JPS6057837B2 - セフアロスポリン化合物の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はセフアロスポリンＣの同族体から酵素的にセフ
アロスポリン化合物を製造する方法に関する。

従来の技術 ペルキー特許第７３６９３４号、英国特許第１２７２７
６９号、特開昭４７−３９５９５号、特開昭５０−１０
１５８４号に於いては、好気的条件下でアスペルギルス
属、ペニシリウム属、ノイロスポラ属、エアロバクター
属またはトリゴノプシス・バリアビリスから誘導”され
るＤ−アミノ酸オキシダーゼの利用例が知られている。

また英国特許第１２７２７６吟によれば、アジ化ナトリ
ウムを添加して３−アセトキシメチルー ー（４’一カ
ルボキシブタンアミド）セフー３−エムー４−カルボン
酸を生産する方法が明示されている。発明が解決しよう
とする問題点 セフアロスポリンｃ同族体の酵素による酸化的脱アミノ
反応は、優れた抗菌活性を有するセフアロスポリン誘導
体を開発製造する上て重要であるにもかかわらず、成功
例は少ない。

特に、Ｄ−α−アミノアジピン酸が酸アミド結合してい
るセフアロスポリンｃの場合、普通のＤ−アミノ酸オキ
シダーゼでは作用しがたいことが問題となつている。ま
た、セフアロスポリンｃ同族体を単にＤーアミノ酸オキ
シダーゼにより酵素的に酸化すると、３−アセトキシメ
チルー ７−（５’一カルボキシー５″−オキソペンタ
ンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸誘導体およ
び３−アセトキシメチルー７−（４″一カルボキシブタ
ンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸誘導体が得
られるが該誘導体を選択的に生産することができず、工
業的に不利であり、今だ充分ではない。問題を解決する
ための手段 本発明者らは、セフアロスポリンＣ醗酵プロスから７−
アミノセフアロスポラン酸類を製造するのに有利な中間
体３−アセトキシメチルー７一（５−カルボキシー５″
−オキソペンタンアミド）セフー３−エムー４−カルボ
ン酸または３−アセトキシメチルー７−（４″一カルボ
キシブタンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸が
、土壌中の検索微生物より分離した糸状菌Ｇｋ−３４０
ｎにより生成することを知つた。

更に、鋭意研究した結果、本発明者らは、酵素と一般式
１の化合物との接触中に少量の過酸化水素水（３５％）
を反応液に対して０．１〜０．５％添加することにより
、３−アセトキシメチルー７一（５−カルボキシー５″
−オキソペンタンアミド）セフー３−エムー４−カルボ
ン酸の生成を完全に押え、収量を減することなく３−ア
セトキシメチルー７−（４″一カルボキシブタンアミド
）セフー３−エムー４−カルボン酸を容易に、し々）も
、選択的に単離てきることを見い出し、本発明を完成し
た。

作用 即ち、本発明はセフアロスポリンＣ醗酵プロスに含有す
る式 Ｃ （式中、Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、アセトキシル
基、または親核性残基を示す）で表わされる化合物又は
その塩を、醗酵プロスより抽出することなく、そのまま
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有する糸状菌Ｇ
ｋ−３４唯１微工研菌寄第３２７６号ョの培養物または
其の処理物を、水性媒体下で通気して接触させた後、ア
ジ化ナトリウム及び過酸化水素水の存在下で、カタラー
ゼ活性を阻害することにより式 （式中、Ｒは前記と同じ基を示す）で表わされるセフア
ロスポリン化合物または其の塩を選択的にの製造する方
法である。

上記糸状菌Ｇｋｍｌ■株の各種培地上における培養の特
徴は、次に記載する通りである。

Ａ肉眼的観察 １ ツアベツク寒天培地 生育は、やや早く３日間で直径３Ｔｆａに達する。

菌糸は初め白色であるが、分生子が形成されるに従いオ
リーブ●イエロー（０１１ｖｅＹｅ１１０ｗ）となり、
更に長時間培養すると明るい黄味緑色（ＣＯｂａｌｔＧ
ｒｅｅｎ）となる。

