JPS6127398B2

JPS6127398B2 -

Info

Publication number: JPS6127398B2
Application number: JP6129674A
Authority: JP
Inventors: Hisayasu Ishimaru; Mariko Kawabata
Original assignee: SANGYO KAGAKU KENKYU KYOKAI
Current assignee: SANGYO KAGAKU KENKYU KYOKAI
Priority date: 1974-05-28
Filing date: 1974-05-28
Publication date: 1986-06-25
Also published as: JPS50151894A

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、セフアロスポリンＣ類含有水溶液
からセフアロスポリンＣ類を有機塩基との付加物
として分離すること及び、その付加物から７−ア
ミノセフアロスポラン酸類を製造することに関す
る。セフアロスポリンＣ及びそれから導かれる７−
セフアロスポラン酸はセフアロスポリン系抗生物
質を製造する鍵化合物として有名で非常に重要な
ものである。この発明の目的の一つは、セフアロ
スポリンＣやデアセトキシセフアロスポリンＣを
含有する発酵液からセフアロスポリンＣ及びデア
セトキシセフアロスポリンＣを工業的に有利に分
離することである。他の目的は、新規なＮ−アシ
ルセフアロスポリンＣ類及びそれと有機塩基との
付加物を提供することにある。他の一つの目的
は、新規なＮ−アシルセフアロスポリンＣ類と有
機塩基との付加物から工業的に有利に７−アミノ
セフアロスポラン酸類を得ることにある。セフアロスポリンＣの分離法として、米国特許
第3467654号はセフアロスポリンＣの発酵ブロス
にアセトンを加え不純物を沈澱させ、その液か
らセフアロスポリンＣをアニオン交換樹脂上に吸
着させ、酸性緩衝液で樹脂からセフアロスポリン
Ｃを溶離することを記載している。又、特公昭48
−61494号は側鎖のアミノ基をハロゲン含有脂肪
酸でアシル化し、キノリンを加えてPH３付近でセ
フアロスポリンＣのハロゲン含有アシル化物をキ
ノリン酸として沈澱させ、セフアロスポリンＣを
抽出する方法を記載している。この後者の方法
は、従来のセフアロスポリンＣ含有水溶液から目
的物を回収する方法としてはかなり改善された方
法であるが、セフアロスポリンＣの濃度が１％又
はそれ以下ではキノリン塩の析出がみられず、収
率面でも満足できる方法とはいいがたい。この発明の発明者は、セフアロスポリンＣ類の
工業的発酵生産によつて得られる溶液の、セフア
ロスポリンＣ濃度が約0.3％程度であることか
ら、低濃度のセフアロスポリンＣ類含有液からで
も収率よく且つ経済的にセフアロスポリンＣ類を
回収する方法を種々に検討した結果この発明に到
達したものである。更に加えて一連の工程によつ
て７−アミノセフアロスポラン酸類を工業的に有
利に製造する方法を見出した。かくして、この発明は、セフアロスポリンＣ類
含有水溶液に一般式 R₁−Ｙ−R₂−COOH （式中R₁は低級アルキル基、Ｙは硫黄原子又はス
ルフイニル基、R₂は低級アルキレン基）で示さ
れる酸の反応性誘導体を反応させてＮ−アシルセ
フアロスポリンＣ類含有水溶液とし、次いでキノ
リン又はイソキノリンを添加し、酸性化剤を加え
てPHを約2.0〜3.5に調節すると共に必要に応じ無
機塩を加えて、Ｎ−アシルセフアロスポリンＣ類
の付加物を分離することよりなるセフアロスポリ
ンＣ類の抽出法が提供される。この発明においてセフアロスポリンＣ類含有水
溶液としては、セフアロスポリンＣ及び／又はデ
アセトキシセフアロスポリンＣを低濃度例えば約
0.3％以上約８％を含有する水溶液を用いること
ができる。このような水溶液には、セフアロスポ
リンＣ又はデアセトキシセフアロスポリンＣの発
酵液を過処理、アセトン処理、イオン交換樹脂
処理など当該技術分野で通常行われる部分精製を
