【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は新規なビタミンD3誘導体に関する。
更に詳細には、その側鎖にラクトン構造を、１α
位に水酸基を有し、生理活性として、生体内の１
α，25―ジヒドロキシコレカルシフエロールのレ
ベルをコントロールし得る作用を有する新規なビ
タミンD3誘導体に関する。
しかして本発明によれば下記式
で表わされる、１α，25―ジヒドロキシビタミン
D3―26，23―ラクトン、すなわち１α３β，25
―トリヒドロキシ―９，10（19）―コレスタトリ
エノー26，23―ラクトンが提供される。かかる化
合物は本発明者らの知るかぎり文献未載の新規化
合物であり、その側鎖にγ―ラクトン構造を持
ち、かつ１α位に水酸基を有するという極めて特
異な構造をもつ化合物である。
そして、かかる化合物は、生理活性として、生
体内の１α，25―ジヒドロキシコレカルシフエロ
ールのレベルをコントロールし得る作用を有し、
それ故に医薬品としてその応用が十分に期待され
る有用な化合物である。
上記１α，25―ジヒドロキシビタミンD3―
26，23―ラクトン（以下Dx1という）は、１α―
ヒドロキシビタミンD3（以下、１α（OH）D3と
いう）又は１Α，25―ジヒドロキシビタミンD3
（以下、１α，25（OH）2D3という）をラツト又は
犬に、例えば経口，静注，筋注などの通常の手段
で、毒性的に許容し得る範囲内の量を投与し、投
与後約２時間〜約50時間経過後に、投与した１α
（OH）D3又は１α，25（OH）2D3の代謝産物とし
て、ラツト又は犬の血液中のプラズマの脂溶性部
分より、カラムクロマトグラフイー，高速液体ク
ロマトグラフイーなどの手段によつて、単離抽出
されるものである。
このような単離抽出法の一例として、例えば以
下に述べるような方法が挙げられる。
すなわち、ラツト又は犬を通常の量のビタミン
D3を含む飼料で飼育した後に、一昼夜絶食さ
せ、次いで0.4〜250μｇ／Kgの範囲で、経口的に
１α（OH）D3を投与する。そして投与後７，８
時間後に、エーテルにて麻酔をかけ、腹腔の大動
脈より採血する。採取した血液より、通常の方法
でプラズマを得、これをメタノール／クロロホル
ム（１／１，ｖ／ｖ）で抽出する。
次いで抽出液を、セフアデツクスLH―20のカ
ラムを用い、最初は、クロロホルム／ｎ―ヘキサ
ン（65／35，ｖ／ｖ）、次にクロロホルム／ｎ―
ヘキキサン／メタノール（75／23／２，ｖ／ｖ）
の展開溶媒を用いて、カラムクロマトグラフイー
に付する。次いで、１α，24，25―トリヒドロキ
シビタミンD3（以下、１α，24，25（OH）3D3と
いう）が現われるのと同一のフラクシヨンを集
め、これを次にマイクローポラシル（μ―
porasil）珪酸カラムを用い、展開溶媒としてイ
ソプロパノール／メチレンクロライド（6/94,v/
ｖ）を用いて、高速液体クロマトグラフイーにか
ける。次いで分離された主要部分を再び同一条件
で高速液体クロマトグラフイーにかける。そして
最後にマイクローポラシル、イソプロパノール／
ｎ―ヘキサン（15／85，ｖ／ｖ）の条件で高速液
体クロマトグラフイーに付し、精製されたDx1が
得られる。
例えば、400μｇの１α（OH）D3を40匹のラ
ツトに投与し、そのプラズマより、上記した条件
によつて単離精製することによつて、おおよそ
700ngのDx1が得られる。
かくして得られるDx1は生理活性として、本発
明者らの研究によれば、生体内の１α，25―
（OH）2D3のレベルをコントロールし得る作用を有
するものであることが見出された。
すなわち、Dx1は、ビタミンD3の代謝産物の１
つである25―ヒドロキシビタミンD3を更に１
α，25―（OH）2D3に変換させる酵素を、極めて
低濃度で阻害する作用を有し、他方Dx1は小腸の
１α，25―（OH）2D3レセプターに対して殆んど
親和性を示さないものであつて、通常のビタミン
D3様活性、例えば血清カルシウム，パラサイロ
イドホルモン（PTH），カルシトニンなどに対し
て影響を与えない化合物であるということが示唆
され、従つて生体内の１α，25―（OH）2D3のレ
ベルをコントロールし得る作用、例えば体内の１
