JPS6233875B2

JPS6233875B2 -

Info

Publication number: JPS6233875B2
Application number: JP59182840A
Authority: JP
Inventors: Yoshiki Minamoto; Koji Mitsuki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-09-03
Filing date: 1984-09-03
Publication date: 1987-07-23
Also published as: JPS6163279A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、リンパ芽球様細胞株を高密度培養方
法に関する。従来の技術リンパ芽球様細胞株を培養して、その培養上清
液から有用な生理活性物質を得ることが研究され
ている。しかしながら、細胞培養上清液から生理
活性物質を大量に得、それを精製して用いるため
には大きな技術上問題がある。その一つは、細胞
が産生する生理活性物質は、極めて微量であるこ
とである。これは、細胞が増殖し、生理活性物質
を産生し得るための細胞飽和密度が低いことが第
一の原因であると考えられる。例えばインターフ
エロン自発産生細胞株であるUMCL細胞は、細
胞増殖性が良好な株の一つではあるけれどもその
飽和密度は２×10⁶／ml程度にすぎない。そのた
め、従来は、培養液量を大量にする方法がとられ
てきたが、大量の培養液を取扱うためには培養工
学的な技術開発が必要である上、設備投資及び維
持管理費が大きくなるという問題がある。そこで培養液量を増大させるかわりに飽和細胞
密度を高めることによつて、細胞の生理活性物質
産生量を増大させる方法が考えられている。例え
ば、培養液をパツチ方式又は連続的に交換するこ
とによつて、５〜10×10⁶／mlまで高密度に細胞
を培養する方法（特開昭55−169261）、インター
フエロン自発産生細胞の培養途中で消費された栄
養成分を添加させることによつて、飽和細胞密度
を増大させ、インターフエロンの産生を増大させ
る方法が知られている。（特開昭58−162035）。二つめの大きな問題点は、細胞培養液に牛胎児
血清（FBS）などの血清を10％前後添加する必要
があることである。これらの血清は非常に高価で
あり、かつ原因不明のロツト差があるため、大量
に細胞を培養するには問題があつた。さらに、こ
れらの血清は多種類の異種蛋白を含むので、有用
活性物質を分離精製する際に不都合が生じる。これまでに、血清の代替として、各種の増殖因
子や性格が明らかな蛋白を含む培養液を金用いて
細胞を培養する方法が開発されてきた（D.
Barnes、G.H.Sato、Cell、122巻、649頁、1980
年）また、血清アルブミンの代替物としてサイク
ロデキストリンと不飽和脂肪酸を含有する無血清
培地（特開昭56−81600）などが知られている。一方、さらにこれまでに、20〜150mg／の濃
度でＬ−グルタミン酸を添加した無血清培地が知
られている（高岡聰子、組織培養９巻、196頁、
1983年、特開昭56−81600）。しかしながらこれまでに報告されている無血清
培地は、いずれも細胞を低密度（１〜５×10⁵／
mlから１〜２×10⁶／ml）でしか増殖させられな
く高密度細胞培養（１×10⁷／ml以上）に適した
培養方法ではない。問題点を解決するための手段我々は以上のような問題点を踏まえ、鋭意検討
した結果、(1)１〜４ｇ／のα−サイクロデキス
トリン（α−CD）及び(2)２〜４ｇ／のガラク
トース又は0.3〜１ｇ／のＬ−グルタミン酸を
含有し、実質的に血清を含まない培地を用いて、
Ｂリンパ芽球様細胞株を培養することにより、こ
れらの細胞を高密度で培養できることを見出し
た。本発明に使用する培地としては、従来知られて
いる血清を含まない培地のいずれも用ることがで
きる。例えばRITC57−１培地、RITC57−８培
地イスコフ培地、ハムＦ−12とダルベツコMEM
培地の混合培地に各種増殖因子を添加した無血清
培地などがあげられるが、一般的にアミノ酸、ビ
タミン等を含む豊富な無血清培地が好ましい。本発明の無血清培養液は１〜４ｇ／のα−
CDを含み、更に0.3〜１ｇ／のＬ−グルタミン
酸及び／又は２〜４ｇ／のガラクトースを含有
するこれらの成分はこれ以上では毒性が認められ
る。Ｌ−グルタミン酸は、遊離型でもよく、ナトリ
ウム塩などの金属塩および塩酸塩などの塩として
添加してもよい。本発明のα−CDは、６個のグルコース残基が
環状になつた化合物である。その濃度範囲は、１
〜４ｇ／である。この範囲以下では効果が認め
られず、これ以上では毒性がみられると同時に溶
解性が悪化する。本発明におけるＢリンパ芽球様細胞株は
Epstein−Barrウイルスで変異したヒトＢリンパ
芽球様細胞株、例えばUMCL細胞、C5細胞、
TAPC301細胞などやＢリンパ球由来白血病細胞
であるBALL−１細胞、Ｘ−5563細胞などがあ
る。本発明における培養方法は、公知の培養容器な
らびに装置を用いればよいが、酸素の供給を高
め、かつ、機械的な細胞障害を最小限にするよう
