JPS6154769B2 - - Google Patents
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- JPS6154769B2 JPS6154769B2 JP51010836A JP1083676A JPS6154769B2 JP S6154769 B2 JPS6154769 B2 JP S6154769B2 JP 51010836 A JP51010836 A JP 51010836A JP 1083676 A JP1083676 A JP 1083676A JP S6154769 B2 JPS6154769 B2 JP S6154769B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protease
- toxoid
- pseudomonas aeruginosa
- lysine
- oep
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Gram-negative bacteria
- C07K16/1214—Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は緑膿菌から産生されるプロテアーゼの
トキソイドおよびその製造法に関する。また、動
物をそのプロテアーゼトキソイドで免疫して緑膿
菌症のプロテアーゼによる障害を予防、治療する
方法に関する。 今日医薬の著しい進歩に伴つて一層注目される
ようになつたOpportunistic infections（日和見
感染）の代表的な病原として緑膿菌は医学、獣医
学両分野で種々の大きな問題を提起している。 新生児の生理的免疫不全、癌白血病、移植、熱
傷患者の免疫機能低下、ステロイド、イムラン等
の投薬治療による免疫機能抑制時に本菌感染症は
おこりやすく、重篤である。 獣医学方面ではミンクの本菌による出血性肺
炎、ウシの本菌による乳房炎は畜産経済上の大問
題である。 緑膿菌に対する２〜３の抗生物質は最近開発さ
れてはいるが、個体の免疫機能不全時または低下
時ではほとんど効を奏さない。また、前述の獣医
学方面の本菌感染症についても、ミンクの場合に
数千〜数万頭に対して抗生物質治療を行うことは
実施上不可能であり、価格の面でも成立しない。
ウシ乳房炎についてもほぼ同様の事情にある。そ
こで化学療法に代わつて免疫療法またはその両者
の併用療法が強く待望されている。 免疫療法としては緑膿菌の血清型別（現在13種
類以上ある）の種類に拘らずすべての本菌感染を
防御する共通抗原OEPが本間等により分離され
既に応用されつつある〔J.Y.Homma et al、
Japan.J.Exp.Med.、45、355−360（1975）；J.
Y.Homma et al、Japan.J.Exp.Med、42、23−
34（1972）；J.Y.Homma、Microbial Drug
Resistance、Tokyo University Press、
Tokyo、（1975）；J.Y.Homma、The Fourth
International Congress of Animal、Plant and
Microbial Toxins、Plenum Publisher、London
（1975）〕。 一方、緑膿菌は菌体外にプロテアーゼ、エラス
ターゼおよびその他の物質を産生するが、この二
種の酵素が病原因子として作用していることが確
認された〔J.Y.Homma et al、Japan J.Exp.
Med.、45、79−88（1975）；J.Y.Homma et
al、Japan.J.Exp.Med.、45、515（1975）；K.
Kawaharajo et al、Japan.J.Exp.Med.、44、435
−442（1974）；J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、45、89−100（1975）〕。それはヒトの
本菌による慢性気道感染症およびウシ乳房炎の血
清中にOEPと共にプロテアーゼ、エラスターゼ
の高い抗体価があることで充分に推定される〔J.
Y.Homma、Japan.J.Exp.Med.、45、361−366
（1975）〕。 実際に動物実験でプロテアーゼ、エラスターゼ
が皮膚の壊死、角膜の潰瘍を微量でおこし、内臓
諸器官に著しい病理変化をおこさせることが明ら
かになつている〔J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、45、79−88（1975）；J.Y.Homma
et al、Japan.J.Exp.Med.、45、515（1975）；
K.Kawaharajo et al、Japan.J.Exp.Med.、44、
435−442（1974）；J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、4589−100（1975）〕。また、プロテア
ーゼ、エラスターゼ産生菌と非産生菌をマウスの
角膜に接種すると、前者では潰瘍を形成するが、
後者では形成しないことによつて両者の病原性の
差が明らかにされた〔J.Y.Homma et al、Japan.
J.Exp.Med.、45、515（1975）〕。 そこで免疫療法の完全を期するためには本間等
の共通の感染防御抗原OEPによつてその増殖阻
止を計ると共に代謝産物による有毒作用の中和を
行うことが必要となる。 この目的のためにはプロテアーゼおよびエラス
ターゼをトキソイド化して免疫を行わなければな
らない。 本発明者らはプロテアーゼのトキソイド化の研
究を行ない、抗原活性を保持し、酵素活性を失つ
ているプロテアーゼのトキソイドを得ることに成
功し、本発明を完成した。 本発明の緑膿菌プロテアーゼのトキソイドは下
記の如くして製造される。 本発明に使用する緑膿菌の産生するプロテアー
ゼの製造方法およびその性質は特公昭40−
27315；K.Morihara et al、Biochim.Biophys.
Acta、73、113−124、125−131（1963）；K.
Morihara et al、Biochim.Biophys.Acta、92、
351−360、361−366（1964）；K.Morihara et
al、Arch.Biochem.Biophys.、114、158−165
（1966）；K.Morihara et al、Biochim.Biophys.