分生子の形成は非常に多い。集落表面は綿毛状。裏面は
薄縁色（０ｐａ１１ｎｅＧｒｅｅｎ）〜赤紫色（Ｍａｇ
ｅｎｔａ）。

拡散性色素は生成しない。２麦芽汁寒天培地 生育はツアベツク寒天培地より菌糸の伸長が抑制的て遅
く３日間で直径２ｗｎである。

培養初期は白色であるが、分生子が形成されるに従い草
色（ＧｒａｓｓＧｒｅｅｎ）となる。分生子は早期に形
成され非常に多い。集落表面はビロード状。裏面は薄黄
色（Ｃｒｅａｍ）〜赤紫色（Ｍａｇｅｎｔａ）。拡散性
色素は生成しない。３ オートミール寒天培地 生育は早く拡大性、３日間で４１！Ｒｍに達する。

菌糸は初め白色であるが、分生子が形成され暗緑色（Ｆ
ＯｒｅｓｔＧｒｅｅｎ）となり表面に水滴を生ずる。分
生子は多い。集落表面はビロード状。裏面は薄黄色（Ｐ
ａｌｅＹｅｌｌＯｗ）である。Ｂ顕微鏡的観察 分生子柄は非対象に分枝しその長さは３０〜７０μ、基
部の巾は１．９μであるが一般的には巾３μ壁は平滑で
やや厚い。

基底分枝（Ｂｒａｎｃｈｅｓｒａｍｌ）はなく、分生子
柄に接続する基底担子（Ｈｅｔｕｌａｅ）７×０．７μ
が分枝する。その上にペン先型フイアライドが群生し、
夫々惰円型１．５μ〜１．８μ×２１μの分生子が連鎖
する。分生子連鎖はオートミール寒天培地で約１帽、ツ
アベツク寒天培地で約１陥、麦芽汁寒天培地で約２０〜
３陥である。これらの連鎖した分生子は密生して扇状の
大集塊を呈する。閉子のう穀、菌核は認められない。Ｃ
生育条件 生育温度は１５〜４０℃、生育ＰＨは３．０〜７．へ最
適生育温度は２８〜３７７Ｃ１最適生育ＰＨは４．０〜
５．０である。

上記の菌学的性状を有する糸状菌Ｇｋ−３４０菌株の分
類学上の位置をギルマンズ ア マニュアルオブ ソイ
ル フアンジ（Ｊ．Ｃ．Ｇｉｌｍａｎ″ＳＡＭａｎｕａ
ｌＯｆＳＯｉｌＦｕｎｇｉ）、レイパー、トム共著のア
マニアル オブ ザ ペニシリア（ＡＭａｎｕａｌＯ
ｆＴｌｌｅＰｅｎｉｃｉＩｌｌａ）およびパーネットの
インパーフエクト フアンジ（１１１ｕｓｔｒａｔｅｄ
Ｇｅｒ１ｅｒａ０ｆＩｍｐｅｒｆｅｃｔｆｕｒ１ｇｉ）
を参照して検討し、さらに本菌株の近縁と認められるＩ
ＦＯ−６６１７と比較検討した結果、本菌株は肉眼では
ペニシリウムのような外観であるが顕微鏡で分生子構造
を観察し、グリオクラデイウム属（ＧＩｉＯｃｌａｄｉ
ｕｍ）に属するものと判定される。

なお、本菌株は工業技術院微生物工業研究所に１微工研
菌寄第３２７６号ョとして寄託されている。

酵素生産菌株を培養するに当つては、炭素源としてグル
コース、澱粉、窒素源として落花生粉、綿実粕、無機塩
として燐酸カリ、硫酸マグネシウムなどの他、Ｄ−α−
アミノアジピン酸側鎖のオキシダーゼを誘導するためＤ
−アミノ酸が必要である。Ｄ−グルタミン酸を用いる場
合、添加量０．１〜３％ではオキシダーゼ生成に著しく
影響し、添加増量が生成量に比例する知見を得た。ＤＬ
−グルタミン酸でも有効であるが、Ｄ−グルタミン酸と
して０．３％以上含有していることが望ましい。２８℃
で約２ｍ間の通気攪拌培養を行う。

