JPS6137918B2

JPS6137918B2 -

Info

Publication number: JPS6137918B2
Application number: JP53132631A
Authority: JP
Inventors: Eiichi Nakano; Tsutomu Masuda; Narimasa Saito; Danji Fukushima
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1978-10-30
Filing date: 1978-10-30
Publication date: 1986-08-26
Also published as: DK455679A; GB2034717B; JPS5561798A; US4348477A; GB2034717A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規組み換え体DNAの作成法に関す
る。

遺伝子操作の分野は、一方ではプラスミド
（plasmid）、バクテリオフアージ
（bacteriophage）などのレプリコン（replicon）
の遺伝学的、化学的性質の研究が急速に進展した
ことと、他方でDNA（デオキシリボ核酸）関係
の酵素、特にDNA上のヌクレオチド配列を認識
して特異的な切断を起こすエンドヌクレアーゼ
（制限酵素）とDNAリガーゼの研究の進歩がちよ
うどタイミングよく結びついた結果可能になつた
新領域である。

遺伝子操作の研究はこれまでの科学的方法をも
つてしては到達できなかつた新しく深い領域に生
物学を導くものと思われ、何よりも遺伝子系が自
然に起こる組み換え現象への依存から解放される
ことであり、又この問題について“好ましい形
質”をもつ微生物を作り、発酵工業的経験などを
活用し、やがてはより高等な系の遺伝子操作によ
つて人類社会に役だたせようとするものである。

従来、種々の遺伝子の組み換え方法が提案さ
れ、その例としては、たとえばλ（ラムダ）フア
ージDNAにシヨウジヨウバエのDNA断片を組み
換える方法は知られているが、組み換えられる場
所がフアージの溶原化（宿主細胞のDNAにフア
ージのDNAが組み込まれること）に必要な遺伝
情報を持つ部分であるので、出来た混成DNAは
宿主DNAに組み込ませることが出来ない。その
ため、実際の使用に際しては、たえず宿主細胞と
核フアージを用意しておかねばならないが、該フ
アージの保存等に問題がある。また溶原化に必要
な遺伝情報をもつた組み換え体DNA、例えば大
腸菌DNAリガーゼの遺伝子DNAをλフアージ
DNAの中央部分に組み込まれた組み換え体DNA
を宿主に溶原化し、その溶原菌を培養し、途中で
溶原化されたフアージを誘発して培養を継続する
ことにより、DNAリガーゼの生産を著しく高め
ることが知られている。

しかしこの場合には同時にフアージ粒子が出来
るため酵素の精製に不利であること、及びフアー
ジによる汚染等が考えられ、特に組み換え体
DNAをもつフアージによる汚染は社会的に大き
な問題がある。

またプラスミドに特定の酵素蛋白の遺伝情報を
組み込んで宿主に感染させた場合には、特定の酵
素が常に生産される状態にあり、保存時において
も酵素を作り続けるように働くため、宿主の代謝
は著しく撹乱され、これを補償する二次的な変異
がいろいろと誘起される。たとえば、感染したプ
ラスミドに変異を生じてプラスミドのコピー数を
減じるように変わつたものや、酵素の機能や合成
能を低下させるような変異を獲得したものや、あ
るいは他の代謝系を変えてひずみを補正するよう
な変異体が出現し、実際にはこの二次的に起こる
変異に左右されることが多く、遺伝子の組み換え
操作はまだまだ充分でない。

そこで本発明者らは、上記諸欠点を解消するた
め、バクテリオフアージを用いて種々検討を行つ
た。

一般にフアージ粒子は蛋白質と核酸（DNAあ
るいはRNA）とから構成されており、核酸の囲
りを蛋白質（コート蛋白質と呼ばれている）が包
むような構造をとつている。核酸には、バクテリ
オフアージが宿主に感染し、その細胞内で増殖す
るのに必要な全ての遺伝情報が記憶されている。
例えばバクテリオフアージλ（ラムダ）の場合に
は、DNA鎖の一方の半分にはフアージDNAの自
己複製に必要とされる遺伝情報が記憶されてお
り、もう一方の半分にコート蛋白質の合成に関与
する遺伝情報が記憶されている（A.D.Hershey編
Cold Spring Harbor Lap.発行「The
Bacteriophage Lambda」45頁、1971年）。そこ
でもしフアージDNAのこのコート蛋白質の合成
に関与する遺伝情報の部分の代りに他の遺伝情
報、例えば有用酵素の合成に関する遺伝情報を有
するDNA部分をエンドヌクレアーゼとDNAリガ
ーゼを利用し入れ換えるならば、フアージ感染宿
主細胞内でコート蛋白質の代りに大量の有用酵素
を合成させることが可能と考えられる。

しかし、一般にフアージは自己複製に関与する
DNA部分にもエンドヌクレアーゼ感受性を有し
ているため、エンドヌクレアーゼによりその
DNA部分が開裂されて自己増殖が不可能にな
る。

そこで本発明者等は、自己複製に関与する
DNA部分に損傷を与えずしてその部分のエンド
ヌクレアーゼ感受性を消去し、そしてコート蛋白
質の合成（製造）に関与するDNA部分を目的と
する遺伝情報をもつDNA断片に置き換えコート
蛋白質生産能を欠失した新規組み換え体DNAの
作成法を鋭意研究した結果、DNAの複製及び宿
主染色体への組み込みに関与するDNA部分にエ
ンドヌクレアーゼによる開裂部位が存在せずにそ
の他のDNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位
を有するフアージDNAと、それと同種又は類縁
でしかもコート蛋白質製造の遺伝情報DNA部分
にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもつフアージ
DNAと、目的とする遺伝情報を有するDNAを用
いることにより、目的とする遺伝情報をもつ
DNA断片をコート蛋白質製造の遺伝情報をもつ
DNA部分に置き換え、遺伝子操作における遺伝
子のクローン化に際し、自己複製可能なコート蛋
白質生産能を欠失し、目的とする遺伝情報をもつ
混成DNAの作成を効率よく、容易に可能ならし
めることの新知見を得、この知見に基いて本発明
を完成したのである。

すなわち、本発明はテンペレートフアージの
DNAの複数及び宿主染色体への組み込みに関与
するDNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位を
もたず、その他のDNA部分にエンドヌクレアー
ゼ開裂部位を有するフアージDNAとコート蛋白
質製造の遺伝情報をもつDNA部分にエンドヌク
レアーゼ開裂部位を有するテンペレートフアージ
DNAをエンドヌクレアーゼで切断し、他方目的
とする遺伝情報を有するDNAをエンドヌクレア
ーゼで切断した後、これらを混合し、次いで
DNAリガーゼを加え、該混合液からコート蛋白
質製造の遺伝情報をもつDNA部分が目的とする
遺伝情報をもつDNA断片に置き換えられ、コー
ト蛋白質生産能を欠失したフアージDNAを採取
することを特徴とする新規組み換え体DNAの作
成法であ、本発明によつて得られた組み換え体
DNAは、宿主染色体への組み込みが可能であ
り、又宿主に組み込まれた組み換え体DNAは誘
発により大量に複製させることができる。またこ
の新規組み換え体DNAは、コート蛋白質生産能
を欠失しているため、活性型フアージとはならな
いためフアージによる汚染がなく、更に目的とす
る遺伝情報のDNAとして従来よりも分子量の大
きいものを組み換えることができる。

