【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はエコーウイルス感染症の診断用感作ラ
テツクスに関するものであり、さらに詳しくはラ
テツクス粒子にエコーウイルス抗原を結合させて
なるエコーウイルス受身ラテツクス凝集反応用感
作ラテツクスに関するものである。
エコーウイル（Echovirus）は、大きさ28nｍ
のRNAウイルスで、ピコルナウイルス
（picornavirus）群の中の腸管ウイルス
（Enterovirus）に属する。すなわち糞便より経口
的に人から人へ感染するウイルスである。このエ
コーウイルスは、これに感染しても多くは不顕性
感染におわるが、時として発症する。この症状は
齦膜炎、ポリオ様麻痺、発疹、上気道炎、夏期に
おける下痢などで、神経症状から呼吸器疾患、腸
管系疾患にわたる非常に広範囲の多彩な症状を示
す感染症であり、このエコーウイルス感染症に特
有の臨床所見がみられず、従つて他の病原による
感染症と臨床所見によつて鑑別することはほとん
ど不可能である。
この、エコーウイルス感染症の血清学的診断法
としては、現在、中和反応（Neutalization
Test、以下NTと略記する）と補体結合反応
（Complement Fixation Test以下CFと略記す
る）が行われている。このうち、CFは診療機関
で広く実施されている検査法であるが、この反応
はエコーウイルスに関しては非常に感度が低く、
多くの場合抗体が検出できず、エコーウイルス感
染症でありながら陰性と判断されることが多い。
これに反して、NTはCFよりも高い感度を示し、
かつ特異的であるので、すぐれた反応であるが、
組織培養によるウイルスの培養を行なわなければ
ならないので、特別な設備と多くの労力を要し、
通常用いる診断法として応用することはほとんど
不可能に近い。
このエコーウイルス感染症を確実に診断するこ
とは、治療方針の設定、予後の予測に必須である
ばかりではなく、流行の予測などの公衆衛生上の
観点からも極めて重要である。
本発明者は上記した従来のエコーウイルス診断
法における欠点を克服すべく鋭意研究を行なつた
結果、エコーウイルス抗原を結合させた感作ラテ
ツクスを用い、受身ラテツクス凝集反応により、
高感度でしかも特異的にエコーウイルス感染症を
鑑別診断することができることを見出し、本発明
を完成した。
本発明の目的は、ラテツクス粒子にエコーウイ
ルス抗原を結合してなるエコーウイルス感染症診
断用感作ラテツクスを提供することである。
本発明の感作ラテツクス製造に用いるエコーウ
イルス抗原は、ウイルスビリオンそのものであ
り、その性質および分離方法は周知である。例え
ば、LLCMK2などの培養細胞にエコーウイルス
を高い感染度で感染させ、約６時間後、凍結融解
をくりかえすことによつて、細胞内および上清中
のウイルス抗原を得ることができる。この試料か
らは、超遠心法、あるいはポリエチレングリコー
ルを用いる遠心法により容易にウイルスビリオン
のみを集めることができる。
上記エコーウイルス抗原によつて前記ラテツク
ス粒子を感作するには、ラテツクス粒子とウイル
ス抗原を生理食塩液、緩衝液などの中で接触させ
ればよい。この場合かきまぜまたはふりまぜによ
つて接触時間を短縮することができる。この感作
処理は、一般に、PH約6.4〜9.0、温度約４〜37℃
で行なう。感作処理後、水溶液で洗浄することに
よつて未吸着の過剰の抗原を除去する。この感作
洗浄後、さらにラテツクス粒子に吸着される性状
を有する物質たとえばウシ血清アルブミンなどで
抗原未吸着部分を飽和して、もはや何も吸着しな
いようにしておく。
上記のようにして得たラテツクス試薬は、通常
約0.5％のラテツクス粒子懸濁液として使用す
る。
上記の感作ラテツクスを長期にわたつて保存す
るには保存液中に懸濁させて氷室に保存してもよ
く、あるいは保護剤を含む媒体とともに凍結乾燥
して、凍結乾燥品として保存してもよい。凍結乾
燥品の場合は使用に際しては感作ラテツクスに希
釈液を加えて診断液を調製する。
本発明の感作ラテツクスがエコーウイルス抗体
に対し特異的に反応して凝集を起すこと、また正
常抗原感作ラテツクスは上記抗体に全く反応しな
いことから本発明の感作ラテツクスはラテツクス
粒子にエコーウイルス抗原が結合したものである
といえる。本発明に用いる高比重ポリスチレンラ
テツクスは、比重1.14好ましくは比重1.2以上の
ポリスチレンラテツクスをいう。ポリスチレンラ
テツクスの比重が小さいと、感作ラテツクスの凝
集による沈降に時間がかかり、分析時間が長くな
つて好ましくない。
本発明において用いられるラテツクスとして
は、上記の高比重ポリスチレンが最も好適なもの
であるが、この他に、カルボキシル化ポリスチレ
ン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−
ジビンルベンゼン共重合体、アクリロニトリル−
ブタジエン−スチレン共重合体なども用いること
ができる。
本発明の感作ラテツクスを用いたエコーウイル
ス感染症の診断は、本発明の感作ラテツクス懸濁
液をヒトまたは動物の血清などの体液もしくはそ
の希釈液と接触させ、受身ラテツクス凝集反応に
基づく管底凝集像を観察することによつて行う
が、手法としてはマイクロタイター法によるのが
最も好ましく、本発明の感作ラテツクスを用いた
マイクロタイター法によれば、(イ)手技が極めて簡
単であり、(ロ)約10時間で判定が可能であり、(ハ)感
度が極めて高く（CFの100〜1000倍）(ニ)さらに担
体がラテツクスであるために、担体に対する抗体
が人血中に存在しないので担体による血清の前処
理がすべて不要になる。しかも以上詳記したとこ
