５倍容の生理的食塩水を加え、４℃で
１吟間均質化した。

これにさらに等量の生理的食塩水（窒化ソーダを０．０
５％含有する）を加え、４゜Ｃて詔時間攪拌して蛋白質
を抽出した後、５０００重力（Ｇ）て３紛間遠心分離し
た。最上層にある脂肪層を除去し、上澄液を採集した。
得られた上澄液を２００唾力（Ｇ）で３吟間再度遠心分
離し、最上層の少量の脂肪層を除去し、上澄液を採集し
た。この上澄液を透析用セルローズチューブに入れ、ポ
リエチレングリコール（平均分子量約１５０００）液中
で約２紛の１容に濃縮した。濃縮液の蛋白濃度はローリ
ー・フオリン（ＬＯｌｙ−ＦＯｌｌｎ）法で測定した結
果７３ｍ９／ｍｌであつた。この濃縮液３ｍ１を、セフ
アデツクスＧ−２００を充てんした直径２．６Ｃ７７！
、長さ９０Ｃ！ＲＬ（床容量４６０ｍ１）のカラムによ
り、ＰＨ８．６、イオン強度０．０５のバルビタール緩
衝液中でゲル沖過を行ない、溶出液を分取した。溶出時
、２８０７Ｔ１．Ｐの分光光度計で４つのピークがみら
れた。即ち第１のピークはα２−マクログロブリン、免
疫グロブリンＭ１β−リボ蛋白などを含むμｓ以上の蛋
白を含む分画、第２のピークは免疫グロブリンを含むゐ
グロブリン分画、第３のピークは、アルブミンを含む４
．５Ｓ分画、第４のピークは、さらに小さな分子量の物
質を含む分画であつた。ＮＥＡは第２分画と第３分画の
中間に溶出された。即ち、分子量１２００００〜８００
００の分画にＮＥＡの約９０％が溶出された。第２およ
び第３ピークを除く、第２と第３ピーク間の溶出液を採
集し、粗ＮＥＡ分画とした。以上の操作を繰返して粗Ｎ
ＥＡ分画を集め、この粗ＮＥＡ分画液を限外沖過膜（通
過可能分子量１００００以下）を用いて、原組織量の約
１０分の１容に膿縮した。次いで、長さ３３ｃｍ、幅８
ｃｍ１厚さ２Ｇの電気泳動槽に支持体としてペピコンＣ
−８７０を充填し、ＰＨ８人イオン強度０．０５のバル
ビタール緩衝液を使用し、前記泳動層の陰極側より１０
ｃｍの部位に設けた試料溝に粗ＮＥＡ分画濃縮液５ｍ１
を注入し、８０ｎ１Ａ定電流て１６時間泳動した。試料
溝より陰極側へ３〜７ｃｍの距離にＮＥＡは、存在する
ためこの区域の支持体を切離し、１００ｍＬ（７）ＰＨ
７．５，Ｏ．Ｏ５モル燐酸緩衝生理食塩水を加え攪拌し
ノた後、３０００ｒｐｍ１紛間遠心分離して上澄液を採
集した。この上澄液に、さらに１００ｍ１の同じ緩衝液
を加え攪拌後、同条件で遠心分離し上澄液を採取した。

この採取液中にわずかに混入するペピコンＣ７−８７０
を除去するため、採集液をガラスフィルターで沖過した
。約２００ＴｒＬｔ（７）淵液をプロテインバック〔カ
ール シユライヒヤー（ＣａｒｌＳｃｈｉｅｉｃｈｅｒ
）社製ＵｌｔｒａｈｕｌｓｅｎＮＯ．ｌＯＯ、通過可能
分子量２５０００〕を用い、５ｍ１に濃縮した。

上記と同じ操作を５回行ない、得られた濃縮液を４℃で
保存した。得られたＮＥＡの電気易動度は免疫グロブリ
ンＧとほぼ同じ易動度を示した。本標品中には、夾雑蛋
白として免疫グロブリンＧおよびＡがウクタロニー試験
法および免疫電気泳動法により認められた。なお、以上
の方法によりＮＥＡは最初の生理的食塩水による抽出液
中のＮＥＡより計算して約５０％が回収された事になり
、また精製度は約１０皓であつた。実験例２ ＮＥＡ抗体の製造 実験例１て得た部分精製ＮＥＡを生理食塩水で蛋白量１
ｍｇ／ｍｌになるように調整し、この溶液０．５ｍ１に
等量のフロイント完全アジバントを混和乳化した液を体
重約２ｋ９の家兎の後肢、腹部の皮内、皮下および筋肉
内に分割注射した。