以下本発明について具体的に説明する。

一般にバクテリオフアージは多かれ少なかれ宿
主の機能に依存し増殖しているわけであるが、宿
主の染色体外に独立して増殖できるレプリコンで
あり、自律的状態にあるが、本発明に使用される
バクテリオフアージとしては宿主細胞に感染した
場合、宿主細胞のDNAにフアージDNAが組み込
まれる性質（溶原性）を有するテンペレートフア
ージ（Temperate phage）が用いられる。この
テンペレートフアージとしてはλ系
（lambdoid）が好ましく、λ系フアージとしては
λ（ラムダ）（IFO20016）、434（IFO20018）、82
（IFO20019）、φ80（IFO20020）、φ170
（IFO20021）などが挙げられ、また宿主DNAに
組み込まれたこれらフアージDNA、たとえば大
腸菌（E.coli）W3110に容原化されたφ80〔大腸
菌（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110
（φ80）（ATCC31277）〕、大脹菌（E.coli）
W3350に溶原化されたλcI857〔大腸菌（E.coli）
K12ストレイン（strain）W3350（λcI857）
（ATCC31278）〕なども用いられる。

次にエンドヌクレアーゼとしては、DNA鎖の
特定の部位を認識することができ、その認識部位
のDNA二重らせんを千鳥足状の付着端
（cohesiveends）を生じさせるように切断を行な
う特異性の極めて高いエンドヌクレアーゼが好ま
しく、この酵素としては制限酵素が好適であり、
具体的にはEcoRI、BamI、Hind 等が挙げら
れる。なお制限酵素は生化学工業又はベーリンガ
ー・マンハイム・山之内より入手できる。

まず本発明に用いれるDNAの複製及び宿主染
色体の組み込みに関与するDNA部分にエンドヌ
クレアーゼ開裂部位をもたず、その他のDNA部
分にエンドヌクレアーゼ開裂部位を有するフアー
ジDNAの作成であるが、たとえば、制限酵素に
全く開裂されないエンドヌクレアーゼ抵抗性の変
異株フアージを作成した後、DNAの複製及び宿
主染色体への組み込みに関与するDNA部分以外
のDNA部分にも開裂部位をもつフアージと掛け
合せることにより得ることができる。

上記のエンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージ
は、たとえば次のようにして得ることができる。
λ系フアージを制限酵素をもつている宿主ともた
ない宿主に交互に培養すると、制限酵素の作用を
受けるフアージは死滅し、制限酵素の作用を受け
にくい変異株が次第に増加する。このような微生
物的濃縮法によりついには制限酵素の作用を全く
受けない（制限酵素によりDNA鎖が全く開裂さ
れない）DNAをもつフアージ（制限酵素抵抗性
フアージ）を得ることができる。

また制限酵素の切断部位を部分的に欠失させた
後、微生物的濃縮法を用いることにより、より早
く抵抗性フアージを得ることができる。例えば
DNA上の制限酵素の切断部位を部分的に消去す
る方法としては、フアージの切断部位を含む
DNA部分を欠失させた欠失変異株を分離するこ
とである。即ちフアージの生存に不必要なDNA
部分に制限酵素の切断部位が存在する場合、その
DNA部分が欠失した変異株を分離することによ
り、そのフアージの制限酵素に対する抵抗性を増
加させることができる。欠失変異株は、切断部位
を含むDNA部分が欠失しているため比重が軽く
又熱安定性がよいので、この性質を利用して通常
のフアージ培養液から分離できる。たとえば培養
液にCsCl（塩セシウム）を添加して遠心分離す
るCsCl密度こう配遠心法、又はフアージ培養液
を60℃位に加熱して生き残つたフアージを分離す
ることにより欠失変異株を得ることができる。こ
の変異株を使用して制限酵素をもつている宿主と
もたない宿主に交互に培養する微生物的濃縮法に
より制限酵素の作用を全く受けないDNAをもつ
フアージをより早く得ることができる。

次にこのようにして得た制限酵素による開裂部
位の全く存在しないエンドヌクレアーゼ抵抗性フ
アージ（以下、単にエンドヌクレアーゼ抵抗性の
フアージと称する）DNAを用いフアージDNAの
複製及びフアージDNAが宿主染色体に組み込ま
れるのに必要な遺伝情報をもつDNA部分以外の
DNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもつ
フアージを得るために、λ系フアージの内少なく
ともDNAの複製及び宿主染色体への組み込みに
関与するDNA部分以外のDNA部分にエンドヌク
レアーゼ感受性を有するフアージ（以下、単にエ
ンドヌクレアーゼ感受性のフアージと称する）を
用いエンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージと掛け
合わせを行なう。掛け合わせの方法としてはエン
ドヌクレアーゼ抵抗性のフアージ液（10⁹〜
10¹⁰／ml）とエンドヌクレアーゼ感受性のフアー
ジ液（10⁹〜10¹⁰／ml）とを混合するか、または
しないで両者に感受性のある大腸菌（両者が増殖
可能な大腸菌）（10⁸〜10⁹／ml）に２種のフアー
ジを同時に又は相前後して感染させる。あるいは
K12株に含まれる大腸菌に溶原化されたエンドヌ
クレアーゼ抵抗性又は感受性のフアージを誘発し
た後に別のエンドヌクレアーゼ感受性又は抵抗性
のフアージを感染させることによつても可能であ
る。その後上記のようにフアージを感染させた大
腸菌を培地（培地としては大腸菌の生長可能な培
地であれば特に制限されない）、たとえばトリプ
トン培地に入れ、37℃で１〜２時間振盪培養す
る。

なお感受性の大腸菌としては、一般的なK12株
に含まれる大腸菌ならばいずれでもよく、たとえ
ばW3110（ATCC27325）、W3350
（ATCC27020）、1100（Max−Plank−Institut西
独）等が挙げられる。。また大腸菌は培養液の状
態で用いてもよいが、培養液を遠心分離して培養
液を除去した後、10ｍＭのMgCl₂に懸濁し、37℃
で１時間振盪した後使用した方がフアージの吸着
感染が良くなる。

このようにしてフアージDNAの複製及びフア
ージDNAが宿主染色体に組み込まれるのに必要
な遺伝情報をもつDNA部分以外のDNA部分にエ
ンドヌクレアーゼによる開裂部位を有するフアー
ジを10⁵／ml程度得ることが出来る。