行つたもの及び一部濃縮処理したものが含まれ
る。しかしながら、セフアロスポリンＣ類の濃度が
あまり高いと、以後処理で得られるＮ−アシルセ
フアロスポリンＣ類と有機塩基の付加物が泥状と
なり分離回収が困難となり好ましくない。一方あ
まり低濃度では、セフアロスポリンＣ類の回収収
率が低下する傾向がある。又上記したごとき発酵
液を濃縮て行くことは、多量の熱源や労力を要し
更にセフアロスポリンＣ類の分解の危険を伴うも
ので技術的にも経済的にも好ましくない。従つて
この発明の方法では、発酵液中に含まれるアシル
化に悪影響を及ぼす物質、例えばモノアミノモノ
カルボン酸を部分精製で除去したそのままの発酵
液あるいは最小限の濃縮を行なつたものを使用す
ることにより好ましい結果が得られる。このようなセフアロスポリンＣ類含有水溶液
と、一般式R₁−Ｙ−R₂−COOH（式中の各記号
は前記と同一意味）の酸の反応性誘導体とが反応
させられる。この一般式におけるR₁の低級アル
キル基には、炭素数１〜５の直鎖又はアルキル基
が含まれる。R₂の低級アルキレン基には、炭素
数１〜３の直鎖又は分枝状のアルキレン基が含ま
れる。このような酸の具体例としては次の化学式
で示されるようなものが挙げられる。更に上記の酸の反応性誘導体としては、セフア
ロスポリンＣ類の側査のアミノ基を約０〜30℃の
温度で、セフアロスポリンＣ類の濃度が低くても
充分アシル化し得る能力のあるものを用いること
が好ましい。又反応性誘導体の選択に当つては経
済面も考慮の上決められる。かくして、この発明
に用いられる好ましい反応性誘導体とは、上記一
般式で示した酸の二分子で形成される酸無水物、
上記一般式で示した酸と、酢酸、プロピオン酸、
α−メチルプロピオン酸、酪酸、α−エチル酪
酸、吉草酸、ピバリン酸、２−エチルヘキサン酸
のような低級脂肪酸、クロル炭酸メチル、クロツ
炭酸ブチル、クロル炭酸イソブチルのようなハロ
炭酸アルキルエステルなどとの混合酸無水物が挙
げられる。即ち、混合酸無水物の原料となるべき
酸は、上記の一般式で示した酸の解離恒数に比
し、少なくとも２分の１以下の好ましくは５分の
１程度の解離恒数を示す酸が好ましい例である。
その他酸ハライドなどであつてもよい。このアシル化反応は、約０〜30℃でPH約７〜
11、より好ましくは約８〜9.5で行なうのが望ま
しい。アシル化反応中PHは低下する傾向があるの
で、塩基を添加しつつ行なうか、緩衝剤を加えて
所望のPHを維持するのがよい。アシル化剤の使用
量は、発酵液の種類によつてことなるが、例えば
イオン交換樹脂で部分精製処理したものでは含有
セフアロスポリンC1モルに対して約1.5〜3.0モル
当量用いると好結果を与える。アセトン部分で精
製処理した発酵液に対しては、約４〜７倍モル当
量用いることが必要とされるであろう。ここで生成するＮ−アシルセフアロスポリンＣ
類はキノリン又はイソキノリンと処理し、水溶液
から析出させる。この有機塩基は、単品又は混合
物であつてもよく、それ程純品である必要はな
い。その添加量は、Ｎ−アシルセフアロスポリン
Ｃの１モルに対して約２〜５モルである。添加
後、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸などの酸性化剤で
PHを2.0〜3.5に調節し、混合物を０〜30℃通常10
〜20℃で約１時間撹拌するとＮ−アシルセフアロ
スポリンＣ類と有機塩基が沈澱する。このものは
付加物と考えられるもので通常結晶状である。な
おこの際、生成物が溶液中の濃度、溶液中の他の
成分との関係などにより沈澱し難い際には硫酸ナ
トリウム、塩化ナトリウムなどの無機塩類を適宜
加えるとよい。次いでこれを通常の分離手段例え
ば遠心分離、過などによつて分離し、水、次い
で酢酸エチルのような有機溶液で洗浄し乾燥すれ
ばよい。かくして得られたＮ−アシルセフアロスポリン
Ｃ類と有機塩基との付加物は次のようにして７−
セフアロスポラン酸類に導かれる。即ち、先づ分離した付加物はその側鎖及び４位
のカルボキシル基を易加水分解性のエステル又は
混合酸無水物の形に導いて保護する。そのための
試剤としては、一般式