Acta、309、414−429（1973）；K.Morihara et
al、Agr.Biol.Chem.、38（３）、621−626
（1974）に記載されている。 プロテアーゼをトキソイド化する場合、アミノ
酸（たとえばリジン）の存在下にホルマリンまた
はオキシメタンスルフイン酸塩でトキソイド化す
れば良い。 リジンの存在下にホルマリンでトキソイド化し
て得られるプロテアーゼのトキソイドの理化学的
性質を下記に示す。 分子量：6.3万（ゲル濾過法） 紫外線吸収スペクトル：最高280ｍμ（Ｅ２８０ １
％
＝9.27、0.1M KCl）最低250ｍμ 等電点：PH5.2（焦点電気泳動） アミノ酸組成：アミノ酸残基（ｇ／100ｇ蛋
白）、アスパラギン酸（15.6）、スレオニン
（5.0）、セリン（7.6）、グルタミン酸（9.5）、プ
ロリン（2.1）、グリシン（7.7）、アラニン
（8.5）、バリン（5.0）、イソロイシン（3.9）、ロ
イシン（8.7）、チロシン（6.9）、フエニルアラ
ニン（5.9）、リジン（4.1）、ヒスチジン
（1.9）、アルギニン（2.3）、トリプトフアン
（2.3）、アンモニア（1.4）（計98.5ｇ） 物質の色：無色粉末 抗原活性：有り 酵素活性：なし 以上の理化学的性質を有する緑膿菌プロテアー
ゼのトキソイドは新規な物質である。 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこの
実施例に限定されるものではない。 実施例 １ 緑膿菌の結晶プロテアーゼ100mgを0.2Mリジン
を含有する0.1M Na2HPO4溶液約20mlに溶解し、
さらにホルマリンを加えて最終濃度を約８％とす
る。３日間以上室温に静置した後、水に対して透
析し、次いで凍結乾燥してプロテアーゼトキソイ
ドを得る。その収率は約98〜100％である。 プロテアーゼのホルマリン処理での残存酵素活
性を表１、２および３に示す。 酵素活性測定法：２％カゼイン（PH7.4）１ml
を適当に稀釈した酵素液に混じ、40℃、10分間反
応後、直ちに反応停止液（0.1Mトリクロル酢
酸、0.2M酢酸および0.2M酢酸ナトリウムを含む
溶液）を２ml添加し、その温度で20分間保つて未
反応のカゼインを完全に沈澱させた後、濾過し、
濾液の１mlについてFoline法でチロシン量を測定
した。すなわち、濾液の１mlに0.4M Na2CO35ml
を添加し、1/5に稀釈したPhenol Reagent
Solution（酸濃度1.8N、フエノール試薬、半井化
学、京都）１ml添加し、15〜20分後、670ｍμで
吸光度を測定する。なお、反応０時間で同様の処
理したものをコントロールとし、その差からプロ
テアーゼ作用による遊離チロシン量が算出され
る。 残存酵素活性は相対活性（％）で示す。 表１から明らかなように、リジンの存在下にホ
ルマリンでプロテアーゼを４日間処理すると、酵
素活性は約90％以上失活するが、２週間処理して
も酵素活性は完全に失活しない。リジンの存在下
にプロテアーゼをホルマリンで約１日以上処理
し、得られたプロテアーゼを水で透析し、次いで
凍結乾燥して再び同様の方法で処理すると完全に
プロテアーゼは失活する。
トキソイドおよびその製造法に関する。また、動
物をそのプロテアーゼトキソイドで免疫して緑膿
菌症のプロテアーゼによる障害を予防、治療する
方法に関する。 今日医薬の著しい進歩に伴つて一層注目される
ようになつたOpportunistic infections（日和見
感染）の代表的な病原として緑膿菌は医学、獣医
学両分野で種々の大きな問題を提起している。 新生児の生理的免疫不全、癌白血病、移植、熱
傷患者の免疫機能低下、ステロイド、イムラン等
の投薬治療による免疫機能抑制時に本菌感染症は
おこりやすく、重篤である。 獣医学方面ではミンクの本菌による出血性肺
炎、ウシの本菌による乳房炎は畜産経済上の大問
題である。 緑膿菌に対する２〜３の抗生物質は最近開発さ
れてはいるが、個体の免疫機能不全時または低下
時ではほとんど効を奏さない。また、前述の獣医
学方面の本菌感染症についても、ミンクの場合に
数千〜数万頭に対して抗生物質治療を行うことは
実施上不可能であり、価格の面でも成立しない。
ウシ乳房炎についてもほぼ同様の事情にある。そ
こで化学療法に代わつて免疫療法またはその両者
の併用療法が強く待望されている。 免疫療法としては緑膿菌の血清型別（現在13種
類以上ある）の種類に拘らずすべての本菌感染を
防御する共通抗原OEPが本間等により分離され
既に応用されつつある〔J.Y.Homma et al、
Japan.J.Exp.Med.、45、355−360（1975）；J.
Y.Homma et al、Japan.J.Exp.Med、42、23−
34（1972）；J.Y.Homma、Microbial Drug
Resistance、Tokyo University Press、
Tokyo、（1975）；J.Y.Homma、The Fourth
International Congress of Animal、Plant and
Microbial Toxins、Plenum Publisher、London
（1975）〕。 一方、緑膿菌は菌体外にプロテアーゼ、エラス
ターゼおよびその他の物質を産生するが、この二
種の酵素が病原因子として作用していることが確
認された〔J.Y.Homma et al、Japan J.Exp.
Med.、45、79−88（1975）；J.Y.Homma et
al、Japan.J.Exp.Med.、45、515（1975）；K.
Kawaharajo et al、Japan.J.Exp.Med.、44、435
−442（1974）；J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、45、89−100（1975）〕。それはヒトの
本菌による慢性気道感染症およびウシ乳房炎の血
清中にOEPと共にプロテアーゼ、エラスターゼ
の高い抗体価があることで充分に推定される〔J.