しかし、フアージの生存に不必要なDNA部分
が欠失した欠失変異株を分離した後、エンドヌク
レアーゼの作用を全く受けないDNAをもつフア
ージを得た場合、欠失したDNA部分に宿主染色
体への組み込みに関与するDNA部分が含まれて
おり、そのDNA部分が必要な場合には、該エン
ドヌクレアーゼ抵抗性の欠失変異株に、欠失変異
株作成時の親株又は同種で、たとえば免疫に関与
する遺伝情報が変更した株、たとえば免疫性を示
すための蛋白質を作れなくなつたか、あるいは免
疫性を示すための蛋白質の性質が変り免疫性を示
さないか若しくは特定の条件下で免疫性を示す株
を掛け合わせて、塩化セシウム密度こう配遠心法
により重いフアージ部分を採取し免疫が変更して
いない株を分離すると、DNAの複製及び宿主染
色体への組み込みに関与するDNA部分を有し、
欠失していた部分に開裂部位を有するフアージを
得ることができる。

欠失していた部分の開裂部位が宿主への組み込
みに関与する遺伝情報部分に存在しない場合に
は、そのままDNAの複製及びフアージDNAが宿
主染色体に組み込まれるのに必要な遺伝情報をも
つDNA部分以外のDNA部分にエンドヌクレアー
ゼ開裂部位を有するフアージとして用いることが
できるが、該部分に存在する場合には、微生物的
濃縮法により開裂部位を全て消去した後にエンド
ヌクレアーゼ感受性のフアージと掛け合わせるこ
とにより目的とするフアージを得ることができ
る。

また、エンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージ
DNAとして宿主染色体への組み込みに関与する
DNA部分が欠失しているフアージを用いた場合
には、エンドヌクレアーゼ感受性のフアージの宿
主染色体への組み込みに関与するDNA部分が組
み込まれた、DNAの複製及びフアージDNAが宿
主染色体に組み込まれるのに必要な遺伝情報をも
つDNA部分以外のDNA部分にエンドヌクレアー
ゼ開裂部位を有するフアージを得ることができ
る。

得られたフアージから目的とするフアージを分
離するには次の方法による。

たとえば、λ系フアージの内の任意のものをＡ
フアージおよびＢフアージとし、エンドヌクレア
ーゼ抵抗性のＡフアージとエンドヌクレアーゼ感
受性のＢフアージを掛け合せ、フアージDNAの
コート蛋白質製造の遺伝情報部分が感受性Ｂフア
ージの部分であり、自己複製に関与する遺伝情報
部分が抵抗性Ａフアージの部分の新種フアージを
得れば、ＡレジスタントＢ免疫性の大腸菌におい
て、新種フアージのみが増殖することが出来、他
のフアージは生育することが出来ず、この方法に
より分離することが出来る。

このＡレジスタントＢ免疫性の大腸菌を得るに
は次の方法による。

まずＡフアージ好ましくは溶原化の起らない条
件でＡフアージを大腸菌に感染させる。たとえば
大腸菌１に対して溶原性を失つたＡフアージの変
異株100程度を混合し、生残つた大腸菌はＡフア
ージにレジスタントな大腸菌である。一般にテン
ペレートフアージはある確率で大腸菌に溶原化さ
れるため、にごつたプラーク（溶菌斑）を作る
が、溶原性を失なつた変異株は透明なプラークを
作るため、この透明なプラークからフアージを採
取すれば、溶原性を失つたフアージを得ることが
でき、該フアージを用いると、Ａフアージレジス
タントな大腸菌を得るための選別操作が簡単で好
ましい。

即ちこの大腸菌は使用したフアージに抵抗性を
有し、Ａフアージを吸着しない性質を有するもの
である。吸着の特異性はフアージの尾部に存在す
る蛋白質によつて支配されている。このフアージ
の吸着に関する遺伝情報がコート蛋白質製造の遺
伝情報DNA部分に含まれているので、Ａフアー
ジコート蛋白質製造の遺伝情報を有するフアージ
はＡフアージにレジスタントな大腸菌には吸着出
来ず、大腸菌中には進入出来ない。宿主大腸菌が
フアージ抵抗性変異をもつているかどうかは次の
方法で確認することが出来る。例えばλフアージ
にレジスタントな大腸菌はマルトースを資化する
ことができないので、マルトースと指示薬（メチ
レンブルー及びエオシンイエロー）を含む培地に
培養した場合、菌体が赤く染色されないことで確
認される。

次にＡレジスタント宿主に対してＢ免疫性を付
与する。即ち免疫性を支配している遺伝情報が自
己複製に関与するDNA部分に存在する、たとえ
ばＢフアージをＡレジスタント宿主細胞に感染さ
せ宿主DNAにＢフアージDNAが組み込まれた宿
主細胞を作成する。この宿主細胞に組み込まれた
ＢフアージDNAと同じ免疫性を有するフアージ
が宿主細胞内に進入してもそのフアージは宿主細
胞内では増殖できない。ＢフアージDNAが宿主
DNAに組み込まれたかどうかは、宿主大腸菌に
紫外線を照射する等、フアージを誘発した後に宿
主菌を振盪培養し、Ｂフアージが遊離してくれば
宿主細胞DNAにＢフアージが組み込まれていた
ことになる。

また同種のフアージＸ、X′を用いた場合に
は、たとえばエンドヌクレアーゼ抵抗性にするフ
アージＸとして免疫性を示すための蛋白質を作れ
なくなつたか、あるいは免疫性を示すための蛋白
質の性質が変り免疫性を示さないか若しくは特定
の条件下で免疫性を示すフアージを用い、フアー
ジＸのDNA複製及び宿主染色体への組み込みに
関与するDNA部分以外の部分のエンドヌクレア
ーゼ開裂部位を部分的に欠失させた欠失変異株で
あるフアージを分離した後、微生物的濃縮法によ
りエンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージを得る
か、若しくはフアージＸから微生物的濃縮法によ
りエンドヌクレアーゼ抵抗性フアージを分離し、
そのフアージからDNA複製及び宿主染色体への
組み込みに関与するDNA部分以外の部分を部分
的に欠失させたエンドヌクレアーゼ抵抗性のフア
ージを得、該フアージと残りのもう一方のフアー
ジX′を掛け合わせ、CsCl（塩化セシウム）を添
加して遠心分離するCsCl密度こう配遠心法等に
より比重の重い方を採取し、その中からエンドヌ
クレアーゼ抵抗性にしたフアージＸの免疫をもつ
株を採取すれば目的とするフアージを分離するこ
とができる。

