JPS6119236B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵によるＬ−バリンの生産方法に関
する。Ｌ−バリンの多数の生産方法が提案されて
いる。最善の結果は、その発育にイソロイシンを
必要とするブレビバクテリウム突然変異体とコリ
ネバクテリウム突然変異体を用いて得られてい
る。更に最近では、チアゾールアラニンに対する
耐性を主な特徴とするブレビバクテリウム突然変
異体とコリネバクテリウム突然変異体によるＬ−
バリンの生物学的生産方法が味の素(株)により発表
されている。しかし、この方法により生産される
Ｌ−バリンの量は少く、又多くは多量の他アミノ
酸（例えばＬ−スレオニン）の存在下で生産され
るので抽出コスト、精製コストが増加することが
発見されている。 Ｌ−バリンは人間及び他動物にとり不可欠であ
り、それゆえ、人間用医薬、獣医薬中に幅広く使
用できる。しかし、その用途を薬学分野に限定し
ないようにするためには、Ｌ−バリンを経済的に
かつ十分な純度で得なければならない。 今や、その発酵を追つて述べる新規微生物によ
り実施するならばかなりの量のＬ−バリンを発酵
液中に得ることができることが発見された。更
に、相当量のＬ−バリンを得るためには発酵培地
中の主要窒素源としてアンモニウムを酢酸塩の形
で使用することがかなり重要であることも発見さ
れた。以上に述べた本発明の特徴と利点とは、以
下の記載により一層明らかになるであろう。 本発明の目的は、その発育がシステイン酸とＬ
−スレオニンンの混合物、又はシステイン酸とＬ
−バリンとの混合物による共同阻止作用に服する
ことを特徴とするコリネバクテリウム グルタミ
カム（Corynebacterium glutamicum）菌株を使
用することにより達成される。これら菌株は、既
知の突然変異誘発剤を使用しての通常の突然変異
誘発法によりＬ−グルタミン酸生産菌株から得ら
れる。共同阻止作用とは、上記化合物、即ちシス
テイン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−スレオニンの各々は
該突然変異菌株の発育に対してほんのわずかな悪
影響しか持たず、かつこの影響力はその親菌株に
対するのと類似しているにもかかわらず、該菌株
がシステイン酸とＬ−バリンとの混合物、又はシ
ステイン酸とＬ−スレオニンとの混合物の存在下
では実際上は全く発育を示さないことを意味す
る。 該共同阻止現象は実施例１で例示する。 本発明で使用される菌株の別の特徴は、酢酸ア
ンモニウムが主要窒素源として使用されるならば
Ｌ−バリンの生産が非常に好ましい影響を受ける
ということである。 Ｌ−バリンの生産に対する酢酸アンモニウムの
非常に好ましい影響は実施例２に例示する。実施
例２には、Ｌ−バリンの生産量を高めるためには
少くとも25ｇ/の酢酸アンモニウムを培地に導
入する必要があることが示されている。 酢酸アンモニウムは単独ででも、又は他の通常
の窒素源（例えば他アンモニウム塩、尿素、精糖
工業で得られる糖密、コーン浸液、ペプトン、イ
ーストエキス、ミートエキス、様々な水解物等）
と混合しても使用できる。 更に詳細には、本発明の目的は、前記特性の全
てを示す変異株の解離により得られるコリネバク
テリウム グルタミカムＩ−026菌株（工業技術
院微生物工業技術研究所寄託番号4035）の使用に
より達成される。 コリネバクテリウム グルタミカム菌株は、次
の方法によりグルタミン酸生産菌株をＮ−メチ
ル、N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）により突然変異させて得られる菌株を栄
養培地＋Ｌ−バリンで変異させて単離された。

【表】 ↓
コリネバクテリウム グルタミカム I−026
初めのグルタミン酸生産菌株の特徴と比較して
のＩ−026菌株の特徴を表１に示す。この２菌株
の特徴的相異は、アセトイン生産テスト即ちホゲ
ス・プロスカウエルテストに対する反応にある。 炭素源としては炭水化物、グルコース、フルク
トース、マンノース、ガラクトース、シユクロー
ス、糖密等を単独で、又は混合して使用できる。 添加される無機化合物は、硫酸マグネシウム、
リン酸二水素カリウム、リン酸−水素カリウム、
硫酸鉄その他の普通に用いられる塩の様な必須無
機塩；マンガン、カルシウム等である。 ビタミンを加えることも、培地が全くの合成で
ある場合には特に必要である。 本発明の発酵は普通の好気性条件下で、例えば
撹拌し、滅菌空気を導入し、25〜37℃の、好まし
くは25〜33℃の温度で実施する。PHは５〜９、好
ましくは７〜8.5に維持する。培養中にPHが低下
する傾向があるので、例えばアンモニアを導入し
て調整する。 培養は一般には２〜５日間続ける。この間に相
当量のＬ−バリンが発酵液中に蓄積する。他のア
ミノ酸も見い出されるが、Ｌ−バリンの生産量に
比較すれば無視できる量である。 以下の実施例は、本発明の実施方法をより十分
に理解できるようにするための例示である。 実施例 １ 母菌株とその突然変異Ｉ−026菌株とを試験管
内での発育比較テストに付した。各管には５mlの
培地を含めた。塩溶液で一度洗つた菌株浮遊液を
接種した。 培地を回転撹拌機上で24時間30℃で培養させ
た。 10倍に希釈した後にベツクマン分光光度計
（UV24、10mmバツト）でその光学的濃密（650n
ｍ）を読み取つた。