【式】（式中Ｘはハロゲン原子、R₃は低及アルキル基又は低級アル
コキシ基、R₄はハロゲン原子又は低級アルコキ
シ基、但しR₃とR₄とが共に低級アルコキシ基の
ときは、ｐと共に環を形成してもよい。）で示さ
れるリンハロゲン化合物、又は一般式

【式】（式中Ｘはハロゲン原子、R₅ は低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハロゲ
ン原子、R₆及びR₇は低級アルキル基又は低級ア
ルコキシ基）で示される珪素ハロゲン化合物が挙
げられる。これらのリン又は珪素ハロゲン化合物
の中で、好ましい化合物の具体例としては

【式】

【式】 CH₃OPCl₂、C₂H₅OPCl₂、C₄H₉OPCl₂、
CH₃PCl₂、C₄H₉PCl₂；（CH₃）₃SiCl、CH₃
（CH₃O）₂SiCl、（CH₃O）₃SiCl、CH₃O（CH₃）
SiCl、（CH₃）₂SiCl₂、（CH₃O）₂SiCl₂、CH₃
（CH₃O）SiCl₂などが挙げられる。この中で更に
好ましい化合物としては、

【式】

【式】（CH₃）₃Cl、CH₃ （CH₃O）₂SiCl、CH₃O（CH₃）₂SiCl、
（CH₃O）₃SiClなどが挙げられる。その他、炭素ハ
ロゲン化合物であるCOCl₂、CH₃COClなどを試
剤として用いてもよい。要するに、この発明にお
いて、Ｎ−アシルセフアロスポリンＣ類のカルボ
キシル基の保護は、次のイミノハライド形成反応
及びイミノエーテル形成反応時に反応に関与しな
いようにするために行われるものであつて、保護
基の種類は特に限定されない。しかしながら、易
加水分解性、試剤のコスト、処理のし易さなどを
考慮して上記のごときものから選択することが望
ましい。このカルボキシル基の保護を行う反応は、塩化
メチレン、塩化エチレン、クロロホルムのような
不活性有機溶媒中無水の条件下でトリエチルアミ
ン、キノリン、ピリジン、ジメチルアニリン及び
これらの同族体のごとき有機塩基を添加して行わ
れる。次いで上記の反応生成物にイミノハライド形成
剤例えば五塩化燐、オキシ塩化燐、ホスゲンを反
応させる。この反応によつて、Ｎ−アシルセフア
ロスポリンＣ類の７位及び5′位の酸アミド結合を
イミノハライドに変換させる。その後上記反応液にメタノール、プロパノー
ル、ブタノール、アミルアルコール、エチレング
リコール、プロピレングリコール、エチレンクロ
ルヒドリン、アルコキシエタノールなどの低級ア
ルコール類を添加する。それによつてイミノハラ
イドをイミノエーテルに変換させる。以上の二つの反応は、カルボキシル基の保護を
行つた反応液そのまゝが用いられる。上記で得られたイミノエーテルは、水による加
水分解反応に付し、所望の７−セフアロスポラン
酸に導かれる。この加水分解は酸性で行われる
が、原料にＮ−アシルセフアロスポリンＣを用い
たときにPH２〜３で行うことが望ましい。Ｎ−アシルデアセトキシセフアロスポリンＣの
場合は、PH１程度でもよい。加水分解を行つた反
応液を７−セフアロスポラン酸類の等電点に調節
すれば、所望物質が沈澱として得られる。この沈
澱は常法に従つて分離、乾燥させる。上記の方法
によつて所望物質は極めて高収率且つ高純度で得
ることができる。次にこの発明の方法を実施例によつて説明する
が、この発明はこれに限定されるものではない。実施例１１ml当りのセフアロスポリンC30mg（UV定量
法による）を含有する“樹肪溶離液”20mlにホウ
酸ナトリウム約0.2ｇを加え希水酸化ナトリウム
液でPH9.0に調整し、これにヒバリン酸クロリド
とメチルチオ酢酸のＮ−メチルホルモリン塩から
作つた混合酸無水物（セフアロスポリンC1モル
当り2.5当量を含む）の酢酸エチル溶液５mlを加
え、０〜10℃で激しく撹拌する。反応液は、希水酸化ナトリウム液でPH9.0に調
整しながら約１時間反応させる。反応終了は
TLC（ベンゼン：酢酸：ピリジン：水＝15：
３：10：12、発色剤は沃化アジド溶液噴霧後加
熱）で確認し、希硫酸PH５〜６に調整する。有機層を除き水層は30mlに希釈する（セフアロ
スポリンＣ換算２％溶液）。この溶液15mlにキノ
リン0.43ml（セフアロスポリンC1モル当り５当
量）を加え、10℃で撹拌しながら希硫酸でPH3.0
に調整する。まもなく結晶が析出し始める。１時間撹拌後、
結晶を集め少量の氷水で洗い、更に酢酸エチルで
洗つて、１夜真空乾燥器で乾燥する。 IR 1790cm^-1（β−ラクタム）、UVλ_nax264ｍ
μ。450mg（UV定量法により97％純度）。収率98
％実施例２実施例１に従つて行つたセフアロスポリンＣの
３％溶液からの反応液（セフアロスポリンＣ換算
２％液）各15mlをとり下記のごとく希釈した濃度
の溶液を作り、各々にキノリン0.43ml（セフアロ
スポリンC1モル当り５当量）を加え実施例１に
従い処理する。（カツコ内は、５％食塩水で希釈
したさいの数値を示す。）

