JPS606486B2

JPS606486B2 - 透過型螢光測光顕微鏡

Info

Publication number: JPS606486B2
Application number: JP15944977A
Authority: JP
Inventors: 健二小野木; 良蔵伊藤
Original assignee: Nippon Kogaku KK
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1977-12-28
Filing date: 1977-12-28
Publication date: 1985-02-19
Also published as: JPS5491346A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は透過型の蟹光側光顕微鏡に関し、特に試料の蟹
光波長スペクトルを求める際の装置関数を除去した透過
型の蟹光漁り光顕微鏡に関する。

蟹光顕微鏡が広く一般に行き渡った今日、マクロの分光
技術の発達と相まって、顕微鏡レベルでの蟹光の発光強
度や蟹光波長スペクトルあるいは励起波長スペクトルを
求め、物質や後光色素の同定判別、解折を行なう顕微蟹
光預り光技術が盛んに用いられるようになってきた。こ
のような顕徴蟹光側光技術に用いられる透過型の篭光側
光顕微鏡を第１図によって説明する。第１図において、
１は光源、２は励起側モノクロメータ、３は石英全反射
ミラー、４は石英タイプの階視野コンデンサ、５は試料
、６は対物レンズ、７は顕微鏡の光路に挿脱できる観察
用プリズム、８は鞍眼レンズ、９は蜜光側モノクロメー
タ、１川まフオトマル等で構成される検知器、１１は記
録計である。このような顕微鏡において試料５の後光波
長スペクトルを求めるには、観察用プリズム７を光路中
に挿入して視野を決め、その後観察用プリズム７を光路
から取外し、励起側モノクロメータ２を試料５の最大励
起波長近傍のある波長＾Ｅに設定し、蟹光側モノクロメ
ータ９を走査する。この時「検知器１０から得られるス
ペクトルＳ，入は、顕微鏡の各要素の有する波長特性の
影響である装置関数と試料５の釜光波長スペクトルとの
積で与えられる。励起側モノクロメー夕２からの光東は
単波長入Ｅであるから光源１、励起側モノクロメータ２
の波長特性は考える必要がなく、装置関数としては対物
レンズ６、蟹光側モノクロメー夕９、検知器量０の波長
特性を考えればよい。それ故「登光側モノクロ〆−夕９
の設定波長が入の時、対物レンズ６「蟹光側モノクロメ
ー夕９「検知器１０の波長特性をそれぞれ○入、Ｍ２
人、Ｄ入とすれば「検知器９で得られるスペクトルＳ，
入と試料５の蟹光波長スペクトルＳＴ入Ｅ入との間には
次式｛１｝カギ成立する。ＳＩ入＝。

入・Ｍ２入・Ｄ入・ＳＴ人Ｅ入…（１）すなわち、上述
の従来技術では検知器１０から得られるスペクトルＳ，
Ｍま、試料５の蟹光波長スペクトルＳＴ入Ｅ入の外に対
物レンズ６、蟹光側モノクロメータ９、検知器１０の波
長特性を含んだ値となってしまう。これは特に「蟹光ピ
ーク値の近い試料（例えば５−ＨＴとカテコールアミノ
）の同定判別をする場合に、誤まった結果を得てしまう
原因となる。本発明の目的は、試料の蟹光波長スペクト
ルを求める際に、検知器からの信号に含まれる装置関数
を除去し、試料の蟹光波長スペクトルのみを取り出すこ
とのできる透過型の蟹光側光顕微鏡の提供にある。