α，25―（OH）2D3レベルが異常な高値を示した
ものを低下させるという作用を有するものであ
る。それ故に本発明のDx1は、なんらかの素因あ
るいは原因によつて、血清中の１α，25
（OH）2D3レベルが異常に高い症候群１α，25
（OH）2D3レベルの高値に起因する症候群、例えば
副甲状腺機能亢進症，ベーチエツト病、あるいは
ビタミンD3類投与による中毒などの症状に対し
て、極めて有効な治療薬となり得るものである。
このように本発明においては、新規な１α，25
―ジヒドロキシビタミンD3―26，23―ラクトン
が提供され、該化合物はその生理作用として、生
体内の１α，25（OH）2D3レベルをコントロール
し得る作用を有し、医薬品への応用が期待される
有用なものである。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。
実施例
単離精製
(i) 体重約200gの雌アルビノラツト（SPF―
Wister，SLC）を、ビタミンD3を通常の飼料
と同じように含む飼料（NIPPON、CLEA、
Corp.CE―２；Ca：1.0％，Ｐ：1.0％，ビタミ
ンD3：2000IU／Kg）で飼育した。次に１昼夜
絶食させ、40匹の雌ラツトに、トリチウムでラ
ベルした１α（OH）D3（１α（OH）―〔24S
―3H〕―D3）400μｇを、５％のエタノールを
含む0.1％TritonX―100溶液0.2ml中で、ラベル
しない１α（OH）D3と混合して、11.3mCi／
mmolの放射能を有するように希釈して、
Stomach tubesで経口的に投与した。
投与後、７，８時間経過した後、ラツトをエ
ーテルで麻酔をかけた後、腹腔の大動脈より血
液を採取した。該血液より得られるプラズマ
（102ml）を２倍の水で希釈し次いでクロロホル
ム／メタノール（１／１，ｖ／ｖ）で抽出し
た。
(ii) 得られる抽出液を乾燥，濃縮して、次にセフ
アデツクスLH−20のカラム（1.5×22cm）に付
した。最初は、クロロホルム／ｎ―ヘキサン
（65／35，ｖ／ｖ）200mlで展開し、次にクロロ
ホルム／ｎ―ヘキサン／メタノール（75／23／
２，ｖ／ｖ）200mlで更に展開した。各フラク
シヨン3.0mlをクロロホルムで4.0mlになるよう
に調整し、その0.5mlを放射能測定に供した。
この時のカラムクロマトグラフイーのプロフア
イルは第１図に示したとおおりである。
次に、化学合成した１α，24（Ｒ）、25
（OH）3―D3に相当する、放射能活性を有するピ
ーク（フラクシヨンNo.85〜100）（Dx1）を集め
た。
(iii) フラクシヨンNo.85〜100を集めたものを、次
に、高速液体クロマトグラフイー（HPLC，μ
―porasil珪酸）に付し、イソプロパノール／
メチレンクロライド（６／94，ｖ／ｖ）1.0
ml／minで展開した。そして、主なUVピーク
を示すフラクシヨンを集めて、再び同一条件で
HPLCに付した。更に主なUVピークを有する
フラクシヨンを、HPLCに付し、イソプロパノ
ール／ｎ―ヘキサン（15／85，ｖ／ｖ）1.0
ml／minで展開し、この時のUVピークより、
単一化合物が得られたと認められた。この時の
クロマトプロフアイルを第２図のＣに示した。
また、上記した方法で得られた精製されたフラ
クシヨンをイソプロパノール／メチレンクロラ
イド（６／94，ｖ／ｖ）で展開した時のクロマ
トプロフアイルを第２図のｂに示した。
また上記(ii)で得られる第１図のプロフアイル
において、１α，25（OH）2D3に相当する放射
能活性を有するフラクシヨンNo.40〜60を集め、
同様にして精製した。精製したフラクシヨンを
イソプロパノール／ｎ―ヘキサン（15／85，
ｖ／ｖ）1.0ml／minで展開したときのカラム
プロフイルを第２図のａに示した。
(iv) 上記(iii)で得られた、１α，24，25（OH）3D3
に相当する部分の精製物のUVスペクトルを測
定した。結果は第３図に示した通りである。ま
たマススペクトルを測定した結果は第４図に示
した通りである。
以上に示した単離精製のプロセスを図で示すと
次のようになる。
The present invention relates to novel vitamin D3 derivatives.
