【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
この発明はシコニソ等のナフトキノン系の色素を含有す
るムラサキ科植物の組織培養方法に関する。
さらに詳しくは液体塔地の特定の成分の濃度をコントロ
ールしてムラサキ科の植物を組織培養することにより、
ナフトキノン系化合物その他の有用成分を多量に効率よ
く生産する方法に関する。ムラサキ料の植物であるムラ
サキの根には下記の式（Ｒ＝−ＯＨ，−ＯＣＯＣＨ３な
ど）
で示されるシコニン（Ｒ＝−ＯＨ）等のナフトキノン系
の化合物が含まれており、従来から「紫根」と呼ばれ漢
方薬に用いられている。
すなわちゴマ油等の油脂によって、紫根からシコニンそ
の他の物質を抽出して得られる軟膏は紫雲管と呼ばれ各
種皮膚疾患、切優、火傷、痔疾等の治療に用いられ、抗
炎症作用、肉芽形成作用等のあることが知られている。
しかしながら紫線から抽出できるシコニン等の薬効成分
は徴量であり、またムラサキの栽培には時間がかかり、
自然環境や天候にも左右される等の問題があり、その安
定供尊台が危ぶまれている。
これに対し、組織培養方法を用いてムラサキ科の植物を
増殖させることが、田端守、水上元らによつて「フアイ
トケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔひ）第１鏡
肇第９２７ページ「「薬学雑誌」第９５登第１３７６ペ
ージ、「ファイトケミストリー一（Ｐｈｙのｃｈｅｍｉ
ｓｔひ）第１６巻第１１雛ページ、同第１７巻第９５ペ
ージに報告されている。
この方法によれば、季節、天候に左右されることなく、
ムラサキ料の植物を増殖させることができるので非常に
有利である。しかしながらこれらに開示されている方法
では、いずれも培地を寒天で固体状にして使用しており
、大量生産には不適当である。そこで本発明者らは大量
生産に適している液体培地を用いて、同様にカルスを生
育させる方法を検討し「 まず田端らの用いた培地（リ
ンスマイヤー・スクーグの渚地）に寒天を添加すること
なく液体塔地の形態でムラサキの組織培養に使用したが
、カルスはある程度増殖するものの、シコニン等の色素
生成量は少量であり、またその生成量もバラッキが大き
く安定した収量を確保することができなかった。
一方、植物の組織培養に用いられる液体培地としては、
無機塩類、炭素源、植物ホルモン類、ビタミン類、アミ
ノ酸類等を培地成分とするものが知られている。
本発明者らはこれらの培地成分について、更に検討した
結果、無機成分の特定の成分の濃度をコントロールする
ことにより、ナフトキノン系の化合物の生成量が増加し
、その生成量のバラッキも少なく、安定した生産を確実
に行うことができることを見出し、この発明を完成する
に至った。すなわち本発明は、下記の濃度条件The present invention relates to a method for culturing the tissue of a plant of the family Murasaceae containing a naphthoquinone-based pigment such as Shiconiso. More specifically, by controlling the concentration of specific components in the liquid tower and tissue culturing the plants of the family Prunusaceae,
The present invention relates to a method for efficiently producing large quantities of naphthoquinone compounds and other useful ingredients. The roots of the purple root, which is a plant used as a purple root, contain naphthoquinone-based compounds such as shikonin (R=-OH), which is represented by the following formula (R=-OH, -OCOCH3, etc.), and has traditionally been called ``purple root''. ” and is used in Chinese medicine. In other words, the ointment obtained by extracting shikonin and other substances from Shikonin using oils such as sesame oil is called Shiunkan and is used to treat various skin diseases, acne, burns, hemorrhoids, etc., and has anti-inflammatory and granulation-forming effects. It is known that there are
However, the medicinal ingredients such as shikonin that can be extracted from purple linen are only available in quantities, and cultivating purple violets takes time.