Y.Homma、Japan.J.Exp.Med.、45、361−366
（1975）〕。 実際に動物実験でプロテアーゼ、エラスターゼ
が皮膚の壊死、角膜の潰瘍を微量でおこし、内臓
諸器官に著しい病理変化をおこさせることが明ら
かになつている〔J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、45、79−88（1975）；J.Y.Homma
et al、Japan.J.Exp.Med.、45、515（1975）；
K.Kawaharajo et al、Japan.J.Exp.Med.、44、
435−442（1974）；J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、4589−100（1975）〕。また、プロテア
ーゼ、エラスターゼ産生菌と非産生菌をマウスの
角膜に接種すると、前者では潰瘍を形成するが、
後者では形成しないことによつて両者の病原性の
差が明らかにされた〔J.Y.Homma et al、Japan.
J.Exp.Med.、45、515（1975）〕。 そこで免疫療法の完全を期するためには本間等
の共通の感染防御抗原OEPによつてその増殖阻
止を計ると共に代謝産物による有毒作用の中和を
行うことが必要となる。 この目的のためにはプロテアーゼおよびエラス
ターゼをトキソイド化して免疫を行わなければな
らない。 本発明者らはプロテアーゼのトキソイド化の研
究を行ない、抗原活性を保持し、酵素活性を失つ
ているプロテアーゼのトキソイドを得ることに成
功し、本発明を完成した。 本発明の緑膿菌プロテアーゼのトキソイドは下
記の如くして製造される。 本発明に使用する緑膿菌の産生するプロテアー
ゼの製造方法およびその性質は特公昭40−
27315；K.Morihara et al、Biochim.Biophys.
Acta、73、113−124、125−131（1963）；K.
Morihara et al、Biochim.Biophys.Acta、92、
351−360、361−366（1964）；K.Morihara et
al、Arch.Biochem.Biophys.、114、158−165
（1966）；K.Morihara et al、Biochim.Biophys.
Acta、309、414−429（1973）；K.Morihara et
al、Agr.Biol.Chem.、38（３）、621−626
（1974）に記載されている。 プロテアーゼをトキソイド化する場合、アミノ
酸（たとえばリジン）の存在下にホルマリンまた
はオキシメタンスルフイン酸塩でトキソイド化す
れば良い。 リジンの存在下にホルマリンでトキソイド化し
て得られるプロテアーゼのトキソイドの理化学的
性質を下記に示す。 分子量：6.3万（ゲル濾過法） 紫外線吸収スペクトル：最高280ｍμ（Ｅ２８０ １
％
＝9.27、0.1M KCl）最低250ｍμ 等電点：PH5.2（焦点電気泳動） アミノ酸組成：アミノ酸残基（ｇ／100ｇ蛋
白）、アスパラギン酸（15.6）、スレオニン
（5.0）、セリン（7.6）、グルタミン酸（9.5）、プ
ロリン（2.1）、グリシン（7.7）、アラニン
（8.5）、バリン（5.0）、イソロイシン（3.9）、ロ
イシン（8.7）、チロシン（6.9）、フエニルアラ
ニン（5.9）、リジン（4.1）、ヒスチジン
（1.9）、アルギニン（2.3）、トリプトフアン
（2.3）、アンモニア（1.4）（計98.5ｇ） 物質の色：無色粉末 抗原活性：有り 酵素活性：なし 以上の理化学的性質を有する緑膿菌プロテアー
ゼのトキソイドは新規な物質である。 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこの
実施例に限定されるものではない。 実施例 １ 緑膿菌の結晶プロテアーゼ100mgを0.2Mリジン
を含有する0.1M Na2HPO4溶液約20mlに溶解し、
さらにホルマリンを加えて最終濃度を約８％とす
る。３日間以上室温に静置した後、水に対して透
析し、次いで凍結乾燥してプロテアーゼトキソイ
ドを得る。その収率は約98〜100％である。 プロテアーゼのホルマリン処理での残存酵素活
性を表１、２および３に示す。 酵素活性測定法：２％カゼイン（PH7.4）１ml
を適当に稀釈した酵素液に混じ、40℃、10分間反
応後、直ちに反応停止液（0.1Mトリクロル酢
酸、0.2M酢酸および0.2M酢酸ナトリウムを含む
溶液）を２ml添加し、その温度で20分間保つて未
反応のカゼインを完全に沈澱させた後、濾過し、
濾液の１mlについてFoline法でチロシン量を測定
した。すなわち、濾液の１mlに0.4M Na2CO35ml
を添加し、1/5に稀釈したPhenol Reagent
Solution（酸濃度1.8N、フエノール試薬、半井化
学、京都）１ml添加し、15〜20分後、670ｍμで
吸光度を測定する。なお、反応０時間で同様の処
理したものをコントロールとし、その差からプロ
テアーゼ作用による遊離チロシン量が算出され
る。 残存酵素活性は相対活性（％）で示す。 表１から明らかなように、リジンの存在下にホ
ルマリンでプロテアーゼを４日間処理すると、酵
素活性は約90％以上失活するが、２週間処理して
も酵素活性は完全に失活しない。リジンの存在下
にプロテアーゼをホルマリンで約１日以上処理
し、得られたプロテアーゼを水で透析し、次いで
凍結乾燥して再び同様の方法で処理すると完全に
プロテアーゼは失活する。
【表】
【表】
性を測定
【表】
存活性を測定