次にもう一方のテンペレートフアージとして
は、コート蛋白質の合成に関与する遺伝情報をも
つDNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をも
ち、DNA末端の付着端（cohesive ends）がDNA
の複製及び宿主染色体への組み込みに関与する
DNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位（作用
部位）をもたないフアージと同じであるテンペレ
ートフアージが用いられる。

他方、目的とする遺伝情報を有するDNA（供
与体DNA）としては、微生物（細菌、糸状菌、
酵母）、高等動殖物、または形質導入フアージ等
由来のDNAが挙げられ、新規組み換え体DNAと
して組み込まれる遺伝情報としては、例えばシス
チン合成酵素、サプレツサー遺伝子、DNAリガ
ーゼ、トリプトフアン合成酵素、カイコのフイブ
ロンの合成に関与する遺伝子、ホルモン合成に関
与する遺伝子等が挙げられる。

また、コート蛋白質の合成に関与するDNA部
分にエンドヌクレアーゼに対する開裂部位をもつ
フアージにあらかじめ目的とする遺伝情報を組み
込み、形質導入フアージとした後、そのDNAと
DNAの複製及び宿主染色体への組み込みに関与
するDNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位を
もたず、その他のDNA部分にエンドヌクレアー
ゼ開裂部位を有するフアージDNAを用いて、効
率よく新規組み換え体DNAを作成することがで
きる。

エンドヌクレアーゼを用いて、フアージDNA
又は目的とする遺伝情報を有するDNAを切断す
る場合には、DNA濃度20〜200μｇ/ml、酵素濃
度100〜2000ユニツト／mlとするのが好ましく、
26〜42℃、好ましくは37℃で、10分〜２時間作用
させるのがよい。

エンドヌクレアーゼによる切断は、適宜フアー
ジDNA及び目的とする遺伝情報を有するDNAを
混合して行つてもよい。

次にエンドヌクレアーゼを作用させた各溶液を
通常DNA量として等量ずつ混合した後、DNAリ
ガーゼを添加する。この場合に用いられるDNA
リガーゼとしては、大腸菌DNAリガーゼ、T4フ
アージDNAリガーゼ等が挙げられるが、T4フア
ージDNAリガーゼの方が入手しやすい。

DNAリガーゼを作用させる場合、通常DNA濃
度10〜80μｇ/mlに対しDNAリガーゼ濃度１〜10
ユニツト／mlを添加し、０〜10℃で１〜14日保持
する。

このようにして得られた種々の組み換え体
DNA等の混合物の中から目的とする組み換え体
DNAを採取するには次の方法による。

まず、組み換え体DNAの作成に使用したフア
ージと同じ付着端（cohesive ends）及び同じ免
疫（immunity）をもち、異なるアタツチメント
サイト（attachment site、溶原化する際に宿
主の染色体と組み換えを起す部位）をもつテンペ
レートフアージを溶原化した大腸菌に、同じ付着
端及び同じ免疫をもち、宿主染色体へのアタツチ
メントサイトをもたないテンペレートフアージ
を大量に感染させた後に、組み換え体DNAを混
合し、20〜40℃に保つことにより組み換え体
DNAを菌体内にとり込ませることができる。

菌体内に入つた組み換え体DNAは宿主に同じ
免疫をもつフアージが組み込まれているので、増
殖できず、宿主染色体に組み込まれやすくなる。
この様にして組み換え体DNAを溶原化した細胞
の中から目的のDNAをもつ細胞を分離するに
は、組み換えに使用した供与体DNAが酵母、細
菌、形質導入フアージ等に由来する場合には、目
的とする遺伝子の産物を生産する細胞を分離すれ
ばよい。例えば目的とする遺伝子がトリプトフア
ン合成酵素の遺伝子の場合には、トリプトフアン
合成酵素を合成できない大腸菌を用いて組み換え
体DNAをとりこませ、トリプトフアン合成能の
回復した細胞、即ちトリプトフアンを欠く培地で
生育可能な細胞を分離すればよい。

供与体DNAが糸状菌、高等動植物等に由来す
る場合には、予め大腸菌の中で発現可能な遺伝
子、例えば薬剤耐性遺伝子をもつプラスミド
DNAの断片等を供与体DNAにDNAリガーゼを用
いて結合させておき、その遺伝情報（薬剤耐性）
の発現した細胞を分離すればよい。

次に目的とする遺伝情報がベクター（DNA供
与体を組み込むことができ、自己増殖可能な
DNAを作るのに使用するDNA）として用いたフ
アージDNAに結合していて、そのDNAのコート
蛋白質合成に関与するDNA部分と置き換えられ
ているかどうかを確かめるには、目的とする遺伝
子の産物を生産し得る大腸細胞にベクターとして
用いたフアージと異なる免疫をもち、同じアタツ
チメントサイトをもつ例えばフアージＣを大量
に感染させ、フアージＣが溶原化した細胞をと
り、その細胞が目的とする遺伝子産物を生産し得
るかどうかを調べればよい。

目的とする遺伝情報がベクターとして用いたフ
アージDNAのコート蛋白質合成に関与するDNA
部分と置き換えられた形で結合し宿主に溶原化し
ている場合には、フアージＣが溶原化することに
よりその組み換え体DNAは宿主染色体から追い
出され、宿主が増殖をつづけると希釈されて消滅
してしまい、目的とする遺伝子の産物をつくらな
くなつてしまう。

この様にして得られた目的の遺伝情報をもつ
DNA断片がベクターとして用いたフアージDNA
のコート蛋白質合成に関与するDNA部分と置き
換えられた組み換え体DNAが溶原化している細
胞から組み換え体DNAを回収するには以下の方
法を用いる。

まずこの細胞には組み換え体DNAの他に最初
に溶原化した別のフアージDNAが存在するの
で、これを取り除く。

すなわち組み換え体DNAの分子量が最初に溶
原化したフアージDNAの分子量とあまり違わな
い場合には、両者の増殖を同時に誘発し培養を続
けると、最初に溶原化したフアージDNAからの
遺伝情報に基いてつくられるコート蛋白質に組み
換え体DNAがパツクされて感染性を有するフア
ージ粒子ができるので、得られた溶菌液の中には
最初に溶原化したフアージと組み換え体フアージ
の両者が存在する。この溶菌液を非溶原性大腸菌
の懸濁液に加えてフアージを感染させ目的とする
遺伝情報をもつ細胞を上記の様にして多数分離す
る。この中からフアージ粒子をつくらない細胞を
分離すればよい。フアージ粒子をつくるかどうか
はそのフアージが溶菌斑をつくり得る大腸菌を寒
天平板培地上にぬり、その上に検体細胞をスポツ
トし、培養した後に検体細胞のコロニーの周囲に
溶菌が起つているかどうかを調べればよい。

