【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はコクサツキーウイルス感染症の診断用
感作ラテツクスに関するものであり、さらに詳し
くはラテツクス粒子にコクサツキーウイルス抗原
を結合させてなるコクサツキーウイルス受身ラテ
ツクス凝集反応用感作ラテツクスに関するもので
ある。コクサツキーウイルス（Coxackievirus）
は大きさ28nｍのRNAウイルスで、ピコルナウイ
ルス（Picornavirus）群の中の腸管ウイルス
（Enterovirus）に属する。すなわち糞便より経口
的に人から人へ感染するウイルスである。このコ
クサツキーウイルスは、これに感染しても多くは
不顕性感染におわるが、時として発症する。その
症状は脳炎、髄膜炎、麻痺、発疹、上気道炎、夏
期における下痢、筋痛症、心嚢炎、心筋炎、手足
口病などで、神経症状から呼吸器疾患、腸管系疾
患にわたる非常に広範囲の多彩な症状を示す感染
症であり、このコクサツキーウイルス感染症に特
有の臨床所見がみられず、従つて他の病原による
感染症と臨床所見によつて鑑別することはほとん
ど不可能である。
このコクサツキーウイルス感染症の血清学的診
断法としては、現在、中和反応（Neutralization
Test、以下NTと略記する）と補体結合反応
（Complement Fixation Test、以下CFと略記す
る）が行われている。このうち、CFは診療機関
で広く実施されている検査法であるが、この反応
はコクサツキーウイルスに関しては非常に感度が
低く、多くの場合抗体が検出できず、コクサツキ
ーウイルス感染症でありながら陰性と判断される
ことが多い。これに反して、NTはCFよりも高い
感度を示し、かつ特異的であるので、すぐれた反
応であるが、組織培養によるウイルスの培養を行
なわなければならないので、特別な設備と多くの
労力を要し、通常用いる診断法として応用するこ
とはほとんど不可能に近い。
このコクサツキーウイルス感染症を確実に診断
することは、治療方針の設定、予後の予測に必須
であるばかりではなく、流行の予測などの公衆衛
生上の観点からも極めて重要である。
本発明者は上記した従来のコクサツキーウイル
ス診断法における欠点を克服すべく鋭意研究を行
なつた結果コクサツキーウイルス抗原を結合させ
た感作ラテツクスを用い、受身ラテツクス凝集反
応により、高感度でしかも特異的にコクサツキー
ウイルス感染症を鑑別診断することができること
を見出し、本発明を完成した。
本発明の目的は、ラテツクス粒子にコクサツキ
ーウイルス抗原を結合してなるコクサツキーウイ
ルス感染症診断用感作ラテツクスを提供すること
である。
本発明の感作ラテツクス製造に用いるコクサツ
キーウイルス抗原は、ウイルスビリオンそのもの
であり、その性質および分離方法は周知である。
例えば、LLCMK2などの培養細胞にコクサツキ
ーウイルスを高い感染度で感染させ、約６時間
後、凍結融解をくりかえすことによつて、細胞内
および上清中のウイルス抗原を得ることができ
る。この試料からは、超遠心法、あるいはポリエ
チレングリコールを用いる遠心法により容易にウ
イルスビリオンのみを集めることができる。
上記コクサツキーウイルス抗原によつて前記ラ
テツクス粒子を感作するには、ラテツクス粒子と
ウイルス抗原を生理食塩液、緩衝液などの中で接
触させればよい。この場合、かきまぜまたはふり
まぜによつて接触時間を短縮することができる。
この感作処理は、一般に、PH約6.4〜9.0、温度約
４〜37℃で行なう。感作処理後水溶液で洗浄する
ことによつて、未吸着、過剰の抗原を除去する。
この感作洗浄後、さらにラテツクス粒子に吸着さ
れる性状を有する物質たとえばウシ血清アルブミ
ンなどで抗原未吸着部分を飽和して、もはや何も
吸着しないようにしておく。
上記のようにして得たラテツクス試薬は、通常
約0.5％のラテツクス粒子懸濁液として使用す
る。
上記の感作ラテツクスを長期にわたつて保存す
るには保存液中に懸濁させて氷室に保存してもよ
く、あるいは保護剤を含む媒体と共に凍結乾燥し
て、凍結乾燥品として保存してもよい。凍結乾燥
品の場合は使用に際しては感作ラテツクスに希釈
液を加えて診断液を調製する。
本発明の感作ラテツクスがコクサツキーウイル
ス抗体に対し特異的に反応して凝集を起すこと、
また正常抗原感作ラテツクスは上記抗体に全く反
応しないことから本発明の感作ラテツクスはラテ
ツクス粒子にコクサツキーウイルス抗原が結合し
たものであるといえる。本発明に用いる高比重ポ
リスチレンラテツクスは、比重1.14好ましくは比
重1.2以上のポリスチレンラテツクスをいう。ポ
リスチレンラテツクスの比重が小さいと、感作ラ
テツクスの凝集による沈降に時間がかかり分析時
間が長くなつて好ましくない。
本発明において用いられるラテツクスとして
は、上記の高比重ポリスチレンが最も好適なもの
であるが、この他にカルボキシ化ポリスチレン、
スチレンブタジエン共重合体、スチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体、アクリロニトリル−ブタジ
エン−スチレン共重合体なども用いることができ
る。
本発明の感作ラテツクスを用いたコクサツキー
ウイルス感染症の診断は、本発明の感作ラテツク
ス懸濁液をヒトまたは動物の血清などの体液もし
くはその希釈液と接触させ、受身ラテツクス凝集
反応に基づく管底凝集像を観察することによつて
行うが、手法としてはマイクロタイター法による
のが最も好ましく、本発明の感作ラテツクスを用
いたマイクロタイター法によれば、(イ)手技が極め
て簡単であり：(ロ)約10時間で判定が可能であり、
(ハ)感度が極めて高く（CFの100〜1000倍）、(ニ)さ
らに担体がラテツクスであるために担体に対する