ろより明らかなように、本発明のエコーウイルス
感染症診断用感作ラテツクスは、抗原を組織培養
で調製するため、CF抗原とほゞ同一の低コスト
で製造することができる上、生血球、補体、溶血
素などを使用しないため、全体として診断に要す
る費用はCF法に比較してかなり低いものにな
る。すなわち本発明は、従来エコーウイルス感染
症の診断に用いられたことのない受身ラテツクス
凝集反応用感作ラテツクスを提供し、本発明の感
作ラテツクスを用いた診断法によつてエコーウイ
ルスの抗体を高感度で迅速に検出し、患者の診断
を確実にしたのはもちろんのこと、さらに、ヒト
の抗体測定によるエコーウイルス感染症の流行予
測など、公衆衛生上、疫学上の要請に応えること
ができるほか、期限切れの輪血用血液から特異的
血清療法用のガンマーグロブリン製剤を調製する
時の抗体スクリーニングにも有用である。現在ま
でにラテツクス粒子にエコーウイルス抗原を感作
した例は全く交献未載であり、マイクロタイター
法による受身ラテツクス凝集反応は全く新規なも
のである。
以下調製例および実施例を示して本発明をさら
に詳しく説明するが、本発明はその要旨を超えな
い限りこれらによつて限定されるものではない。
調製例 １
抗原の調製
LLCMK2細胞の単層培養にFchovirus Type7
（Wallace株）を感染の度合（multiplicity of
infection）50で接種し、37℃で６時間培養した。
培養びんから細胞を剥離し、ドライアイス−メタ
ノールと温湯で凍結融解を３回くりかえして細胞
を破壊し、これを10000rpm30分遠心して上清を
分取し、この上清にポリエチレングリコール6000
を８％加え、室温に２時間、４℃に一夜おいた
後、5000rpm15分遠心してウイルスを沈渣として
集め、培養液の1/100容のリン酸塩緩衝食塩液
（以下PBSという）に懸濁してから5000rpm30分
遠心して上清をとり、抗原とした。
他の型のエコーウイルスについても同様にして
抗原を調製した。またウイルスを感染させないで
全く同様にして調製した抗原をつくり、これを正
常抗原として対照に用いた。このようにして調製
した抗原は−20℃以下で長期間安定である。
調製例 ２
感作ラテツクスの調製
高比重ラテツクスであるところのポリスチレン
ラテツクス（武田薬品工業株式会社製、SDL59比
重1.2）をPBSで0.25％懸濁液とし、これに等量
の、調製例１において得られた抗原液の80倍希釈
液を加え、室温で２〜４時間処理した後、PBSで
２回洗浄し原量の1/10量の凍結乾燥媒〔希釈液
（PH7.2のＭ／60PBSに、牛血清アルブミン１％、
NaN30.1％を加えたもの）にグリシン0.5％、デキ
ストランT10（フアルマシア社製）0.7％を加え
たもの〕に懸濁し凍結乾燥した。
実験例
受身ラテツクス凝集反応
凍結乾燥感作ラテツクスに前記希釈液を、原量
の10倍量加える。反応はマイクロタイター法によ
つて行ない、先ずプレートにドロツパーで希釈液
を0.025mlずつ分注する。第１穴目に適当に希釈
した患者血清（例えば１：100）を0.025ml加え
る。ダイリユーターで２n希釈する。感作ラテツ
クス液を0.025mlずつ滴下し、ミキサーをかけ、
室温に10時間以上静置した後、判定を行なう。陽
性を示す最大希釈倍数の逆数を抗体価とする。本
発明の感作ラテツクスと患者血清のボツクス・タ
イトレーシヨンの結果を第１表に示す。
The present invention relates to a sensitized latex for diagnosis of echovirus infection, and more particularly to a sensitized latex for echovirus passive latex agglutination reaction, which is obtained by binding an echovirus antigen to latex particles. Echovirus is 28nm in size
It is an RNA virus that belongs to the enteroviruses of the picornavirus group. In other words, it is a virus that can be transmitted from person to person through feces orally. In most cases, infection with this echovirus is asymptomatic, but occasionally symptoms develop. This is an infectious disease that exhibits a wide variety of symptoms, including pharyngitis, polio-like paralysis, rash, upper respiratory tract inflammation, and diarrhea in the summer. There are no clinical findings specific to viral infections, and therefore it is almost impossible to differentiate it from infections caused by other pathogens based on clinical findings. Currently, the serological diagnostic method for echovirus infection is neutralization reaction (Neutalization reaction).