There are problems such as being affected by the natural environment and weather, and the stability of the offering platform is at risk. On the other hand, propagation of plants of the family Murasakiceae using tissue culture method was proposed by Mamoru Tabata, Hajime Mizukami et al. No. 1376 page, “Phytochemistry 1 (Phy chemistry
This is reported in Volume 16, Page 11, and Volume 17, Page 95. According to this method, regardless of the season or weather,
It is very advantageous because it allows the cultivation of purple plants. However, the methods disclosed in these publications all use agar as a solid medium, and are unsuitable for mass production. Therefore, the present inventors investigated a method for growing callus in a similar manner using a liquid medium suitable for mass production, and ``First, we added agar to the medium used by Tabata et al. It was used in the tissue culture of purple violet in the form of a liquid column without drying, but although the callus proliferated to some extent, the amount of pigments such as shikonin produced was small, and the amount produced also varied greatly, making it difficult to ensure a stable yield. On the other hand, as a liquid medium used for plant tissue culture,
Culture media containing inorganic salts, carbon sources, plant hormones, vitamins, amino acids, etc. are known. The present inventors further investigated these culture medium components and found that by controlling the concentration of specific inorganic components, the amount of naphthoquinone compounds produced increased, and the amount produced was stable with little variation. They discovered that it is possible to reliably produce the same amount of energy, and completed this invention. That is, the present invention provides the following concentration conditions:
【ａ】マンガンイオン ｌＯＡＭ以下｛
ｂ｝ モリブデンイオン ０．００３ＡＭ以
下｛ｃ’ヨウ素イオン ２．０仏Ｍ以
下のうちの少なくとも１以上の条件を満たす液体塔地を
用いることを特徴とするムラサキ料植物の組織培養方法
に関する。
本発明で用いられる液体塔地は、上記の成分の濃度がコ
ントロールされている限り、他の成分を通常用いられる
範囲で広く変化させることができ、従来から植物の組織
培養に用いられている渚地を改変して用いることができ
る。
また植物の組織培養に用いられる液体培地としては無機
成分および炭素源を必須成分とし、これに植物ホルモン
類、ビタミン類およびアミノ酸類等から選ばれる少なく
とも１種類以上の成分を加えた液体培地があり、必要に
応じてその他の成分も併用される。
無機成分としては、上記の他に窒素、リン、カリウム、
カルシウム「マグネシウム、イオウ「鉄「亜鉛、ホウ素
、銅、塩素、ナトリウムトコバルト等があり、具体的に
は硝酸カリウム、硝酸ナトリウムし硝酸カルシウムトリ
ン酸１カリウムＬリン酸２ナトリウム、塩化カリウム、
塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホ
ウ酸、硫酸鋼、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブ
デン「ョウ化カリウム、塩化コバルトなどが例示される
。
また炭素源には、ショ糖等の炭化水素「その誘導体「脂
肪酸等の有機酸、エタノール等の一級アルコールなどが
例示される。
植物ホルモン類には、インドール酢酸
（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ｐ−クロロフ
ェノキシィソ酪酸、２・４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２・４一Ｄ）などのオーキシン類「 カイネチン「ゼア
チン、ジヒドロゼアチン等のサィトカィニン類が例示さ
れる。
ビタミン類には、ピオチン、チアミン（ビタミンＢ）「
ピリドキシン（ビタミンＢ６）へバントテン酸、アスコ
ルビン酸（ビタミンＣ）へィノシトール「ニコチン酸な
どが例示される。
アミノ酸類には、グリシン〜アラニン、グルタミン、シ
ステインなどがある。
本発明においては、これらの成分のうちの無機成分に属
する｛ａｉマンガンイオン、‘ｂｉモリブデンイオンお
よび｛ｃ｝ヨウ素イオンから選ばれる少なくとも一成分
の濃度を前記した範囲内にコントロールすることが必要
であり、とくに一成分のみならず、三成分以上の濃度を
コントロールすることが望ましく、上記蜘〜【ｃ｝のす
べての成分の濃度をコントロールすることが最も望まし
い。
またこれら｛ａー〜｛ｃ）の成分の濃度は、前記した濃
度以下のうちでも「 さらに濃度を低くすることが望ま
しく、これらの成分が添加されていない液体塔地を用い
ることがとくに望ましい。
これによりカルス中のナフトキノン系化合物の生成量が
さらに増加する。液体塔地中の上記以外の成分の種類濃
度は、広い範囲で変えることができる。
通常は無機成分を約０．１仏Ｍ〜約１００肌Ｍ程度、炭
素源を約１多〆そ〜３０多′そ程度、さらに植物ホルモ
ン類を約０．０１仏Ｍ〜約１０仏Ｍ程度、ビタミン類お
よびアミノ酸類をそれぞれ約０．１の９ノ〆〜約１００
双９′〆程度とすることが行われる。本発明においては
、培地中の他の成分の調整によりナフトキノン系の化合
物の生成量をさらに増大させることも可能である。
例えば全窒素源に対するアンモニウムイオンの割合を約
１０モル％以下にすれば、ナフトキノン系化合物の生成
量はさらに増大する。この発明の好適例としては、以下
のような方法がある。
即ちムラサキ科に属する植物の植物体、例えば根、生長
点、葉、茎、種子などから採取された組織片を殺菌処理
後、寒天で固めたりンスマィャー・スクーグの固体培地
上に層床し、１０〜３５℃で７〜３０日程度経過後、組
織片の一部をカルス化させる。このようにして得られた
カルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化し
たカルスが得られる。このカルスを増殖に適した液体培
地、例えばリンスマィャー・スクーグの液体塔地に移し
て増殖させる。
液体培地においてさらに生育速度が高められ、安定化し
たカルスを本発明の液体塔地に添加して培養する方法が
ある。
これらの方法において、液体塔地中のカルスの初期濃度
は、広い範囲で変えることができる。
通常は液体培地１のこ対して、カルスを約１夕〜約２０
０夕（新鮮重量）程度添加することが望ましい。本発明