More specifically, 1α has a lactone structure in its side chain.
It has a hydroxyl group in the biologically active position, and has 1
This invention relates to a novel vitamin D 3 derivative that has the ability to control the level of α,25-dihydroxycholecalciferol. However, according to the present invention, the following formula 1α,25-dihydroxyvitamin, expressed as
D 3 -26,23-lactone, i.e. 1α3β,25
-trihydroxy-9,10(19)-cholestatrieno-26,23-lactone is provided. As far as the present inventors are aware, this compound is a new compound that has not been published in any literature, and has a very unique structure in that it has a γ-lactone structure in its side chain and a hydroxyl group in the 1α position. In addition, such a compound has the action of controlling the level of 1α,25-dihydroxycholecalciferol in the living body as a physiological activity,
Therefore, it is a useful compound that is fully expected to be applied as a medicine. The above 1α,25-dihydroxyvitamin D 3 -
26,23-lactone (hereinafter referred to as Dx1) is 1α-
Hydroxyvitamin D 3 (hereinafter referred to as 1α(OH)D 3 ) or 1α,25-dihydroxyvitamin D 3
(hereinafter referred to as 1α,25(OH) 2 D 3 ) is administered to rats or dogs in a toxically acceptable amount by conventional means such as oral, intravenous, or intramuscular injection. About 2 hours to about 50 hours later, 1α was administered.
As a metabolite of (OH)D 3 or 1α,25(OH) 2D 3 , it is extracted from the lipophilic part of plasma in the blood of rats or dogs by means such as column chromatography or high performance liquid chromatography. , which is isolated and extracted. An example of such an isolation/extraction method is the method described below. i.e. rats or dogs are fed normal amounts of vitamins.
After being fed a diet containing D3 , the animals are fasted for one day and night, and then 1α(OH) D3 is orally administered in a range of 0.4 to 250 μg/Kg. and after administration 7,8
After an hour, the animal is anesthetized with ether and blood is collected from the aorta of the peritoneal cavity. Plasma is obtained from the collected blood in a conventional manner and extracted with methanol/chloroform (1/1, v/v). Next, the extract was filtered using a Sephadex LH-20 column, first with chloroform/n-hexane (65/35, v/v), then with chloroform/n-hexane (65/35, v/v).
Hexane/methanol (75/23/2, v/v)
The sample is subjected to column chromatography using the following developing solvent. Next, the same fraction in which 1α,24,25-trihydroxyvitamin D 3 (hereinafter referred to as 1α,24,25(OH) 3 D 3 ) appears is collected, and this is then added to microporacil (μ-
using isopropanol/methylene chloride (6/94,v/
v) and subjected to high performance liquid chromatography. The separated main portion is then subjected to high performance liquid chromatography again under the same conditions. And finally, microporacil, isopropanol/
Purified Dx 1 is obtained by high performance liquid chromatography under the conditions of n-hexane (15/85, v/v). For example, by administering 400 μg of 1α(OH)D 3 to 40 rats and isolating and purifying it from their plasma under the conditions described above, approximately
You get 700ng of Dx1. According to the research of the present inventors, Dx1 obtained in this way has physiological activity as 1α,25-
It was found that it has the ability to control the level of (OH) 2 D 3 . That is, Dx 1 is one of the metabolites of vitamin D 3 .