Complement Fixation Test (hereinafter abbreviated as NT) and Complement Fixation Test (hereinafter abbreviated as CF) are performed. Among these, CF is a testing method widely implemented in medical institutions, but this reaction has very low sensitivity for echoviruses.
In many cases, antibodies cannot be detected, and the test result is often negative even though it is an echovirus infection.
On the contrary, NT shows higher sensitivity than CF,
It is an excellent reaction because it is both specific and
The virus must be cultured by tissue culture, which requires special equipment and a lot of effort.
It is almost impossible to apply this method as a commonly used diagnostic method. Reliably diagnosing this echovirus infection is not only essential for setting treatment policies and predicting prognosis, but is also extremely important from a public health perspective, such as predicting epidemics. The present inventor has conducted intensive research to overcome the drawbacks of the conventional echovirus diagnostic methods described above, and as a result, using sensitized latex bound to echovirus antigens, a passive latex agglutination reaction is performed.
We have discovered that it is possible to differentially diagnose echovirus infection with high sensitivity and specificity, and have completed the present invention. An object of the present invention is to provide a sensitized latex for diagnosing echovirus infection, which is made by binding echovirus antigens to latex particles. The echovirus antigen used in the production of the sensitized latex of the present invention is the virus virion itself, and its properties and isolation methods are well known. For example, by infecting cultured cells such as LLCMK 2 with echovirus at a high degree of infection and repeating freezing and thawing after about 6 hours, viral antigens in the cells and in the supernatant can be obtained. Only virus virions can be easily collected from this sample by ultracentrifugation or centrifugation using polyethylene glycol. In order to sensitize the latex particles with the echovirus antigen, the latex particles and the virus antigen may be brought into contact in a physiological saline solution, a buffer solution, or the like. In this case, the contact time can be shortened by stirring or shaking. This sensitization treatment generally involves a pH of approximately 6.4 to 9.0 and a temperature of approximately 4 to 37°C.
