JPS6225038B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6225038B2 JPS6225038B2 JP58017271A JP1727183A JPS6225038B2 JP S6225038 B2 JPS6225038 B2 JP S6225038B2 JP 58017271 A JP58017271 A JP 58017271A JP 1727183 A JP1727183 A JP 1727183A JP S6225038 B2 JPS6225038 B2 JP S6225038B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- molecular weight
- pcc1
- corynebacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Biophysics (AREA)
Description
この発明は、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌より分離されるプラスミドに関する。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌は大量のＬ
−グルタミン酸を生産することが知れている。ま
たその変異株はリジン等のアミノ酸、イノシン酸
等のプリンヌクレオチドを生産するものが知られ
ていて、工業的に有用な微生物である。一方、最
近DNA組換え技術による工業微生物の育種、改
良がエシエリヒア・コリ等により試みられている
が、コリネホルム・グルタミン酸生産菌について
は、これらの微生物を宿主とするに適したベクタ
ーが開発されておらず、DNA組換えによるコリ
ネホルム・グルタミン酸生産菌の育種、改良の妨
げとなつていた。 本発明者らはこのような背景において、コリネ
ホルム・バクテリアに適したベクターを開発すべ
く鋭意研究し、ついにコリネホルム・グルタミン
酸生産菌より、ベクターとして用いるのに適し
た、あるいはベクターとして加工するに適したプ
ラスミドである分子量4.2kbであつて、第１図に
示す制限酵素切断地図を有するプラスミドpCC1
を見い出した。 このプラスミドは、コリネホルム・グルタミン
酸生産菌であるコリネバクテリウム・カルナエ
（Ccrynebaeterium callunae）NRRLB−2244よ
り分離された。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、好気性
無胞子、非抗酸性、グラム陽性、不定性の桿菌で
ある、所謂コリネホルム・バクテリアの内のグル
タミン酸を多量に生産するものであり、以下にそ
の一部を具体的に例示する。 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC13745 ブレビバクテリウム・デイバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・イマリオフイラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ケトグルタミクム ATCC15887 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウス ATCC13825 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・アルカノリテカム ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032 コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス ATCC15592 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコラ ATCC17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム ATCC15354 これらのコリネホルム・グルタミン酸生産菌
は、本発明のプラスミドを安定して細胞内に法つ
ことができ、本発明のプラスミドの宿主となるこ
とができる。 本発明のプラスミドは上記のような宿主微生物
内にて、よく増殖することができるので、このプ
ラスミドのいずれかの位置に外来遺伝子が挿入さ
れれば、その外来遺伝子の遺伝情報を宿主である
コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で発現
せしめることができ、これら宿主微生物の遺伝形
質を変換せしめることができる。 本発明のプラスミドを宿主微生物細胞内に導入
するには、E.ccli Ｋ−12で報告されているよう
に低温のもとで菌を塩化カルシウムで処理して菌
膜の透過性を増大せしめ、プラスミドを移入する
方法（Mandel，Ｍ and、Higa，A.，J.Mol.
Biol.，53，159（1970））、枯草菌で報告されてい
るように増殖のある段階で自然にプラスミドを取
り込みやすくなること（いわゆるコンピーテント
な状態）を利用して、プラスミドを移入する方法
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and、Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））、更には枯草菌、放
線菌、酵母の報告にあるように細胞はプロトプラ
スト又はスフエプラストにしてプラスミドを移入
する方法（Chang，Ｓ and Cohen，S.N.，
Molec.Gen.Genet.，168，111（1979）；Bibb，
M.J.，Ward，J.M.and、Hopwood，D.A.，
Nature，274，398（1978）；Hinnen，A.，
Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.
Sci.，USA，75，1929（1978））等がある。 本発明のプラスミドに外来遺伝子を挿入するに
は、制限酵素により切断さる個所に挿入するのが
便利であるが、その内、特に同じ制限酵素による
被切断個所が１カ所であるような個所に挿入する
のが望ましい。外来遺伝子を挿入するには、プラ
スミド及び外来遺伝子源となるゲノムDNAをそ
れぞれ同じ制限酵素で、部分的又は完全に分解
し、これを適当な条件下に接続せしめればよい。 外来遺伝子としてコリネホルム・グルタミン酸
生産菌のゲノムDMAが最も効率よく、その遺伝
情報が発現される。 本発明のプラスミドは、細胞内でのコピー数が
多く、従つて外来遺伝子を組み換えた時に、多量
の遺伝子増巾が期待できる。 実施例 １ pCC1 DNAの単離 コリネバクテリウム・カルナエ
（（Corgnebacterium callunae）NRRL Ｂ−
2244株をトリプテイケース・ソイ・ブロス
（1.5％カゼインペプトン、0.5％大豆ペプト
ン、0.5％Nacl，PH7.0）にて、30℃で対数中期
まで培養し（OD＝0.6）、ペニシリンＧを最終
濃度0.3u／mlで添加したのちさらに18hr培養し
た。遠心分離により集菌し、リゾチーム（10
mg／ml）、SDS（10mg／ml）を加えて溶菌さ
せ、高速遠心して上漬を得た。ポリエチレン・
グリコールを添加してDNAを濃縮し、遠心し
て沈澱を集め、TENバツフアーにけんだくし
た。このDNA液をセシウムクロライド・エチ
ジウムブロマイドの密度勾配遠心にかけ、ccc
DNA部分を分取し、イソアシルアルコールで
エチジウムブロマイドを除き、透析によりセシ
ウムクロライイドを除いた。 ２ pCC1の分子量の決定 アガロースゲル電気泳動距離から分子量を計
算した。すなわち、シヤープからの方法
（Biochemistry 12，3055（1973））に従い、
E.wli Ｖ 517株のもつ種々のプラスミドDNA
を分子量測定用標準物質とし（Macrina F.L.