このような誘導培養により蓄積した著量のオキシダーゼ
含有菌体は濾別したままでも使用できるが、更に菌体を
凍結融解するか又は生菌体をアーカードＣなどと接触（
対液０．１％で１時間）させることにより酵素の活性化
を一層促進させることができる。セフアロスポリンＣ培
養プロスに適用して反応させる場合、Ｄ−α−アミノア
ジピン酸側鎖オキシダーゼの浪費を防ぐため、セフアロ
スポリンＣ培養プロスの濾過液を弱酸性カチオン交換樹
脂たとえばアンパーライトＩＲＣ−５０（Ｎａ＋）で前
処理（ＰＨ６．Ｏの酸性液として通過）することが好ま
しい。

この前処理液にＧＫ−３４話性化菌体を６〜１０％添加
し、ＰＨ７．Ｏ〜７．５に修正後、反応温度３３′Ｃｌ
ｌ〜５ｖ．ｖ．ｍ．の通気下１０ｒ．ｐ．ｍ．以上の高
速攪拌で２〜３時間反応させる。以上の活性化技術およ
びイオン交換樹脂による前処理を組み合わせて酵素反応
を行うと、全く酵素阻害を受けることなく、・セフアロ
スポリンＣ培養プロスから高収率で目的物が得られる。
実際には既にべたように、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活
性化菌体と一般式１の化合物を接触させる際、２つの化
合物すなわち３−アセトキシメチルー７−（５″一カル
ボキシー５″−オキソペンタンアミド）セフー３−エム
ー４−カルボン酸および３−アセトキシメチルー７−（
４―カルボキシブタンアミド）セフー３−エムー４ーカ
ルボン酸が生産される。この際、アジ化ナトリウム及び
過酸化水素水を用いて、カタラーゼ活性を阻害すると、
３−アセトキシメチルー７一（４″一カルボキシブタン
アミド）セフー３−エムー４−カルボン酸が選択的に生
産される。即ち、３−アセトキシメチルー７−（４−カ
ルボキシブタンアミ（へ）セフニ３−エムー４−カルボ
ン酸を生産する場合には、酸化反応中０．１〜０．２％
のアジ化ナトリウムを添加し、更に反応中３紛後に３５
％過酸化水素水０．２５％を加え、６紛後さらに０．１
５％を加える。

生成した３−アセトキシメチルー７−（４″一カルボキ
シブタンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸の量
は、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出した後、そのＷ吸
収（２６０ｒ１ｍ）を測定して定量する。

また同時に薄層クロマトグラフィ（展開溶媒イソプロパ
ノールニ水＝７：３）によつても反応完結を確認する。
酸化反応後、反応液のＰＨを６．０以下にし濾過する。
反応濾液は、そのまま若しくは濃縮しＰＨを１．５〜２
．０に修正した後、水と混和しない有機溶媒たとえばメ
チルイソブチルケトン、ｎ−ブタノール、酢酸エチルな
どで抽出を行う。若し必要なら反応液は、次の濃縮操作
を加えてもよい。即ち反応濾液を、その１５％量の強塩
基性陰イオン交換樹脂（例えばＰＡ−３０巳１ＲＡ−４
０１など）の酢酸タイプに吸着させ、樹脂の１．５〜２
倍量の水で洗浄後、０．２〜１．ＣＭ塩化アンモニウム
溶液で溶出する。溶出液は減圧下で濃縮し、反応液の１
１１０〜１１１２とする。この濃縮液は、ＰＨｌ．５〜
２．１とし、水と混和しない同量の有機溶媒て３回抽出
し、その有機溶媒を減圧下て溜去することにより、３−
アセトキシメチルー７−（４″一カルボキシブタンアミ
ド）セフー３−エムー４−カルボン酸の粗粉末を得る。