25-Hydroxyvitamin D
It has the effect of inhibiting the enzyme that converts α,25-(OH) 2D3 into α,25-(OH) 2D3 at extremely low concentrations, while Dx 1 has almost no effect on the 1α,25-(OH) 2D3 receptor in the small intestine . Vitamins that have no affinity with normal vitamins
It has been suggested that this compound has no effect on D 3 -like activities, such as serum calcium, parathyroid hormone (PTH), and calcitonin, and therefore 1α,25-(OH) 2 D 3 in vivo. An effect that can control the level of 1 in the body, e.g.
It has the effect of lowering abnormally high α,25-(OH) 2 D 3 levels. Therefore, the Dx 1 of the present invention may increase the concentration of 1α,25 in serum due to some predisposition or cause.
(OH) Syndrome 1α with abnormally high 2D3 levels , 25
It can be an extremely effective treatment for syndromes caused by high (OH) 2 D 3 levels, such as hyperparathyroidism, Behtzet's disease, and toxicity due to the administration of vitamin D 3 . In this way, in the present invention, a novel 1α,25
-Dihydroxyvitamin D 3 -26,23-lactone is provided, and this compound has the physiological action of controlling the 1α,25(OH) 2 D 3 level in the living body, and has potential for application in pharmaceuticals. It is expected and useful. Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. Example Isolation and Purification (i) Female albino rats (SPF-
Wister, SLC) and feed containing vitamin D 3 (NIPPON, CLEA,
Corp.CE-2; Ca: 1.0%, P: 1.0%, vitamin D3 : 2000IU/Kg). Next, after fasting for one day and one night, 40 female rats were treated with tritium-labeled 1α(OH)D 3 (1α(OH)-[24S
― 3 H〕―D 3 ) was mixed with unlabeled 1α(OH)D 3 in 0.2 ml of 0.1% TritonX-100 solution containing 5% ethanol to give 11.3 mCi/
diluted to have mmol of radioactivity,
Administered orally via Stomach tubes. Seven or eight hours after administration, the rats were anesthetized with ether, and blood was collected from the aorta of the peritoneal cavity. Plasma (102 ml) obtained from the blood was diluted twice with water and extracted with chloroform/methanol (1/1, v/v). (ii) The resulting extract was dried and concentrated, and then applied to a Sephadex LH-20 column (1.5 x 22 cm). First, develop with 200 ml of chloroform/n-hexane (65/35, v/v), then chloroform/n-hexane/methanol (75/23/
2, v/v) and further developed with 200 ml. 3.0 ml of each fraction was adjusted to 4.0 ml with chloroform, and 0.5 ml of this was used for radioactivity measurement.
The column chromatography profile at this time is as shown in FIG. Next, chemically synthesized 1α,24(R),25
Radioactive peaks (fractions No. 85 to 100) (Dx 1 ) corresponding to (OH) 3 -D 3 were collected. (iii) The collected fractions No. 85 to 100 are then subjected to high performance liquid chromatography (HPLC, μ
-porasil silicic acid) and isopropanol/
Methylene chloride (6/94, v/v) 1.0
It was developed at ml/min. Then, collect the fractions showing the main UV peak and repeat under the same conditions.
It was subjected to HPLC. Furthermore, the fraction having the main UV peak was subjected to HPLC and treated with isopropanol/n-hexane (15/85, v/v) 1.0
Developed at ml/min, and from the UV peak at this time,
It was recognized that a single compound was obtained. The chromatoprofile at this time is shown in C of FIG.