以下第２図に基づいて本発明の実施例を説明する。

光源２１からの光東は、励起側モノクロ〆−夕２２へ入
射する。

励起側モノクロメータ２２は光源２１からの入射光東の
うち、あらかじめ設定した波長の光東のみを選択して射
出する。励起側モノクロメータ２２から射出した光東は
「光量子計３５の一部である石英部分透過ミラー２８‘
こよって２つの光東に分けられる。石英部分透過ミラー
２８を透過した光東は石英全反射ミラー２３で反射した
後、石英タイプのコンデンサ２４を透過して試料２５を
照射する。試料２５からの光東は対物レンズ２６によっ
て絞り２７上に集光する。絞り２７に設けたピンホール
を透過した光東は「後光側モノクロ〆−夕２９へ入射す
る。蟹光側モノクロ〆−夕２９は入射した光東のうち設
定した波長の光東のみを透過してフオトマル等から構成
される検知器３０へ導く。検知器３０へ入射した単一の
波長の光東は光電変換される。一方、石英部分透過ミラ
ー２８１こよって反射された光東は、石英三角セル３２
中に入れられたローダミンＢ３ｇ′〆ェチレングＩＪコ
ール溶液を照射する。ローダミンＢは良く知られている
ように励起波長（３０仇ｍ〜６０仇ｍ程度）にかかわら
ず、発光効率の一定な蟹光物質である。石英三角セル３
２を射出した光東（後光）は、カットフィル夕３３でロ
ーダミンＢの射出する蟹光以外をカットされ、フオトマ
ル等で構成される光電変換器３４で電気信号に変えられ
る。光量子計３５の出力である光電変換器３４からの電
気信号は、割算回路３６の一方の入力端子に印加される
。切換スイッチＳＷは、検知器３０の出力を割算回路３
６の他方の入力端子（第１端子）ａに印加するか、演算
回路３８の一方の入力端子（第２端子）ｂに印加するか
を選択する。割算回路３６は両入力端子に印加された電
圧の間の比を出力する。記憶回路３７は割算回路３６の
出力を記憶する。演算回路３８は記憶回路３７の記憶内
容を他方の入力端子に印加され、検知器３０の出力との
間で鶏算もしくは割算を行なう。この時、記憶回路３７
からは、同期手段３９からの信号によって蟹光側モノク
ロメータ２９の設定波長と同期した波長の記憶内容が読
み出され「演算回路３８へ印加される。演算回路３８は
検知器３０の出力と記憶回路３７の対応した波長の間で
演算を行ない、その結果を出力する。このような蜜光側
光顕微鏡において蟹光波長スペクトルを求める為には以
下のように行なう。まず試料２５を顕微鏡の光路から外
し、励起側モノクロメーク２２及び蟹光側モノクロメー
夕２９を同期させて設定波長をある波長変化域全体にわ
たって変化する。このとき、蟹光側モノクロメータ２９
の設定波長が入の時「光量子計３５から得られるスペク
トル強度をＳ，′Ｘ、検知器３８で得られるスペクトル
強度をＳ２′入とするとそれぞれに対して次式■と次式
（３’が成立する。Ｓ，′入＝Ｌ＾・Ｍ，入・ｋ
”””（２）Ｓ２′入：Ｌ入．ＭＩ入。

〇入・Ｍ２入。Ｄ入 “
川川【３｝ただし、Ｌ入三光源２１の波長特性Ｍ，入；
励起側モノクロメータ２２の波長特性ｋ：ローダミンＢ
３ｇ′そエチレングリコール溶液のスペクトル強度（一
定値） ○入：対物レンズ２６の波長特性Ｍ２入：蟹光側モノクロメータ２９の波長特性Ｄ入：検
知器３０の波長特性スイッチＳＷは試料２５を顕微鏡の光路から外すと第１
端子ａに接続される。

それ故、割算回路３６には式■、式湖で与えられるスペ
クトル強度が入力される。それ故、割算回路３６からの
出力は、両者の比であり、次式■で与えられる。９一
ｋ ……【４’ ９２一。

入・Ｍ２＾・Ｄ入この値は記憶回路３７へ入力される。

次に顕微鏡の光路中に試料２５を挿入すると共に、励起
側モノクロメータ２２を一つの波長に設定する。

このときスイッチＳＷは第２端子ｂへ切換えられる。こ
の状態において、蟹光側モノクロメータ２９をある波長
変化城全体にわたって走査させる、この時検知器３０か
ら得られるスペクトル強度Ｓ２入は、試料の蟹光スペク
トルをＳＴ入Ｅ入とすれば、次式■で与えられる。Ｓ２
入＝。

＾・Ｍ２入・Ｄ＾・ＳＴ＾Ｅ入 ‐・‐・・‐｛
５１同期手段３９は、現在の蟹光側モノクロメータ２９の設
定波長と等しい波長の記憶回路３７の記憶内容を演算回
路３８へ入力するから、演算回路３８は両入力の間で積
をとる。