抗体が人血中に存在しないので担体による血清の
前処理がすべて不要になる。しかも以上詳記した
ところより明らかなように、本発明のコクサツキ
ーウイルス感染症診断用感作ラテツクスは、抗原
を組織培養で調製するため、CF抗原とほゞ同一
の低コストで製造することができる上、生血球、
補体、溶血素などを使用しないため全体として診
断に要する費用はCF法に比較してかなり低いも
のになる。すなわち本発明は、従来コクサツキー
ウイルス感染症の診断に用いられたことのない受
身ラテツクス凝集反応用感作ラテツクスを提供
し、本発明の感作ラテツクスを用いた診断法によ
つてコクサツキーウイルスの抗体を高感度で迅速
に検出し、患者の診断を確実にしたのはもちろん
のこと、さらに、ヒトの抗体測定によるコクサツ
キーウイルス感染症の流行予測など公衆衛生上、
疫学上の要請に応えることができるほか、期限切
れの輸血用血液から特異的血清療法用のガンマー
グロブリン製剤を調製する時の抗体スクリーニン
グにも有用である。現在までにラテツクス粒子に
コクサツキーウイルス抗原を感作した例は全く文
献未載であり、マイクロタイター法による受身ラ
テツクス凝集反応は全く新規なものである。
以下調製例および実施例を示して本発明をさら
に詳しく説明するが、本発明はその要旨を超えな
い限りこれらによつて限定されるものではない。
調製例 １
抗原の調製
LLCMK2細胞の単層培養にCoxackievirus（Ｂ
群５型、Faulkner株）を感染の度合
（multiplicity of infection）50で接種し、37℃で
６時間培養した。培養びんから細胞を剥離し、ド
ライアイス−メタノールと温湯で凍結融解を３回
くりかえして細胞を破壊し、これを10000rpm30
分遠心して上清を分取し、この上清にポリエチレ
ングリコール6000を８％加え、室温に２時間、４
℃に一夜おいた後5000rpm15分遠心してウイルス
を沈渣として集め、培養液の1/100容のリン酸塩
緩衝食塩液（以下PBSという）に懸濁してから
5000rpm30分遠心して上清をとり、抗原とした。
他の型のコクサツキーウイルスについても同様
にして抗原を調製した。また、ウイルスを感染さ
せないで全く同様にして調製した抗原をつくり、
これを正常抗原として対照に用いた。このように
して調製した抗原は−20℃以下で長期間安定であ
る。
調製例 ２
感作ラテツクスの調製
高比重ラテツクスであるところのポリスチレン
ラテツクス（武田薬品工業株式会社製SDL59、比
重1.2）をPBSで0.25％懸濁液とし、これに等量
の、調製例１において得られた抗原液の80倍希釈
液を加え、室温で２〜４時間処理した後、PBSで
２回洗浄し原量の1/10量の凍結乾燥媒〔希釈液
（PH7.2M／60PBSに牛血清アルブミン１％0.1％を
加えたもの）にグリシン0.5％、デキストラン
T10（フアルマシア社製）0.7％を加えたもの〕
に懸濁し凍結乾燥した。
実験例
受身ラテツクス凝集反応
凍結乾燥感作ラテツクスに前記希釈液を原量の
10倍量加える。反応はマイクロタイター法によつ
て行ない、先ずプレートにドロツパーで希釈液を
0.025mlずつ分注する。第１穴目に適当に希釈し
た患者血清（例えば１：100）を0.025ml加える。
ダイリユーターで２n希釈する。感作ラテツクス
液を0.025mlずつ滴下しミキサーをかけ室温に10
時間以上静置した後判定を行なう。陽性を示す最
大希釈倍数の逆数を抗体価とする。本発明の感作
ラテツクスと患者血清のボツクス・タイトレーシ
ヨンの結果を第１表に示す。
The present invention relates to a sensitized latex for diagnosis of Coxsatsky virus infection, and more particularly to a sensitized latex for Coxsatsky virus passive latex agglutination reaction, which is obtained by binding a Coxsatsky virus antigen to latex particles. Coxackievirus
is an RNA virus with a size of 28 nm and belongs to the Enterovirus group of Picornaviruses. In other words, it is a virus that can be transmitted from person to person through feces orally. Infections with Coxsatsky virus are mostly asymptomatic, but occasionally symptoms develop. Symptoms include encephalitis, meningitis, paralysis, rash, upper respiratory tract inflammation, diarrhea in the summer, myalgia, pericarditis, myocarditis, and hand, foot and mouth disease, which can range from neurological symptoms to respiratory and intestinal diseases. It is an infectious disease that exhibits a wide variety of symptoms, and there are no clinical findings specific to Coxsatskyvirus infection, so it is almost impossible to differentiate it from infections caused by other pathogens based on clinical findings. be. Currently, the serological diagnostic method for Coxsatsky virus infection is neutralization reaction (neutralization reaction).