の組織培養において、光は必ずしも必要ではなく、かえ
って暗所での培養がシコニン等の色素の生産に望ましい
。
また培養温度は約１０００〜約３５ｑｏ、とくに約２３
℃〜約２がＣが好適であり、約１０００未満ではカルス
の増殖速度が小さく、約３５ｑｏを越えても同様にカル
スの増殖速度は小さくなる。カルスおよび液体塔地から
ナフトキノン系化合物を分離採取するには、従釆から天
然品の「紫根」に適用されている抽出等の方法を採用す
ることができる。
本発明によれば、液体塔地を用いるのでタンクを利用し
た大量培養が可能であり、さらにカルスを培地から分離
する方法として、デカンテーション、炉過等の簡便な操
作を採用できるので工業上有利である。
さらにカルスの増殖が速やかであり、シコニン等のナフ
トキノン系の化合物を確実に大量生産することができる
。
比較例
ム ラ サキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈ
ｒｏｒｈｂｏｎＳｅ心ｅｔＺＭｃ．）の根の組織片を、
リンスマイャー・スクーグの寒天固体塔地に層床し、静
贋培養法でムラサキのカルスを得た。
このカルスをリンスマイャー・スクーグの液体培地で培
養することにより、カルスの生育速度を高めた。一方、
１００机【のェルレンマィャーフラスコに第１表の組成
からなるホワイトの改変液体培地（ただし植物ホルモン
類として、インドール酢酸を１仏Ｍ、カイネチンをｌＯ
ＡＭおよび炭素源としてショ糖を２０タ′そ含む）３０
の‘入れ、１２０ｏＣ、１ぴ合間滅菌した。
この液体塔地にＬ上記の生育速度の高められたムラサキ
の新鮮カルス０．５夕を添加して２５００で１４日間、
ロータリーシェーカー上で、旋回培養（振幅２５燭、１
０比ｐｍ）した。培養後のムラサキカルスを炉過により
採取し３５℃で２独特間乾燥させた後し その重量（乾
重）を測定し、液体培地１〆あたりの培養細胞の生育乾
童を求めた。
また得られたカルスから、抽出によりシコニンを分離し
、その重量を測定し、液体塔地１そあたりの総シコニン
の生成量を求めた。
結果を第２表に示す。
実施例 １〜３
比較例において、液体塔地の培地成分のうちの特定成分
を第２表に示す値とする以外は比較例と同様に行った。
第１表２表[a] Manganese ion less than lOAM {
b} Molybdenum ion: 0.003 AM or less {c' Iodine ion: 2.0 AM or less {c' Iodine ion: 2.0 AM or less As long as the concentration of the above-mentioned components is controlled, the other components of the liquid tower used in the present invention can be varied widely within the commonly used range. The ground can be modified and used. In addition, there are liquid media used for plant tissue culture that have inorganic components and carbon sources as essential components, and at least one component selected from plant hormones, vitamins, amino acids, etc. , and other ingredients may be used in combination as necessary. In addition to the above, inorganic components include nitrogen, phosphorus, potassium,
Calcium, magnesium, sulfur, iron, zinc, boron, copper, chlorine, sodium tocobalt, etc. Specifically, potassium nitrate, sodium nitrate, calcium nitrate, monopotassium phosphate, disodium phosphate, potassium chloride,
Calcium chloride, magnesium sulfate, sodium sulfate,
Examples of carbon sources include ferrous sulfate, ferric sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, boric acid, steel sulfate, sodium molybdate, molybdenum trioxide, potassium iodide, and cobalt chloride. Examples include hydrocarbons such as sugars, their derivatives, organic acids such as fatty acids, and primary alcohols such as ethanol. Plant hormones include indole acetic acid (IAA), naphthalene acetic acid (NAA), Butyric acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (
Examples include auxins such as 2.41D), kinetin, and cytokinins such as zeatin and dihydrozeatin. Vitamins include pyotin, thiamine (vitamin B), and
Examples include pyridoxine (vitamin B6), bantothenic acid, ascorbic acid (vitamin C), heinositol, and nicotinic acid. Amino acids include glycine to alanine, glutamine, and cysteine. It is necessary to control the concentration of at least one component selected from {ai manganese ions, 'bi molybdenum ions, and {c} iodine ions belonging to inorganic components within the above-mentioned range. , it is desirable to control the concentrations of three or more components, and it is most desirable to control the concentrations of all the components {a to {c} above. It is desirable to lower the concentration even further, and it is especially desirable to use a liquid column to which these components are not added. This further increases the amount of naphthoquinone compounds produced in the callus. The concentrations of components other than those listed above in the pagoda soil can be varied within a wide range. Usually, the inorganic components are about 0.1 to about 100 M, and the carbon source is about 1 to 30. 'That's about it, plus plant hormones from about 0.01 fm to about 10 fm, and vitamins and amino acids from about 0.1 to about 100 fm each.