表２から明らかなように、ホルマリン濃度は高
い方がよい。しかし、酵素濃度を必要以上に高く
すると（＞４mg/ml）、反応中に沈澱が生じ不適で
ある。反応PHは６〜９が適当で、ホルマリンの代
りにオキシメタンスルフイン酸も使用することが
できる（オキシメタンスルフイン酸0.5M、リジ
ン0.05M、室温３日で活性は15％以下に低下。オ
キシメタンスルフイン酸2.5M、リジン0.05M、３
日処理で完全失活）。表１および３に見るように
リジンの効果は顕著で、それなくしてトキソイド
化は不可能である。その代用として他にアルギニ
ン、ロイシン、チロジン、グルタミン酸などを検
討したが、リジン程の効果は期待できなかつた。
かくして、リジンの存在下でホルマリン処理を行
うことによりプロテアーゼトキソイドを得ること
に成功した。 本発明の緑膿菌プロテアーゼのトキソイドが抗
原活性を有することを以下の実験例で示す。 実験例 １ プロテアーゼトキソイドのウサギ免疫試験 １ 実験方法：ニユージーランドホワイト種家兎
３匹にプロテアーゼトキソイド１mgをFreund
のインコンプリートアジユバントと共に皮下注
射し、さらに２週間後にプロテアーゼトキソイ
ド１mgをFreundのインコンプリートアジユバ
ントと共に皮下注射する。さらに、２週間−２
週間−３週間の間隔でプロテアーゼトキソイド
１mgを筋肉注射する。表４に示すように経時的
に家兎の耳静脈から採血する。血清を分離して
非働化してHA価を測定する。 HA価の測定法はJapan.J.Exp.Med.Vol45、
No.5、p361−365、1975に記載されている。す
なわち、プロテアーゼを抗原とする受身血球凝
集反応の方法で行つた。 ２ 実験結果：その実験結果を表４に示す。HA
価は250〜4000倍になつた。
表２から明らかなように、ホルマリン濃度は高
い方がよい。しかし、酵素濃度を必要以上に高く
すると（＞４mg/ml）、反応中に沈澱が生じ不適で
ある。反応PHは６〜９が適当で、ホルマリンの代
りにオキシメタンスルフイン酸も使用することが
できる（オキシメタンスルフイン酸0.5M、リジ
ン0.05M、室温３日で活性は15％以下に低下。オ
キシメタンスルフイン酸2.5M、リジン0.05M、３
日処理で完全失活）。表１および３に見るように
リジンの効果は顕著で、それなくしてトキソイド
化は不可能である。その代用として他にアルギニ
ン、ロイシン、チロジン、グルタミン酸などを検
討したが、リジン程の効果は期待できなかつた。
かくして、リジンの存在下でホルマリン処理を行
うことによりプロテアーゼトキソイドを得ること
に成功した。 本発明の緑膿菌プロテアーゼのトキソイドが抗
原活性を有することを以下の実験例で示す。 実験例 １ プロテアーゼトキソイドのウサギ免疫試験 １ 実験方法：ニユージーランドホワイト種家兎
３匹にプロテアーゼトキソイド１mgをFreund
のインコンプリートアジユバントと共に皮下注
射し、さらに２週間後にプロテアーゼトキソイ
ド１mgをFreundのインコンプリートアジユバ
ントと共に皮下注射する。さらに、２週間−２
週間−３週間の間隔でプロテアーゼトキソイド
１mgを筋肉注射する。表４に示すように経時的
に家兎の耳静脈から採血する。血清を分離して
非働化してHA価を測定する。 HA価の測定法はJapan.J.Exp.Med.Vol45、
No.5、p361−365、1975に記載されている。す
なわち、プロテアーゼを抗原とする受身血球凝
集反応の方法で行つた。 ２ 実験結果：その実験結果を表４に示す。HA
価は250〜4000倍になつた。
【表】
実験例 ２
プロテアーゼトキソイドのマウス免疫試験
１ 実験方法：DDY種（♀、５週令）マウス３
匹にプロテアーゼトキソイド10γをFreundの
インコンプリートアジユバントと共に皮下注射
し、さらに２週間後にプロテアーゼトキソイド
10γをFreundのインコンプリートアジユバン
トと共に皮下注射する。さらに２週間の間隔で
腹腔内にプロテアーゼトキソイド10γを注射す
る。経時的にマウスの尾静脈から採血する。血
清を分離して非働化してHA価を測定する。 HA価の測定法は実験例１に記載されてい
る。 ２ 実験結果 マウスのHA価は最終免疫後２週間で1024〜
2048倍になつた。 実験例 ３ ミンク（サフアイア）13頭にプロテアーゼトキ
ソイド1000γをアジユバント（カリ明ばん）と共
に皮下に注射し、約２週間後に500γを再注射す
るとプロテアーゼ−HA価は64〜512倍に上昇す
る。注射前のミンクの血清中のプロテアーゼ−
HA価は認められない。 実験例 ４ 抗プロテアーゼトキソイドウサギ血清のプロテ
アーゼ中和活性 (1) プロテアーゼ中和活性を酵素活性で判定。 (イ) 被検血清：プロテアーゼトキソイドで免疫
したプロテアーゼ−HA価7860のウサギ免疫
血清を用いた。エラスターゼ−HA、OEP−
HA反応では共に陰性であつた。 対照として正常ウサギ血清（プロテアーゼ
−HA、エラスターゼ−HA、OEP−HAはす
べて陰性）を用いた。また、エラスターゼト
キソイド−抗血清はウサギを免疫して得たも
ので、プロテアーゼ−HA価、OEP−HA価
はすべて陰性のものを用いた。 (ロ) 測定方法：血清は56℃、30分非働化して使
用された。プロテアーゼの一定量を1/15Ｍ燐
酸緩衝液（PH7.4）で溶解し、その0.2mlに被
検血清0.2mlを加え生理食塩水を加えて全量
3.0mlとした。37℃に60分おき、この残存酵
素活性の測定を行つた。酵素活性の測定は実
施例１に記載の方法に従つて行なわれた。 (ハ) その結果を表５に示した。