Test (hereinafter abbreviated as NT) and complement fixation test (hereinafter abbreviated as CF) are performed. Among these, CF is a test method widely used in medical institutions, but this reaction has very low sensitivity for Coxsatsky virus, and in many cases antibodies cannot be detected, even though it is a Coxsatsky virus infection. It is often judged as negative. On the other hand, NT shows higher sensitivity and specificity than CF, so it is an excellent reaction, but it requires culturing the virus by tissue culture, which requires special equipment and a lot of labor. Therefore, it is almost impossible to apply it as a commonly used diagnostic method. Reliably diagnosing this Coxsatsky virus infection is not only essential for setting treatment policies and predicting prognosis, but also extremely important from a public health perspective, such as predicting epidemics. The present inventor has conducted intensive research to overcome the drawbacks of the conventional Coxsatsky virus diagnostic methods described above, and as a result, has achieved high sensitivity and The present invention was completed based on the discovery that it is possible to specifically differentially diagnose Coxsatsky virus infection. An object of the present invention is to provide a sensitized latex for diagnosing a Coxsatsky virus infection, which is made by binding a Coxsatsky virus antigen to latex particles. The Coxsatsky virus antigen used in the production of the sensitized latex of the present invention is the virus virion itself, and its properties and isolation methods are well known.
For example, by infecting cultured cells such as LLCMK 2 with Coxsatsky virus at a high degree of infection, and repeating freezing and thawing after about 6 hours, the virus antigen in the cells and in the supernatant can be obtained. Only virus virions can be easily collected from this sample by ultracentrifugation or centrifugation using polyethylene glycol. In order to sensitize the latex particles with the Coxsatsky virus antigen, the latex particles and the virus antigen may be brought into contact in a physiological saline solution, a buffer solution, or the like. In this case, the contact time can be shortened by stirring or shaking.
