JPS6137917B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6137917B2 JPS6137917B2 JP53130437A JP13043778A JPS6137917B2 JP S6137917 B2 JPS6137917 B2 JP S6137917B2 JP 53130437 A JP53130437 A JP 53130437A JP 13043778 A JP13043778 A JP 13043778A JP S6137917 B2 JPS6137917 B2 JP S6137917B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- phage
- coli
- genetic information
- coat protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規組み換え体DNAの作成法に関す
る。遺伝子操作の分野は、一方ではプラスミド
（plasmid）、バクテリオフアージ
（bacteriophage）などのレプリコン（replicon）
の遺伝学的、化学的性質の研究が急速に進展した
ことと、他方でDNA（デオキシリボ核酸）関係
の酵素、特にDNA上のヌクレオチド配列を認識
して特異的な切断を起こすエンドヌクレアーゼ
（制限酵素）とDNAリガーゼの研究の進歩がちよ
うどタイミングよく結びついた結果可能になつた
新領域である。
る。遺伝子操作の分野は、一方ではプラスミド
（plasmid）、バクテリオフアージ
（bacteriophage）などのレプリコン（replicon）
の遺伝学的、化学的性質の研究が急速に進展した
ことと、他方でDNA（デオキシリボ核酸）関係
の酵素、特にDNA上のヌクレオチド配列を認識
して特異的な切断を起こすエンドヌクレアーゼ
（制限酵素）とDNAリガーゼの研究の進歩がちよ
うどタイミングよく結びついた結果可能になつた
新領域である。
従来、種々の遺伝子の組み換え方法が提案さ
れ、その例としては、たとえばλ（ラムダ）フア
ージDNAにシヨウジヨウバエのDNA断片を組み
換える方法は知られているが、組み換えられる場
所がフアージの溶原化に必要な遺伝情報を持つ部
分であるので、出来た混成DNAは宿主DNAに組
み込ませることが出来ない。そのため、実際の使
用に際しては、たえず宿主細胞と該フアージを用
意しておかねばならないが、該フアージの保存等
に問題があり、またプラスミドに特定の酵素蛋白
の遺伝情報を組み込んで宿主に感染させた場合に
は、特定の酵素が常に生産される状態にあり、保
存時においても酵素を作り続けるように働くた
め、宿主の代謝は著しく撹乱され、これを補償す
る二次的な変異がいろいろと誘起される。たとえ
ば、感染したプラスミドに変異を生じてプラスミ
ドのコピー数を減じるように変わつたものや、酵
素の機能や合成能を低下させるような変異を獲得
したものや、あるいは他の代謝系を変えてひずみ
を補正するような変異体が出現し、実際にはこの
二次的に起こる変異に左右されることが多く、遺
伝子の組み換え操作はまだ充分でない。
れ、その例としては、たとえばλ（ラムダ）フア
ージDNAにシヨウジヨウバエのDNA断片を組み
換える方法は知られているが、組み換えられる場
所がフアージの溶原化に必要な遺伝情報を持つ部
分であるので、出来た混成DNAは宿主DNAに組
み込ませることが出来ない。そのため、実際の使
用に際しては、たえず宿主細胞と該フアージを用
意しておかねばならないが、該フアージの保存等
に問題があり、またプラスミドに特定の酵素蛋白
の遺伝情報を組み込んで宿主に感染させた場合に
は、特定の酵素が常に生産される状態にあり、保
存時においても酵素を作り続けるように働くた
め、宿主の代謝は著しく撹乱され、これを補償す
る二次的な変異がいろいろと誘起される。たとえ
ば、感染したプラスミドに変異を生じてプラスミ
ドのコピー数を減じるように変わつたものや、酵
素の機能や合成能を低下させるような変異を獲得
したものや、あるいは他の代謝系を変えてひずみ
を補正するような変異体が出現し、実際にはこの
二次的に起こる変異に左右されることが多く、遺
伝子の組み換え操作はまだ充分でない。
そこで本発明者らは、上記諸欠点を解消するた
め、バクテリオフアージを用いて自己複製に関与
するDNA部分に損傷を与えずしてその部分のエ
ンドクレアーゼ開裂部位を消去し、そしてコート
蛋白質の合成（製造）に関与するDNA部分に
「エンドヌクレアーゼ開裂部位（感受性）」を持た
せる方法を鋭意研究した結果、エンドヌクレアー
ゼによる開裂部位が全く存在しないフアージとそ
れと同種又は類縁でしかも目的とするDNA部分
又は類似の部分に開裂部位をもつフアージとの雑
種をつくることにより、目的とするDNA領域に
エンドヌクレアーゼ開裂部位を残し、遺伝子操作
における遺伝子のクローン化に際し、自己複製可
能な混成DNA分子の作成を効率よく、容易に可
能ならしめることの新知見を得、この知見に基づ
いて新種バクテリオフアージの作成に成功した。
め、バクテリオフアージを用いて自己複製に関与
するDNA部分に損傷を与えずしてその部分のエ
ンドクレアーゼ開裂部位を消去し、そしてコート
蛋白質の合成（製造）に関与するDNA部分に
「エンドヌクレアーゼ開裂部位（感受性）」を持た
せる方法を鋭意研究した結果、エンドヌクレアー
ゼによる開裂部位が全く存在しないフアージとそ
れと同種又は類縁でしかも目的とするDNA部分
又は類似の部分に開裂部位をもつフアージとの雑
種をつくることにより、目的とするDNA領域に
エンドヌクレアーゼ開裂部位を残し、遺伝子操作
における遺伝子のクローン化に際し、自己複製可
能な混成DNA分子の作成を効率よく、容易に可
能ならしめることの新知見を得、この知見に基づ
いて新種バクテリオフアージの作成に成功した。
本発明はこの新種バクテリオフアージのコート
蛋白質の合成に関与するDNA部分を、目的とす
る遺伝情報を有するDNAに置き換え、目的とす
る遺伝情報に基づき、コート蛋白質の代りに有用
な蛋白質類を作成するか又は新規組み換え体
DNAを大量に合成させることができる新規組み
換え体DNAの作成法に関する。
蛋白質の合成に関与するDNA部分を、目的とす
る遺伝情報を有するDNAに置き換え、目的とす
る遺伝情報に基づき、コート蛋白質の代りに有用
な蛋白質類を作成するか又は新規組み換え体
DNAを大量に合成させることができる新規組み
換え体DNAの作成法に関する。
即ち、本発明はテンペレートフアージのDNA
の複製及び宿主染色体への組み込みに関与する
DNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもた
ず、少なくともコート蛋白質合成の遺伝情報をも
つDNA部分に開裂部位を有するフアージDNA及
び目的とする遺伝情報を有するDNAをエンドヌ
クレアーゼで切断し、両者の混合液にDNAリガ
ーゼを加え、該混合液からコート蛋白質合成の遺
伝情報をもつDNA部分が目的とする遺伝情報を
もつDNA断片に組み換えられ、コート蛋白質生
産能を欠失したフアージDNAを採取することを
特徴とする新規組み換え体DNAの作成法であ
り、本発明によつて得られた組み換え体DNAは
宿主染色体への組み込みが可能であり、又宿主に
組み込まれた組み換え体DNAは誘発により大量
に複製させることができる。また新規組み換え体
DNAはコート蛋白質生産能を欠失しているので
活性型フアージとはならないためフアージによる
汚染がなく、更に目的とする遺伝情報をもつ
DNA断片として従来よりも分子量の大きいもの
を組み換えることができる。
の複製及び宿主染色体への組み込みに関与する
DNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもた
ず、少なくともコート蛋白質合成の遺伝情報をも
つDNA部分に開裂部位を有するフアージDNA及
び目的とする遺伝情報を有するDNAをエンドヌ
クレアーゼで切断し、両者の混合液にDNAリガ
ーゼを加え、該混合液からコート蛋白質合成の遺
伝情報をもつDNA部分が目的とする遺伝情報を
もつDNA断片に組み換えられ、コート蛋白質生
産能を欠失したフアージDNAを採取することを
特徴とする新規組み換え体DNAの作成法であ
り、本発明によつて得られた組み換え体DNAは
宿主染色体への組み込みが可能であり、又宿主に
組み込まれた組み換え体DNAは誘発により大量
に複製させることができる。また新規組み換え体
DNAはコート蛋白質生産能を欠失しているので
活性型フアージとはならないためフアージによる
汚染がなく、更に目的とする遺伝情報をもつ
DNA断片として従来よりも分子量の大きいもの
を組み換えることができる。
以下本発明について具体的に説明する。
一般にバクテリオフアージは多かれ少なかれ宿
主の機能に依存し増殖しているわけであるが、宿
主の染色体に独立して増殖できるレプリコンであ
り、自律的状態にあるが、本発明に使用されるバ
クテリオフアージとしては宿主細胞に感染した場
合、宿主細胞のDNAにフアージDNAが組み込ま
れる性質（溶原性）を有するテンペレートフアー
ジ（Temperate phage）が用いられる。このテ
ンペレートフアージとしてはλ系（lambdoid）
が好ましく、λ系フアージとしてはλ（ラムダ）
（IFO 20016）、434（IFO 20018）、82（IFO
20019）、φ80（IFO 20020）、φ170（IFO
20021）などが挙げられ、また宿主DNAに組み込
まれたこれらフアージDNA、たとえば大腸菌
（E.coli）W3110に溶原化されたφ80〔大腸菌
（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110（φ
80）（ATCC 31277）〕、大腸菌（E.coli）W3350
に溶原化されたλcI857〔大腸菌（E.coli）K12ス
トレイン（strain）W3350（λcI857）（ATCC
31278〕なども用いられる。
主の機能に依存し増殖しているわけであるが、宿
主の染色体に独立して増殖できるレプリコンであ
り、自律的状態にあるが、本発明に使用されるバ
クテリオフアージとしては宿主細胞に感染した場
合、宿主細胞のDNAにフアージDNAが組み込ま
れる性質（溶原性）を有するテンペレートフアー
ジ（Temperate phage）が用いられる。このテ
ンペレートフアージとしてはλ系（lambdoid）
が好ましく、λ系フアージとしてはλ（ラムダ）
（IFO 20016）、434（IFO 20018）、82（IFO
20019）、φ80（IFO 20020）、φ170（IFO
20021）などが挙げられ、また宿主DNAに組み込
まれたこれらフアージDNA、たとえば大腸菌
（E.coli）W3110に溶原化されたφ80〔大腸菌
（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110（φ
80）（ATCC 31277）〕、大腸菌（E.coli）W3350
に溶原化されたλcI857〔大腸菌（E.coli）K12ス
トレイン（strain）W3350（λcI857）（ATCC
31278〕なども用いられる。
次にエンドヌクレアーゼとしては、DNA鎖の
特定の部位を認識することができ、その認識部位
のDNA二重らせんを千鳥足状の付着端
（cohesiveends）を生じさせように切断を行なう
特異性の極めて高いエンドヌクレアーゼが好まし
く、この酵素としては制限酵素が好適であり、具
体的にはEcoRI、BamI、Hind 等が挙げられ
る。なお制限酵素は生化学工業又はベーリンガ
ー・マンハイム・山之内より入手できる。
特定の部位を認識することができ、その認識部位
のDNA二重らせんを千鳥足状の付着端
（cohesiveends）を生じさせように切断を行なう
特異性の極めて高いエンドヌクレアーゼが好まし
く、この酵素としては制限酵素が好適であり、具
体的にはEcoRI、BamI、Hind 等が挙げられ
る。なお制限酵素は生化学工業又はベーリンガ
ー・マンハイム・山之内より入手できる。
まず本発明に用いられるDNAの複製及び宿主
染色体への組み込みに関与するDNA部分にエン
ドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少なくともコ
ート蛋白質合成の遺伝情報をもつDNA部分にエ
ンドヌクレアーゼ開裂部位を有するバクテリオフ
アージの作成であるが、DNAの複製及び宿主染
色体への組み込みに関与するDNA部分にエンド
ヌクレアーゼ開裂部位をもたないエンドヌクレア
ーゼ抵抗性のフアージ、たとえば制限酵素に全く
開裂されないエンドヌクレアーゼ抵抗性のフアー
ジ（以下、単にエンドクレアーゼ抵抗性のフアー
ジと称する）と少なくともコート蛋白質製造の遺
伝情報をもつDNA部分にエンドヌクレアーゼ開