匹にプロテアーゼトキソイド10γをFreundの
インコンプリートアジユバントと共に皮下注射
し、さらに２週間後にプロテアーゼトキソイド
10γをFreundのインコンプリートアジユバン
トと共に皮下注射する。さらに２週間の間隔で
腹腔内にプロテアーゼトキソイド10γを注射す
る。経時的にマウスの尾静脈から採血する。血
清を分離して非働化してHA価を測定する。 HA価の測定法は実験例１に記載されてい
る。 ２ 実験結果 マウスのHA価は最終免疫後２週間で1024〜
2048倍になつた。 実験例 ３ ミンク（サフアイア）13頭にプロテアーゼトキ
ソイド1000γをアジユバント（カリ明ばん）と共
に皮下に注射し、約２週間後に500γを再注射す
るとプロテアーゼ−HA価は64〜512倍に上昇す
る。注射前のミンクの血清中のプロテアーゼ−
HA価は認められない。 実験例 ４ 抗プロテアーゼトキソイドウサギ血清のプロテ
アーゼ中和活性 (1) プロテアーゼ中和活性を酵素活性で判定。 (イ) 被検血清：プロテアーゼトキソイドで免疫
したプロテアーゼ−HA価7860のウサギ免疫
血清を用いた。エラスターゼ−HA、OEP−
HA反応では共に陰性であつた。 対照として正常ウサギ血清（プロテアーゼ
−HA、エラスターゼ−HA、OEP−HAはす
べて陰性）を用いた。また、エラスターゼト
キソイド−抗血清はウサギを免疫して得たも
ので、プロテアーゼ−HA価、OEP−HA価
はすべて陰性のものを用いた。 (ロ) 測定方法：血清は56℃、30分非働化して使
用された。プロテアーゼの一定量を1/15Ｍ燐
酸緩衝液（PH7.4）で溶解し、その0.2mlに被
検血清0.2mlを加え生理食塩水を加えて全量
3.0mlとした。37℃に60分おき、この残存酵
素活性の測定を行つた。酵素活性の測定は実
施例１に記載の方法に従つて行なわれた。 (ハ) その結果を表５に示した。
【表】
この結果から明らかなように、正常ウサギ血
清、溶媒のみの対照には中和抗体を含まない。
また、 ※エラスターゼトキソイドウサギ抗血
清にも中和抗体を含まない。これに対してプロ
テアーゼトキソイド免疫ウサギ抗血清のみプロ
テアーゼ活性を中和している。 (2) プロテアーゼ中和活性を角膜潰瘍の有無で判
定。 一定量のプロテアーゼ液と一定量の被検プロ
テアーゼトキソイド免疫血清を37℃で５分ない
し11時間反応させて、K.Kawaharajo et al、
Japan.J.Exp.Med.、44、435−442（1974）文
献記載の方法に従つてマウスの角膜に滴下し、
潰瘍形成などの病変の強弱、有無で判定する。 その結果、HA価によつても異なるがプロテ
アーゼトキソイド抗血清は１ml当り約100γ〜
200γのプロテアーゼ活性を中和した。 (3) プロテアーゼ中和活性をマウスの内臓の諸病
変および生存で判定。 プロテアーゼとプロテアーゼトキソイド抗血
清の反応液およびその沈降物をマウスの腹腔内
に注射した場合、抗血清を加えない場合に生ず
る内臓の諸病変がおこらず、また致死量が中和
されて生残する。 抗血清の代りに正常ウサギ血清を加えても中
和の効果は認められない。 実験例 ５ OEP単独ワクチンとOEP、プロテアーゼトキ
ソイドおよびエラスターゼトキソイドを含む三
種混合ワクチンによる免疫ミンクの血清中の
HA価と感染防御効果 現在、緑膿菌感染症のワクチンとしてOEPワ
クチンが知られている。このOEP抗原にプロテ
アーゼトキソイドおよび本発明のエラスターゼト
キソイドを混合して三種混合ワクチンを製造する
と、この三種混合ワクチンは単独のOEPワクチ
ンより緑膿菌感染症予防、治療に著しい効力を有
することが明らかになつた。 １ 実験方法 動物：ミンク（サフアイア種）、５〜６月令
の♀。ワクチン投与方法：皮下または筋肉注射
でワクチンを投与した。 攻撃試験：緑膿菌No.5株を使用した。生菌
による感染はエーテル麻酔下、鼻腔によりビニ
ール管で菌液0.5mlを注入する方法で行なつ
た。 感染免疫の方法：免疫月日、投与量、感染月
日、剖検月日を表６に示した。 OEPワクチンおよび三種混合ワクチンの製
造法：
清、溶媒のみの対照には中和抗体を含まない。
また、 ※エラスターゼトキソイドウサギ抗血
清にも中和抗体を含まない。これに対してプロ
テアーゼトキソイド免疫ウサギ抗血清のみプロ
テアーゼ活性を中和している。 (2) プロテアーゼ中和活性を角膜潰瘍の有無で判
定。 一定量のプロテアーゼ液と一定量の被検プロ
テアーゼトキソイド免疫血清を37℃で５分ない
し11時間反応させて、K.Kawaharajo et al、
Japan.J.Exp.Med.、44、435−442（1974）文
献記載の方法に従つてマウスの角膜に滴下し、
潰瘍形成などの病変の強弱、有無で判定する。 その結果、HA価によつても異なるがプロテ
アーゼトキソイド抗血清は１ml当り約100γ〜
200γのプロテアーゼ活性を中和した。 (3) プロテアーゼ中和活性をマウスの内臓の諸病
変および生存で判定。 プロテアーゼとプロテアーゼトキソイド抗血
清の反応液およびその沈降物をマウスの腹腔内
に注射した場合、抗血清を加えない場合に生ず
る内臓の諸病変がおこらず、また致死量が中和
されて生残する。 抗血清の代りに正常ウサギ血清を加えても中
和の効果は認められない。 実験例 ５ OEP単独ワクチンとOEP、プロテアーゼトキ
ソイドおよびエラスターゼトキソイドを含む三
種混合ワクチンによる免疫ミンクの血清中の
HA価と感染防御効果 現在、緑膿菌感染症のワクチンとしてOEPワ
クチンが知られている。このOEP抗原にプロテ