Let's do it. After the sensitization treatment, unadsorbed excess antigen is removed by washing with an aqueous solution. After this sensitization and washing, the areas where the antigen is not adsorbed are further saturated with a substance that is adsorbed to the latex particles, such as bovine serum albumin, so that nothing is adsorbed anymore. The latex reagent obtained as described above is usually used as a latex particle suspension of about 0.5%. To preserve the above-mentioned sensitized latex for a long period of time, it may be suspended in a preservation solution and stored in an ice chamber, or it may be lyophilized with a medium containing a protective agent and stored as a lyophilized product. good. When using a lyophilized product, a diluent is added to the sensitized latex to prepare a diagnostic solution. The sensitized latex of the present invention specifically reacts with echovirus antibodies and causes agglutination, and the normal antigen-sensitized latex does not react with the above-mentioned antibodies at all. It can be said that the antigen is bound to it. The high-density polystyrene latex used in the present invention refers to polystyrene latex with a specific gravity of 1.14 or more, preferably 1.2 or more. If the specific gravity of the polystyrene latex is low, it will take time for the sensitized latex to settle due to aggregation, which is undesirable as it will lengthen the analysis time. The most suitable latex used in the present invention is the above-mentioned high-density polystyrene, but other materials include carboxylated polystyrene, styrene-butadiene copolymer, and styrene-butadiene copolymer.
Divinylbenzene copolymer, acrylonitrile
Butadiene-styrene copolymers and the like can also be used. Diagnosis of echovirus infection using the sensitized latex of the present invention involves contacting the sensitized latex suspension of the present invention with body fluids such as human or animal serum, or diluted solutions thereof, and using a tube based on passive latex agglutination reaction. This is carried out by observing the bottom aggregation image, but the most preferable method is the microtiter method. According to the microtiter method using the sensitized latex of the present invention, (a) the procedure is extremely simple; (b) It can be determined in about 10 hours, (c) It has extremely high sensitivity (100 to 1000 times that of CF), and (d) Furthermore, since the carrier is latex, antibodies against the carrier are present in human blood. This eliminates the need for pretreatment of serum with a carrier. Moreover, as is clear from the detailed description above, the sensitized latex for diagnosing echovirus infection of the present invention can be produced at almost the same low cost as the CF antigen because the antigen is prepared by tissue culture. Moreover, since live blood cells, complement, hemolysin, etc. are not used, the overall cost of diagnosis is considerably lower than that of the CF method. That is, the present invention provides a sensitized latex for passive latex agglutination reaction, which has not been previously used in the diagnosis of echovirus infection, and allows echovirus antibodies to be detected by a diagnostic method using the sensitized latex of the present invention. Not only has high sensitivity and rapid detection ensured the diagnosis of patients, but it has also been able to meet public health and epidemiological demands, such as predicting the prevalence of echovirus infections by measuring human antibodies. It is also useful for antibody screening when preparing gamma globulin preparations for specific serum therapy from expired cycle blood. To date, there have been no published examples of sensitizing latex particles with echovirus antigens, and the passive latex agglutination reaction using the microtiter method is completely new. The present invention will be explained in more detail below with reference to Preparation Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto unless it exceeds the gist thereof. Preparation example 1 Preparation of antigen Fchovirus Type7 in monolayer culture of LLCMK 2 cells
(Wallace strain)
infection) and cultured at 37°C for 6 hours.
Detach the cells from the culture bottle, repeat freezing and thawing three times with dry ice-methanol and warm water to destroy the cells, centrifuge at 10,000 rpm for 30 minutes to collect the supernatant, and add polyethylene glycol 6,000 to this supernatant.