et，al，Plasurid １ 417（1978））、pCC1の
分子量を測定した。 その結果、分子量は4.21±0.23kbと算出され
た。 さらに、Hind ，Kpm ，Sma お
よびBal などの制限酵素で開裂させたDNA
についても、ラムダフアージDNAのHind分
解分子量標準品を対照として、アガロースゲル
電気泳動して分子量は4.27±0.05kbと算出され
た。 ３ pCC1 DNAの制限酵素による切断 pCC1の純化DNAを各種の制限酵素で切断
し、第１表に示す結果を得た。
菌より分離されるプラスミドに関する。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌は大量のＬ
−グルタミン酸を生産することが知れている。ま
たその変異株はリジン等のアミノ酸、イノシン酸
等のプリンヌクレオチドを生産するものが知られ
ていて、工業的に有用な微生物である。一方、最
近DNA組換え技術による工業微生物の育種、改
良がエシエリヒア・コリ等により試みられている
が、コリネホルム・グルタミン酸生産菌について
は、これらの微生物を宿主とするに適したベクタ
ーが開発されておらず、DNA組換えによるコリ
ネホルム・グルタミン酸生産菌の育種、改良の妨
げとなつていた。 本発明者らはこのような背景において、コリネ
ホルム・バクテリアに適したベクターを開発すべ
く鋭意研究し、ついにコリネホルム・グルタミン
酸生産菌より、ベクターとして用いるのに適し
た、あるいはベクターとして加工するに適したプ
ラスミドである分子量4.2kbであつて、第１図に
示す制限酵素切断地図を有するプラスミドpCC1
を見い出した。 このプラスミドは、コリネホルム・グルタミン
酸生産菌であるコリネバクテリウム・カルナエ
（Ccrynebaeterium callunae）NRRLB−2244よ
り分離された。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、好気性
無胞子、非抗酸性、グラム陽性、不定性の桿菌で
ある、所謂コリネホルム・バクテリアの内のグル
タミン酸を多量に生産するものであり、以下にそ
の一部を具体的に例示する。 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC13745 ブレビバクテリウム・デイバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・イマリオフイラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ケトグルタミクム ATCC15887 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウス ATCC13825 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・アルカノリテカム ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032 コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス ATCC15592 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコラ ATCC17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム ATCC15354 これらのコリネホルム・グルタミン酸生産菌
は、本発明のプラスミドを安定して細胞内に法つ
ことができ、本発明のプラスミドの宿主となるこ
とができる。 本発明のプラスミドは上記のような宿主微生物
内にて、よく増殖することができるので、このプ
ラスミドのいずれかの位置に外来遺伝子が挿入さ
れれば、その外来遺伝子の遺伝情報を宿主である
コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で発現
せしめることができ、これら宿主微生物の遺伝形
質を変換せしめることができる。 本発明のプラスミドを宿主微生物細胞内に導入
するには、E.ccli Ｋ−12で報告されているよう
に低温のもとで菌を塩化カルシウムで処理して菌
膜の透過性を増大せしめ、プラスミドを移入する
方法（Mandel，Ｍ and、Higa，A.，J.Mol.
Biol.，53，159（1970））、枯草菌で報告されてい
るように増殖のある段階で自然にプラスミドを取
り込みやすくなること（いわゆるコンピーテント
な状態）を利用して、プラスミドを移入する方法
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and、Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））、更には枯草菌、放
線菌、酵母の報告にあるように細胞はプロトプラ
スト又はスフエプラストにしてプラスミドを移入
する方法（Chang，Ｓ and Cohen，S.N.，
Molec.Gen.Genet.，168，111（1979）；Bibb，
M.J.，Ward，J.M.and、Hopwood，D.A.，
Nature，274，398（1978）；Hinnen，A.，
Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.