アーゼトキソイドおよび本発明のエラスターゼト
キソイドを混合して三種混合ワクチンを製造する
と、この三種混合ワクチンは単独のOEPワクチ
ンより緑膿菌感染症予防、治療に著しい効力を有
することが明らかになつた。 １ 実験方法 動物：ミンク（サフアイア種）、５〜６月令
の♀。ワクチン投与方法：皮下または筋肉注射
でワクチンを投与した。 攻撃試験：緑膿菌No.5株を使用した。生菌
による感染はエーテル麻酔下、鼻腔によりビニ
ール管で菌液0.5mlを注入する方法で行なつ
た。 感染免疫の方法：免疫月日、投与量、感染月
日、剖検月日を表６に示した。 OEPワクチンおよび三種混合ワクチンの製
造法：
【表】
(1) プロテアーゼトキソイド−カリミヨウバン
溶液：プロテアーゼトキソイドの100mgを
24.8mlのリン酸緩衝食塩水（Ｍ／15、PH
7.4）（PBS）にとかし、この溶液に2.5mlの
10％カリウムミヨウバン〔K2Al2（SO4）4・
24H2O〕を加える。さらに、20％の
Na2HPO4・12H2Oの2.5mlを加えPH6.5にし、
完全に沈澱を起こさせる。最後に0.3mlの１
％チメロサールを防腐剤として加える（１mg
プロテアーゼトキソイド／0.3ml）。 (2) ※エラスターゼトキソイド−カリミヨウバ
ン溶液：プロテアーゼトキソイドの代りにエ
ラスターゼトキソイドを使用すること以外前
述の方法と同じ方法で製造される。 (3) OEP−カリミヨウバン溶液：OEPの100mg
を５mlの0.01N NaOHにとかし、これに28ml
のPBSを加える。次にこの溶液に3.3mlの10
％カリミヨウバンを加え、さらに3.3mlの20
％Na2HPO4を加えた。最後に0.4mlの１％チ
メロサールを加えた（１mgOEP／0.4ml）。 (4) 使用直前に上記のプロテアーゼトキソイド
−カリミヨウバン溶液、エラスターゼトキソ
イド−カリミヨウバン溶液、OEP−カリミ
ヨウバン溶液の三者を混合する。この混合液
0.5ml中に500γのプロテアーゼトキソイド、
500γのエラスターゼトキソイド、500γの
OEPを含む。 ※エラスターゼトキソイド：エラスターゼ
溶液（10〜15mg酵素蛋白質／ml、5M食塩、
10ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウ
ムおよび0.1ｍＭ塩化亜鉛を含む）を酵素濃
度２〜５mg/mlとなるように硼酸塩緩衝液
（PH９）で稀釈（最終硼酸塩濃度約0.1M）
し、それに最終濃度１％となるようにホルマ
リンを加えて室温に保つ。失活したエラスタ
ーゼ溶液を水に対して透析し、次いで凍結乾
燥してエラスターゼトキソイドを得る。 ２ 実験結果 ミンクに生菌感染（攻撃試験）を行ない、
OEPおよび三種混合ワクチンの免疫効果を調
べその結果を表７に示した。 カリ明ばん単独の場合にはLD50は約3.0×106
であつた。OEP単独の場合LD50≦3.6×106であ
り、カリ明ばんとの差は認められなかつた。し
かし、三種混合免疫Ｃ群ではLD50＞1.9×109で
あり、Ｂ群、Ａ群とは明らかに差が認められ
る。 無処理でLD503.4×105であつた。カリ明ばん
単独またはOEPとカリ明ばん免疫では高々10
倍位の生菌量に耐えるようになる。しかし、こ
れにプロテアーゼトキソイドとエラスターゼト
キソイドを加えた三種混合ワクチンとして用い
ると約10000倍量を耐過する。
溶液：プロテアーゼトキソイドの100mgを
24.8mlのリン酸緩衝食塩水（Ｍ／15、PH
7.4）（PBS）にとかし、この溶液に2.5mlの
10％カリウムミヨウバン〔K2Al2（SO4）4・
24H2O〕を加える。さらに、20％の
Na2HPO4・12H2Oの2.5mlを加えPH6.5にし、
完全に沈澱を起こさせる。最後に0.3mlの１
％チメロサールを防腐剤として加える（１mg
プロテアーゼトキソイド／0.3ml）。 (2) ※エラスターゼトキソイド−カリミヨウバ
ン溶液：プロテアーゼトキソイドの代りにエ
ラスターゼトキソイドを使用すること以外前
述の方法と同じ方法で製造される。 (3) OEP−カリミヨウバン溶液：OEPの100mg
を５mlの0.01N NaOHにとかし、これに28ml
のPBSを加える。次にこの溶液に3.3mlの10
％カリミヨウバンを加え、さらに3.3mlの20
％Na2HPO4を加えた。最後に0.4mlの１％チ
メロサールを加えた（１mgOEP／0.4ml）。 (4) 使用直前に上記のプロテアーゼトキソイド
−カリミヨウバン溶液、エラスターゼトキソ
イド−カリミヨウバン溶液、OEP−カリミ
ヨウバン溶液の三者を混合する。この混合液
0.5ml中に500γのプロテアーゼトキソイド、
500γのエラスターゼトキソイド、500γの
OEPを含む。 ※エラスターゼトキソイド：エラスターゼ
溶液（10〜15mg酵素蛋白質／ml、5M食塩、
10ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウ
ムおよび0.1ｍＭ塩化亜鉛を含む）を酵素濃
度２〜５mg/mlとなるように硼酸塩緩衝液
（PH９）で稀釈（最終硼酸塩濃度約0.1M）
し、それに最終濃度１％となるようにホルマ
リンを加えて室温に保つ。失活したエラスタ
ーゼ溶液を水に対して透析し、次いで凍結乾
燥してエラスターゼトキソイドを得る。 ２ 実験結果 ミンクに生菌感染（攻撃試験）を行ない、
OEPおよび三種混合ワクチンの免疫効果を調
べその結果を表７に示した。 カリ明ばん単独の場合にはLD50は約3.0×106
であつた。OEP単独の場合LD50≦3.6×106であ