溶媒抽出時に食塩などの塩を添加することは、溶媒抽出
を完全に行う上で好ましい方法の一つである。粗粉末を
精製するには、３倍容のメタノールを加え完全に溶解後
、３０〜４０ｆ８量のエーテルを加えることにより不純
物を沈澱させる。

そのエーテル層は濾過後に濃縮すると、針状結晶が析出
するので、濾別してから改めてクロロホルムで洗浄し減
圧乾燥させる。もしくは、粗粉末を等量のメチルイソブ
チルケトンに溶解し、ナトリウムー２−エチルヘキサノ
エートを添加することによつてもナトリウム塩として析
出させることができる。

反応溶液から有機溶媒で抽出した３−アセトキシメチル
ー７−（４″一カルボキシブタンアミド）セフー３−エ
ムー４−カルボン酸は、有機溶媒を全量溜去することな
く単に１１３〜１１４に濃縮した後ジシクロヘキシルア
ミンを添加し夫々の塩として沈澱分別することもできる
。

次に実施例を挙けて本発明を具体的に説明するが、これ
により本発明を限定するものではない。

実施例１グリオクラデイウム・ＧＫ−３４唯を合同フラ
ワー４％、ピーナツミール１．５％、第１燐酸カリ０．
２％、硫酸マグネシウム０．０５％を含む前培養液体培
地６０ｍ１に接種し２８゜Ｃで２４〜４８時間振盪培養
した後、グルコース４％、ピーナツミール１．５％、Ｄ
−グルタミン酸０．５％、第１燐酸カリ０．２％、硫酸
マグネシウム０．０５％を含むシート培地２５０ｍ１に
移液し詔時間２８′Ｃで振盪培養する。

このシート１ｅをグルコース４％、ピーナツミール２％
、ＤＬ−グルタミン酸０．５％、第１燐酸カリ０．１％
、硫酸マグネシウム０．０５％を含むタンク培地１３０
１に移液し、２ｇ′Ｃで約ｎ時間通気攪拌培養するが培
養停止時期はプロスＰＨが５．０まで上昇した時点とす
る。この際アーガードＣを１３０ｍ１加え１時間攪拌後
、フィルターブレスで濾過水洗しＤ−アミノ酸オキシダ
ーゼの活性化湿菌体８ｋ９が得られた。これを一２０℃
で凍結保存した。一方、セフアロスポリンＣ培養プロス
は濾過し、その濾液６０１（セフアロスポリンＣとして
２１６′を含む）２Ｎ−ＮａＯＨでＰＨ６．Ｏに修正し
、アンパーライト１ＲＣ−５０（Ｎａつ６ｊにＳＶ＝３
で通過させる。

通過液は直ちに心−ＨＣＩ″Ｃ′ＰＨ５．５〜６．０に
修正する。酸化反応をする際には、このＩＲＣ−５０の
処理液６０ｅ（セフアロスポリンＣとして２０５．２Ｖ
を含む）２Ｎ−ＮａＯＨ′Ｃ−ＰＨ７．５に修正し通気
攪拌装置を備えたタンクに入れ温度を３３′Ｃとした後
アジ化ナトリウム９０ｆを添加し、更に前記の活湿菌体
５ｋ９を加え３ｖ．ｖ．ｍ．の通気下２００ｒ．ｐ．ｍ
．で攪拌する。