裂部位を有するフアージ（以下、単にエンドヌク
レアーゼ感受性のフアージと称する）と掛け合わ
せることにより得ることができる。
染色体への組み込みに関与するDNA部分にエン
ドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少なくともコ
ート蛋白質合成の遺伝情報をもつDNA部分にエ
ンドヌクレアーゼ開裂部位を有するバクテリオフ
アージの作成であるが、DNAの複製及び宿主染
色体への組み込みに関与するDNA部分にエンド
ヌクレアーゼ開裂部位をもたないエンドヌクレア
ーゼ抵抗性のフアージ、たとえば制限酵素に全く
開裂されないエンドヌクレアーゼ抵抗性のフアー
ジ（以下、単にエンドクレアーゼ抵抗性のフアー
ジと称する）と少なくともコート蛋白質製造の遺
伝情報をもつDNA部分にエンドヌクレアーゼ開
裂部位を有するフアージ（以下、単にエンドヌク
レアーゼ感受性のフアージと称する）と掛け合わ
せることにより得ることができる。
エンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージは、たと
えば次のようにして得ることができる。λ系フア
ージを制限酵素をもつている宿主ともたない宿主
に交互に培養すると、制限酵素の作用を受けるフ
アージは死滅し、制限酵素の作用を受けにくい変
異株が次第に増加する。このような微生物的濃縮
法によりついには制限酵素の作用を全く受けない
（制限酵素によりDNA鎖が全く開裂されない）
DNAをもつフアージ（制限酵素抵抗性フアー
ジ）を得ることができる。
えば次のようにして得ることができる。λ系フア
ージを制限酵素をもつている宿主ともたない宿主
に交互に培養すると、制限酵素の作用を受けるフ
アージは死滅し、制限酵素の作用を受けにくい変
異株が次第に増加する。このような微生物的濃縮
法によりついには制限酵素の作用を全く受けない
（制限酵素によりDNA鎖が全く開裂されない）
DNAをもつフアージ（制限酵素抵抗性フアー
ジ）を得ることができる。
また制限酵素の切断部位を部分的に欠失させた
後、微生物的濃縮法を用いることにより、より早
く抵抗性フアージを得ることができる。例えば
DNA上の制限酵素の切断部位を部分的に消去す
る方法としてはフアージの切断部位を含むDNA
部分を欠失させた欠失変異株を分離することであ
る。即ちフアージの生存に不必要なDNA部分に
制限酵素の切断部位が存在する場合、そのDNA
部分が欠失した変異株を分離することにより、そ
のフアージの制限酵素に対する抵抗性を増加させ
ることができる。欠失変異株は、切断部位を含む
DNA部分が欠失しているため比重が軽く又熱安
定性がよいので、この性質を利用して通常のフア
ージ培養液から分離できる。たとえば培養液に
CsCl（塩化セシウム）を添加して遠心分離する
CsCl密度こう配遠心法又はフアージ培養液を60
℃位に加熱して生き残つたフアージを分離するこ
とにより欠失変位株を得ることができる。この変
異株を使用して制限酵素をもつている宿主ともた
ない宿主に交互に培養する微生物的濃縮法により
制限酵素の作用を全く受けないDNAをもつフア
ージをより早く得ることができる。
後、微生物的濃縮法を用いることにより、より早
く抵抗性フアージを得ることができる。例えば
DNA上の制限酵素の切断部位を部分的に消去す
る方法としてはフアージの切断部位を含むDNA
部分を欠失させた欠失変異株を分離することであ
る。即ちフアージの生存に不必要なDNA部分に
制限酵素の切断部位が存在する場合、そのDNA
部分が欠失した変異株を分離することにより、そ
のフアージの制限酵素に対する抵抗性を増加させ
ることができる。欠失変異株は、切断部位を含む
DNA部分が欠失しているため比重が軽く又熱安
定性がよいので、この性質を利用して通常のフア
ージ培養液から分離できる。たとえば培養液に
CsCl（塩化セシウム）を添加して遠心分離する
CsCl密度こう配遠心法又はフアージ培養液を60
℃位に加熱して生き残つたフアージを分離するこ
とにより欠失変位株を得ることができる。この変
異株を使用して制限酵素をもつている宿主ともた
ない宿主に交互に培養する微生物的濃縮法により
制限酵素の作用を全く受けないDNAをもつフア
ージをより早く得ることができる。
又欠失変異株を分離した後、微生物的濃縮法に
よりエンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージを得た
場合、欠失したDNA部分に宿主染色体への組み
込みに関与する部分が含まれており、その欠失し
たDNA部分が必要な場合には欠失変異株作成時
に使用した親株の、たとえば免疫性に関与する遺
伝情報が変異した株、たとえば免疫性を示すため
の蛋白質を作れなくなつたか、あるいは免疫性を
示すための蛋白質の性質が変わり免疫性を示さな
いか若しくは特定の条件下で免疫性を示す株と上
記の欠失変異株より得たエンドヌクレアーゼ抵抗
性のフアージを掛け合わせ、CsCl（塩化セシウ
ム）密度こう配遠心法により重いフアージ部分を
採取し、これより免疫性が変異していない株を分
離することによりDNA複製及び宿主染色体への
組み込みに関与するDNA部分を有し、欠失して
いた部分が組み込まれ、その部分にのみエンドヌ
クレアーゼ開裂部位を有するフアージを得る。
よりエンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージを得た
場合、欠失したDNA部分に宿主染色体への組み
込みに関与する部分が含まれており、その欠失し
たDNA部分が必要な場合には欠失変異株作成時
に使用した親株の、たとえば免疫性に関与する遺
伝情報が変異した株、たとえば免疫性を示すため
の蛋白質を作れなくなつたか、あるいは免疫性を
示すための蛋白質の性質が変わり免疫性を示さな
いか若しくは特定の条件下で免疫性を示す株と上
記の欠失変異株より得たエンドヌクレアーゼ抵抗
性のフアージを掛け合わせ、CsCl（塩化セシウ
ム）密度こう配遠心法により重いフアージ部分を
採取し、これより免疫性が変異していない株を分
離することによりDNA複製及び宿主染色体への
組み込みに関与するDNA部分を有し、欠失して
いた部分が組み込まれ、その部分にのみエンドヌ
クレアーゼ開裂部位を有するフアージを得る。
欠失していた部分の開裂部位が、たとえば宿主
への組み込みに関与する遺伝情報部分に存在しな
い場合には該フアージはエンドヌクレアーゼ抵抗
性のフアージ同様に用いられる、宿主染色体への
組み込み関与する遺伝情報部分に存在する場合に
は微生物的濃縮法により開裂部位を全て消去して
エンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージとして用い
ることが好ましい。
への組み込みに関与する遺伝情報部分に存在しな
い場合には該フアージはエンドヌクレアーゼ抵抗
性のフアージ同様に用いられる、宿主染色体への
組み込み関与する遺伝情報部分に存在する場合に
は微生物的濃縮法により開裂部位を全て消去して
エンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージとして用い
ることが好ましい。
次にこのようにして得た制限酵素による開裂部
位の全く存在しないフアージDNAに、目的とす
る部位に制限酵素による開裂部位を入れるため
に、λ系フアージの内、コート蛋白質製造の遺伝
情報をもつDNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂
部位（感受性）を有するフアージを用い掛け合わ
せを行なう。掛け合わせの方法としては制限酵素
抵抗性のフアージ液（109〜1010／ml）と感受性
のフアージ液（109〜1010／ml）とを混合するか
またはしないで両者に感受性のある大腸菌（両者
が増殖可能な大腸菌）（108〜109／ml）に２種の
フアージを同時に又は相前後して感染させる。あ
るいはK12株に含まれる大腸菌に溶原化されたエ
ンドヌクレアーゼ抵抗性又は感受性のフアージを
誘発した後に別のエンドヌクレアーゼ感受性又は
低抗性のフアージを感染させることによつても可
能である。その後上記のようにしてフアージを感
染させた大腸菌を培地（培地としては大腸菌の生
長可能な培地であれば特に制限されない）、たと
えばトリプトン培地に入れ、37℃で１〜２時間振
盪培養する。
位の全く存在しないフアージDNAに、目的とす
る部位に制限酵素による開裂部位を入れるため
に、λ系フアージの内、コート蛋白質製造の遺伝
情報をもつDNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂
部位（感受性）を有するフアージを用い掛け合わ
せを行なう。掛け合わせの方法としては制限酵素
抵抗性のフアージ液（109〜1010／ml）と感受性
のフアージ液（109〜1010／ml）とを混合するか
またはしないで両者に感受性のある大腸菌（両者
が増殖可能な大腸菌）（108〜109／ml）に２種の
フアージを同時に又は相前後して感染させる。あ
るいはK12株に含まれる大腸菌に溶原化されたエ
ンドヌクレアーゼ抵抗性又は感受性のフアージを
誘発した後に別のエンドヌクレアーゼ感受性又は
低抗性のフアージを感染させることによつても可
能である。その後上記のようにしてフアージを感
染させた大腸菌を培地（培地としては大腸菌の生
長可能な培地であれば特に制限されない）、たと
えばトリプトン培地に入れ、37℃で１〜２時間振
盪培養する。
なお感受性の大腸菌としては、一般的なK12株
に含まれる大腸菌ならばいずれでもよく、たとえ
ば大腸菌W3110（ATCC 27325）、大腸菌W3350
（ATCC 27020）、大腸菌1100（Max−Plank−
Institute西独）等が挙げられる。また大腸菌は培
養液の状態で用いてもよいが、培養液を遠心分離
して培養液を除去した後、10ｍＭのMgCl2に懸濁
し、37℃で１時間振盪した後使用した方がフアー
ジの吸着感染が良くなる。
に含まれる大腸菌ならばいずれでもよく、たとえ
ば大腸菌W3110（ATCC 27325）、大腸菌W3350
（ATCC 27020）、大腸菌1100（Max−Plank−
Institute西独）等が挙げられる。また大腸菌は培
養液の状態で用いてもよいが、培養液を遠心分離
して培養液を除去した後、10ｍＭのMgCl2に懸濁
し、37℃で１時間振盪した後使用した方がフアー
ジの吸着感染が良くなる。
このようにしてフアージDNAのコート蛋白質
製造の遺伝情報をもつDNA部分のみにエンドヌ
クレアーゼ感受性を有するフアージを得ることが
できる。
製造の遺伝情報をもつDNA部分のみにエンドヌ
クレアーゼ感受性を有するフアージを得ることが
できる。
ここで大腸菌制限酵素E.coRIによりコート蛋
白質製造に関与する遺伝情報をもつDNA部分の
みが切断される新種フアージλcI857RIrh80の作
成につき実験例を示して説明する。
白質製造に関与する遺伝情報をもつDNA部分の
みが切断される新種フアージλcI857RIrh80の作
成につき実験例を示して説明する。
実施例 １
１ フアージλcI857から欠失変異株フアージλ
cI857b6042の分離 １−１ 大腸菌（E.coli）K12ストレイン
（strain）W3350（λcI857）〔微工研菌寄第
8603号（FERM Ｐ−8603）、ATCC
31278）〕を１白金耳トリプトン培地３mlに接
種し、300℃で16時間振盪前培養する。得ら
れた前培養液３mlを30mlのトリプトン培地に
入れ、30℃で３時間振盪培養後、43℃で20分
間振盪し、λcI857を誘発する。その後、更
に30℃で３〜６時間培養を続け、溶菌現象が
起り、培養液が透明に近くなつたところで培
養をやめ、培養液を遠心分離して細胞破片を
除去し、その上澄液をフアージλcI857液と
した。この時のフアージ数は約1011／mlであ
つた。
cI857b6042の分離 １−１ 大腸菌（E.coli）K12ストレイン
（strain）W3350（λcI857）〔微工研菌寄第
8603号（FERM Ｐ−8603）、ATCC
31278）〕を１白金耳トリプトン培地３mlに接
種し、300℃で16時間振盪前培養する。得ら
れた前培養液３mlを30mlのトリプトン培地に
入れ、30℃で３時間振盪培養後、43℃で20分
間振盪し、λcI857を誘発する。その後、更
に30℃で３〜６時間培養を続け、溶菌現象が
起り、培養液が透明に近くなつたところで培
養をやめ、培養液を遠心分離して細胞破片を
除去し、その上澄液をフアージλcI857液と
した。この時のフアージ数は約1011／mlであ
つた。
１−２ 該フアージλcI857液0.1mlを0.02Mエチ
レンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含むト
リス緩衝液（PH8.2）５mlに懸濁し、40℃に