Furthermore, the chromatoprofile obtained when the purified fraction obtained by the above method was developed with isopropanol/methylene chloride (6/94, v/v) is shown in FIG. 2b. In addition, in the profile shown in Figure 1 obtained in (ii) above, fractions No. 40 to 60 having radioactivity corresponding to 1α,25(OH) 2 D 3 were collected,
It was purified in the same manner. The purified fraction was mixed with isopropanol/n-hexane (15/85,
Figure 2 a shows the column profile when developed at 1.0 ml/min (v/v). (iv) 1α,24,25(OH) 3 D 3 obtained in (iii) above
The UV spectrum of the purified product was measured. The results are shown in Figure 3. Moreover, the results of mass spectrum measurement are as shown in FIG. The isolation and purification process described above is illustrated as follows.
〔方 法〕〔Method〕
Eisman，J.A.（1976）〓の方法を用いて、ニワ
トリの小腸より調製した１，25―（OH）2D3―レ
セプターに対する結合親和性を測定した。
すなわち、孵化後第１日より４週間ビタミンＤ
欠乏食で飼育して作成したビタミンＤ欠乏状態の
ニワトリヒナより小腸を摘出し、これより小腸粘
膜を得る。ついで、よく洗浄後、緩衝液中でホモ
ジエナイズし、遠沈操作により細胞質画分
（105000G×60分遠心後の上清）を得る。１，25
―（OH）2D3―レセプターを含むこの細胞質画分
１mlに一定量の3H―で標識した１，25―（OH）2
―〔23，24―3H〕―D3（比放射能90Ci／mmol）
と種々の量の検体（１，25―（OH）2D3および
１，25―（OH）2―D3―26，23―ラクトン
（Dx1））を加え、25℃で１時間反応後、40％ポリ
エチレンリコール水溶液１mlを加え、よく撹拌
後、遠心する。遠心管の底部を切り取りペレツト
状に附着している変性蛋白質に結合している放射
能を液体シンチレーシヨンカウンターを用いて測
定する。
このようにして測定された結果より、ペレツト
に附着して測定された放射能（１α，25―
（OH）2―〔23，24―3H〕―D3）を1/2に減ずるの
に必要な１，25―（OH）2D3あるいは１，25―
（OH）2―D3―26，23―ラクトンの量を求め、親和
性の指標とした。
上記方法は文献、Arch.Biochem.Biophys.
176，235〜243，（1976）に記載された方法が参考
とされる。
〔結 果〕
細胞質画分１ml（蛋白質0.5mg）に対して
3000cpmの１α，25―（OH）2―〔23，24―3H〕
―D3（比放射能90Ci／mmol）を用いた時、ペレ
ツトとして分離された蛋白に結合した上記の賦射
性１α，25―（OH）2D3の量を1/2に減ずるのに、
１α，25―（OH）2D3は30pgが、１α，25―
（OH）2D3―26，23―ラクトンでは90ngが必要で
あつた。この結果は、１α，25―（OH）2D3―
26，23―ラクトンの１α，25―（OH）2D3―レセ
プターに対する結合親和性は１α，25―
（OH）2D3の約1/3000であることを示している。
このことから本発明の１α，25―（OH）2D3―
26，23―ラクトン（Dx1）は１α，25―（OH）2D3
レセプターに対して殆んど親和性を示さないもの
であることがわかる。
(ii) １α，25―（OH）2D3―26，23―ラクトン
（Dx1）のニワトリヒナの腎臓に存在する25―
OH―D3―１α―水酸化酵素活性に及ぼす影
響。
〔方 法〕
Henry，H.L.J.Biol.Chem.249，7584〜7592
（1974）の方法により、ニワトリヒナの腎臓ホモ
ジエネートを用いて、25―OH―D3―１α―水酸
化酵素活性に及ぼす１，25―（OH）2D3―26，23
―ラクトンの影響を調べた。
孵化翌日より４週間ビタミンＤ欠食食で飼育し
て作成したビタミンＤ欠乏状態のニワトリヒナよ
り腎臓を摘出し、0.25M糖糖溶液中で10％ホモジ
エネートとする。MgCl2，コハク酸を含む0.03M
トリス／塩酸緩衝液（PH7.4）140μに、上記の
ホモジエネート60μを加え、さらに基質として
25―OH―〔26，27―3H〕―D3（比放射能9Ci／
mmol）2.5pmolを加えて40分間37℃で反応させ