それ故演算回路３８の出力Ｓｏは式｛４ーと式■の積で
ある次式‘６）で与えられる。Ｓ。

＝ｋ・ＳＴ入耳入……【６｝式（６｝もこおいてｋ‘ま
定数であるから試料２５の蟹光波長スペクトルＳＴ入Ｅ
入を容易に取り出すことができる。

脇乱実施価側胸路３６もま、義を計算しているので演算回路３８は両入力の間の積をとっ
てし柳割算回路３肋鰐を計算するような構成の時、演算
回路３８は両入力の間の比をとるように設定される。

また、実施例では蟹光側モノクロメータ２９の変化変化
城にわたって式｛４１を測定してから式（５｝を測定し
ている。

これは記憶回路３７に式■で与えられる値を補正量とし
て記憶しているので、異なった試料の測定に際しても一
々補正量を測定する必要がなくなるという利点を有する
。しかしながら、測定の順序は式（５｝を得て記憶回路
に記憶させてから式｛４｝を測定し、その後両者の間で
演算を行なってもよい。さらに実施例では、まず蟹光側
モノクロメータ２９の波長変化城にわたって式｛４）を
得ているが、蜜光側モノクロメータ２９の各設定波長毎
に式（４字と式■を測定して演算を行なってもよい。

さらに、本顕微鏡は、試料２５の励起波長スペクトルを
測定する場合にも用いることができる。

光量子計３５から得られるスペクトル強度は式｛２｝で
与えられる。また、検知器３０からの信号Ｓ３について
は、蟹光側モノクロメータ２９はある一定の波長に設定
してあるから、対物レンズ２６、蟹光側モノクロメータ
２９、検知器３０の波長特性を考える必要はなく信号Ｓ
３は次式（７｝で表わせる。Ｓ３；Ｌ入・ＭＩ＾・ＳＴ
入Ｅ入……（７１ただし、ＳＴ入Ｅ＾：試料２５の励起
波長スペクトルここで式〔２’と式【７｝の比を割算回
路３６で求めれ夕ば、ミキヱニが得られ、これから試料
の励起波長スペクトルＳＴ＾Ｅ＾のみを取り出すことは
容易である。以上述べたように本発明によれば、検知器
からの信号に含まれる装置関数を除去でき、試料の蟹ｏ
光波長スペクトルのみを求めることのできる透過型蟹光
測光顕微鏡が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来の頭徴蟹光側光技術に用いられる透過型蟹
光側光顕微鏡の説明図、第２図は本発明夕の実施例の説
明図である。主要部分の符号の説明、２５・…・・試料、２９・・・
・・・蟹光側モノクロメーク、３０…・・・検知器、３
４・・・・・・光露変換器、３５・…・・光量子計、Ｓ
Ｗ・・…・功換スイッチ、３６・・・・・・割算回路、
３８…・・・演算回ｏ路、３７・…・・記憶回路、３９
・・…・同期手段、ａ…・・・第１端子、ｂ…・・・第
２端子。三ト「図スフ２図

Claims

【特許請求の範囲】

１所定の波長の励起光を射出できる光源手段と、異な
った波長の光を順次設定して検出でき、該検出した光を
光電変換する検知手段と、前記光源手段からの励起光に
て試料を透過照明し、該試料からの螢光を前記検知手段
に入射せしめる光学手段とを有する透過型の螢光測光顕
微鏡において、前記励起光を分岐して入力することによ
り、該励起光の光強度に比例した電気信号を出力する補
正信号検出手段と、前記検知手段が出力する光電変換信
号を第１端子と第２端子とに選択的に発生せしめる選択
手段と、前記補正信号検出手段の出力端子と前記第１端
子とに接続され、両端子に生じた信号の比に応じた信号
を出力する割算手段と、該割算手段の出力端子と前記第
２端子とのいずれか一方に接続され、入力される信号を
前記検出光の波長に対応せしめて記憶する記憶手段と、
該記憶手段の記憶値から前記検知手段の波長の設定に同
期せしめて、該設定波長に対応する記憶値を読み出す同
期手段と、前記割算手段の出力端子と前記第２端子との
他方と、前記記憶手段の出力端子とに接続され、該両端
子に生じた信号の間で比もしくは積を演算し装置関数を
除去する演算手段と、を含み、前記演算手段の出力とし
て前記検知手段の波長特性を除去した螢光波長スペクト
ルを求めることを特徴とする透過型の螢光測光顕微鏡。