10分間保つた後に、0.01M MgCl2を含む
0.1Mトリス緩衝液（PH7.2、トリス−Mg緩衝
液と略す）で107／mlになるように希釈し、
その0.1mlとトリプトン培地で37℃で16時間
静置培養した大腸菌W3110（ATCC 27325）
培養液0.25mlとを46℃に加温したB1−ソフト
アガー３mlと共にトリブトン寒天平板培地に
撤き、37℃で４〜５時間培養した。平板上の
フアージは４mlのトリス−Mg緩衝液で洗い
出しゴム栓付の殺菌した小試験管に保存し
た。続いてこのフアージ液の一部を用いて上
と全く同様の操作を５回繰返した。
レンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含むト
リス緩衝液（PH8.2）５mlに懸濁し、40℃に
10分間保つた後に、0.01M MgCl2を含む
0.1Mトリス緩衝液（PH7.2、トリス−Mg緩衝
液と略す）で107／mlになるように希釈し、
その0.1mlとトリプトン培地で37℃で16時間
静置培養した大腸菌W3110（ATCC 27325）
培養液0.25mlとを46℃に加温したB1−ソフト
アガー３mlと共にトリブトン寒天平板培地に
撤き、37℃で４〜５時間培養した。平板上の
フアージは４mlのトリス−Mg緩衝液で洗い
出しゴム栓付の殺菌した小試験管に保存し
た。続いてこのフアージ液の一部を用いて上
と全く同様の操作を５回繰返した。
１−３ 更に上記１−２で得られたフアージを、
１−２の40℃に10分間処理の代りに60℃に10
分間処理する以外は１−２と全く同様の方法
で４回繰返し、得られたフアージ液を103／
mlに希釈し、その0.1mlを上記大腸菌W3110
の培養液0.25mlに混合し、トリプトン寒天平
板培地に撤き、37℃で一晩培養した後に100
個前後の溶菌斑が見られる平板からその１つ
の溶菌斑中のフアージを竹串でとりトリス−
Mg緩衝液に懸濁し、フアージλcI857b6042
株を得た。
１−２の40℃に10分間処理の代りに60℃に10
分間処理する以外は１−２と全く同様の方法
で４回繰返し、得られたフアージ液を103／
mlに希釈し、その0.1mlを上記大腸菌W3110
の培養液0.25mlに混合し、トリプトン寒天平
板培地に撤き、37℃で一晩培養した後に100
個前後の溶菌斑が見られる平板からその１つ
の溶菌斑中のフアージを竹串でとりトリス−
Mg緩衝液に懸濁し、フアージλcI857b6042
株を得た。
この欠失変異株は親株λcI857株の比重
1.493よりもやや軽い比重1.465を示し、その
比重から計算によりDNAの約23％が欠失し
ていることがわかつた。又、親株のフアージ
λcI857DNAは制限酵素EcoRI（生化学工業
K.K.より入手）により５ケ所で切断される
が、フアージλcI857b6042株では、大腸菌
W3110並びに大腸菌3110（RI）を用いてそ
の生菌数を測定し、計算式により算出した
所、EcoRIによる切断部位が３ケ所になつた
ことが確認された。
1.493よりもやや軽い比重1.465を示し、その
比重から計算によりDNAの約23％が欠失し
ていることがわかつた。又、親株のフアージ
λcI857DNAは制限酵素EcoRI（生化学工業
K.K.より入手）により５ケ所で切断される
が、フアージλcI857b6042株では、大腸菌
W3110並びに大腸菌3110（RI）を用いてそ
の生菌数を測定し、計算式により算出した
所、EcoRIによる切断部位が３ケ所になつた
ことが確認された。
なお大腸菌W3110（RI）は次の様にして
分離した。薬剤耐性因子RI（ペニシリン、
ストレプトマイシン、テトラサイクリン、サ
ルフア剤に耐性）をもつ大腸菌（E.coli）
RY−13（カリフオルニア大学、H.W.Boyer
より入手）〔微工研菌寄第8606号（FERM
Ｐ−8606）〕と大腸菌W3110（ATCC27325）
を混合培養し、薬剤耐性因子をもつ大腸菌
W3110（RI）を分離した。
分離した。薬剤耐性因子RI（ペニシリン、
ストレプトマイシン、テトラサイクリン、サ
ルフア剤に耐性）をもつ大腸菌（E.coli）
RY−13（カリフオルニア大学、H.W.Boyer
より入手）〔微工研菌寄第8606号（FERM
Ｐ−8606）〕と大腸菌W3110（ATCC27325）
を混合培養し、薬剤耐性因子をもつ大腸菌
W3110（RI）を分離した。
２ フアージλcI857b6042株より制限酵素EcoRI
の作用を全く受けないフアージλ
cI857b6042RIr株の分離 ２−１ １−２の方法で培養した大腸菌W3110株
の16時間静置培養液0.25mlとフアージλ
cI857b6042液0.1mlとを46℃に加温したB1−
ソフトアガー３ml中に混合し、トリプトン寒
天平板培地上に撤き、37℃で４〜4.5時間培
養した後に、トリス−Mg緩衝液４mlとクロ
ロホルム３滴を加えて37℃に15分間放置し、
次いで上澄をピペツトでゴム栓付の小試験管
に移した。この時のフアージ数は６×1010／
mlであつた。
の作用を全く受けないフアージλ
cI857b6042RIr株の分離 ２−１ １−２の方法で培養した大腸菌W3110株
の16時間静置培養液0.25mlとフアージλ
cI857b6042液0.1mlとを46℃に加温したB1−
ソフトアガー３ml中に混合し、トリプトン寒
天平板培地上に撤き、37℃で４〜4.5時間培
養した後に、トリス−Mg緩衝液４mlとクロ
ロホルム３滴を加えて37℃に15分間放置し、
次いで上澄をピペツトでゴム栓付の小試験管
に移した。この時のフアージ数は６×1010／
mlであつた。
２−２ ２−１で得られたフアージ粒子の数を制
限酵素EcoRIもつ大腸菌W3110（RI）株を用
いて測定する〔大腸菌W3110（RI）株は制
限酵素によりその細胞内に浸入したフアージ
DNAを切断し不活性化する。その為に大腸
菌W3110（RI）株を用いて測定したフアー
ジ数は制限酵素をもたない大腸菌W3110株を
用いて測定した数に比べて遥かに低く1/600
の108／mlを示したた〕。
限酵素EcoRIもつ大腸菌W3110（RI）株を用
いて測定する〔大腸菌W3110（RI）株は制
限酵素によりその細胞内に浸入したフアージ
DNAを切断し不活性化する。その為に大腸
菌W3110（RI）株を用いて測定したフアー
ジ数は制限酵素をもたない大腸菌W3110株を
用いて測定した数に比べて遥かに低く1/600
の108／mlを示したた〕。
１−２の方法で培養した大腸菌W3110
（RI）の培養液0.25mlと、２−１で得られた
フアージをW3110（RI）で測定した場合に
107／mlになるように希釈し、その0.1mlを用
いて２−１と全く同様の操作を行ないフアー
ジ液を得た。
（RI）の培養液0.25mlと、２−１で得られた
フアージをW3110（RI）で測定した場合に
107／mlになるように希釈し、その0.1mlを用
いて２−１と全く同様の操作を行ないフアー
ジ液を得た。
２−３ ２−２で得られたフアージは今度は２−
１の方法で処理した。この様に２−１と２−
２を交互に10回繰り返し最後に２−１の方法
で処理した標品のフアージ数を大腸菌W3110
（RI）で測定したところ、大腸菌W3110で測
定した数と変らない値を示した。つまり、得
られたフアージ標品はEcoRIの作用を全く受
けない変異株から成つていることが示され
た。このフアージ液を103／mlに希釈し、そ
の0.1mlを大腸菌W3110培養液の0.25mlに混
合し、トリプトン寒天平板上で互に重ならな
い溶菌斑をつくらせ、そこからEcoRIの作用
を全くうけないフアージλcI857b6042RIr株
を単離した。
１の方法で処理した。この様に２−１と２−
２を交互に10回繰り返し最後に２−１の方法
で処理した標品のフアージ数を大腸菌W3110
（RI）で測定したところ、大腸菌W3110で測
定した数と変らない値を示した。つまり、得
られたフアージ標品はEcoRIの作用を全く受
けない変異株から成つていることが示され
た。このフアージ液を103／mlに希釈し、そ
の0.1mlを大腸菌W3110培養液の0.25mlに混
合し、トリプトン寒天平板上で互に重ならな
い溶菌斑をつくらせ、そこからEcoRIの作用
を全くうけないフアージλcI857b6042RIr株
を単離した。
３ フアージλcI857b6042RIrとフアージφ80よ
りテンペレートフアージのDNA部分の複製及
び宿主染色体への組み込みに関与するDNA部
分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少
なくともコート蛋白質合成の遺伝情報をもつ
DNA部分に開裂部位を有するDNAをもつフア
ージの形成 λcI857フアージDNAにはもともとコート蛋白
質製造の遺伝情報をもつDNA部分にEcoRIによる
切断部位が存在しない。この部分に切断部位を付
与するためにλフアージに類似のフアージφ80と
EcoRIに抵抗性のフアージλcI857b6042RIrとの
間で次のようにして雑種を形成させ新種のフアー
ジλcI857RIrh80を得た。
りテンペレートフアージのDNA部分の複製及
び宿主染色体への組み込みに関与するDNA部
分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少
なくともコート蛋白質合成の遺伝情報をもつ
DNA部分に開裂部位を有するDNAをもつフア
ージの形成 λcI857フアージDNAにはもともとコート蛋白
質製造の遺伝情報をもつDNA部分にEcoRIによる
切断部位が存在しない。この部分に切断部位を付
与するためにλフアージに類似のフアージφ80と
EcoRIに抵抗性のフアージλcI857b6042RIrとの
間で次のようにして雑種を形成させ新種のフアー
ジλcI857RIrh80を得た。
即ち大腸菌W3110を１mlのトリプトン培地に１
白金耳接種し、37℃で16時間振盪培養し、その
0.1mlを15mlのトリプトン培地に加え、37℃で振
盪培養し菌数が３×108／mlに達した時に、菌体
を10000回転／分で10分遠心分離し、５mlのトリ
ス−Mg緩衝液に懸濁した。この懸濁液を37℃で
１時間振盪した後に0.2mlを試験管にとつた。別
に大腸菌W3110をトリプトン培地で37℃で３時間
振盪培養後、これにλcI857b6042RIrを接種し、
更に４時間培養した。該培養液をトリス−Mg緩
衝液で30倍に希釈してλcI857b6042RIr液を得
た。つぎに大腸菌（E.coli）K12ストレイン
（strain）W3110（φ80）〔微工研菌寄第8604号
（FERM Ｐ−8604）、ATCC 31277）を１白金
耳、トリプトン培地３mlに接種し、37℃で16時間
振盪前培養して得られた前培養液３mlを30mlのト
リプトン培地に入れ、37℃で３時間振盪培養後、
直径15cmのシヤーレに該振盪培養液15mlを入れ、
15W紫外線ランプを用い、50cmの距離から１〜２
分間照射し、再び37℃で４時間振盪培養した。該
培養液を30倍に希釈してφ80液を得た。
白金耳接種し、37℃で16時間振盪培養し、その
0.1mlを15mlのトリプトン培地に加え、37℃で振
盪培養し菌数が３×108／mlに達した時に、菌体
を10000回転／分で10分遠心分離し、５mlのトリ
ス−Mg緩衝液に懸濁した。この懸濁液を37℃で
１時間振盪した後に0.2mlを試験管にとつた。別
に大腸菌W3110をトリプトン培地で37℃で３時間
振盪培養後、これにλcI857b6042RIrを接種し、
更に４時間培養した。該培養液をトリス−Mg緩
衝液で30倍に希釈してλcI857b6042RIr液を得
た。つぎに大腸菌（E.coli）K12ストレイン
（strain）W3110（φ80）〔微工研菌寄第8604号
（FERM Ｐ−8604）、ATCC 31277）を１白金
耳、トリプトン培地３mlに接種し、37℃で16時間
振盪前培養して得られた前培養液３mlを30mlのト
リプトン培地に入れ、37℃で３時間振盪培養後、
直径15cmのシヤーレに該振盪培養液15mlを入れ、
15W紫外線ランプを用い、50cmの距離から１〜２
分間照射し、再び37℃で４時間振盪培養した。該
培養液を30倍に希釈してφ80液を得た。
上記λcI857b6042RIr液、（3.4×109／ml）0.2ml
と、上記φ80液（3.3×109／ml）0.2mlとを、上
記した試験管にとつた0.2mlの大腸菌W3110の懸
濁液に加え、37℃で10分間放置した後に、その
0.1mlを10mlのトリプトン培地に加え、37℃で70
分間振盪した。この振盪後、クロロホルムを７滴
加えて激しく振り、その0.1mlを大腸菌W3110
（φ80）／λ（λレジスタントでφ80が溶原化さ
れている大腸菌）と混合して46℃のB1−ソフト
アガー３mlを加えてトリプトン寒天平板培地に撤
いた。37℃に一晩放置して生じた溶菌斑の１つか
らフアージを竹串でとりトリス−Mg緩衝液に懸