Sci.，USA，75，1929（1978））等がある。 本発明のプラスミドに外来遺伝子を挿入するに
は、制限酵素により切断さる個所に挿入するのが
便利であるが、その内、特に同じ制限酵素による
被切断個所が１カ所であるような個所に挿入する
のが望ましい。外来遺伝子を挿入するには、プラ
スミド及び外来遺伝子源となるゲノムDNAをそ
れぞれ同じ制限酵素で、部分的又は完全に分解
し、これを適当な条件下に接続せしめればよい。 外来遺伝子としてコリネホルム・グルタミン酸
生産菌のゲノムDMAが最も効率よく、その遺伝
情報が発現される。 本発明のプラスミドは、細胞内でのコピー数が
多く、従つて外来遺伝子を組み換えた時に、多量
の遺伝子増巾が期待できる。 実施例 １ pCC1 DNAの単離 コリネバクテリウム・カルナエ
（（Corgnebacterium callunae）NRRL Ｂ−
2244株をトリプテイケース・ソイ・ブロス
（1.5％カゼインペプトン、0.5％大豆ペプト
ン、0.5％Nacl，PH7.0）にて、30℃で対数中期
まで培養し（OD＝0.6）、ペニシリンＧを最終
濃度0.3u／mlで添加したのちさらに18hr培養し
た。遠心分離により集菌し、リゾチーム（10
mg／ml）、SDS（10mg／ml）を加えて溶菌さ
せ、高速遠心して上漬を得た。ポリエチレン・
グリコールを添加してDNAを濃縮し、遠心し
て沈澱を集め、TENバツフアーにけんだくし
た。このDNA液をセシウムクロライド・エチ
ジウムブロマイドの密度勾配遠心にかけ、ccc
DNA部分を分取し、イソアシルアルコールで
エチジウムブロマイドを除き、透析によりセシ
ウムクロライイドを除いた。 ２ pCC1の分子量の決定 アガロースゲル電気泳動距離から分子量を計
算した。すなわち、シヤープからの方法
（Biochemistry 12，3055（1973））に従い、
E.wli Ｖ 517株のもつ種々のプラスミドDNA
を分子量測定用標準物質とし（Macrina F.L.
et，al，Plasurid １ 417（1978））、pCC1の
分子量を測定した。 その結果、分子量は4.21±0.23kbと算出され
た。 さらに、Hind ，Kpm ，Sma お
よびBal などの制限酵素で開裂させたDNA
についても、ラムダフアージDNAのHind分
解分子量標準品を対照として、アガロースゲル
電気泳動して分子量は4.27±0.05kbと算出され
た。 ３ pCC1 DNAの制限酵素による切断 pCC1の純化DNAを各種の制限酵素で切断
し、第１表に示す結果を得た。
【表】
【表】
４ pCC1の制限酵素切断地図
３で述べた制限酵素感受性パターンから第１
図に示すような制限酵素切断地図を作成した。 ５ pCC1のコピー数の測定 コリネバクテリウム・・カルナエ NRRL
Ｂ−2244をトリチウム・チミジン 100μCiを
含む最少培地で培養し、DNAにラジオアイソ
ト−プラベルした、菌体をリゾチーム、SDS法
で溶解し、全DNAを含む画分をCscl−EtBr平
衡密度勾配遠心処理し、ccc DNA部分と染色
体DNA部分の放射能の比からpCC1プラスミド
のコピー数を算出した。すなわち、染色体
DNAの分子量を8000kbとし、pcc1、DNAの分
子量を4.2kbとして、コピー数が30と算出され
た。
図に示すような制限酵素切断地図を作成した。 ５ pCC1のコピー数の測定 コリネバクテリウム・・カルナエ NRRL
Ｂ−2244をトリチウム・チミジン 100μCiを
含む最少培地で培養し、DNAにラジオアイソ
ト−プラベルした、菌体をリゾチーム、SDS法
で溶解し、全DNAを含む画分をCscl−EtBr平
衡密度勾配遠心処理し、ccc DNA部分と染色
体DNA部分の放射能の比からpCC1プラスミド
のコピー数を算出した。すなわち、染色体
DNAの分子量を8000kbとし、pcc1、DNAの分
子量を4.2kbとして、コピー数が30と算出され
た。
第１図は、pCC1制限酵素切断地図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量4.2Kbであつて、下記式に示す制限酵
素切断地図を有し、かつBam HI，Bc1I，
EcoR1，HpaI，PstI，SacII，Sa1I及びXhoI制限
酵素によつて切断されないプラスミド。 式
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58017271A JPS59143591A (ja) | 1983-02-04 | 1983-02-04 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58017271A JPS59143591A (ja) | 1983-02-04 | 1983-02-04 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59143591A JPS59143591A (ja) | 1984-08-17 |
| JPS6225038B2 true JPS6225038B2 (ja) | 1987-06-01 |
Family
ID=11939302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58017271A Granted JPS59143591A (ja) | 1983-02-04 | 1983-02-04 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59143591A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2165546B (en) * | 1984-08-21 | 1989-05-17 | Asahi Chemical Ind | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| KR102269639B1 (ko) * | 2020-02-12 | 2021-06-25 | 대상 주식회사 | L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법 |
-
1983
- 1983-02-04 JP JP58017271A patent/JPS59143591A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59143591A (ja) | 1984-08-17 |
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