また組み換え体DNAの分子量が最初に溶原化
してあるフアージDNAの分子量と著しく違う場
合には、最初に溶原化したフアージと同じ部位に
溶原化し最初に溶原化したフアージと異なる免疫
をもち、その増殖が組み換え体DNAと同じ方法
では誘発できないフアージを大量に感染させるこ
とによりそのDNAを最初に溶原化してあるフア
ージDNAの代りに溶原化することにより代用す
ることができる。

この様にして得られた細胞を培養し組み換え体
DNAの複製を誘発した直後に組み換え体DNAと
同じ付着端をもちDNAの分子量が組み換え体
DNAとは異なる変異株、例えばフアージＤを感
染させ、培養することによりフアージＤの生産す
るコート蛋白質にパツクされた形で組み換え体
DNAを回収できる。この様にして得られたフア
ージＤと組み換え体DNAを含むフアージとは、
コート蛋白質が同一でDNAの分子量が異なり、
異なる比重をもつているので、塩化セシウム密度
こう配平衡遠心法により分離し単離することがで
きる。

組み換え体DNAの分子量が著しく大きくフア
ージＤのコート蛋白質にパツクされない場合に
は、組み換え体DNAを溶原化した細胞を培養
し、組み換え体DNAの複製を誘発した後に培養
を続けることにより組み換え体DNAを多数その
細胞内につくらせることができる。この細胞から
DNAを抽出すると、大腸菌のDNAは分子量が極
めて大きいので抽出操作中に切断されて両端のあ
る線状のDNA断片として回収されるが、両端の
閉じた環状分子として回収されるのは組み換え体
DNAである。線状DNAと環状DNAは塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド密度こう配平衡心法に
より分別することができるので、この方法により
組み換え体DNAを回収できる。

このようにしてフアージDNAのコート蛋白質
製造の遺伝情報の部分を欠失し、目的とする遺伝
情報をもつDNA断片を組み換えられた新規組み
換え体DNAを宿主に感染させて宿主のDNAに組
み込ませた形で保存し、必要に応じて誘発させる
ことにより遺伝情報を『増幅』することができ、
またその宿主細胞をたとえばトリプトン培地に培
養することにより増幅された情報に基づいて特定
の蛋白質を大量に生産せしめることが出来るの
で、本発明の産業的有益性は多大なものである。

次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに
よつて制限されるものではない。

なお実施例中で使用する各培地を説明すると、
次の如くである。

トリプトン寒天平板培地トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25％、寒
天1.2％；加圧滅菌後30mlずつを直径９cmのシ
ヤーレに分注した。

B₁−ソフトアガートリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25％、
MgCl₂5ｍＭ、ビタミンB₁1.5μｇ/ml、寒天0.5
％；３mlずつ小試験管に分注し加圧滅菌した。

トリプトン培地トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25％。

CA平板培地 K₂HPO₄0.7％、KH₂PO₄0.3％、クエン酸ナト
リウム0.05％、MgSO₄・7H₂O0.01％、
（NH₄）₂SO₄0.1％、グルコース0.2％、カゼイン
酸分解物0.15％、及び寒天1.5％からなる平板
培地。

eM−SM平板培地 K₂HPO₄1.05％、KH₂PO₄0.45％、MgSO₄・
7H₂O0.005％、（NH₄）₂SO₄0.1％、クエン酸ナ
トリウム0.047％、グルコース0.2％、Difco
nutrient broth0.01％、ストレプトマイシン硫
酸0.01％、及び寒天1.5％からなる平板培地。

Ｈ−trp培地 0.1Mリン酸カリウム緩衝液PH7.0、0.015M
（NH₄）₂SO₄、１ｍＭ MgSO₄、1.8×10^-6M
FeSO₄、0.2％グルコース、及び0.1mg/mlトリ
プトフアンからなる液体培地。

Ｉ−trp培地 0.01Mトリス緩衝液PH7.1、６×10^-5M
MgCl₂、６×10^-4Mリン酸カリウム緩衝液PH
7.1、５×10^-4M（NH₄）₂SO₄、４×10^-10M
FeSO₄、0.2％グルコース、及び0.1mg/mlトリ
プトフアンからなる液体培地。

実施例１１フアージλcI857から欠失変異株フアージλ
cI857b6042の分離１−１大腸菌（E.coli）K12ストレインW3350
（λcI857）〔微工研菌寄第8603号（FERM Ｐ
−8603）、ATCC31278〕を１白金耳トリプト
ン倍地３mlに接種し、30℃で16時間振盪前培
養する。得られた前培養液３mlを30mlのトリ
プトン培地に入れ、30℃で３時間振盪培養
後、43℃で20分間振盪し、λcI857を誘発す
る。その後、更に30℃で３〜６時間培養を続
け、溶菌現象が起り、培養液が透明に近くな
つたところで培養をやめ、培養液を遠心分離
して細胞破片を除去し、その上澄液をフアー
ジλcI857液とした。この時のフアージ数は
約10¹¹／mlであつた。

１−２該フアージλcI857液0.1mlを0.02Mエチレ
ンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含むトリ
ス緩衝液（PH8.2）５mlに懸濁し、40℃に10
分間保つた後に、0.01M MgCl₂を含む0.01M
トリス緩衝液（PH7.2、トリス−Mg緩衝液と
略す）で10⁷／mlになる様に希釈し、その0.1
mlとトリプトン培地で37℃で16時間静置培養
した大腸菌W3110（ATCC27325）培養液
0.25mlとを46℃に加温したB₁−ソフトアガー
３mlと共にトリプトン寒天平板培地に撤き、
37℃で４〜５時間培養した。平板上のフアー
ジは４mlのトリス−Mg緩衝液で洗い出しゴ
ム栓付の殺菌した小試験管に保存した。続い
てこのフアージ液の一部を用いて上と全く同
様の操作を５回繰返した。

１−３更に上記１−２で得られたフアージを、１
−２の40℃に10分間処理の代りに60℃に10分
間処理する以外は１−２と全く同様の方法で
４回繰返し、得られたフアージ液を10³／ml
に稀釈し、その0.1mlを上記大腸菌W3110の
培養液0.25mlに混合し、トリプトン寒天平板
培地に撤き、37℃で一晩培養した後に100個
前後の溶菌斑が見られる平板からその１つの
溶菌斑中のフアージを竹串でとりトリス−
Mg緩衝液に懸濁し、フアージλcI857b6042
株を得た。

この欠失変異株は親株λcI857の比重1.493
よりもやや軽い比重1.465を示し、その比重
から計算によりDNAの約23％が欠失してい
ることがわかつた。又、親株フアージλ
cI857DNAは制限酵素EcoRI（生化学工業K.
K.より入手）により５ケ所で切断れるが、
フアージλcI857b6042株では、大腸菌W3110
並びにW3110（RI）を用いてその生菌数を
測定し、計算式により算出したところ、
EcoRIによる切断部位が３ケ所になつたこと
が確認された。