濁した。その後更に大腸菌W3110（φ80）／λを
用いて溶菌斑をつくらせることを２度繰り返して
精製しλcI857RIrh80の新種フアージを得た。
と、上記φ80液（3.3×109／ml）0.2mlとを、上
記した試験管にとつた0.2mlの大腸菌W3110の懸
濁液に加え、37℃で10分間放置した後に、その
0.1mlを10mlのトリプトン培地に加え、37℃で70
分間振盪した。この振盪後、クロロホルムを７滴
加えて激しく振り、その0.1mlを大腸菌W3110
（φ80）／λ（λレジスタントでφ80が溶原化さ
れている大腸菌）と混合して46℃のB1−ソフト
アガー３mlを加えてトリプトン寒天平板培地に撤
いた。37℃に一晩放置して生じた溶菌斑の１つか
らフアージを竹串でとりトリス−Mg緩衝液に懸
濁した。その後更に大腸菌W3110（φ80）／λを
用いて溶菌斑をつくらせることを２度繰り返して
精製しλcI857RIrh80の新種フアージを得た。
なお、上記大腸菌W3110（φ80）／λは次のよ
うにして得たものである。
うにして得たものである。
大腸菌（E.coli）K12ストレイン（strain）
W3110（φ80）〔微工研菌寄第8604号（FERM Ｐ
−8604）、ATCC 31277〕の１白金耳を２mlのト
リプトン培地に接種し、37℃で16時間静置培養す
る。この培養液0.1mlとλｖフアージ液（IFO
20017）の0.1mlを混合し、37℃で30分間保つた
後、46℃に加温したB1−ソフトアガー３mlを加
え、トリプトン寒天平板培地に撤き、37℃で48時
間培養する。培養後、平板上のコロニーの１つか
ら大腸菌を白金耳で滅菌した５mlの0.9％食塩水
にとり、その0.05mlを滅菌した0.9％食塩水で
10000倍に希釈する。この希釈液の0.1mlをトリプ
トン寒天平板培地上に撒き、37℃で48時間培養し
た平板上に生じたコロニーの１つから大腸菌を取
りW3110（φ80）／λとして用いる。
W3110（φ80）〔微工研菌寄第8604号（FERM Ｐ
−8604）、ATCC 31277〕の１白金耳を２mlのト
リプトン培地に接種し、37℃で16時間静置培養す
る。この培養液0.1mlとλｖフアージ液（IFO
20017）の0.1mlを混合し、37℃で30分間保つた
後、46℃に加温したB1−ソフトアガー３mlを加
え、トリプトン寒天平板培地に撤き、37℃で48時
間培養する。培養後、平板上のコロニーの１つか
ら大腸菌を白金耳で滅菌した５mlの0.9％食塩水
にとり、その0.05mlを滅菌した0.9％食塩水で
10000倍に希釈する。この希釈液の0.1mlをトリプ
トン寒天平板培地上に撒き、37℃で48時間培養し
た平板上に生じたコロニーの１つから大腸菌を取
りW3110（φ80）／λとして用いる。
上記のようにして得た新種のフアージλ
cI857RIrh80の性質は次の如くである。
cI857RIrh80の性質は次の如くである。
宿主：φ80レジスタントな大腸菌には感染出来
ず、λレジスタントの大腸菌には感染し、フア
ージφ80の宿主域と全く同じで、フアージλの
宿主域とは異る。
ず、λレジスタントの大腸菌には感染し、フア
ージφ80の宿主域と全く同じで、フアージλの
宿主域とは異る。
このことはフアージλcI857RIrh80のコート
蛋白質の少なくとも一部はフアージφ80と同じ
であることを示している。
蛋白質の少なくとも一部はフアージφ80と同じ
であることを示している。
免疫：フアージλの免疫を示した。
EcoRIによる制限：両親株の中間の値を示した。
温度感受性：フアージλcI857RIrh80は43℃では
活性のあるフアージ粒子を生産できなかつた。
これはフアージφ80のコート蛋白質の合成が43
℃では不可能（フアージλでは可能）であるこ
とと一致している。なお、得られたλ
cI857RIrh80はアメリカン・タイプ・カルチユ
ア・コレクシヨンに寄託番号ATCC 31285とし
て寄託されている。
活性のあるフアージ粒子を生産できなかつた。
これはフアージφ80のコート蛋白質の合成が43
℃では不可能（フアージλでは可能）であるこ
とと一致している。なお、得られたλ
cI857RIrh80はアメリカン・タイプ・カルチユ
ア・コレクシヨンに寄託番号ATCC 31285とし
て寄託されている。
該λcI857RIrh80を大腸菌（E.coli）1100（Max
−Plank−Institut西独、ハイデルベルクより入
手）に溶原化して得られた溶原菌、すなわち大腸
菌（E.coli）1100（λcI857RIrh80）は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8605号
（FERM Ｐ−8605）として寄託されている〔な
お、大腸菌1100に代えて大腸菌W3110（ATCC
37325）を使用することもできる〕。
−Plank−Institut西独、ハイデルベルクより入
手）に溶原化して得られた溶原菌、すなわち大腸
菌（E.coli）1100（λcI857RIrh80）は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8605号
（FERM Ｐ−8605）として寄託されている〔な
お、大腸菌1100に代えて大腸菌W3110（ATCC
37325）を使用することもできる〕。
次に欠失変異株から得たエンドヌクレアーゼ抵
抗性のフアージと野性株を掛け合わせエンドヌク
レアーゼ抵抗性フアージの中央部分にのみエンド
ヌクレアーゼ開裂部位をもつ株の作成及び該株と
コート蛋白質の合成に関与するDNA部分にエン
ドヌクレアーゼ開裂部位をもつフアージの掛け合
わせを実施例を示して説明する。
抗性のフアージと野性株を掛け合わせエンドヌク
レアーゼ抵抗性フアージの中央部分にのみエンド
ヌクレアーゼ開裂部位をもつ株の作成及び該株と
コート蛋白質の合成に関与するDNA部分にエン
ドヌクレアーゼ開裂部位をもつフアージの掛け合
わせを実施例を示して説明する。
実験例 ２
１−１ フアージλcI857b6042RIrとλフアージ
の掛け合わせ 実施例１で得たフアージλcI857b6042RIr
液（3.6×109／ml）を0.2ml、λフアージ液
（3.5×109／ml）〔大腸菌W3110（λ）（IFO
20016）を15mlのトリプトン培地、37℃で振
盪培養し、大腸菌菌数が109／mlに達した時
に直径15cmのシヤーレに移し15Wの紫外線ラ
ンプで50cmの距離から２分12秒照射してλフ
アージの増殖を誘発した後に、更に３時間振
盪培養して得た液〕0.2ml、及び大腸菌1100
懸濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC 27325）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕（大腸菌1100を15mlの
トリプトン培地で振盪培養し、菌数が３×
103／mlに達した時に菌体を遠心分離し、５
mlのトリス−Mg緩衝液に懸濁し、37℃で１
時間振盪して得た液）0.2mlを混合し、37℃
に10分間放置した後にその0.1mlを10mlのト
リプトン培地に加え、37℃で100分間振盪培
養してフアージ培養液を得た。
の掛け合わせ 実施例１で得たフアージλcI857b6042RIr
液（3.6×109／ml）を0.2ml、λフアージ液
（3.5×109／ml）〔大腸菌W3110（λ）（IFO
20016）を15mlのトリプトン培地、37℃で振
盪培養し、大腸菌菌数が109／mlに達した時
に直径15cmのシヤーレに移し15Wの紫外線ラ
ンプで50cmの距離から２分12秒照射してλフ
アージの増殖を誘発した後に、更に３時間振
盪培養して得た液〕0.2ml、及び大腸菌1100
懸濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC 27325）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕（大腸菌1100を15mlの
トリプトン培地で振盪培養し、菌数が３×
103／mlに達した時に菌体を遠心分離し、５
mlのトリス−Mg緩衝液に懸濁し、37℃で１
時間振盪して得た液）0.2mlを混合し、37℃
に10分間放置した後にその0.1mlを10mlのト
リプトン培地に加え、37℃で100分間振盪培
養してフアージ培養液を得た。
１−２ 塩化セシウム（Cscl）密度こう配遠心
法によるフアージ粒子の分画 １−１で調製したフアージ液中にはλ
cI857b6042RIr、λ及び両者の雑種が存在す
る。この中からλcI857b6042RIrを除くため
にCsCl密度こう配遠心を行つた。この遠心
は比重の異なる高分子を分離するのに極めて
有効な方法であり、λcI857b6042RIrはλに
比べて比重が軽いいので遠心後に重い部分の
フアージ粒子を分取すればよい。
法によるフアージ粒子の分画 １−１で調製したフアージ液中にはλ
cI857b6042RIr、λ及び両者の雑種が存在す
る。この中からλcI857b6042RIrを除くため
にCsCl密度こう配遠心を行つた。この遠心
は比重の異なる高分子を分離するのに極めて
有効な方法であり、λcI857b6042RIrはλに
比べて比重が軽いいので遠心後に重い部分の
フアージ粒子を分取すればよい。
１−１で得られたフアージ液をトリス−
Mg緩衝液で30倍に希釈し、その0.69mlを５
mlの超遠心用チユーブにとり、比重1.6の
CsCl溶液2.31mlを加えて混合しチユーブの
残りの部分に流動パラフインを重層して水平
ローターを用いて250000回転／分で24時間遠
心を行つた。遠心後、チユーブの底に穴をあ
け、滴下する内容物を順次３滴ずつ小試験管
にとつた。11番目から14番目までと16番目か
ら20番目までの試験管中にフアージの存在が
確められたので、12番目の試験管の内容物
（比重の重いフアージが入つている）0.1mlを
順次1M KCl、0.3M KCl、及び0.1M KClに
対して透析し、その0.05mlを0.1mlの大腸菌
1100懸濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸
菌W3110（ATCC 27325）を使用しても全く
同様の結果が得られた〕（２×109／ml）と混
合し、B1−ソフトガー（46℃）３mlを加え
てトリプトン寒天平板培地上に撤いた。38℃
で１晩培養すると、約5000個の不透明な溶菌
斑と50個の透明な溶菌斑が出現した。不透明
な溶菌斑をつくるフアージは野生型のλフア
ージであるが、透明な溶菌斑をつくるフアー
ジはλcI857b6042RIrの性質（透明な溶菌
斑）と野生型λの性質（比重が重い）を併せ
て持つているもので、両者の雑種と考えられ
る。
Mg緩衝液で30倍に希釈し、その0.69mlを５
mlの超遠心用チユーブにとり、比重1.6の
CsCl溶液2.31mlを加えて混合しチユーブの
残りの部分に流動パラフインを重層して水平
ローターを用いて250000回転／分で24時間遠
心を行つた。遠心後、チユーブの底に穴をあ
け、滴下する内容物を順次３滴ずつ小試験管
にとつた。11番目から14番目までと16番目か
ら20番目までの試験管中にフアージの存在が
確められたので、12番目の試験管の内容物
（比重の重いフアージが入つている）0.1mlを
順次1M KCl、0.3M KCl、及び0.1M KClに
対して透析し、その0.05mlを0.1mlの大腸菌
1100懸濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸
菌W3110（ATCC 27325）を使用しても全く
同様の結果が得られた〕（２×109／ml）と混
合し、B1−ソフトガー（46℃）３mlを加え
てトリプトン寒天平板培地上に撤いた。38℃
で１晩培養すると、約5000個の不透明な溶菌
斑と50個の透明な溶菌斑が出現した。不透明
な溶菌斑をつくるフアージは野生型のλフア
ージであるが、透明な溶菌斑をつくるフアー
ジはλcI857b6042RIrの性質（透明な溶菌
斑）と野生型λの性質（比重が重い）を併せ
て持つているもので、両者の雑種と考えられ
る。
透明な溶菌斑12個からフアージ粒子を竹串
でとり、各々５mlのトリス−Mg緩衝液に懸
濁し、それを更に同じ緩衝液で100倍に希釈
し、その0.1mlと大腸菌1100懸濁液〔なお、
大腸菌1100に代えて大腸菌W3110（ATCC
27325）を使用しても全く同様の結果が得ら
れた〕0.1mlを３mlのB1−ソフトアガー（46
℃）と共にトリプトン寒天平板培地に撤き、
38℃で１晩培養して溶菌斑をつくらせた。こ
の操作を更にもう一度繰り返して得られた溶
菌斑からフアージ粒子を竹串で0.1mlのトリ
ス−Mg緩衝液にとり0.25mlの大腸菌1100懸
濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC 27325）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕（２×109／ml）とB1−
ソフトアガー（46℃）３mlを加えて混合し、
トリプトン寒天平板培地に撤いた。そして37
℃で４時間培養した後、トリス−Mg緩衝液
４mlとクロロホルム３滴を加え、37℃に15分
間放置し、上澄をピペツトでゴム栓付の小試
験管に移し、フアージ保存液とした。次いで
大腸菌1100〔なお、大腸菌1100に代えて大腸
菌W3110（ATCC 27325）を使用しても全く
同様の結果が得られた〕とトリプトン培地を
用いてフアージを大量培養してCsCl密度こ
う配遠心を用いてフアージを精製し、その
DNAを大腸菌の制限酵素EcoRIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で分析すると、12株の
うち２株がDNAの中央部分に２箇所の切断
部位をもつことがわかつた。そのうち１株の
λcI857sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １を以下に使用し
た。
でとり、各々５mlのトリス−Mg緩衝液に懸
濁し、それを更に同じ緩衝液で100倍に希釈
し、その0.1mlと大腸菌1100懸濁液〔なお、
大腸菌1100に代えて大腸菌W3110（ATCC
27325）を使用しても全く同様の結果が得ら
れた〕0.1mlを３mlのB1−ソフトアガー（46
℃）と共にトリプトン寒天平板培地に撤き、
38℃で１晩培養して溶菌斑をつくらせた。こ
の操作を更にもう一度繰り返して得られた溶
菌斑からフアージ粒子を竹串で0.1mlのトリ
ス−Mg緩衝液にとり0.25mlの大腸菌1100懸
濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC 27325）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕（２×109／ml）とB1−
ソフトアガー（46℃）３mlを加えて混合し、
トリプトン寒天平板培地に撤いた。そして37
℃で４時間培養した後、トリス−Mg緩衝液
４mlとクロロホルム３滴を加え、37℃に15分
間放置し、上澄をピペツトでゴム栓付の小試
験管に移し、フアージ保存液とした。次いで
大腸菌1100〔なお、大腸菌1100に代えて大腸
菌W3110（ATCC 27325）を使用しても全く
同様の結果が得られた〕とトリプトン培地を
用いてフアージを大量培養してCsCl密度こ
う配遠心を用いてフアージを精製し、その
DNAを大腸菌の制限酵素EcoRIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で分析すると、12株の
うち２株がDNAの中央部分に２箇所の切断
部位をもつことがわかつた。そのうち１株の
λcI857sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １を以下に使用し
た。
２ λcI857sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １とφ80ptrpよ
り
DNAの複製及び宿主染色体への組み込みに関
与するDNA部分にエンドヌクレアーゼ（制限
酵素EcoRI）開裂部位をもたず、少なくともコ
ート蛋白質合成の遺伝情報をもつDNA部分の
開裂部位を有するフアージDNAをもつテンペ
レートフアージλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２
sRIλ０ １の作成 大腸菌1100をトリプトン培地で、37℃、１晩
培養し、その0.75mlを7.5mlのトリプトン培地
に接種し、37℃で45分間振盪培養した後に、λ
cI857sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １とφ80ptrp（大腸菌
のトリプトフアン合成酵素の遺伝情報をもつ形
質導入フアージ）を混合し、各々1.1×1010／
mlになる様にトリス−Mg緩衝液で希釈し、直
径９cmのシヤーレに入れて15Wの紫外線ランプ
で50cmの距離から２分間照射したフアージ液
3.8mlを加えた。37℃で更に３時間振盪しクロ
ロホルムを５滴加え溶菌液を調製した。溶菌液
0.2mlを大腸菌W3110（φ80）／λ懸濁液
（109／ml）0.1mlとB1−ソフトアガー（46℃）
３mlと共にトリプトン寒天平板培地上に撤き、
37℃で１晩培養した。大腸菌W3110（φ80）／
λはφ80が溶原化している菌であるのでφ80の
免疫をもつたフアージはこの菌では生育できな
い。又、λ−レジスタントであるのでλフアー
ジのコート蛋白質をもつフアージはこの菌には
感染できない。即ち、λの免疫をもちφ80のコ
ート蛋白質をもつλcI857h80のみが溶菌斑をつ
くる。生じた溶菌斑（約1200個）の中から５個
を竹串でとり、１−２で述べた方法により大腸
菌W3110（φ80）／λ上で２度、大腸菌1100上
で１度精製を行ない各フアージ保存液を調製し
た。得られたフアージ５株をトリプトン培地と
大腸菌1100〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC 27325）を使用しても全く同様
の結果が得られた〕を用いて大量培養し、超遠
心沈殿法により濃縮した後にCsCl密度こう配
遠心法により精製し、DNAを抽出して制限酵
素EcoRIにより切断し、アガロースゲル電気泳
動により分解産物を分析したところ、５株のう
ちDNAの複製及び宿主染色体への組み込みに
関与するDNA部分に制限酵素EcoRI開裂部位を
もたず、コート蛋白質の合成に関与するDNA
部分及びDNA分子の中央部分に制限酵素EcoRI
開裂部位をもつ株であるλcI857h80att〓sRIλ
０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １２株を得た。
り
DNAの複製及び宿主染色体への組み込みに関
与するDNA部分にエンドヌクレアーゼ（制限
酵素EcoRI）開裂部位をもたず、少なくともコ
ート蛋白質合成の遺伝情報をもつDNA部分の
開裂部位を有するフアージDNAをもつテンペ
レートフアージλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２
sRIλ０ １の作成 大腸菌1100をトリプトン培地で、37℃、１晩
培養し、その0.75mlを7.5mlのトリプトン培地
に接種し、37℃で45分間振盪培養した後に、λ
cI857sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １とφ80ptrp（大腸菌
のトリプトフアン合成酵素の遺伝情報をもつ形
質導入フアージ）を混合し、各々1.1×1010／
mlになる様にトリス−Mg緩衝液で希釈し、直
径９cmのシヤーレに入れて15Wの紫外線ランプ
で50cmの距離から２分間照射したフアージ液
3.8mlを加えた。37℃で更に３時間振盪しクロ
ロホルムを５滴加え溶菌液を調製した。溶菌液
0.2mlを大腸菌W3110（φ80）／λ懸濁液
（109／ml）0.1mlとB1−ソフトアガー（46℃）
３mlと共にトリプトン寒天平板培地上に撤き、
37℃で１晩培養した。大腸菌W3110（φ80）／
λはφ80が溶原化している菌であるのでφ80の
免疫をもつたフアージはこの菌では生育できな
い。又、λ−レジスタントであるのでλフアー
ジのコート蛋白質をもつフアージはこの菌には
感染できない。即ち、λの免疫をもちφ80のコ
ート蛋白質をもつλcI857h80のみが溶菌斑をつ
くる。生じた溶菌斑（約1200個）の中から５個
を竹串でとり、１−２で述べた方法により大腸
菌W3110（φ80）／λ上で２度、大腸菌1100上
で１度精製を行ない各フアージ保存液を調製し
た。得られたフアージ５株をトリプトン培地と
大腸菌1100〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC 27325）を使用しても全く同様
の結果が得られた〕を用いて大量培養し、超遠
心沈殿法により濃縮した後にCsCl密度こう配
遠心法により精製し、DNAを抽出して制限酵
素EcoRIにより切断し、アガロースゲル電気泳
動により分解産物を分析したところ、５株のう
ちDNAの複製及び宿主染色体への組み込みに
関与するDNA部分に制限酵素EcoRI開裂部位を
もたず、コート蛋白質の合成に関与するDNA
部分及びDNA分子の中央部分に制限酵素EcoRI
開裂部位をもつ株であるλcI857h80att〓sRIλ
０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １２株を得た。
尚、φ80ptrpは次の様にして分離した。
まずトリプトンフアン合成酵素の合成能を失つ
た株である大腸菌K12B4trp-（米国スタンフオー
ド大学H.W.Boyerより入手）〔なお、大腸菌
K12B4trp-に代えて大腸菌K12trpB-（ATCC
23718）を使用しても全く同様の結果が得られ
た〕をトリプトン培地15mlに接種し、37℃で４時
間振盪培養した後に遠心分離し、15mlのトリス−
Mg緩衝液に懸濁した。その１mlに、メンブラン
フイルターを通して除菌したφ80フアージ〔トリ
プトフアン合成能を有する原溶菌である大腸菌
（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110（φ
80）〔微工研菌寄第8604号（FERM Ｐ−8604）、
ATCC 31277〕より紫外線で誘発して得た〕液
（2.2×1010／ml）0.12mlを加え37℃、15分間放置
した後にその0.1mlずつをCA平板培地上に広げ37
℃で７〜14日培養した。生じたコロニーから菌体
を竹串でとり、４mlのトリス−Mg緩衝液に懸濁
し、クロロホルム２滴を加えて激しく振盪した。
この懸濁援を更にトリス−Mg緩衝液で100倍に希
釈しその0.05mlを大腸菌1100懸濁液〔なお、大腸
菌1100に代えて大腸菌W3110（ATCC 27325）を
使用しても全く同様の結果が得られた〕（２×
109／ml）0.1mlと混合し、B1−ソフトアガー（46
℃）３mlを加えてトリプトン寒天平板培地上に撤
いた。37℃で１晩培養して生じた溶菌斑からフア
ージを竹串でとり、大腸菌K12B4trp-SMr（109／
ml）｛大腸菌K12B4trp-〔なお、大腸菌K12B4trp-
に代えて大腸菌K12trpB-（ATCC 23718）を使
用しても全く同様の結果が得られた〕をストレプ
トマイシン含有寒天平板培地に培養し生育したコ
ロニーより分離したストレプトマイシン抵抗性を
有する株｝0.1mlを0.6％寒天溶液（46℃）３mlと
共に撤いたeM−SM平板培地上に接種し37℃で培
養した。eM−SM平板培地にはトリプトフアンが
少量しか含まれていず、大腸菌K12B4trp-SMrは
その生育にトリプトフアンを必要とするので、平
板上には少量の菌体のみが生育してくる。そこで
接種したフアージがトリプトフアン合成能をもつ
ている、場合には溶菌斑の周囲にフアージによつ
てつくられたトリプトフアンを資化して生育した
菌のリングが生じる。このリングが生じるフアー
ジを竹串でとり、１−２で述べた方法により精製
し、フアージ保存液を調製してφ80ptrpとして
使用した。
た株である大腸菌K12B4trp-（米国スタンフオー
ド大学H.W.Boyerより入手）〔なお、大腸菌
K12B4trp-に代えて大腸菌K12trpB-（ATCC
23718）を使用しても全く同様の結果が得られ
た〕をトリプトン培地15mlに接種し、37℃で４時
間振盪培養した後に遠心分離し、15mlのトリス−
Mg緩衝液に懸濁した。その１mlに、メンブラン
フイルターを通して除菌したφ80フアージ〔トリ
プトフアン合成能を有する原溶菌である大腸菌
（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110（φ
80）〔微工研菌寄第8604号（FERM Ｐ−8604）、
ATCC 31277〕より紫外線で誘発して得た〕液
（2.2×1010／ml）0.12mlを加え37℃、15分間放置
した後にその0.1mlずつをCA平板培地上に広げ37
℃で７〜14日培養した。生じたコロニーから菌体
を竹串でとり、４mlのトリス−Mg緩衝液に懸濁
し、クロロホルム２滴を加えて激しく振盪した。
この懸濁援を更にトリス−Mg緩衝液で100倍に希
釈しその0.05mlを大腸菌1100懸濁液〔なお、大腸
菌1100に代えて大腸菌W3110（ATCC 27325）を
使用しても全く同様の結果が得られた〕（２×
109／ml）0.1mlと混合し、B1−ソフトアガー（46