た。反応後CHCl3―MeOH系で抽出し、抽出液を
高速液体クロマトグラフイーにかけ、標記の１，
25―（OH）2D3の溶出位置に回収された放射能量
より、25―OH―D3よりこの反応で生成した１，
25―（OH）2D3の量を計算した。上述の反応系
に、種々の量の１α，25―（OH）2D3―26，23―
ラクトンおよび１α，25―（OH）2D3を加えて、
その影響を観察した。
〔結 果〕
この実験の全体を通しての（最終放射能）回収
率は45〜50％であつた。基質だけが反応系に加え
られた時には0.195pmoleの１，25（OH）2D3が測
定された。しかし、１，25―（OH）2D3―26，23
―ラクトンはこの反応を著明に阻害し、10-9，
10-8，10-7Mのそれぞれの濃度で生成した１α，
25―（OH）2D3は0.091，0.041，0.031pmoleに減
少した。
なお、本条件における高速液体クロマトグラフ
イーより得られるデータには、約0.030pmoieに
相当するバツクグランドが含まれているので、実
察には、10-8，10-7Mでは、１α，25―
（OH）2D3の生成は完全に阻害されていると云え
る。他方、この反応の生成物である１α，25―
（OH）2D3をその反応液中の濃度が2.5×10-8Mに
なるように加えた時には0.236pmoleの〔3H〕―
１，25―（OH）2D3が測定され、１，25―
（OH）2D3はこの反応を全く阻害しないことがわか
る。
以上の事実は、１α，25―（OH）2D3―26，23
―lactoneは、ニワトリの腎臓に存在する25―OH
―D3の１α―水酸化反応を試験管内で特異的に
阻害し、かつその効果は10-9Mという極めて低濃
度でも十分に発揮されることを示している。これ
は、１α，25―（OH）2D3―26，23―ラクトンに
よる上記の水酸化反応の阻害には、in vivoで25
―OH―D3の水酸化反応に影響を与えるPTH，
CT，血清Caあるいは血清Ｐなどとは独立な反応
であることを併せて示している。
Binding affinity for 1,25-(OH) 2 D 3 -receptor prepared from chicken small intestine was measured using the method of Eisman, JA (1976). That is, vitamin D for 4 weeks from the first day after hatching.
The small intestine is removed from a vitamin D-deficient chicken chick raised on a deficient diet, and the small intestine mucosa is obtained from this. Then, after thorough washing, homogenization is performed in a buffer solution, and a cytoplasmic fraction (supernatant after centrifugation at 105,000 G for 60 minutes) is obtained by centrifugation. 1,25
-(OH) 2 D 3 - To 1 ml of this cytoplasmic fraction containing the receptor, add a certain amount of 1,25-(OH) 2 labeled with 3 H-.
―[23,24― 3 H]―D 3 (specific radioactivity 90Ci/mmol)
and various amounts of analytes (1,25-(OH) 2 D 3 and 1,25-(OH) 2 -D 3 -26,23-lactone (Dx 1 )) and reacted at 25°C for 1 hour. Add 1 ml of 40% polyethylene recall aqueous solution, stir well, and centrifuge. The bottom of the centrifuge tube is cut off and the radioactivity bound to the pelleted denatured protein is measured using a liquid scintillation counter. From the results measured in this way, the radioactivity (1α, 25-
1,25- (OH) 2 D 3 or 1,25- necessary to reduce (OH) 2 - [23, 24- 3 H] - D 3 ) to 1/2
The amount of (OH) 2 -D 3 -26,23-lactone was determined and used as an index of affinity. The above method is described in the literature, Arch.Biochem.Biophys.