２週間後に前記と同様の操作て作製したＮＥＡ乳化液１
ｍ１を追加免疫し、さらにその２週間後に同ＮＥＡ乳化
液１ｍ１を再度追加免疫した。

最後の免疫より１０日後に血液を採取し、血清を分離後
５６゜Ｃて３吟間り貯置して非動化し、その後防腐の目
的で０．０５％濃度になるよう窒化ソーダを加えた。本
抗血清１ｍ１につき、３分の１容の正常人典清および初
乳精製γ−グロブリン５ｍｇを加えて３ＴＣ１時間、つ
いで４℃北時間り降置後、３吟間４℃３０００ｒ′Ｐｍ
で遠心分離し、上澄液を採集した。このような処理後の
抗血清のＮＥＡ抗体特異性は原乳癌組織抽出液を抗原と
したウクタロニー試験法および免疫電気泳動法て同定し
た結果ＮＥＡ抗体以外の抗体は含まれていないことが証
明された。なお、初乳精製γ−グロブリンを抗血清の中
和に用いた理由は、抗原抽出組織が乳癌組織のため、Ｎ
ＥＡ部分精製標品中に免疫グロブリンＡの分泌型抗原を
含んている可能性があり、作製した抗血清中にこれに対
する抗体が生じている可能性があ，るため、この抗体を
吸収除去する目的て免疫グロブリンＡの分泌型抗原を含
む初乳より精製したγーグロブリンを用いた。実施例１ ＮＥＡの単離精製 ＮＥＡ特異抗体を用いて、アフイニテイークロマトグラ
フイー法により、ＮＥＡを単離精製する。

実験例２で作製したＮＥＡ特異家兎抗血清５０ｒ１Ｌ１
に等量のＰＨ７．５，Ｏ．Ｏ５モル燐酸生食緩衝液を加
えた溶液に、同量のＰＨ７．８の飽和硫酸アンモニウ・
ム溶液を加えた。６０分後に５０００ｒ″Ｐｍて遠心分
離し、得られた沈澱物を前記燐酸生食緩衝液に溶解し、
原抗血清と等量の溶解液となした。

ついで、ＰＨ７．８の飽和硫酸アンモニウム溶液を４分
の１容加えて、６紛後に５０００ｒｐｍで遠心分離し、
得られた上澄液にさらに４分の１容の同飽和硫酸アンモ
ニウム溶液を加えて３３％硫酸アンモニウム溶液となし
、６紛後に５００〔Ｐｍで遠心分離して沈澱物のγグロ
ブリン分画を採集した。

沈澱物をＰＨ８。Ｏ，Ｏ．Ｏｌモルの燐酸緩衝液約１５
ｍｔに溶解した。この溶液１５ｍ１を、セフアデツクス
Ｇ−５０の直径２．６Ｃ！Ｒｌｌ長さ４０ｃｍのカラム
および前記の燐酸緩衝ノ液を用いたゲルろ過法で分画し
、最初に溶出される蛋白分画を採集する事により、脱塩
および緩衝化を行つた。

さらにこの溶液をプロテインバックを用いて蛋白濃度７
０ｍｇ／ｍｌに濃縮調整した。ついで活性化したＤＥＡ
Ｅ−セルロースを、前記燐酸緩衝液を用いて直径２．６
ＣＷｉ１長さ４０Ｃ７ｎのカラムに充填し、このカラム
に前記濃縮液を添加し、カラムベッドに吸入させた後、
前記のりん酸緩衝液をペット上部に満し、流し続けた。
免疫グロブリンＧの大部分は、ＤＥＡＥ−セルロースに
吸着し゛ないが、他の蛋白は、すべて吸着される。した
がつて、流出液を分割採取して、２８０Ｔ１ｍの吸収を
測定し、蛋白分画液を得た。このようにして免疫グロブ
リンＧを単離採取した。さらにこの分画液の蛋白濃度を
プロテインバックを用いて、１０ｍ９／ｍｌに濃縮調整
した。ついで、ブロムシアン活性化セフアローズ心ゲル
５０ｍＬにゲル１ｍ１当り、前記のＮＥＡ抗体活性をも
つ免疫グロブリンＧ５ｍ９を加えて室温（２０゜〜２５
℃）で６時間反応させ免疫グロブリンを固着させた。