℃）３mlを加えてトリプトン寒天平板培地上に撤
いた。37℃で１晩培養して生じた溶菌斑からフア
ージを竹串でとり、大腸菌K12B4trp-SMr（109／
ml）｛大腸菌K12B4trp-〔なお、大腸菌K12B4trp-
に代えて大腸菌K12trpB-（ATCC 23718）を使
用しても全く同様の結果が得られた〕をストレプ
トマイシン含有寒天平板培地に培養し生育したコ
ロニーより分離したストレプトマイシン抵抗性を
有する株｝0.1mlを0.6％寒天溶液（46℃）３mlと
共に撤いたeM−SM平板培地上に接種し37℃で培
養した。eM−SM平板培地にはトリプトフアンが
少量しか含まれていず、大腸菌K12B4trp-SMrは
その生育にトリプトフアンを必要とするので、平
板上には少量の菌体のみが生育してくる。そこで
接種したフアージがトリプトフアン合成能をもつ
ている、場合には溶菌斑の周囲にフアージによつ
てつくられたトリプトフアンを資化して生育した
菌のリングが生じる。このリングが生じるフアー
ジを竹串でとり、１−２で述べた方法により精製
し、フアージ保存液を調製してφ80ptrpとして
使用した。
（注） トリプトン寒天平板培地
トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25％、寒
天1.2％；加圧滅菌後30mlずつを直径９cmのシ
ヤーレに分注した。
天1.2％；加圧滅菌後30mlずつを直径９cmのシ
ヤーレに分注した。
B1−ソフトアガー
トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25％、
MgCl25ｍＭ、ビタミンB11.5μｇ/ml、寒天0.5
％；３mlずつ小試験管に分注し加圧滅菌した。
MgCl25ｍＭ、ビタミンB11.5μｇ/ml、寒天0.5
％；３mlずつ小試験管に分注し加圧滅菌した。
トリプトン培地
トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25％。
CA平板培地
K2HPO40.7％、KH2PO40.3％、クエン酸ナト
リウム0.05％、MgSO4・7H2O0.01％、
（NH4）2SO40.1％、グルコース0.2％、カゼイン
酸分解物0.15％及び寒天1.5％から成る平板培
地。
リウム0.05％、MgSO4・7H2O0.01％、
（NH4）2SO40.1％、グルコース0.2％、カゼイン
酸分解物0.15％及び寒天1.5％から成る平板培
地。
eM−SM平板培地
K2HPO41.05％、KH2PO40.45％、MgSO4・
7H2O0.005％（NH4）2SO40.1％、クエン酸ナト
リウム0.047％、グルコース0.2％、Difco
nutrient broth0.01％、ストレプトマイシン硫
酸0.01％、及び寒天1.5％から成る平板培地。
7H2O0.005％（NH4）2SO40.1％、クエン酸ナト
リウム0.047％、グルコース0.2％、Difco
nutrient broth0.01％、ストレプトマイシン硫
酸0.01％、及び寒天1.5％から成る平板培地。
他方、目的とする遺伝情報を有するDNA（供
与体DNA）としては、微生物（細菌、糸状菌、
酵母）、高等動物または形質導入フアージ等由来
のDNAが挙げられ、新規組み換え体DNAとして
組み込まれる遺伝情報としてはシスチン合成酵
素、サプレツサー遺伝子、DNAリガーゼ、トリ
プトフアン合成酵素、カイコのフイブロインの合
成に関与する遺伝子、ホルモン合成に関与する遺
伝子等が挙げられる。
与体DNA）としては、微生物（細菌、糸状菌、
酵母）、高等動物または形質導入フアージ等由来
のDNAが挙げられ、新規組み換え体DNAとして
組み込まれる遺伝情報としてはシスチン合成酵
素、サプレツサー遺伝子、DNAリガーゼ、トリ
プトフアン合成酵素、カイコのフイブロインの合
成に関与する遺伝子、ホルモン合成に関与する遺
伝子等が挙げられる。
また、エンドヌクレアーゼに対する感受性をも
つフアージにあらかじめ目的とする遺伝情報を組
み込み、形質導入フアージとした後、そのフアー
ジDNAを供与体DNAとして用いることができ
る。
つフアージにあらかじめ目的とする遺伝情報を組
み込み、形質導入フアージとした後、そのフアー
ジDNAを供与体DNAとして用いることができ
る。
テンペレートフアージのDNAの複製及び宿主
染色体への組み込みに関与するDNA部分にエン
ドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少なくともコ
ート蛋白質合成の遺伝情報もつDNA部分に開裂
部位を有するフアージDNA又は目的とする遺伝
情報を有するDNAをエンドヌクレアーゼで切断
する場合には、DNA濃度20〜200μｇ/ml、酵素
濃度100〜200ユニツト／mlとするのが好ましく、
26〜42℃、好ましくは37℃で10〜２時間作用させ
る。
染色体への組み込みに関与するDNA部分にエン
ドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少なくともコ
ート蛋白質合成の遺伝情報もつDNA部分に開裂
部位を有するフアージDNA又は目的とする遺伝
情報を有するDNAをエンドヌクレアーゼで切断
する場合には、DNA濃度20〜200μｇ/ml、酵素
濃度100〜200ユニツト／mlとするのが好ましく、
26〜42℃、好ましくは37℃で10〜２時間作用させ
る。
エンドヌクレアーゼによる切断は、適宜フアー
ジDNA及び目的とする遺伝情報を有するDNAを
混合して行つてもよい。
ジDNA及び目的とする遺伝情報を有するDNAを
混合して行つてもよい。
次にエンドヌクレアーゼを作用させた各溶液を
通常DNA量として等量ずつ混合した後DNAリガ
ーゼを添加する。この場合に用いられるDNAリ
ガーゼとしては大腸菌DNAリガーゼ、T4フアー
ジDNAリガーゼ等が挙げられるが、T4フアージ
DNAリガーゼの方が入手しやすい。
通常DNA量として等量ずつ混合した後DNAリガ
ーゼを添加する。この場合に用いられるDNAリ
ガーゼとしては大腸菌DNAリガーゼ、T4フアー
ジDNAリガーゼ等が挙げられるが、T4フアージ
DNAリガーゼの方が入手しやすい。
DNAリガーゼを作用させる場合、通常DNA濃
度10〜80μｇ/mlに対しDNAリガーゼ濃度１〜10
ユニツト／mlを添加し、０〜10℃で１〜14日間保
持する。
度10〜80μｇ/mlに対しDNAリガーゼ濃度１〜10
ユニツト／mlを添加し、０〜10℃で１〜14日間保
持する。
この様にして得られた種々の組み換え体DNA
等の混合物の中から目的とする組み換え体DNA
を採取するには次の方法による。
等の混合物の中から目的とする組み換え体DNA
を採取するには次の方法による。
まず、組み換え体DNAの作成に使用したフア
ージと同じ付着端（cohesive ends）及び同じ免
疫（immunity）をもち、異なるアタツチメント
サイト（attachment site）（溶原化する際に宿主
の染色体と組み換えを起す部位）をもつテンペレ
ートフアージを溶原化した大腸菌に、同じ付着端
及び同じ免疫をもち、宿主染色体へのアタツチメ
ントサイトをもたないテンペレートフアージを大
量に感染させた後に、組み換え体DNAを混合
し、20〜40℃に保つことにより組み換え体DNA
を菌体内にとり込ませることができる。
ージと同じ付着端（cohesive ends）及び同じ免
疫（immunity）をもち、異なるアタツチメント
サイト（attachment site）（溶原化する際に宿主
の染色体と組み換えを起す部位）をもつテンペレ
ートフアージを溶原化した大腸菌に、同じ付着端
及び同じ免疫をもち、宿主染色体へのアタツチメ
ントサイトをもたないテンペレートフアージを大
量に感染させた後に、組み換え体DNAを混合
し、20〜40℃に保つことにより組み換え体DNA
を菌体内にとり込ませることができる。
菌体内に入つたた組み換え体DNAは宿主に同
じ免疫をもつフアージが組み込まれているので、
増殖できず、宿主染色体に組み込まれやすくな
る。この様にして組み換え体DNAを溶原化した
細胞の中から目的のDNAをもち細胞を分離する
には、組み換えに使用した供与体DNAが酵母、
細菌、形質導入フアージ等に由来する場合には、
目的とする遺伝子の産物を生産する細胞を分離す
ればよい。例えば目的とする遺伝子がトリプトフ
アン合成酵素の遺伝子の場合には、トリプトフア
ン合成酵素を、合成できない大腸菌を用いて組み
換え体DNAをとりこませ、トリプトフアン合成
能の回復した細胞、即ちトリプトフアンを欠く培
地で生育可能な細胞を分離すればよい。
じ免疫をもつフアージが組み込まれているので、
増殖できず、宿主染色体に組み込まれやすくな
る。この様にして組み換え体DNAを溶原化した
細胞の中から目的のDNAをもち細胞を分離する
には、組み換えに使用した供与体DNAが酵母、
細菌、形質導入フアージ等に由来する場合には、
目的とする遺伝子の産物を生産する細胞を分離す
ればよい。例えば目的とする遺伝子がトリプトフ
アン合成酵素の遺伝子の場合には、トリプトフア
ン合成酵素を、合成できない大腸菌を用いて組み
換え体DNAをとりこませ、トリプトフアン合成
能の回復した細胞、即ちトリプトフアンを欠く培
地で生育可能な細胞を分離すればよい。
供与体DNAが糸状菌、高等動植物等に由来す
る場合には、予め大腸菌の中で発現可能な遺伝
子、例えば薬剤耐性遺伝子をもつプラスミド
DNAの断片等を供与体DNAにDNAリガーゼを用
いて結合させておき、その遺伝情報（薬剤耐性）
の発現した細胞を分離すればよい。
る場合には、予め大腸菌の中で発現可能な遺伝
子、例えば薬剤耐性遺伝子をもつプラスミド
DNAの断片等を供与体DNAにDNAリガーゼを用
いて結合させておき、その遺伝情報（薬剤耐性）
の発現した細胞を分離すればよい。
次に目的とする遺伝情報がベクター（DNA供
与体を組み込むことができ、自己増殖可能な
DNAを作るのに使用するDNA）として用いたフ
アージDNAに結合していて、そのDNAのコート
蛋白質合成に関与するDNA部分と組み換えられ
ているかどうかを確かめるには、目的とする遺伝
子の産物を生産し得る大腸菌細胞にベクターとし
て用いたフアージと異なる免疫もち、同じアタツ
チメントサイトをもつ例えばフアージＣを大量に
感染させ、フアージＣが溶原化した細胞をとり、
その細胞が目的とする遺伝子産物を生産し得るか
どうかを調べればよい。
与体を組み込むことができ、自己増殖可能な
DNAを作るのに使用するDNA）として用いたフ
アージDNAに結合していて、そのDNAのコート
蛋白質合成に関与するDNA部分と組み換えられ
ているかどうかを確かめるには、目的とする遺伝
子の産物を生産し得る大腸菌細胞にベクターとし
て用いたフアージと異なる免疫もち、同じアタツ
チメントサイトをもつ例えばフアージＣを大量に
感染させ、フアージＣが溶原化した細胞をとり、
その細胞が目的とする遺伝子産物を生産し得るか
どうかを調べればよい。
目的とする遺伝情報をもつDNA断片がベクタ
ーとして用いたフアージDNAのコート蛋白質合
成に関与するDNA部分と置き換えられた形で結
合し宿主に溶原化している場合には、フアージＣ
が溶原化することによりその組み換え体DNAは
宿主染色体から追い出され、宿主が増殖をつづけ
ると希釈されて消滅してしまい、目的とする遺伝
子の産物を作らなくなつてしまう。
ーとして用いたフアージDNAのコート蛋白質合
成に関与するDNA部分と置き換えられた形で結
合し宿主に溶原化している場合には、フアージＣ
が溶原化することによりその組み換え体DNAは
宿主染色体から追い出され、宿主が増殖をつづけ
ると希釈されて消滅してしまい、目的とする遺伝
子の産物を作らなくなつてしまう。
この様にして得られた目的の遺伝情報をもつ
DNA断片がベクターとして用いたフアージDNA
のコート蛋白質合成に関与するDNA部分と置き
換えられた組み換え体DNAが溶原化している細
胞から組み換え体DNAを回収するには以下の方
法を用いる。
DNA断片がベクターとして用いたフアージDNA
のコート蛋白質合成に関与するDNA部分と置き
換えられた組み換え体DNAが溶原化している細
胞から組み換え体DNAを回収するには以下の方
法を用いる。
まずこの細胞には組み換え体DNAの他に最初
に溶原化した別のフアージDNA（組み換え体
DNAの作成に使用したフアージと同じ付着端及
び同じ免疫をもち異なるアタツチメントサイトを
もつテンペレートフアージDNA）が存在するの
でこれを取り除く。
に溶原化した別のフアージDNA（組み換え体
DNAの作成に使用したフアージと同じ付着端及
び同じ免疫をもち異なるアタツチメントサイトを
もつテンペレートフアージDNA）が存在するの
でこれを取り除く。
即ち、組み換え体DNAの分子量が最初に溶原
化したフアージDNAの分子量とあまり違わない