176 , 235-243, (1976) is referred to. [Results] For 1 ml of cytoplasmic fraction (0.5 mg of protein)
3000cpm 1α, 25- (OH) 2 - [23, 24- 3 H]
-D 3 (specific radioactivity 90Ci/mmol), the amount of the above-mentioned 1α,25-(OH) 2 D 3 bound to the protein separated as a pellet was reduced to 1/2. ,
1α,25-(OH) 2 D 3 is 30pg, but 1α,25-
(OH) 2 D 3 -26,23-lactone required 90 ng. This result is 1α,25-(OH) 2 D 3 -
The binding affinity of 26,23-lactone to 1α,25-(OH) 2 D 3 -receptor is 1α,25-
It shows that it is about 1/3000 of (OH) 2 D 3 . From this, 1α,25-(OH) 2 D 3 - of the present invention
26,23-lactone (Dx 1 ) is 1α,25-(OH) 2 D 3
It can be seen that it shows almost no affinity for receptors. (ii) 1α,25-(OH) 2D3-26,23 - lactone ( Dx1 ) present in the kidneys of chicken chicks.
Effect on OH-D 3 -1α-hydroxylase activity. [Method] Henry, HLJBiol.Chem. 249 , 7584-7592
(1974) using chick kidney homogenate to determine the effect of 1,25-(OH) 2 D 3 -26,23 on 25-OH-D 3 -1α-hydroxylase activity.
-We investigated the effects of lactones. Kidneys were removed from vitamin D-deficient chicks raised on a vitamin D-deficient diet for 4 weeks from the day after hatching, and homogenated at 10% in a 0.25M sugar solution. MgCl 2 , 0.03M with succinic acid
Add 60μ of the above homogenate to 140μ of Tris/HCl buffer (PH7.4) and add as a substrate.
25―OH― [26, 27― 3 H]―D 3 (specific radioactivity 9Ci/
2.5 pmol (mmol) was added and reacted at 37°C for 40 minutes. After the reaction, extraction was performed using CHCl 3 -MeOH system, and the extract was subjected to high performance liquid chromatography.
From the amount of radioactivity recovered at the elution position of 25-(OH) 2 D 3 , 1, produced in this reaction from 25-OH-D 3
The amount of 25-(OH) 2D3 was calculated. Various amounts of 1α,25-(OH) 2 D 3 -26,23- are added to the above reaction system.
Add lactone and 1α ,25-(OH) 2D3 ,
We observed its effects. [Results] The recovery rate (final radioactivity) throughout this experiment was 45-50%. When only the substrate was added to the reaction system, 0.195 pmole of 1,25(OH) 2 D 3 was measured. However, 1,25-(OH) 2 D 3 -26,23
-Lactones markedly inhibit this reaction, 10 -9 ,
1α produced at concentrations of 10 -8 and 10 -7 M,
25-(OH) 2 D 3 decreased to 0.091, 0.041, and 0.031 pmole. Note that the data obtained from high performance liquid chromatography under these conditions includes a background equivalent to approximately 0.030 pmoie, so in actual observations, at 10 -8 and 10 -7 M, ―
It can be said that the production of (OH) 2 D 3 is completely inhibited. On the other hand, the product of this reaction, 1α,25-
When (OH) 2 D 3 was added so that the concentration in the reaction solution was 2.5 × 10 -8 M, 0.236 pmol of [ 3 H] -
1,25-(OH) 2D3 was measured , 1,25-
It can be seen that (OH) 2 D 3 does not inhibit this reaction at all. The above facts are 1α,25-(OH) 2 D 3 -26,23
-Lactone is a 25-OH compound found in chicken kidneys.