なお大腸菌W3110（RI）は次の様にして
分離した。薬剤耐性因子RI（ペニシリン、
ストレプトマイシン、テトラサイクリン、サ
ルフア剤に耐性）をもつ大腸菌（E.coli）
RY−13（カリフオルニア大学H.W.Boyerよ
り入手）〔微工研菌寄第8606号（FERM Ｐ
−8606）〕と大腸菌W3110（ATCC27325）を
混合培養し、薬剤耐性因子をもつ大腸菌
W3110（RI）を分離した。

２フアージλcI857b6042株より制限酵素EcoRI
作用を全く受けないフアージλcI857b6042RI^r
株の分離２−１１−２の方法で培養した大腸菌W3110株の
16時間静置培養液0.25mlとフアージλ
cI857b6042液0.1mlとを46℃に加温したB₁−
ソフトアガー３ml中で混合し、トリプトン寒
天平板培地上に撤き、37℃で４〜4.5時間培
養した後に、トリス−Mg緩衝液４mlとクロ
ロホルム３滴を加えて37℃に15分間放置し、
次いで上澄をピペツトでゴム栓付の小試験管
に移した。この時のフアージ数は６×10¹⁰／
mlであつた。

２−２２−１で得られたフアージ粒子の数を制限
酵素EcoRIをもつ大腸菌W3110（RI）株を用
いて測定する〔大腸菌W3110（RI）株は制
限酵素によりその細胞内に侵入したフアージ
DNAを切断し不活性化する。その為に大腸
菌W3110（RI）株を用いて測定したフアー
ジ数は制限酵素をもつていない大腸菌W3110
株を用いて測定した数に比べて遥かに低く1/
６００の10⁸／mlを示した〕。

１−２の方法で培養した大腸菌W3110
（RI）の培養液0.25mlと、２−１で得られた
フアージをW3110（RI）で測定した場合に
10⁷／mlになる様に稀釈し、その0.1mlを用い
て２−１と全く同様の操作を行いフアージ液
を得た。

２−３２−２で得られたフアージは今度は２−１
の方法で処理した。この様に２−１と２−２
を交互に10回繰り返し最後に２−１の方法で
処理した標品のフアージ数を大腸菌W3110
（RI）で測定したところ、大腸菌W3110で測
定した数と変らない値を示した。つまり、得
られたフアージ標品はEcoRIの作用を全く受
けない変異株から成つていることが示され
た。このフアージ数を10³／mlに稀釈し、そ
の0.1mlを大腸菌W3110培養液の0.25mlに混
合し、トリプトン寒天平板上で互に重ならな
い溶菌斑をつくらせ、そこからEcoRIの作用
を全くうけないフアージλcI857b6042RI^r株
を単離した。

３ λcI857b6042RI^r株と野生型λとからDNAの
中央部分にのみ制限酵素EcoRI感受性をもつλ
cI857sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１の作成３−１ λcI857b6042RI^rとλの掛け合わせ λcI857b6042RI^rフアージ液（3.6×10⁹／
ml）0.2ml、λフアージ液（3.5×10⁹／ml、
大腸菌W3110（λ）を15mlのトリプトン培地
に37℃で振盪培養し、大腸菌菌数が10⁹／ml
に達した時に直径15cmのシヤーレに移し、
15Wの紫外線ランプで50cmの距離から２分12
秒照射してλフアージの増殖を誘発した後
に、更に３時間振盪培養して得た液）0.2
ml、及び大腸菌1100懸濁液（大腸菌1100を15
mlのトリプトン培地で振盪培養し、菌数が３
×10⁸／mlに達した時に菌体を遠心分離し、
５mlのトリス−Mg緩衝液に懸濁し、37℃で
１時間振盪して得た液）〔なお、大腸菌1100
に代えて大腸菌W3110（ATCC27325）を使
用しても全く同様の結果が得られた〕0.2ml
を混合し、37℃に10分間放置した後にその
0.1mlを10mlのトリプトン培地に加え、37℃
で100分間振盪培養してフアージ培養液を得
た。

３−２塩化セシウム（CsCl）密度こう配遠心
法によるフアージ粒子の分画３−１で調製したフアージ液中にはλ
cI857b6042RI^r、λ及び両者の雑種が存在す
る。この中からλcI857b6042RI^rを除くため
にCsCl密度こう配遠心を行つた。この遠心
は比重の異なる高分子を分離するのに極めて
有効な方法であり、λcI857b6042RI^rはλに
比べて比重が軽いので遠心後に重い部分のフ
アージ粒子を分取すればよい。

３−１で得られたフアージ液をトリス−
Mg緩衝液で30倍に稀釈し、その0.69mlを５
mlの超遠心用チユーブにとり、比重1.6の
CsCl溶液2.3mlを加えて混合しチユーブの残
りの部分に流動パラフインを重層し水平ロー
ターを用いて25000回転／分で24時間遠心を
行つた。遠心後、チユーブの底に穴をあけ、
滴下する内容物を順次３滴ずつ小試験管にと
つた。11番目から14番目までと16番目から20
番目までの試験管中にフアージの存在が確か
められたので、12番目の試験管の内容物（比
重の重いフアージが入つている）0.1mlを順
次1M KCl、0.3M KCl、及び0.1M KClに対
て透析し、その0.05mlを0.1mlの大腸菌1100
懸濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC27325）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕（２×10⁹／ml）と混合
し、B₁−ソフトアガー（46℃）３mlを加え
てトリプトン寒天平板上に撤いた。38℃で１
晩培養すると、約5000個の不透明な溶菌斑と
50個の透明な溶菌斑が出現した。不透明な溶
菌斑をつくるフアージは野生型のλフアージ
であるが、透明な溶菌斑をつくるフアージは
λcI857b6042RI^rの性質（透明な溶菌斑）と
野生型λの性質（比重が重い）を併せて持つ
ているので、両者の雑種と考えられる。