【表】実施例３１ml当りセフアロスポリンC15mg（UV定量法
による）を含有有する“樹脂溶離液”20mlに、リ
ン酸第２ナトリウム約0.2ｇを加え、希水酸化ナ
トリウム液でPH9.0に調整し、これにメチルチオ
酢酸カリウム塩とプロピオン酸クロリド及び微量
のＮ−メチルホルモリンとから作つた混合酸無水
物（セフアロスポリンC1モル当り2.5当量を含
む）の酢酸エチル溶液５mlを加え、０〜10℃で激
しく撹拌する。反応液は希水酸化ナトリウム液で
PH9.0に調整しながら１時間反応させる。反応混
合物はPH５〜６に調整する。有機層を分け水層は
５％の食塩水を加えて30mlに希釈する（セフアロ
スポリンＣ換算１％溶液）。この溶液15mlにイソキノリン0.22ml（セフアロ
スポリン１モル当り５当量）を加え、10℃で撹拌
しながら希硫酸でPH3.0に調整する。まもなく結
晶が析出し始める。１時間撹拌後結晶を集め、少
量の氷水ついで酢酸エチルで洗い、１夜真空中で
乾燥する。純度97％（UV定量法による）のＮ−
メチルチオアセチル−セフアロスポリンＣのイソ
キノリン付加物を228mg（収率97％）で得た。UV
λ_nax263ｍμ、反応液の残りの15mlは５％食塩水
で30ml（セフアロスポリンＣ換算0.5％溶液）に
希釈し、キノリン0.22mlを加え、PH3.0に調整し
５〜10℃で撹拌する。まもなく結晶が析出する。
１時間後結晶を集め氷水、酢酸エチルの順に洗い
真空で乾燥する。純度97％のＮ−メチルチオアセ
チル−セフアロスポリンＣのキノリン付加物を
226mg得た。実施例４セフアロスポリンＣを10mg/mlの割合で含有す
るように濃度を調整した“樹脂溶離液”10mlにホ
ウ酸ナトリウム約0.04ｇを加え、希水酸化ナトリ
ウム液でPH9.0に調整し、これにメチルチオ酢酸
カリウム塩と微量のＮ−メチルホルモリンおよび
アセチルクロリドから作つた混合酸無水物（セフ
アロスポリンC1モル当り2.5当量を含む）の酢酸
エチル溶液３mlを加え、10〜20℃で激しく撹拌す
る。反応液は希水酸化ナトリウム液でPH9.0に調
整しながら約１時間反応させる。反応混合物にキノリン0.1mlを加え、撹拌しな
がら10％リン酸でPH3.0に調整する。まもなく結
晶が析出し始める。約１時間撹拌後、結晶を集め
少量の氷水、ついで酢酸エチルで洗い、１夜真空
中で乾燥する。Ｎ−メチルチオアセチル−セフア
ロスポリンＣのキノリン付加物145mg（純度98
％）を得た。 IR、UVは標品と一致した。上記混合酸無水物の代りに無水酢酸を用いて、
Ｎ−アセチル化を行つた場合には、キノリン付加
物の結晶は全く得られなかつた。実施例５実施例４におけるメチルチオ酢酸と酢酸との混
合酸無水物の代りに、メチルチオアセチルクロリ
ドとメチルチオ酢酸のＮ−メチル−モルホリン塩
から作つた酸無水物の酢酸エチル溶液を用い、実
施例４に従つて処理し、Ｎ−メチルチオアセチル