【表】

【表】

【表】 実施例 ２ Ｌ−バリンの実験室生産 使用した炭水化物源＝糖密 傾斜栄養ゲロースで24時間、30℃で培養させた
Ｉ−026菌株を使用した。このゲロースの培養後
に、次の組成を持つ、予め培養した培地に接種し
た。

【表】

【表】 200r.p.m.の回転撹拌機上で30℃で８時間培養
後に次の生産培地に接種（接種割合６％）した。

【表】

【表】 200r.p.mの回転撹拌機上で30℃で72時間発酵
させた後に18.5ｇ/のＬ−バリンを得た。 実施例 ３ 使用される窒素源がＬ−バリンの生産に及ぼす
影響 再びＩ−026菌株を使用した。方法は、予備培
養段階までは実施例２の方法と同一だつた。生物
学的生産段階での方法も実施例２のものと同一だ
つた。使用した培地は、Ｌ−バリンの生産に対す
るその影響を調べた窒素源を除けば同一だつた。 72時間の培養後に得られたＬ−バリンの量は使
用した窒素源に依存した。その結果を次表に示
す。

【表】 実施例 ４ 実験条件は実施例２に記載のものと同様だつ
た。しかし、今回使用した窒素源はアンモニウム
塩の混合物、即ち酢酸塩と硫酸塩、であつた。次
表に酢酸塩と硫酸塩の各々の使用量に依存して得
られたＬ−バリンの量を示す（アンモニアの割合
は一定）。

【表】 実施例 ５ 予備培養段階までは実施例２と同一の方法を適
用した。生物学的生産も実施例２と同様に行つた
が、培地は次の組成のものを使用した。

【表】 72時間後に13ｇ/のＬ−バリンが得られた。 実施例 ６ Ｌ−バリンの半工業的生産 (1) 接種物の調製 コリネバクテリウムＩ−026菌株を傾斜栄養
ゲロースで24時間、30℃で培養した。６三角
コルベンに１の脱塩水当たり次の組成を持つ
1.5の培地に２本分の該ゲロースを接種し
た。

【表】 30℃で18時間、回転撹拌機上で培養させた。 (2) 予備培養 ４の脱塩水を含む10バツト中に、次表に
示す成分を溶解ないし懸濁させた。

【表】 培地を125℃で30分間オートクレーブ滅菌し
た。滅菌後のPHは5.70であり、これをアンモニ
アで7.80に調整した。 ついで320mlの前記接種物を接種した。PHは
７に等しくなつた。培養を600r.p.mで撹拌し
ながら、又1v／ｖ・分で通気しながら約14時
間行つた。PHは徐々に変化して、培養終了時に
は5.40に達した。 (3) 生産 生産培地は、１の脱塩水当たり次の組成を
持つていた。

【表】

【表】 小さな14発酵機をこの工程では使用した。 成分を７の水に溶解した。PHは7.20であつ
た。オートクレーブ滅菌を123℃で30分間行つ
た。滅菌後のPHは6.75だつた。これに700mlの
予備培養物を接種した。PHは7.30に上昇した。
培養を30℃で64時間行つた（撹拌＝600r.p.m.
、通気＝1v／ｖ・分）。PHは7.30から８（即ち
それに調整すべき値）に自然に上昇した。培養
中には糖密を供給して、３％という残留糖の割
合を維持した。その供給を停止して、発酵終了
時の残留糖の割合を１％未満とした。シリコー
ンをベースとした消泡剤を必要に応じて加え
た。 64時間後に373ｇのＬ−バリン、即ち発酵液
１当たり36.4ｇのＬ−バリンを得た。糖導入
量に対する割合として表される収率は約19％だ
つた。小量（発酵液１当たり合計で3.76ｇ。
その約50％は糖密によりもたらされた）のロイ
シンとイソロイシンとが発見された。

【表】

【表】 当然に、本発明は例示目的のみで示されたその
態様に決つして限定されるものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 発酵によるＬ−バリンの生産方法において、
   その発育がシステイン酸とＬ−バリンとの相乗作
   用混合物、又はシステイン酸とＬ−スレオニンと
   の相乗作用混合物により阻止されるコリネバクテ
   リウムグルタミカム突然変異株を、その発育に必
   要な少くとも１種の炭素資化源、少くとも１種の
   窒素資化源、有機栄養成分及び無機栄養成分を含
   む発酵培地で培養させることを特徴とする方法。 ２ 使用微生物が工業技術院微生物工業技術研究
   所に寄託番号4035で寄託されているコリネバクテ
   リウムグルタミカム菌である、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３ 炭素資化源として炭水化物を使用する、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 炭素資化源として糖密を使用する、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５ 窒素資化源として酢酸アンモニウムを使用す
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 酢酸アンモニウムの使用量が発酵培地の１
   当たり20〜35ｇを占める、特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ７ 発酵を５〜９のPH、25〜37℃の温度で行う、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 発酵を７〜8.5のPH、30〜33℃の温度で行
   う、特許請求の範囲第１項記載の方法。