反応開始後、初めの約２紛間までＰＨが低下するのでＰ
Ｈ７．Ｏ〜＆０に維持した。３紛後に３５％過酸化水素
水１５０ｍ１を加え、更に６紛後にも１００ｍ１加える
。

反応中３０分毎に薄層クロマトグラフィ定性的検出（展
開溶媒はイソプロパノールニ水＝７：３）を行う。また
１時間毎に試料１ｍ１を採りＰＨ２．Ｏに修正し酢酸エ
チル８ｍ１を加えて５分間振盪し、その酢酸エチル層か
ら５ｍ１を分取して０．４Ｍ一ＮａＨＣＯ３溶液５ｍ１
を加えさらに５分間振盪後、水層の２６０ｒ１ｍの吸収
を測定し、３−アセトキシメチルー７−（４″一カルボ
キシブタンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸の
生成量を測定した。その結果、反応１時間後に１４００
ｒ′／ｍｌ、２時間目には２５００ｒ／ｍｌとなつた。
酸化反応は約２時間て終り、反応液はＰＨ６．Ｏに・修
正後、濾過助剤１ｋｇを加えてフィルターブレスて濾過
し、濾液７．８ｅを得た。

この濾液を高速液体クルマトグラフイーで測定すると、
３−アセトキシメチルー７−（４″一カルボキシブタン
アミド）セフー３−エムー４−カルボン酸１４６ｙが生
．産されていると推定された。この反応濾液をＰＨ６．
Ｏに修正後アンパーライトＩＲＡ−４０１（ＣＨ３ＣＯ
Ｏ−）９１ＳＶ＝３で通過させ、水１３．５ｅで洗浄し
た。その際、吸着廃液と水洗液には未反応のセフアロス
ポリンＣ４７．８ｙが、ヒドロキシルアノミン法により
測定された。前述のＩＲＡ−４０１樹脂は、０．２Ｍ−
ＮＨ４Ｃｌ４．５ｅｌＯ．５Ｍ−ＮＨ４Ｃｌｌ３．５ｅ
．．ＩＭ−ＮＨ，Ｃｌ２５ｅでステツプワイズに溶出し
、活性フラクシヨンを１８ｅを得た。

この活性フラクシヨンを１部採取し酢酸エチル抽出重曹
転溶液の２６０ｒ１ｍ吸収測定値は、１０２ｆであつた
。この活性フラクシヨンをｎ−ブタノール５ｅと共沸さ
せ５ｅまで濃縮後、食塩、１．５ｋ９を加え濃塩酸でＰ
Ｈｌ．８とした後、メチルイソブチルケトン５１′で３
回抽出した。

この抽出液を減圧下で完全に溜去し９３Ｖの３−アセト
キシメチルー７−（４″一カルボキシブタンアミド）セ
フー３−エムー４−カルボン酸の粗粉末が得られた。実
施例２ 実施例１と同じ方法で調製した３−アセトキシメチルー
７−（４″一カルボキシブタンアミド）セフー３−エム
ー４−カルボン酸の粗粉末を精製するには上記の粗粉末
１２０ｙにメタノール３６０ｍ１を加えて溶解後さらに
エーテル３．６ｅを加え、生じた沈澱を濾過し、濾液を
減圧下で１００ｍ１まで濃縮すると針状結晶を生じた。

この結晶を濾過し、クロロホルム２００ｍ１で洗浄後、
減圧乾燥し３−アセトキシメチルー７−（４″一カルボ
キシブタンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸の
結晶８２ｙを得た。このもののノ元素分析値はＣｌ５Ｈ
８Ｎ２Ｏ８Ｓとして、次の通りであつた。実施例３ セフアロスポリンＣの培養濾液から実施例１と同じ方法
で阻害物質をアンパーライトＩＲＣ−５０（Ｎａ＋）で
除去した前処理液６ｅ（セフアロスポリンＣを１８．３
Ｖを含む）とＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性化菌体５０
０ｙとアジ化ナトリウム９ｙを通気下３３℃で２時間反
応させる。

その反応時間中先づ反応開始３吟後に３５％過酸化水素
水１５ｍ１を加え、更に６紛後に１０ｍ１を追加した。
目的物の生成量は１２．４ｙの測定値であつた。この反
応終了液を３０％硫酸でＰＨｌ．８に修正して濾過し濾
液６．３ｅを得た。