場合には、両者の増殖を同時に誘発し培養を続け
ると、最初に溶原化したフアージの遺伝情報に基
いてつくられるコート蛋白質の組み換え体DNA
がパツクされて感染性を有するフアージ粒子がで
きるので、得られた溶菌液の中には最初に溶原化
したフアージと組み換え体フアージの両者が存在
する。この溶菌液を非溶原性大腸菌の懸濁液に加
えてフアージを感染させ目的とする遺伝情報をも
つ細胞を上記の様にして多数分離する。この中か
らフアージ粒子をつくらない細胞を分離すればよ
い。フアージ粒子をつくるかどうかはそのフアー
ジが溶菌斑をつくり得る大腸菌を寒天平板培地に
ぬり、その上に検体細胞をスポツトし、培養した
後に検体細胞のコロニーの周囲に溶菌が起つてい
るかどうかを調べればよい。
化したフアージDNAの分子量とあまり違わない
場合には、両者の増殖を同時に誘発し培養を続け
ると、最初に溶原化したフアージの遺伝情報に基
いてつくられるコート蛋白質の組み換え体DNA
がパツクされて感染性を有するフアージ粒子がで
きるので、得られた溶菌液の中には最初に溶原化
したフアージと組み換え体フアージの両者が存在
する。この溶菌液を非溶原性大腸菌の懸濁液に加
えてフアージを感染させ目的とする遺伝情報をも
つ細胞を上記の様にして多数分離する。この中か
らフアージ粒子をつくらない細胞を分離すればよ
い。フアージ粒子をつくるかどうかはそのフアー
ジが溶菌斑をつくり得る大腸菌を寒天平板培地に
ぬり、その上に検体細胞をスポツトし、培養した
後に検体細胞のコロニーの周囲に溶菌が起つてい
るかどうかを調べればよい。
また、組み換え体DNAの分子量が最初に溶原
化してあるフアージDNAの分子量と著しく違う
場合には、最初に溶原化したフアージと同じ部位
に溶原化し最初に溶原化したフアージと異なる免
疫をもち、その増殖が組み換え体DNAと同じ方
法では誘発できないフアージを大量に感染させる
ことによりそのDNAを最初に溶原化してあるフ
アージDNAの代りに溶原化することにより代用
することができる。
化してあるフアージDNAの分子量と著しく違う
場合には、最初に溶原化したフアージと同じ部位
に溶原化し最初に溶原化したフアージと異なる免
疫をもち、その増殖が組み換え体DNAと同じ方
法では誘発できないフアージを大量に感染させる
ことによりそのDNAを最初に溶原化してあるフ
アージDNAの代りに溶原化することにより代用
することができる。
この様にして得られた細胞を培養し組み換え体
DNAの複製を誘発した直後に組み換え体DNAと
同じ付着端をもちDNAの分子量が組み換え体
DNAとは異なる変異株、例えばフアージＤを感
染させ、培養することによりフアージＤの生産す
るコート蛋白質にパツクされた形で組み換え体
DNAを回収できる。この様にして得られたフア
ージＤと組み換え体DNAを含むフアージとは、
コート蛋白質が同一でDNAの分子量が異なり、
異なる比重を持つているので、塩化セシウム密度
こう配平衡遠心法により分離し単離することがで
きる。
DNAの複製を誘発した直後に組み換え体DNAと
同じ付着端をもちDNAの分子量が組み換え体
DNAとは異なる変異株、例えばフアージＤを感
染させ、培養することによりフアージＤの生産す
るコート蛋白質にパツクされた形で組み換え体
DNAを回収できる。この様にして得られたフア
ージＤと組み換え体DNAを含むフアージとは、
コート蛋白質が同一でDNAの分子量が異なり、
異なる比重を持つているので、塩化セシウム密度
こう配平衡遠心法により分離し単離することがで
きる。
組み換え体DNAの分子量が著しく大きくフア
ージＤのコート蛋白質にパツクされない場合に
は、組み換え体DNAを溶原化した細胞を培養
し、組み換え体DNAの複製を誘発した後に培養
を続けることにより組み換え体DNAを多数その
細胞内につくらせることができる。この細胞から
DNAを抽出すると、大腸菌のDNAは分子量が極
めて大きいので抽出操作中に切断されて両端のあ
る線状のDNA断片として回収されるが、両端の
閉じた環状分子として回収されるのは組み換え体
DNAである。線状DNAと環状DNAは塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド密度こう配平衡遠心法
により分別することができるので、この方法によ
り組み換え体DNAを回収できる。
ージＤのコート蛋白質にパツクされない場合に
は、組み換え体DNAを溶原化した細胞を培養
し、組み換え体DNAの複製を誘発した後に培養
を続けることにより組み換え体DNAを多数その
細胞内につくらせることができる。この細胞から
DNAを抽出すると、大腸菌のDNAは分子量が極
めて大きいので抽出操作中に切断されて両端のあ
る線状のDNA断片として回収されるが、両端の
閉じた環状分子として回収されるのは組み換え体
DNAである。線状DNAと環状DNAは塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド密度こう配平衡遠心法
により分別することができるので、この方法によ
り組み換え体DNAを回収できる。
このようにしてフアージのDNAのコート蛋白
質製造の遺伝情報の部分を欠失し目的とする
DNA断片に組み換えられた新規組み換え体DNA
を宿主に感染させて宿主のDNAに組み込ませた
後保存し、必要に応じて誘発させることにより遺
伝情報を「増幅」し、その宿主細胞をたとえばト
リプトン培地に培養することにより増幅された情
報に基づいて特定の蛋白質を大量に生産せしめる
ことが出来、産業的有益性は多大なものがある。
質製造の遺伝情報の部分を欠失し目的とする
DNA断片に組み換えられた新規組み換え体DNA
を宿主に感染させて宿主のDNAに組み込ませた
後保存し、必要に応じて誘発させることにより遺
伝情報を「増幅」し、その宿主細胞をたとえばト
リプトン培地に培養することにより増幅された情
報に基づいて特定の蛋白質を大量に生産せしめる
ことが出来、産業的有益性は多大なものがある。
次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに
よつて制限されるものではない。
よつて制限されるものではない。
なお実施例中で使用する各培地を説明すると次
の如くである。
の如くである。
Ｈ−trp培地
0.1Mリン酸カルシウム緩衝液PH7.0、0.015M
（NH4）2SO4、１ｍＭ MgSO4、1.8×10-6M
FeSO4、0.2％グルコース、及び0.1mg/mlトリ
プトフアンからなる液体培地。
（NH4）2SO4、１ｍＭ MgSO4、1.8×10-6M
FeSO4、0.2％グルコース、及び0.1mg/mlトリ
プトフアンからなる液体培地。
Ｉ−trp培地
0.01Mトリス緩衝液PH7.1、６×10-5M
MgCl2、６×10-4Mリン酸カリウム緩衝液PH
7.1、５×10-4M（NH4）2SO4、４×10-10M
FeSO4、0.2％グルコース、及び0.1mg/mlトリ
プトフアンからなる液体培地。
MgCl2、６×10-4Mリン酸カリウム緩衝液PH
7.1、５×10-4M（NH4）2SO4、４×10-10M
FeSO4、0.2％グルコース、及び0.1mg/mlトリ
プトフアンからなる液体培地。
実施例
λcI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １DNAとφ
80ptrp DNAの組み換え体DNAの作成 １−１ 制限酵素EcoRIによるDNAの切断 実験例２で得られたλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRI
λ０ ２sRIλ０ １及びφ80trp｛φ80に目的とする遺伝情
報（トリプトフアン合成酵素）が導入された形質
導入フアージ｝の精製フアージを260ｍμの吸光
度が８になる様に0.01M Tris−HCl（PH8.0）、１
ｍＭ MgCl2、及び0.1ｍＭエチレンジアミンテ
トラ酢酸よるなる緩衝液で希釈し、その0.5〜1.0
mlを100〜150mlの50％ホルムアミドと10ｍＭエチ
レンジアミンテトラ酢酸を含む0.1Mトリス緩衝
液（PH8.5）に対して24℃、16時間透析すること
によりDNAを抽出した。これを更に0.1ｍＭエチ
レンジアミンテトラ酢酸を含む0.1ｍＭトリス緩
衝液（PH7.5）150mlに対して４℃で４回透析して
DNA標品とした。
80ptrp DNAの組み換え体DNAの作成 １−１ 制限酵素EcoRIによるDNAの切断 実験例２で得られたλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRI
λ０ ２sRIλ０ １及びφ80trp｛φ80に目的とする遺伝情
報（トリプトフアン合成酵素）が導入された形質
導入フアージ｝の精製フアージを260ｍμの吸光
度が８になる様に0.01M Tris−HCl（PH8.0）、１
ｍＭ MgCl2、及び0.1ｍＭエチレンジアミンテ
トラ酢酸よるなる緩衝液で希釈し、その0.5〜1.0
mlを100〜150mlの50％ホルムアミドと10ｍＭエチ
レンジアミンテトラ酢酸を含む0.1Mトリス緩衝
液（PH8.5）に対して24℃、16時間透析すること
によりDNAを抽出した。これを更に0.1ｍＭエチ
レンジアミンテトラ酢酸を含む0.1ｍＭトリス緩
衝液（PH7.5）150mlに対して４℃で４回透析して
DNA標品とした。
DNA標品を0.1ｍＭエチレンジアミンテトラ酢
酸を含む0.1Mトリス緩衝液（PH7.5）で40μｇ/
mlになる様に希釈し、その90μを小試験管にと
り0.1M MgCl210μと制限酵素EcoRI（Miles
Lab.製、生化学工業株式会社より入手）２μ
を加え37℃に１時間放置してDNAの切断を行つ
た後に73℃、10分間加熱し、次いですばやく０℃
に冷却することによりEcoRIを失活させた。
酸を含む0.1Mトリス緩衝液（PH7.5）で40μｇ/
mlになる様に希釈し、その90μを小試験管にと
り0.1M MgCl210μと制限酵素EcoRI（Miles
Lab.製、生化学工業株式会社より入手）２μ
を加え37℃に１時間放置してDNAの切断を行つ
た後に73℃、10分間加熱し、次いですばやく０℃
に冷却することによりEcoRIを失活させた。
１−２ 組み換え体DNAの作成
制限酵素によつて切断されたλ
cI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １DNAとφ
80ptrpDNAを25μずつを混合し、20μ
の蒸留水10μの50ｍＭ MgCl2、10μの
0.1Mジチオスレイトール、10μの１ｍＭ
ATP及び１μのT4リガーゼ（Miles
Lab.社製、生化学工業株式会社より入手）
１μを加え０℃に３日間放置して組み換え
体DNAを含む溶液を得た。
cI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １DNAとφ
80ptrpDNAを25μずつを混合し、20μ
の蒸留水10μの50ｍＭ MgCl2、10μの
0.1Mジチオスレイトール、10μの１ｍＭ
ATP及び１μのT4リガーゼ（Miles
Lab.社製、生化学工業株式会社より入手）
１μを加え０℃に３日間放置して組み換え
体DNAを含む溶液を得た。
T4リガーゼはDNA断片をつなぐ作用をも
つている酵素であり、制限酵素によつて切断
された２種類のDNAを混合してこの酵素を
作成させることにより両者の組み換え体を作
成することができる。
つている酵素であり、制限酵素によつて切断
された２種類のDNAを混合してこの酵素を
作成させることにより両者の組み換え体を作
成することができる。
２ 組み換え体DNAの分離
トリプトフアン要求性菌株大腸菌K12B4trp-
〔なお、大腸菌K12B4Trp-に代えて大腸菌
K12trpB-（ATCC23718）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕にλcI857RIrh80
（ATCC 31285）を溶原化させた菌株大腸菌
K12B4trp-（λcI857RIrh80）をＨ−trp培地10
mlに接種し30℃で20時間前培養を行ない、その
0.5mlを新らしいＨ−trp培地10mlに接種して30
℃で振盪培養を行つた。菌数が５×108／mlに
達した時に氷で冷却し、その６mlを遠心分離
（10000回転／分、20分間）し、Ｉ−trp培地1.5
ml（０℃）に懸濁した。懸濁液を30℃、12分間
保温し、次いで０℃に６分間保つた後に、Ｉ−
trp培地に懸濁した染色体へのアタツチメント
サイトをもたないフアージであるλb2フアー
ジ（２×1010／ml、国立予防衛生研究所より入
手）1.5mlを加え、30℃で12分間保つた。再び
０℃に冷却した後に、遠心分離を行ない0.01M
MgCl2と0.01M CaCl2とを含む0.01Mトリス緩
衝液（PH7.5）1.5mlに再懸濁した。通常の大腸
菌は外部のDNAを菌体内にとりこむことはで