After adding 8% of the culture solution and leaving it at room temperature for 2 hours and at 4℃ overnight, centrifuge at 5000 rpm for 15 minutes to collect the virus as a precipitate, and suspend it in phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) of 1/100 volume of the culture medium. After that, the cells were centrifuged at 5000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was collected and used as an antigen. Antigens were similarly prepared for other types of echoviruses. In addition, an antigen was prepared in exactly the same manner without infection with the virus, and this was used as a normal antigen as a control. The antigen prepared in this way is stable for a long period of time at -20°C or lower. Preparation Example 2 Preparation of Sensitized Latex Polystyrene latex (manufactured by Takeda Pharmaceutical Company Limited, SDL59 specific gravity 1.2), which is a high specific gravity latex, was made into a 0.25% suspension in PBS, and an equal amount of the same amount in Preparation Example 1 was prepared. Add an 80-fold dilution of the obtained antigen solution, treat at room temperature for 2 to 4 hours, wash twice with PBS, and add 1/10 of the original amount of lyophilization medium [diluent (pH 7.2 M/ Bovine serum albumin 1% in 60PBS,
0.5% glycine and 0.7 % dextran T10 (manufactured by Pharmacia)] and freeze-dried. Experimental example Passive latex agglutination reaction Add the diluted solution 10 times the original amount to the freeze-dried sensitized latex. The reaction is carried out by the microtiter method, and first, 0.025 ml of the diluted solution is dispensed onto the plate using a dropper. Add 0.025 ml of appropriately diluted patient serum (for example, 1:100) to the first hole. Dilute 2n using a direuter. Drop 0.025ml of sensitized latex solution, add a mixer,
Judgment is made after leaving at room temperature for 10 hours or more. The antibody titer is the reciprocal of the maximum dilution that shows positivity. Table 1 shows the results of box titration of the sensitized latex of the present invention and patient serum.
【表】
比較例
補体結合反応
CFは抗体減量法であるコルマー（Kolmer）法
に準拠し、マイクロタイター法で実施した。すな
わち、0.025ml２n希釈非働化血清系列に抗原
0.025mlを加え、これに２単位の補体0.05mlを加
え、混合して４℃で一夜反応させる。この第一段
反応終了後、37℃に加温した後、20単位溶血素感
作した溶血系統0.05mlを加え、37℃で30分反応さ
せた後、1000rpm3分遠心して溶血を判定した。
結果を第２表に示す。[Table] Comparative Example Complement Fixation Reaction CF was carried out using the microtiter method in accordance with the Kolmer method, which is an antibody reduction method. In other words, add antigen to 0.025ml 2n diluted inactivated serum series.
Add 0.025 ml, add 0.05 ml of 2 units of complement, mix and react overnight at 4°C. After the first stage reaction was completed, the mixture was heated to 37°C, 0.05ml of a hemolysate strain sensitized with 20 units of hemolysin was added, reacted at 37°C for 30 minutes, and centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes to determine hemolysis.
The results are shown in Table 2.
【表】【table】
【表】
ここに用いた抗体はラテツクス凝集反応と同一
のものである。
上記したラテツクス凝集反応ボツクス・タイト
レーシヨンにみられるように、この感作ラテツク
スは、CF抗体価160の患者血清に対してラテツク
ス凝集抗体価160000と1000倍の感度を示し、希釈
液に対しては完全な陰性を示している。またこの
血清は正常抗原感作ラテツクスに対しては全く陽
性を示さず、この反応が感作した抗原に対する特
異反応であることを示している。このラテツクス
凝集反応において、抗原感作量は１：10〜１：80
の間で同一の抗体価を示し、抗原感作量の変動に
ともなう抗体価の影響がみられない。[Table] The antibodies used here are the same as those used for latex agglutination reaction. As seen in the latex agglutination reaction box titration mentioned above, this sensitized latex exhibits a latex agglutination antibody titer of 160,000, which is 1,000 times more sensitive than the serum of a patient with a CF antibody titer of 160, and is 1,000 times more sensitive than the diluent. shows complete negativity. Furthermore, this serum did not show any positivity to the normal antigen-sensitized latex, indicating that this reaction was a specific reaction to the sensitized antigen. In this latex agglutination reaction, the antigen sensitization amount is 1:10 to 1:80.
The antibody titer was the same between the two, and there was no effect of the antibody titer due to fluctuations in the amount of antigen sensitization.