This sensitization treatment is generally carried out at a pH of about 6.4 to 9.0 and a temperature of about 4 to 37°C. After sensitization treatment, unadsorbed and excess antigen is removed by washing with an aqueous solution.
After this sensitization and washing, the areas where the antigen is not adsorbed are further saturated with a substance that is adsorbed to the latex particles, such as bovine serum albumin, so that nothing is adsorbed anymore. The latex reagent obtained as described above is usually used as a latex particle suspension of about 0.5%. To preserve the above-mentioned sensitized latex for a long period of time, it may be suspended in a preservation solution and stored in an ice chamber, or it may be lyophilized with a medium containing a protective agent and stored as a lyophilized product. good. When using a lyophilized product, a diluent is added to the sensitized latex to prepare a diagnostic solution. The sensitized latex of the present invention specifically reacts with Coxsatsky virus antibodies and causes agglutination;
Furthermore, since the normal antigen-sensitized latex does not react with the above-mentioned antibodies at all, it can be said that the sensitized latex of the present invention is one in which Coxsatsky virus antigen is bound to latex particles. The high-density polystyrene latex used in the present invention refers to polystyrene latex with a specific gravity of 1.14 or more, preferably 1.2 or more. If the specific gravity of the polystyrene latex is low, it will take time for the sensitized latex to settle due to aggregation, and the analysis time will become longer, which is undesirable. The most suitable latex used in the present invention is the above-mentioned high-density polystyrene, but in addition, carboxylated polystyrene,
Styrene-butadiene copolymers, styrene-divinylbenzene copolymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, etc. can also be used. Diagnosis of Coxsatsky virus infection using the sensitized latex of the present invention is based on a passive latex agglutination reaction by contacting the sensitized latex suspension of the present invention with body fluids such as human or animal serum or diluted solutions thereof. This is carried out by observing the aggregate image at the bottom of the tube, but the most preferable method is the microtiter method. According to the microtiter method using the sensitized latex of the present invention, (a) the procedure is extremely simple; Yes: (b) Judgment can be made in about 10 hours,
(c) The sensitivity is extremely high (100 to 1000 times that of CF), and (d) since the carrier is latex, there are no antibodies against the carrier in human blood, so pretreatment of serum with the carrier is no longer necessary. Moreover, as is clear from the detailed description above, the sensitized latex for diagnosing Coxsatsky virus infection of the present invention can be manufactured at almost the same low cost as the CF antigen because the antigen is prepared by tissue culture. In addition, live blood cells,
Because it does not use complement, hemolysin, etc., the overall cost of diagnosis is considerably lower than that of the CF method. That is, the present invention provides a sensitized latex for passive latex agglutination reaction, which has not been previously used for the diagnosis of Coxsatsky virus infection, and a diagnostic method using the sensitized latex of the present invention to detect Coxsatsky virus infection. Not only has it detected antibodies quickly and with high sensitivity to ensure patient diagnosis, but it has also contributed to public health, such as predicting the prevalence of Coxsatsky virus infection by measuring antibodies in humans.
In addition to meeting epidemiological needs, it is also useful for antibody screening when preparing gamma globulin preparations for specific serum therapy from expired transfusion blood. To date, there have been no published examples of sensitizing latex particles with Coxsatsky virus antigens, and the passive latex agglutination reaction using the microtiter method is completely new. The present invention will be explained in more detail below with reference to Preparation Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto unless it exceeds the gist thereof. Preparation Example 1 Preparation of antigen Coxackievirus (B
Group 5, Faulkner strain) was inoculated at a multiplicity of infection of 50 and incubated at 37°C for 6 hours. Detach the cells from the culture bottle, repeat freezing and thawing three times with dry ice-methanol and warm water to destroy the cells, and then heat at 10,000 rpm30.
Separate the supernatant by centrifugation, add 8% polyethylene glycol 6000 to this supernatant, and leave it at room temperature for 2 hours.
After leaving at ℃ overnight, centrifuge at 5000 rpm for 15 minutes to collect the virus as a precipitate, suspend it in 1/100 volume of the culture medium, and suspend it in phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS).