セフアロスポリンＣのキノリン付加物150mg（純
度98％）を得た。実施例６実施例４におけるメチルチオ酢酸と酢酸との混
合酸無水物の代りに、エチルチオ酢酸カリウム塩
とプロピオン酸クロリドおよび微量のＮ−メチル
モルホリンとから作つた混合酸無水物の酢酸エチ
ル溶液を用い、実施例４に従つて処理し、Ｎ−エ
チルチオアセチル−セフアロスポリンＣのキノリ
ン付加物125mg（純度96％）を得た。 IR 1790cm^-1、UVλ_nax263ｍμ。実施例７実施例４におけるメチルチオ酢酸と酢酸の混合
酸無水物の代りに、(a)イソプロピルチオ酢酸カリ
ウム塩とピバリン酸クロリドと微量のＮ−メチル
モルホリンから作つた混合酸無水物、(b)イソブチ
ルチオ酢酸カリウム塩とピバリン酸クロリドと微
量のＮ−メチルホルモリンから作つた混合酸無水
物、(c)α−メチルチオプロピオン酸カリウム塩と
プロピオン酸クロリドと微量のＮ−メチルモルホ
リンから作つた混合酸無水物、(b)メチルスルフイ
ニル酢酸カリウム塩とピバリン酸クロリドと微量
のＮ−メチルモルホリンから作つた混合酸無水
物、のそれぞれの酢酸メチル溶液を用いて実施例
４に従つて処理し、それぞれ次のものを得た。 (a) Ｎ−イソプロピルチオアセチル−セフアロス
ポリンＣのキノリン付加物108mg（純度95％）
UVλ_nax263ｍμ、 (b) Ｎ−イソブチルチオアセチル−セフアロスポ
リンＣのキノリン付加物105mg（純度96％）、
UVλ_nax263ｍμ、 (c) Ｎ−α−メチルチオプロピオニル−セフアロ
スポリンＣのキノリン付加物134mg（純度97
％）UVλ_nax263ｍμ、 (d) Ｎ−メチルスルフエニルアセチル−セフアロ
スポリンＣのキノリン付加物138mg（純度94
％）UVλ_nax263ｍμ。実施例８実施例４におけるメチルチオ酢酸と酢酸の混合
酸無水物の代りに、(a)β−メチルチオプロピオン
酸カリウム塩とピバリン酸クロリドおよび微量の
Ｎ−メチルチオモルホリンから作つた混合酸無水
物(b)β−エチルチオプロピオン酸カリウム塩とピ
バリン酸クロリドおよび微量のＮ−メチルモルホ
リンから作つた混合酸無水物、のそれぞれの酢酸
エチル溶液を用いて、実施例４に従つて処理して
それぞれ次のものを得た。 (a) Ｎ−β−メチルチオプロピオニル−セフアロ
スポリンＣのキノリン付加物100mg（純度96
％）IR 1790cm^-1、UVλ_nax263ｍμ、 (b) Ｎ−β−エチルチオプロピオニル−セフアロ
スポリンＣのキノリン付加物82mg（純度96％）
IR 1790cm^-1、UVλ_nax263ｍμ。実施例９乾燥したＮ−メチルチオアセチル−セフアロス
ポリンＣのキノリン付加物0.63ｇをトリエチルア
ミン0.3ｇ、ジメチルアニリン0.4ｇを乾燥塩化メ
チレン10mlに加え、０℃で撹拌しながらトリメチ
ルシリルクロリド0.43ｇを含む塩化メチレン溶液