透明な溶菌斑12個からフアージ粒子を竹串
でとり、各々５mlのトリス−Mg緩衝液に懸
濁し、それを更に同じ緩衝液で100倍に希釈
し、その0.1mlと大腸菌1100懸濁液〔なお、
大腸菌1100に代えて大腸菌W3110
（ATCC27325）を使用しても全く同様の結果
が得られた〕0.1mlを３mlのB₁−ソフトアガ
ー（46℃）と共にトリプトン寒天平板培地に
撤き、38℃で１晩培養して溶菌斑をつくらせ
た。この操作を更にもう一度繰り返して得ら
れた溶菌斑からフアージ粒子を竹串で0.1ml
のトリス−Mg緩衝液にとり、0.25mlの大腸
菌1100懸濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大
腸菌W3110（ATCC27325）を使用しても全
く同様の結果が得られた〕（２×10⁹／ml）と
B₁−ソフトアガー（46℃）３mlを加えて混
合し、トリプトン寒天平板培地に撤いた。そ
して37℃で４時間培養した後に、トリスー
Mg緩衝液４mlとクロロホルム３滴を加え、
37℃に15分間放置し、上澄をピペツトでゴム
栓付の小試験管に移し、フアージ保存液とし
た。次いで大腸菌1100〔なお、大腸菌1100に
代えて大腸菌W3110（ATCC・27325）を使
用しても全く同様の結果が得られた〕とトリ
プトン培地を用いてフアージを大量培養して
CsCl密度こう配遠心を用いてフアージを精
製し、そのDNAを大腸菌の制限酵素EcoRIで
切断し、アガロース電気泳動で分析すると、
12株のうち２株がDNAの中央部分に２箇所
の切断部位をもつことがわかつた。そのうち
の１株λcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１をテンペ
レートフアージのDNAの複製及び宿主染色
体への組み込みに関与するDNA部分にエン
ドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、その他の
DNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位を
有するフアージDNAをもつフアージとして
使用した。

４ φ80に目的とする遺伝情報（トリプトフアン
合成酵素）が導入された形質導入フアージφ
80ptrpの分離 φ80のフアージは大腸菌染色体上のトリプト
フアン合成酵素の合成に関与する遺伝情報の存
在する部分（トリプトフアンオペロン）の近く
に溶原化する。φ80の溶原菌を紫外線照射しフ
アージの増殖を誘発する際に極めて低い頻度で
あるがトリプトフアンオペロンを組み込んだφ
80フアージが出現するので、このフアージを分
離すればよい。そしてこのようにして得たφ
80ptrpを、本発明におけるコート蛋白質製造
の遺伝情報DNAにエンドヌクレアーゼ開裂部
位を有するテンペレートフアージ及び目的とす
る遺伝情報を有するDNA（DNA供与体として
用いた。

まずトリプトフアン合成酵素の合成能を失つ
た菌株である大腸菌K12B₄trp^-（スタンフオー
ド大学より入手）〔なお、大腸菌K12B₄trp^-に
代えて大腸菌K12trpB^-（ATCC23718）を使用
しても全く同様の結果が得られた〕をトリプト
ン培地15mlに接種し、37℃で４時間振盪培養し
た後に遠心分離し、15mlのトリス−Mg緩衝液
に懸濁した。その１mlに、メンブランフイルタ
ーを通して除菌したφ80フアージ〔トリプトフ
アン合成能を有する溶原菌大腸菌（E.coli）
K12ストレイン（strain）W3110（φ80）〔微工
研菌第8604号（FERM Ｐ−8604）、
ATCC31277〕より紫外線で誘発して得た〕液
2.2×10¹⁰／ml）0.12mlを加え37℃、15分間放置
した後に、その0.1mlずつをCA平板培地上に広
げ37℃で７〜14日培養した。生じたコロニーか
ら菌体を竹串でとり、４mlのトリス−Mg緩衝
液に懸濁し、クロロホルム２滴を加えて激しく
振盪した。この懸濁液を更にトリス−Mg緩衝
液で100倍に希釈し、その0.05mlを大腸菌1100
懸濁液〔なお、大腸菌1100に代えて大腸菌
W3110（ATCC27325）を使用ても全く同様の
結果が得られた〕（２×10⁹／ml）0.1mlと混合
し、B₁−ソフトアガー（46℃）３mlを加えて
トリプトン寒天平板上に撤いた。37℃で１晩培
養して生じた溶菌斑からフアージを竹串でと
り、大腸菌K12B₄trp^-SM^r｛大腸菌K12B₄trp^-
〔なお、大腸菌K12B₄trp^-に代えて大腸菌
K12trpB^-（ATCC23718）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕をストレプトマイシン含
有寒天平板培地に培養し生育したコロニーより
分離したストレプトマイシン抵抗性を有する
株｝（10⁹／ml）0.1mlを0.6％寒天溶液（46℃）
３mlと共に撤いたeM−SM平板培地上に接触し
37℃で培養した。eM−SM平板培地はトリプト
フアンが少量しか含まれていず、大腸菌
K12B₄trp^-SM^rはその生育にトリプトフアンを
必要とするので、平板上には少量の菌体のみが
生育してくる。そこで接種したフアージがトリ
プトフアン合成能をもつている場合には溶菌斑
の周囲にフアージによつてつくられたトリプト
フアンを資化して生育した菌のリングが生じ
る。このリングが生じるフアージを竹串でと
り、３−２で述べた方法により精製し、フアー
ジ保存液を調製してφ80ptrpとして以下に使
用した。

５ λcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１DNAとφ80ptr
p
DNA間の組み換え体DNAの作成５−１制限酵素EcoRIによるDNAの切断３及び４で得られた精製フアージを26ｍμ
の吸光度が８になる様に0.01M Tris−HCl
（PH8.0）、１ｍＭ MgCl₂、及び0.1ｍＭエチ
レンジアミンテトラ酢酸より成る緩衝液で希
釈し、その0.5〜１mlを100〜150mlの50％ホ
ルムアミドと10ｍＭエチレンジアミンテトラ
酢酸を含む0.1Mトリス緩衝液（PH8.5）に対
して24℃、16時間透析することによりDNA
を抽出した。これを更に0.1ｍＭエチレンジ
アミンテトラ酢酸を含む0.1Mトリス緩衝液
（PH7.5）150mlに対して４℃で４回透析して
各DNA標品とした。

DNA標品を0.1ｍＭエチレンジアミンテト
ラ酢酸を含む0.1Mトリス緩衝液（PH7.5）で
λcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１DNAは40μｇ/
ml、φ80ptrp DNAは80μｇ/mlになる様に
希釈し、その90μを小試験管にとり0.1M
MgCl₂10μと制限酵素EcoRI（Miles Lab.
製、生化学工業株式会社より入手）を、λ
cI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１DNAの場合には２
μ、φ80ptrp DNAの場合には３μ加
え、37℃に１時間放置してDNAの切断を行
なつた後に、73℃で10分間加熱し、次いです
ばやく０℃に冷却することによりEcoRIを失
活させた。

５−２組み換え体DNAの作成制限酵素によつて切断されたλcI857sRIλ
^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１DNAとφ80ptrp DNA25μ
ずつを混合し、20μの蒸溜水、10μの50
ｍＭ MgCl₂、10μの0.1Mジチオスレイ
トール、10μの１ｍＭ ATP、及び１μ
のT4リガーゼ（Miles Lab.社製、生化学
工業株式会社より入手）を加え、０℃に３日
間放置して組み換え体DNAを含む溶液を得
た。

T4リガーゼはDNA断片をつなぐ作用をも
つている酵素であり、制限酵素によつて切断
された２種類のDNAを混合してこの酵素を
作用させることにより両者の組み換え体を作
成することができるのである。