その後、未反応の免疫グロブリンを燐酸緩衝生理食塩水
で充分洗滌除去した。

このセフアローズ心ゲルを直径２．６ｃｍ１長さ２０ｃ
ｍのカラムに前記燐酸緩衝生理食塩水を用いて充填し、
これに実験例１て得た部分精製ＮＥＡ２Ｏｍ９（蛋白量
）を１０ｍ１の生食水に溶解して添加し、セフアローズ
ー心ゲル固着のＮＥＡ抗体と反応させ、ＮＥＡ抗原抗体
複合物をゲル中に作製した。前記燐酸緩衝生理食塩水て
未反応の蛋白質を洗滌した後、０．２モル炭酸ナトリウ
ム液（ＰＨｌｌ．５）をカラムに添加し、ＮＥＡを解離
溶出させた。採取したＮＥＡ液を０．０５モル燐酸緩衝
生理食塩水（ＰＨ７．５）に透析してから濃縮し、４℃
に保存した。

得られたＮＥＡは、実施例１て作製した正常人血清およ
び初乳精製γ−グロブリンで中和する前の抗ＮＥＡ血清
を用いたウクタロニー法および免疫電気泳動法では単一
沈降線を示し、さらに単離したＮＥＡの１０％ＳＤＳ（
ソジユウムドデシルサルフエイト）ポリアクリルアマイ
ドゲルデイスク電気泳動法により単一のバンドとして示
された。この結果、得られたＮＥＡは、高純度の単離精
製標品である。実験例３ 癌患者腹水からのＮＥＡの部分精製 胃癌患者の腹水２ｆを限外沖過膜（通過可能分子量１５
０００）を用いて５００ｍ１に濃縮し、この濃縮液を３
紛間２００００重力（Ｇ）で遠心分離して上澄液を採集
した。

上澄液にＰＨ７．５，Ｏ．Ｏ５モル燐酸緩衝生理食塩水
を加えて、全量１ｅ（蛋白量約３％）とした。これに硫
酸アンモニウムを加えて１．５モル硫酸アンモニウム溶
液とし、水酸化ナトリウムを添加してＰＨ７．Ｏに調整
した。この溶液を６吟間放置後、３紛間１０００〔Ｐｍ
て遠心分離した。上澄液を採集し、硫酸アンモニウムを
加えて、２．６モル硫酸アンモニウム溶液となし、６紛
後に３紛間１００００ｒ′Ｐｍで遠心分離した。沈澱物
中にＮＥＡの６０％以上が採集された。沈澱物をＰＨ８
．６イオン強度０．０５のバルビタール緩衝液に溶解し
、全量を２００ｍＬとした。この溶液を同じ緩衝液を用
いてセフアデツクスＧ−５０（商標、フアーマシア社）
によりゲル沖過を行ない、最初に溶出される蛋白分画を
採取し、硫安の脱塩、バルビタール緩衝化を行なつた。
この硫安分画液の蛋白濃度を約７０ｍ９／ｍｌに調整し
、この溶液５ｍ１を電気泳動した。即ち、長さ３３ｃＴ
ｎ、幅８（：７ｎ１厚さ２αの電気泳動槽に支持体とし
て、ペピコンＣ一８７０を充填し、ＰＨ８．？イオン強
度０．０５のバルビタール緩衝液を使用し、泳動槽の陰
極側より１０ＣＴｆＬの部位に設けた試料溝に前記溶液
５ＴｆＬＬを注入し、８０ｒｒ１Ａ定電流で川時間泳動
した。その後、試料溝より陰極側へ３〜７ｃｍの距離に
ある支持体を切離し、１００ｍｔのＰＨ７．飄０．０５
モル燐酸緩衝生理食塩水を加え攪拌後３０００ｒｐｍ１
紛間遠心分離して上澄液を採取した。さらに１００ｍ１
の同緩衝液を加えて攪拌後、同条件で遠心分離し、上澄
液をガラスフィルターで淵過した。