を滴下する。約30分後透明溶液を−30℃に冷し、Pcl₅ 0.5ｇ
の微粉末を加え、−20℃〜−５℃で２時間撹拌を
つづける。再び−30℃に冷し、無水のイソブタノ
ール３mlを滴下し、−30℃〜−10℃で２時間撹拌
後１夜−20℃に保つ。これに氷水３mlを加え、PH
2.0〜2.5に保つように炭酸アンモニウム塩で調整
しながら30分撹拌する。ついで徐々にPHをあげ等
電点のPH3.5に調整し、１夜氷室におく。析出し
た結晶を遠心分離し、少量の冷60％アセトン水さ
らにアセトンで洗い乾燥する。７−アミノセフアロスポラン酸0.23ｇ（84％）
を得た。純度98％（UV定量法による）。IR 1800
cm^-1、UVλ_nax262ｍμ。実施例 10 実施例９におけるトリメチルシリルクロリドの
代りに(a)２−クロル−１・３・２−ジオキサホス
ホラン0.5ｇ、(b)２−クロル−４−メチル−１・
３・２−ジオキサホスホラン0.55ｇ、(c)トリメト
キシシリルクロリド0.63ｇ、(d)ジメチルメトキシ
シリルクロリド0.5ｇをそれぞれ用い、実施例９
に従い処理し、(a)0.22ｇ、(b)0.24ｇ、(c)0.23ｇ、
(d)0.23ｇのそれぞれの収量で、７−アミノセフア
ロスポラン酸を得た。実施例 11 実施例９におけるイソブチルアルコールの代り
に、(a)無水メタノール、(b)ｎ−ブタノールをそれ
ぞれ用い、実施例９に従い処理し、(a)0.25ｇ、(b)
0.21ｇのそれぞれの収量で７−アミノセフアロス
ポラン酸を得た。実施例 12 セフアロスポリンＣを10mg/mlの割合で含有す
るように濃度を調整した“樹脂溶離液”20mlにホ
ウ酸ナトリウム約0.08ｇを加え、希水酸化ナトリ
ウム液でPH9.0に調整する。この溶液にメチルチ
オ酢酸カリウム塩と微量のＮ−メチルモルホリン
およびクロリ炭酸エチルから作つた混合酸無水物
（セフアロスポリンC1モル当り４当量を含む）の
酢酸エチル溶液５mlを加え、０〜５℃で激しく撹
拌する。反応液は、希水酸化ナトリウム液でPH
9.0に調整しながら約１時間反応させる。反応液にキノリン0.2mlを加え、撹拌しながら
PH3.0に調整する。塩化ナトリウムを飽和し、約
１時間撹拌後、結晶を集め、氷水、酢酸エチルで
順次洗い、乾燥する。Ｎ−メチルチオアセチル−セフアロスポリンＣ
のキノリン付加物260mg（純度97％）を得た。

Claims

【特許請求の範囲】１セフアロスポリンＣ類含有水溶液に、一般式 R₁−Ｙ−R₂−COOH （式中R₁は低級アルキル基、Ｙは硫黄原子又はス
ルフイニル基、R₂は低級アルキレン基）で示さ
れる酸の反応性誘導体を反応させてＮ−アシルセ
フアロスポリンＣ類含有水溶液とし、次いでキノ
リン又はイソキノリンを添加し、酸性化剤を加え
てPHを約2.0〜3.5に調節すると共に必要に応じ無
機塩を加えて、Ｎ−アシルセフアロスポリンＣ類
の付加物を分離することを特徴とするセフアロス
ポリンＣ類の抽出法。