It is done to make it about double 9'. In the present invention, it is also possible to further increase the amount of naphthoquinone compounds produced by adjusting other components in the medium. For example, if the ratio of ammonium ions to the total nitrogen source is about 10 mol % or less, the amount of naphthoquinone compounds produced will further increase. A preferred example of this invention is the following method. That is, after sterilizing tissue pieces collected from the plant body of a plant belonging to the family Murasaceae, such as roots, growing points, leaves, stems, seeds, etc., it is hardened with agar or layered on a solid medium of Smeyer-Skoog. After about 7 to 30 days at ~35°C, a part of the tissue piece is formed into a callus. When the callus thus obtained is subcultured, the growth rate gradually increases and stable callus is obtained. The callus is transferred to a liquid medium suitable for growth, such as a Linsmayer-Skoog liquid medium, and grown. There is a method of culturing callus in which the growth rate is further increased and stabilized in a liquid medium by adding it to the liquid medium of the present invention. In these methods, the initial concentration of callus in the liquid column can be varied within a wide range. Usually, 1 cup of liquid medium is used to grow callus for about 1 night to about 20 minutes.
It is desirable to add about 0.0 kg (fresh weight). In the tissue culture of the present invention, light is not necessarily necessary, and culturing in the dark is preferable for producing pigments such as shikonin. In addition, the culture temperature is about 1000 to about 35 qo, especially about 23
A temperature of C to about 2 is preferable; if it is less than about 1000, the callus growth rate is low, and if it exceeds about 35 qo, the callus growth rate is also low. In order to separate and collect naphthoquinone-based compounds from callus and liquid sludge, it is possible to employ a method such as extraction, which is applied to the natural product "Shikon" from a subculture. According to the present invention, since a liquid tower is used, it is possible to perform mass culture using a tank, and furthermore, as a method for separating callus from a culture medium, simple operations such as decantation and furnace filtration can be adopted, which is industrially advantageous. It is. Furthermore, callus multiplies rapidly, and naphthoquinone compounds such as shikonin can be reliably produced in large quantities. Comparative example Lithospermum eryth
rorhbonSekoro etZMc. ) root tissue pieces,
Purple callus was obtained by layering on Linsmeier-Skoog agar solid soil and using the static culture method. By culturing this callus in a Linsmeyer-Skoog liquid medium, the growth rate of the callus was increased. on the other hand,
White's modified liquid medium with the composition shown in Table 1 was placed in 100 Erlenmeyer flasks (as plant hormones, indole acetic acid 1 M, kinetin 1 O)
AM and sucrose as carbon source) 30
It was then sterilized at 120oC for 1 hour. To this liquid tower, 0.5 liters of fresh purple callus with an increased growth rate as described above was added and heated at 2500 for 14 days.
Swirl culture on a rotary shaker (amplitude 25 candles, 1
0 ratio pm). The cultured purple callus was collected by oven filtering, dried at 35°C for 2 hours, and its weight (dry weight) was measured to determine the growth rate of cultured cells per 1 volume of liquid medium. In addition, shikonin was separated from the obtained callus by extraction, its weight was measured, and the total amount of shikonin produced per liquid column was determined. The results are shown in Table 2. Examples 1 to 3 Comparative Examples were carried out in the same manner as in Comparative Examples, except that the specific components of the culture medium components of the liquid tower base were set to the values shown in Table 2. Table 1 Table 2