The mixture was centrifuged at 5000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was collected and used as an antigen. Antigens were similarly prepared for other types of Coxsatsky virus. In addition, we created an antigen prepared in exactly the same way without infecting the virus,
This was used as a control as a normal antigen. The antigen prepared in this way is stable for a long period of time at -20°C or lower. Preparation Example 2 Preparation of Sensitized Latex Polystyrene latex (SDL59 manufactured by Takeda Pharmaceutical Company Limited, specific gravity 1.2), which is a high specific gravity latex, was made into a 0.25% suspension in PBS, and an equal amount of the same amount in Preparation Example 1 was prepared. Add an 80-fold dilution of the obtained antigen solution, treat at room temperature for 2 to 4 hours, wash twice with PBS, and add 1/10 of the original amount of lyophilization medium [diluted solution (PH7.2M/60PBS)]. Bovine serum albumin 1% (0.1%), glycine 0.5%, dextran
Added 0.7% T10 (manufactured by Pharmacia)]
and freeze-dried. Experimental example Passive latex agglutination reaction
Add 10 times the amount. The reaction was carried out using the microtiter method, and first the diluted solution was added to the plate using a dropper.
Dispense in 0.025ml portions. Add 0.025 ml of appropriately diluted patient serum (for example, 1:100) to the first hole.
Dilute 2n using a direuter. Add 0.025ml of sensitizing latex solution dropwise and heat with a mixer to room temperature for 10 minutes.
Judgment is made after leaving it for more than an hour. The antibody titer is the reciprocal of the maximum dilution that shows positivity. Table 1 shows the results of box titration of the sensitized latex of the present invention and patient serum.
【表】
比較例
補体結合反応
CFは抗体減量法であるコルマー（Kolmer）法
に準拠し、マイクロタイター法で実施した。すな
わち、0.025ml２n希釈非働化血清系列に抗原
0.025mlを加え、これに２単位の補体0.05mlを加
え、混合して４℃で一夜反応させる。この第一段
反応終了後、37℃に加温した後、20単位溶血素感
作した溶血系統0.05mlを加え、37℃で30分反応さ
せた後、1000rpm3分遠心して溶血を判定した。
結果を第２表に示す。[Table] Comparative Example Complement Fixation Reaction CF was carried out using the microtiter method in accordance with the Kolmer method, which is an antibody reduction method. In other words, add antigen to 0.025ml 2n diluted inactivated serum series.
Add 0.025 ml, add 0.05 ml of 2 units of complement, mix and react overnight at 4°C. After the first stage reaction was completed, the mixture was heated to 37°C, 0.05ml of a hemolysate strain sensitized with 20 units of hemolysin was added, reacted at 37°C for 30 minutes, and centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes to determine hemolysis.
The results are shown in Table 2.
【表】【table】
【表】
ここに用いた抗体はラテツクス凝集反応と同一
のものである。
上記したラテツクス凝集反応ボツクス・タイト
レーシヨンにみられるように、この感作ラテツク
スはCF抗体価128の患者血清に対しラテツクス凝
集抗体価64000と500倍の感度を示し、希釈液に対
しては完全な陰性を示している。またこの血清は
正常抗原感作ラテツクスに対しては全く陽性を示
さず、この反応が感作した抗原に対する特異反応
であることを示している。このラテツクス凝集反
応において、抗原感作量は１：５〜１：20の間で
同一の抗体価を示し、抗原感作量の変動にともな
う抗体価の影響がみられなかつた。[Table] The antibodies used here are the same as those used for latex agglutination reaction. As seen in the latex agglutination reaction box titration mentioned above, this sensitized latex exhibits a latex agglutination antibody titer of 64,000, which is 500 times more sensitive to patient serum with a CF antibody titer of 128, and is completely sensitive to diluted solutions. It shows a negative result. Furthermore, this serum did not show any positivity to the normal antigen-sensitized latex, indicating that this reaction was a specific reaction to the sensitized antigen. In this latex agglutination reaction, the antigen sensitization amount showed the same antibody titer between 1:5 and 1:20, and no influence of the antibody titer due to the variation in the antigen sensitization amount was observed.