り、カリ明ばんとの差は認められなかつた。し
かし、三種混合免疫Ｃ群ではLD50＞1.9×109で
あり、Ｂ群、Ａ群とは明らかに差が認められ
る。 無処理でLD503.4×105であつた。カリ明ばん
単独またはOEPとカリ明ばん免疫では高々10
倍位の生菌量に耐えるようになる。しかし、こ
れにプロテアーゼトキソイドとエラスターゼト
キソイドを加えた三種混合ワクチンとして用い
ると約10000倍量を耐過する。
【表】
本発明のプロテアーゼトキソイドの毒性は下
記の通りである。 １mg／マウスを腹腔内投与しても急性毒性は
認められなかつた（プロテアーゼの最小致死量
0.2mg／マウス）。 以上の実験例から明らかなように、本発明のプ
ロテアーゼトキソイドを接種した動物ではHA
価、中和抗体価の上昇が認められるが、無接種動
物ではHA価、中和抗体価が認められない。それ
故に本発明のプロテアーゼトキソイドは動物およ
びヒトの緑膿菌感染症予防ワクチンおよび治療用
の抗体（抗血清）の製造に不可欠であることは明
らかである。 本発明プロテアーゼトキソイドの具体的応用例
を下記に示す。 プロテアーゼトキソイドを動物およびヒトに
接種してプロテアーゼトキソイド抗体を含む血
清または抗体を製造し、その抗血清または抗体
を用いて緑膿菌症のプロテアーゼによる障害
（たとえば角膜潰瘍など）を防御、治療するこ
とができる（血清療法）。 また、プロテアーゼトキソイドまたはアジユ
バントを含むプロテアーゼトキソイドをワクチ
ンとして動物およびヒトに接種（皮下、皮内、
筋肉注射など）して、緑膿菌症のプロテアーゼ
による障害を予防、治療することができる。 プロテアーゼトキソイドを抗原としたワクチ
ンは通常の動物用および人間用ワクチンを製造
する方法に準じて製造できる。すなわち、プロ
テアーゼトキソイドに溶媒を加えて溶液を作
り、もし必要ならアジユバントおよび／または
防腐剤を加えればよい。溶媒として、たとえば
蒸留水、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水が
ある。アジユバントとして、たとえば水酸化ア
ルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カル
シウム、明ばんまたはFreundのインコンプリ
ートアジユバントなどがある。防腐剤としてチ
メロサール、フエノール、石炭酸またはホルマ
リンなどがある。 さらに、本発明のプロテアーゼトキソイドは
非常に活性の高い有効な緑膿菌ワクチンを製造
する上でも非常に有効な物質である。
記の通りである。 １mg／マウスを腹腔内投与しても急性毒性は
認められなかつた（プロテアーゼの最小致死量
0.2mg／マウス）。 以上の実験例から明らかなように、本発明のプ
ロテアーゼトキソイドを接種した動物ではHA
価、中和抗体価の上昇が認められるが、無接種動
物ではHA価、中和抗体価が認められない。それ
故に本発明のプロテアーゼトキソイドは動物およ
びヒトの緑膿菌感染症予防ワクチンおよび治療用
の抗体（抗血清）の製造に不可欠であることは明
らかである。 本発明プロテアーゼトキソイドの具体的応用例
を下記に示す。 プロテアーゼトキソイドを動物およびヒトに
接種してプロテアーゼトキソイド抗体を含む血
清または抗体を製造し、その抗血清または抗体
を用いて緑膿菌症のプロテアーゼによる障害
（たとえば角膜潰瘍など）を防御、治療するこ
とができる（血清療法）。 また、プロテアーゼトキソイドまたはアジユ
バントを含むプロテアーゼトキソイドをワクチ
ンとして動物およびヒトに接種（皮下、皮内、
筋肉注射など）して、緑膿菌症のプロテアーゼ
による障害を予防、治療することができる。 プロテアーゼトキソイドを抗原としたワクチ
ンは通常の動物用および人間用ワクチンを製造
する方法に準じて製造できる。すなわち、プロ
テアーゼトキソイドに溶媒を加えて溶液を作
り、もし必要ならアジユバントおよび／または
防腐剤を加えればよい。溶媒として、たとえば
蒸留水、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水が
ある。アジユバントとして、たとえば水酸化ア
ルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カル
シウム、明ばんまたはFreundのインコンプリ
ートアジユバントなどがある。防腐剤としてチ
メロサール、フエノール、石炭酸またはホルマ
リンなどがある。 さらに、本発明のプロテアーゼトキソイドは
非常に活性の高い有効な緑膿菌ワクチンを製造
する上でも非常に有効な物質である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 緑膿菌から産生されるプロテアーゼをトキソ
イド化して得られ； 分子量：6.3万（ゲル濾過法） 紫外線吸収スペクトル：最高280ｍμ（Ｅ２８０ １
％
＝9.27、0.1M KCl）最低250ｍμ 等電点：PH5.2（焦点電気泳動） アミノ酸組成：アミノ酸残基（ｇ／100ｇ蛋
白）、アスパラギン酸（15.6）、スレオニン
（5.0）、セリン（7.6）グルタミン酸（9.5）、プ
ロリン（2.1）、グリシン（7.7）、アラニン
（8.5）、バリン（5.0）、イソロイシン（3.9）、ロ
イシン（8.7）、チロシン（6.9）、フエニルアラ
ニン（5.9）、リジン（4.1）、ヒスチジン
（1.9）、アルギニン（2.3）、トリプトフアン
（2.3）、アンモニア1.4（計98.5ｇ） 物質の色：無色粉末 抗原活性：有り 酵素活性：なし の理化学的性質を有する緑膿菌プロテアーゼのト