６組み換え体DNAの分離トリプトフアン要求性菌株大腸菌K12B₄trp^-
〔なお、大腸菌K12B₄trp^-に代えて大腸菌
K12trpB^-（ATCC23718）を使用しても全く同
様の結果が得られた〕にλcI857RI^rh80
（ATCC31285）｛該λcI857RI^rh80を大腸菌（E.
coli）1100〔Max−Plank−Institut西独、ハイ
デルベルグより入手〕に溶原化して得られた溶
原菌、すなわち大腸菌（E.coli）1100（λ
cI857RI^rh80）は工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第8605号（FERM Ｐ−
8605）として寄託されている｝〔なお、大腸菌
1100に代えて大腸菌W3110（ATCC27325）を
使用することもできる〕を溶原化させた菌株大
腸菌K12B₄trp^-（λcI857RI^rh80）をＨ−trp培
地10mlに接種し、30℃で20時間前培養を行な
い、その0.5mlを新らしいＨ−trp培地10mlに接
種して30℃で振盪培養を行つた。菌数が５×
10⁸／mlに達した時に氷で冷却し、その６mlを
遠心分離（10000回転／分、20分間）し、Ｉ−
trp培地1.5ml（０℃）に懸濁した。懸濁液を30
℃で12分間保温し、次いで０℃に６分間保つた
後に、Ｉ−trp培地に懸濁した宿主染色体への
アタツチメントサイトをもたないテンペレート
フアージであるλb2フアージ（国立予防衛生
研究所より入手）（２×10¹⁰／ml）1.5mlを加
え、30℃で12分間保つた。再び０℃に冷却した
後に、遠心分離を行ない0.01M MgCl₂と0.01M
CaCl₂を含む0.01Mトリス緩衝液（PH7.5）1.5ml
に再懸濁した。通常の大腸菌は外部のDNAを
菌体内にとりこむことはできないが、上記の方
法で処理した場合にはλ系のフアージDNAの
とりこみが可能となる。

ついで５−２で調製した組み換え体DNAを
含む溶液を73℃で10分間加熱し、急冷した後、
その５〜20μを0.01M MgCl₂と0.01M CaCl₂
を含む0.01Mトリス緩衝液（PH7.5）0.1mlに加
え、０℃に保つた後に上記の処理をした大腸菌
K12B₄trp^-（λcI857RI^rh80）懸濁液0.2mlを加
え、30℃で40分間加温して組み換え体DNAを
とりこませた。

その後45℃に保温したCA−ソフトアガー
（寒天の濃度が0.5％であるのを除いてCA平板
培地と同じ組成である）３mlを加えてCA平板
培地に撤いた。30℃で３〜７日間培養した後
に、30個のコロニーを得た。

このCA平板培地上の30個のコロニーのうち
周囲に溶菌の起つていないコロニーを分離し、
その中から42℃でトリプトン寒天平板培地で培
養して生育する大腸菌をCA平板培地に接種し
て生育のみられない性質を示す２株を分離し
た。

このようにして得られた上記２株は、トリプ
トフアン非要求性であり、42℃で培養して溶原
化されたフアージを除くと、トリプトフアン要
求性になるので、λcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１
のコート蛋白質の合成に関与する遺伝情報以外
の全ての情報を含んでいるDNA断片にφ
80ptrp由来のトリプトフアンオペロンを含む
DNA断片が結合したDNA、即ちλcI857sRIλ^０ _３
sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１DNAのコート蛋白質の合成に関
与するDNA部分にトリプトフアン合成酵素の
合成に関与するDNA断片とφ80ptrp DNA由来
の付着端をもつDNA断片とが置き換えられた
形の新規組み換え体DNAが宿主DNAに組み込
まれてトリプトフアン非要求性株となつた大腸
菌K12B₄trp^-（λcI857RI^rh80、λcI857sRIλ^０ _３
sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１dtrp）である。

実施例２実施例１の４まで全く同様に操作を行ないλ
cI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１及びφ80ptrpを得る
。

５−１制限酵素EcoRIによるDNAの切断３、４及びφ80（ATCC31277）から得ら
れた精製フアージを実施例１に記載したと同
様に処理して各DNA標品とした。

DNA標品を0.1ｍＭエチレンジアミンテト
ラ酢酸を含む0.1Mトリス緩衝液（PH7.5）で
λcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１DNAは40μｇ/
ml、φ80DNA及びφ80ptrp DNAは各80μ
ｇ／mlになる様に希釈し、その90μを小試
験管にとり、0.1M MgCl₂10μと制限酵素
EcoRI（Miles Lab.製、生化学工業株式会社
より入手）をλcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１
DNAの場合には２μ、φ80DNA及びφ
80ptrp DNAの場合には各３μ加え、37℃
に１時間放置してDNAの切断を行つた後
に、73℃、10分間加熱し、次いですばやく０
℃に冷却することによりEcoRIを失活させ
た。

５−２組み換え体DNAの作成制限酵素によつて切断されたλcI857sRIλ
^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１DNA25μ、φ80DNA及びφ
80ptrp DNA各12μずつを混合し、20μ
の蒸溜水、10μの50ｍＭ MgCl₂、10μ
の0.1Mジチオスレイトール、10μの１ｍ
Ｍ ATP、及び１μのT4リガーゼ（Miles
Lab.社製、生化学工業株式会社より入手）
を加え、０℃に３日間放置して組み換え体
DNAを作成した。

以下実施例１に記載したと同様の操作を行
ない50個のコロニーより１株の大腸菌
K12B₄trp^-（λcI857RI^rh80、λcI857sRIλ^０ _３
sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１dtrp）を分離した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における大腸菌K12B₄trp^-
（λcI857RI^rh80、λcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１
dtrp）の作成方法を示す図であり、第２図は実施
例２における大腸菌K12B₄trp^-（λ
cI857RI^rh80、λcI857sRIλ^０ _３sRIλ^０ _２sRIλ^０ _１dtr
p）
の作成方法を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１テンペレートフアージのDNAの複製及び宿
主染色体への組み込みに関与するDNA部分にエ
ンドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、その他の
DNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位を有す
るフアージDNAとコート蛋白質製造の遺伝情報
をもつDNA部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位
を有するテンペレートフアージDNAをエンドヌ
クレアーゼで切断し、他方目的とする遺伝情報を
有するDNAをエンドヌクレアーゼで切断した
後、これらを混合し、次いでDNAリガーゼを加
え、該混合液からコート蛋白質製造の遺伝情報を
もつDNA部分が目的とする遺伝情報をもつDNA
断片に置き換えられ、コート蛋白質生産能を欠失
したフアージDNAを採取することを特徴とする
新規組み換え体DNAの作成法。２テンペレートフアージがλ（ラムダ）系フア
ージである特許請求の範囲第１項記載の新規組み
換え体DNAの作成法。