ｐ液をプロテインバッグで２．５ｍ１に濃縮した。この
濃縮液２．５ｍ１をセフアデツクスＧ−２００を充填し
た直径２．６ｃｆｆ１、長さ９０Ｃｒ！ｉ（床容量４６
０ｍ１）のカラムにより、ＰＨ７．５、０．０５モル燐
酸緩衝液中てゲル沖過を行い、溶出液を各試験管に分取
した。溶出時、２８０ｍμの分光光度計で２つの吸収ピ
ークがみられた。第１のピークは、免疫グロブリンＭを
含む１Ｃｆ５分画で、第２のピークは免疫グロブリンを
含む？分画であつた。ＮＥＡは第２のピークよりやや遅
れて溶出される。即ち分子量１２００００〜８００００
に相当する分画にＮＥＡの約９０％以上が存在した。こ
の分画を採取し、プロテインバッグで濃縮した後、４℃
で保存した。得られたＮＥＡ標品には、夾雑物質として
、免疫グロブリンＧおよびＡがウクタロニー試験法およ
び免疫電気泳動法で認められた。なお、得られたＮＥＡ
の精製度は、約５０倍てあつた。

実施例２ＮＥＡ特異抗体の精製 実験例３て作製した部分精製ＮＥＡをＰＨ７．５、０．
０５モル燐酸緩衝生理食塩水に溶解し、蛋白量を１０ｍ
９／ｍｌに調整した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記（ｉ）〜（ｖｉ）の性状を有するＮＥＡの精製
   に際して、ＮＥＡ含有溶液をＮＥＡ抗体と支持体との結
   合物に接触させ、ついで支持体上に生成した抗原抗体複
   合体を解離してＮＥＡを回収することを特徴とする。 ＮＥＡの精製法： （ｉ）ＰＨ８．６、イオン強度０．０２５〜０．１のバ
   ルビタール緩衝液を用いた電気泳動でγグロブリン分画
   に泳動される。 （ｉｉ）Ｅ■％（２８０ｍμ）＝０．９３６（ただし中
   血清アルブミンを標準とするローリー法によつて測定）
   。 （ｉｉｉ）分子量１０００００±２００００（ただしセ
   フアデツクスＧ−２００（商標フアルマシア社）を用い
   るカラムクロマトグラフィーによつて測定）。 （ｉｖ）塩基性陰イオン交換体を用いたクロマトグラフ
   ィーにおいてイオン強度０．０５、ＰＨ７．０の緩衝液
   で展開すると免疫グロブリンＧとともに溶出する。 （ｖ）等電点ＰＨ＝９．１〜９．４ （ｖｉ）ＰＨ７．０．、２．５モル硫酸アンモニウム溶
   液中で沈澱する。 ２ 下記（ｉ）〜（ｖｉ）の性状を有するＮＥＡに対す
   る抗体であるＮＥＡ抗体の精製に際して、ＮＥＡ抗体含
   有溶液をＮＥＡと支持体との結合物に接触させ、ついで
   支持体上に生成した抗原抗体複合体を解離してＮＥＡ抗
   体を回収することを特徴とする。 ＮＥＡ抗体の精製法：（ｉ）ＰＨ８．６イオン強度０．
   ０２５〜０．１のバルビタール緩衝液を用いた電気泳動
   でγグロブリン分画に泳動される。（ｉｉ）Ｅ■％（２
   ８０ｍμ）＝０．９３６（ただし中血清アルブミンを標
   準とするローリー法によつて測定）。 （ｉｉｉ）分子量１０００００±２００００（ただしセ
   フアデツクスＧ−２００（商標フアルマシア社）を用い
   るカラムクロマトグラフィーによつて測定）。 （ｉｖ）塩基性陰イオン交換体を用いたクロマトグラフ
   ィーにおいてイオン強度０．０５、ＰＨ７．０の緩衝液
   で展開すると免疫グロブリンＧとともに溶出する。 （ｖ）等電点ＰＨ＝９．１〜９．４ （ｖｉ）ＰＨ７．０、２．５モル硫酸アンモニウム溶液
   中で沈澱する。