キソイド。 ２ 緑膿菌から産生されるプロテアーゼをリジン
存在下でホルマリンまたはオキシメタンスルフイ
ン酸でトキソイド化することを特徴とする緑膿菌
プロテアーゼのトキソイドの製造法。 ３ 抗体を形成させるのに十分な量のプロテアー
ゼトキソイドを動物に接種することを特徴とする
緑膿菌症のプロテアーゼによる障害を予防、治療
する方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1083676A JPS5296727A (en) | 1976-02-05 | 1976-02-05 | Toxoid of pseudomonas aeruginosa protease |
| CA270,134A CA1085293A (en) | 1976-02-05 | 1977-01-20 | Toxoids derived from protease and elastase of pseudomonas aeruginosa and production thereof |
| US05/764,454 US4160023A (en) | 1976-02-05 | 1977-01-31 | Toxoids derived from protease and elastase of Pseudomonas aeruginosa and production thereof |
| GB42768/78A GB1560862A (en) | 1976-02-05 | 1977-01-31 | Toxoid derived from the protease of pseudomonas aeruginosa and the production thereof |
| SE7701037A SE442269B (sv) | 1976-02-05 | 1977-02-01 | Sett att framstella en toxoid, avledd fran proteas fran pseudomona aeruginosa |
| DE19772704767 DE2704767A1 (de) | 1976-02-05 | 1977-02-04 | Protease- und elastase-toxoid aus pseudomonas aeruginosa, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von antiserum und toxoid-impfstoffen gegen pseudomonas aeruginosa-infektionen |
| FR7703275A FR2362154A1 (fr) | 1976-02-05 | 1977-02-04 | Toxoides derives de protease de pseudomonas aeruginosa et leur procede de production |
| CH140177A CH628679A5 (de) | 1976-02-05 | 1977-02-04 | Verfahren zur herstellung eines toxoids aus enzymen von pseudomonas aeruginosa. |
| SE8203674A SE442086B (sv) | 1976-02-05 | 1982-06-14 | Sett att framstella en toxoid, avledd fran elastas fran pseudomonas aeruginosa |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1083676A JPS5296727A (en) | 1976-02-05 | 1976-02-05 | Toxoid of pseudomonas aeruginosa protease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5296727A JPS5296727A (en) | 1977-08-13 |
| JPS6154769B2 true JPS6154769B2 (ja) | 1986-11-25 |
Family
ID=11761428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1083676A Granted JPS5296727A (en) | 1976-02-05 | 1976-02-05 | Toxoid of pseudomonas aeruginosa protease |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5296727A (ja) |
| GB (1) | GB1560862A (ja) |
-
1976
- 1976-02-05 JP JP1083676A patent/JPS5296727A/ja active Granted
-
1977
- 1977-01-31 GB GB42768/78A patent/GB1560862A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5296727A (en) | 1977-08-13 |
| GB1560862A (en) | 1980-02-13 |
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