It has been shown that it specifically inhibits the 1α-hydroxylation reaction of -D 3 in vitro, and that its effect is fully exerted even at an extremely low concentration of 10 -9 M. This indicates that inhibition of the above hydroxylation reaction by 1α,25-(OH) 2 D 3 -26,23-lactone requires 25
-OH- D3 PTH affects the hydroxylation reaction,
This also shows that the reaction is independent of CT, serum Ca, serum P, etc.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は、ラツトに１α（OH）―〔24S―
3H〕―D3を50μｇ／Kg経口投与し、７，８時間
後に採取した血液のプラズマの抽出液をセフアデ
ツクスLH―20（1.5×22cm）のカラムクロマトグ
ラフイーに付した時のプロフアイルである。な
お、この時の展開溶媒は最初はクロロホルム／ｎ
―ヘキサン（65/35,v/v）200mlであり、次にクロ
ロホルム／ｎ―ヘキサン／メタノール（75/23/2,
ｖ／ｖ）を用いた。各フラクシヨンの量は３mlであ
る。第２図は、第１図のカラムクロマトグラフイ
ーのプロフアイルにおいて、１α，25―（OH）
2D3もしくは１α，24，25―（OH）3D3の相当す
るradioactivityを有する部分のフラクシヨンを取
り、これを高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）で精製し、精製した後に再びHPLCに
付し、その時のプロフアイルを示したものであ
る。第２図のａは、第１図の、１α，25
（OH）2D3に相当するradioactiuity peakを有する
部分のフラクシヨン（フラクシヨンNo.40〜60）を
集め、これを精製した後に、再びHPIC（μ―
porasil；0.39×30cm，イソプロパノール／ｎ―ヘ
キサン，15/85,v/v1.0ml／min）に付した時のプ
ロフアイルである。ｂ及びｃは第１図の１α，
24，25（OH）3D3に相当するradiactivityを有する
部分のフラクシヨンNo.85〜100を精製した後に再
びHPIC（μ―porasil；0.39×30cm、1.0ml／
min）に付した時のプロフアイルである。ｂは展
開溶媒としてイソプロパノール／メチレンクロラ
イド（6/94,v/v）を用いた場合であり、ｃはイソ
プロパノール／ｎ―ヘキサン（15/85,v/v）を用
いた場合のプロフアイルである。図、ａ〜ｃの矢
印は１α，24（OH）2D3，１α，25（OH）2D3，１
α，24，25（OH）3D3が現われる位置に相当する
場所を示している。第３図は、単離精製したDx1
を15％イソプロパノール―ｎ―ヘキサンに溶解し
て測定したUVスペクトルである。第４図は単離
精製したDx1及び１α，25（OH）2D3のマススペ
クトルである。
Figure 1 shows that 1α(OH)-[24S-
3 H]-D 3 was orally administered at 50 μg/Kg, and the blood plasma extract collected 7 or 8 hours later was subjected to column chromatography using Sephadex LH-20 (1.5 x 22 cm). be. Note that the developing solvent at this time was initially chloroform/n
-200ml of hexane (65/35, v/v), then chloroform/n-hexane/methanol (75/23/2,
v/v) was used. The volume of each fraction is 3 ml. Figure 2 shows 1α,25-(OH) in the column chromatography profile of Figure 1.
2 D 3 or 1α,24,25-(OH) 3 A fraction of the fraction with radioactivity corresponding to 3 D 3 is taken and purified by high performance liquid chromatography (HPLC), and after purification, it is subjected to HPLC again. , which shows the profile at that time. a in Figure 2 is 1α, 25 in Figure 1
(OH) 2 D 3 The fractions with the radioactiuity peak (fractions No. 40 to 60) are collected, purified, and then HPIC (μ-
This is the profile when subjected to porasil; 0.39 x 30 cm, isopropanol/n-hexane, 15/85, v/v 1.0 ml/min). b and c are 1α in Fig. 1,
After purifying fractions No. 85 to 100 of the fraction having radioactivity corresponding to 24,25(OH) 3 D 3 , HPIC (μ-porasil; 0.39 x 30 cm, 1.0 ml/
This is the profile when attached to min). b is the profile when isopropanol/methylene chloride (6/94, v/v) is used as the developing solvent, and c is the profile when isopropanol/n-hexane (15/85, v/v) is used. . The arrows in figures a to c are 1α, 24 (OH) 2 D 3 , 1 α, 25 (OH) 2 D 3 , 1
The location corresponding to the position where α, 24, 25(OH) 3 D 3 appears is shown. Figure 3 shows isolated and purified Dx 1
This is a UV spectrum measured by dissolving the compound in 15% isopropanol-n-hexane. FIG. 4 is a mass spectrum of isolated and purified Dx 1 and 1α,25(OH) 2 D 3 .