きないが、上記の方法で処理した場合にはλ系
のフアージDNAのとりこみが可能となる。
〔なお、大腸菌K12B4Trp-に代えて大腸菌
K12trpB-（ATCC23718）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕にλcI857RIrh80
（ATCC 31285）を溶原化させた菌株大腸菌
K12B4trp-（λcI857RIrh80）をＨ−trp培地10
mlに接種し30℃で20時間前培養を行ない、その
0.5mlを新らしいＨ−trp培地10mlに接種して30
℃で振盪培養を行つた。菌数が５×108／mlに
達した時に氷で冷却し、その６mlを遠心分離
（10000回転／分、20分間）し、Ｉ−trp培地1.5
ml（０℃）に懸濁した。懸濁液を30℃、12分間
保温し、次いで０℃に６分間保つた後に、Ｉ−
trp培地に懸濁した染色体へのアタツチメント
サイトをもたないフアージであるλb2フアー
ジ（２×1010／ml、国立予防衛生研究所より入
手）1.5mlを加え、30℃で12分間保つた。再び
０℃に冷却した後に、遠心分離を行ない0.01M
MgCl2と0.01M CaCl2とを含む0.01Mトリス緩
衝液（PH7.5）1.5mlに再懸濁した。通常の大腸
菌は外部のDNAを菌体内にとりこむことはで
きないが、上記の方法で処理した場合にはλ系
のフアージDNAのとりこみが可能となる。
ついで１−2.で調製した組み換え体DNAを
含む溶液を73℃、10分間加熱し、急冷した後、
その５〜20μを0.01M MgCl2と0.01M CaCl2
を含む0.01Mトリス緩衝液（PH7.5）0.1mlに加
え、０℃に保つた後に上記の処理をした大腸菌
K12B4trp-（λcI857RIrh80）懸濁液0.2mlを加
え、30℃、40分間加温して組み換え体DNAを
とりこませた。
含む溶液を73℃、10分間加熱し、急冷した後、
その５〜20μを0.01M MgCl2と0.01M CaCl2
を含む0.01Mトリス緩衝液（PH7.5）0.1mlに加
え、０℃に保つた後に上記の処理をした大腸菌
K12B4trp-（λcI857RIrh80）懸濁液0.2mlを加
え、30℃、40分間加温して組み換え体DNAを
とりこませた。
その後45℃に保温したCA−ソフトアガー
（寒天の濃度が0.5％であるのを除いてCA平板
培地と同じ組成である）３mlを加えてCA平板
培地に撒いた。30℃で３〜７日間培養した後に
30個のコロニーを得た。このCA平板培地上の
30個のコロニーのうち周囲に溶菌の起つていな
いコロニーを分離し、その中から42℃でトリプ
トン寒天平板培地で培養して生育する大腸菌を
CA平板培地に接種して生育のみられない性質
を示す３株を分離した。
（寒天の濃度が0.5％であるのを除いてCA平板
培地と同じ組成である）３mlを加えてCA平板
培地に撒いた。30℃で３〜７日間培養した後に
30個のコロニーを得た。このCA平板培地上の
30個のコロニーのうち周囲に溶菌の起つていな
いコロニーを分離し、その中から42℃でトリプ
トン寒天平板培地で培養して生育する大腸菌を
CA平板培地に接種して生育のみられない性質
を示す３株を分離した。
得られた上記３株はトリプトフアン非要求性で
あり42℃で培養して溶原化されたフアージを除く
とトリプトフアン要求性になるのでλ
cI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １のコート蛋
白
質の合成に関与する遺伝情報以外の全ての情報を
含んでいるDNA断片にφ80ptrp由来のトリプト
フアンオペロンを含むDNA断片が結合した
DNA、即ちλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０
１
DNAのコート蛋白質の合成に関与するDNA部分
にトリプトフアン合成酵素の合成に関与する
DNA断片が置き換えられた形の新規組み換え体
DNAが宿主DNAに組み込まれてトリプトフアン
非要求性株となつた大腸菌K12B4trp-（λ
cI857RIrh80、λcI857H80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRI
λ０ １dtrp）である。
あり42℃で培養して溶原化されたフアージを除く
とトリプトフアン要求性になるのでλ
cI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １のコート蛋
白
質の合成に関与する遺伝情報以外の全ての情報を
含んでいるDNA断片にφ80ptrp由来のトリプト
フアンオペロンを含むDNA断片が結合した
DNA、即ちλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０
１
DNAのコート蛋白質の合成に関与するDNA部分
にトリプトフアン合成酵素の合成に関与する
DNA断片が置き換えられた形の新規組み換え体
DNAが宿主DNAに組み込まれてトリプトフアン
非要求性株となつた大腸菌K12B4trp-（λ
cI857RIrh80、λcI857H80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRI
λ０ １dtrp）である。
第１図は実験例１におけるλcI857RIrh80の作
成方法を示す図であり、第２図は実験例２におけ
るλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １の作成
方
法を示す図であり、第３図は実施例における大腸
菌K12B4trp-（λcI857RIrh80、λ
cI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １dtrp）の作
成
方法を示す図である。
成方法を示す図であり、第２図は実験例２におけ
るλcI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １の作成
方
法を示す図であり、第３図は実施例における大腸
菌K12B4trp-（λcI857RIrh80、λ
cI857h80att〓sRIλ０ ３sRIλ０ ２sRIλ０ １dtrp）の作
成
方法を示す図である。
Claims (1)
- １ テンペレートフアージのDNAの複製及び宿
主染色体への組み込みに関与するDNA部分にエ
ンドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少なくとも
コート蛋白質合成の遺伝情報もをつDNA部分に
開裂部位を有するフアージDNA及び目的とする
遺伝情報を有するDNAをエンドヌクレアーゼで
切断し、両者の混合液にDNAリガーゼを加え、
該混合液からコート蛋白質合成の遺伝情報をもつ
DNA部分が目的とする遺伝情報をもつDNA断片
に置き換えられ、コート蛋白質生産能を欠失した
フアージDNAを採取することを特徴とする新規
組み換え体DNAの作成法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13043778A JPS5558096A (en) | 1978-10-25 | 1978-10-25 | Method of making novel recombined dna |
| US06/087,167 US4348478A (en) | 1978-10-25 | 1979-10-22 | Method for preparation of a recombinant DNA phage |
| GB7936942A GB2042554B (en) | 1978-10-25 | 1979-10-24 | Method for preparation of recombinant dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13043778A JPS5558096A (en) | 1978-10-25 | 1978-10-25 | Method of making novel recombined dna |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5558096A JPS5558096A (en) | 1980-04-30 |
| JPS6137917B2 true JPS6137917B2 (ja) | 1986-08-26 |
Family
ID=15034211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13043778A Granted JPS5558096A (en) | 1978-10-25 | 1978-10-25 | Method of making novel recombined dna |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4348478A (ja) |
| JP (1) | JPS5558096A (ja) |
| GB (1) | GB2042554B (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5828273A (ja) * | 1981-08-06 | 1983-02-19 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 微生物の培養方法 |
| US5254463A (en) * | 1981-09-18 | 1993-10-19 | Genentech, Inc. | Method for expression of bovine growth hormone |
| US4593002A (en) * | 1982-01-11 | 1986-06-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Viruses with recombinant surface proteins |
| JPS58212781A (ja) * | 1982-06-02 | 1983-12-10 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 新種バクテリオフア−ジ及びその育種法 |
| JPS59205983A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 |
| US5559018A (en) * | 1983-09-13 | 1996-09-24 | Mattson; Thomas L. | Inviable phages, their production and DNA thereof |
| GB8324479D0 (en) * | 1983-09-13 | 1983-10-12 | Mattson T | Recombinant dna molecules |
| US5489529A (en) * | 1984-07-19 | 1996-02-06 | De Boer; Herman A. | DNA for expression of bovine growth hormone |
| US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| US7413537B2 (en) * | 1989-09-01 | 2008-08-19 | Dyax Corp. | Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins |
| US5989894A (en) * | 1990-04-20 | 1999-11-23 | University Of Wyoming | Isolated DNA coding for spider silk protein, a replicable vector and a transformed cell containing the DNA |
| WO1992006191A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-16 | Protein Engineering Corporation | Proteinaceous anti-dental plaque agents |
| EP1820858B1 (en) * | 1991-03-01 | 2009-08-12 | Dyax Corporation | Chimeric protein comprising micro-protein having two or more disulfide bonds and embodiments thereof |
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