この濾液を５℃に冷却し、等量のメチルイソブチルケト
ンで３回くり返し抽出して溶媒層６．３ｅを集めた。こ
れを１．９６ｅまで濃縮し、活性炭０．６ｙを加えて２
紛間攪拌後濾過する。

この濾液および改めてメチルイソブチルケトン１００ｍ
１を用いた活性炭洗一浄濾液を集める。このメチルイソ
ブチルケトン液にジシクロヘキシルアミン７．８ｍ１を
加え、１０℃で９紛攪拌し沈澱を濾過する。この沈澱は
、先づメチルイソブチルケトン９００ｍ１で洗浄し、次
いでアセトン１ｅで再洗浄後、乾一燥し、３−アセトキ
シメチルー７−（４″一カルボキシブタンアミド）セフ
ー３−エムー４−カルボン酸のジシクロヘキシルアミン
塩１６．１ｙを得た。

実施例４実施例１と同じ方法て調製した３−アセトキシ
・メチルー７−（４″一カルボキシブタンアミド）セフ
ー３−エムー４−カルボン酸の粗粉末２０ｙを２００ｍ
１の酢酸エチルに溶解し、濾過して不溶物質を除去し１
１３〜１１諸に濃縮した後〔ナトリウムー２−エチルヘ
キサノエート（４）．０５Ｍ）７．６ｙ／酢酸エチル２
２ｍ１〕の溶液を攪拌しつつ添加すると黄色のナトリウ
ム塩を析出する。

これを酢酸エチル（約３０ｍ１）で２回洗浄して乾燥し
、３−アセトキシメチルー７−（４″一カルボキシブタ
ンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸のナトリウ
ム塩結晶１６ｙを得た。参考例１ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する乾燥菌体粉末４
５ｆＩを、アンパーライトＩＲＣ−５０Ｎａで前処理し
たセフアロスポリンＣプロス１．５′に加え、更にアジ
化ナトリウム７００ｍ９を追加してＰＨ８．Ｏとし毎分
２Ｖ′／ｖの通気量下３３℃で攪拌しながら反応させた
。

反応は５時間で完了し、３−アセトキシメチルー（５″
一カルボキシー５″−オキソペンタンアミド）セフー３
−エムー４−カルボン酸は反応開始後１時間で一定量に
達し、それ以上には増加しなかつた。最終的には、セフ
アロスポリンＣの２６．２％が３−アセトキシメチルー
（５″一カルボキシー５″−オキソペンタンアミド）セ
フー３一エムー４−カルボン酸に転換し、５４．２％相
当が３−アセトキシメチルー７ −（４’一カルボキシ
ブタンアミド）セフー３−エムー４−カルボン酸に変換
した。発明の効果 本発明の製造法によれば、セフアロスポリンｃ同族体に
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有するグリオク
ラデイウム（ＧｌｉＯｃｌａｄｉｕｍ）属に属する微生
物の培養物又はその処理物を水性媒体下で通気して接触
させ、カタラーゼ活性を阻害することにより、７−アミ
ノセフアロスポラン酸誘導体の有用な中間体である３−
アセトキシメチルー７ −（４’一カルボキシブタンア
ミド）セフー３−エムー４−カルボン酸誘導体が選択的
に容易に得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ I ） （式中、Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、アセトキシル
   基、または親核性残基を示す）で表わされる化合物又は
   其の塩を、醗酵ブロスより抽出することなく、そのまま
   Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有するグリオク
   ラデイウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）属に属する微生
   物の培養物または其の処理物を、水性媒体下で通気して
   接触させた後、アジ化ナトリウム及び過酸化水素水の存
   在下で、カタラーゼ活性を阻害することを特徴とする式
   ▲数式、化学式、表等があります▼ （II） （Ｒは前記と同じ基を示す）で表わされるセフアロスポ
   リン化合物または其の塩の製造法。