な装置が適している。例えば、フラスコ又はシヤ
ーレでは容器を10〜20回／分の速度でゆつくりと
揺動させる培養や、マイクロキヤリヤー用として
開発された培養槽に酸素ガスを通気させる方法、
又は、エアリフト培養方法などがあげられる。作用従来の培養方法では１×10⁷／mlで12時間まで
しかＢリンパ芽球様細胞株が維持し得えなかつた
のに対し、本発明の方法によれば、従来の方法に
比べ３割以上の高密度でＢリンパ芽球様細胞株を
培養できる。その結果、例えばUMCL細胞による自発的イ
ンターフエロン産生は、従来の方法に比べ著しく
高めることができた。かつ培地交換頻度を半分以
下に節減することができた。実施例１培養液は、表１に示したRITC57−１培地に0.5
％牛血清アルブミン（BSA）を添加した培地
（RITC57−13＋0.5％BSA）を基礎培地とし、さ
らに表２に示した成分を添加した後、0.22μｍの
ポアサイズをもつメンブレンフイルターで濾過滅
菌した。表１（mg／）塩化ナトリウム 6240.0 塩化カリウム 390.0 塩化カルシウム（無水） 200.0 硫酸マグネシウム（無水） 97.7 リン酸二水素ナトリウム（二水塩） 125.0 硝酸第二鉄（九水塩） 0.1 ブドウ糖 2000.0 ピルビン酸ナトリウム 110.0 Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0 Ｌ−シスチン二塩酸塩 62.6 グリシン 30.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（一水塩） 42.0 Ｌ−イソロイシン 104.8 Ｌ−ロイシン 104.8 Ｌ−リジン塩酸塩 146.2 Ｌ−メチオニン 30.0 Ｌ−フエニルアラニン 66.0 Ｌ−セリン 42.0 Ｌ−スレオニン 95.2 Ｌ−トリプトフアン 16.0 Ｌ−チロシン二ナトリウム（無水） 89.5 Ｌ−バリン 93.6 重酒石酸コリン 7.2 葉酸 4.0 ニコチン酸アミド 4.0 パントテン酸カルシウム 4.0 ピリドキサール塩酸塩 4.0 リボフラビン 0.4 チアミン塩酸塩 4.0 ｉ−イノシトール 7.2 フエノールレツド 5.0 Ｌ−アラニン−水塩 20.0 Ｌ−アスパラギン 56.0 Ｌ−アスパラギン酸 20.0 Ｌ−システイン塩酸−水塩 40.0 Ｌ−グルタミン酸 20.0 Ｌ−プロリン 20.0 ビチオン 0.2 ビタミンB₁₂ 0.1 マンノース 500.0 ガラクトース 500.0 レシチン 2.5 ヒポキサンチン 4.0 チミジン 0.7 デオキシシチジン 0.03 デオキシアデノシン 1.0 ６・８ジハイドロオキシプリン 0.3 硫酸亜鉛７水塩 0.02 亜セレン酸ナトリウム 0.004 Ｌ−グルタミン 584 プトレツシン２塩酸塩 0.1 フオルニツク酸 0.01 グルタチオン 10 硫酸第一鉄７水塩 0.8 β−グリセロリン酸２ナトリウム 1500 HEPES 1200 重炭酸ナトリウム 1300 硫酸カナマイシン 60 結晶インシユリン 10 ヒト・トランスフエリン５ RITC57−１＋0.5％BSA培地にUMCL細胞を培
養し、培地交換（全量）を４日毎に計２回行なつ
て、細胞密度４×10⁶／mlまで増殖させた後、細
胞を低速遠心（1000R.P.M.、５分）にて集め
た。直ちに細胞を表２に示した各培地中に５×
10⁷／mlになるように懸濁し、その５mlをフアル
コン社製3003シヤーレを用い、５％炭酸ガス濃度
のインキユベーター中に設置したベルコ社製ロツ
キングプレートにて15回／分の速度で30時間揺動
培養した。培養後、各々の細胞密度をエオシンＹ染色法と
血球計算盤にて、生細胞密度を計測した。また、
培養後の細胞懸濁液の一部を遠心分離により培養
上清液を採取しインターフエロン力価を測定し
た。インターフエロン測定は、WISH細胞とベズ
キユラーストマテイテイスウイルスを用い、マイ
クロ・タイタープレートにおける細胞変性阻止率
を標準ヒトインターフエロンを基準として測定し
た。それらの結果を表２に示す。

【表】

【表】実施例２培養液としては、表１に示したRITC57−１＋
0.5％BSA培地を基礎培地とし、さらに表３に示
した成分を添加した培養液を使用した。RITC57
−１＋0.5％BSA培地でBALL−１細胞を培養
し、６×10⁶まで増殖させた後、細胞を低速遠心
（1000R.P.M.、５分）にて集めた。直ちに細胞を
表３に示した各培地に５×10⁷／mlになるように
懸濁し、その10mlをフアルコン社製3024フラスコ
を用い実施例１出同様に48時間培養した。培養
後、実施例１と同様に、細胞密度と培養上清液中
のIgM産生量を測定した。結果を表３に示す。 BALL−１細胞が産生する免疫グロブリン−ク
ラスＭ（IgM）は、バイオラド社製イムノフロー
ビーズを用いる螢光免疫測定法によつて測定し
た。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ (1)１〜４ｇ／のα−サイクロデキストリン
及び、(2)２〜４ｇ／のガラクトース又は0.3〜
１ｇ／のＬ−グルタミン酸を含有し、血清を実
質的に含まない培地を用いて、Ｂリンパ芽球様細
胞株を培養することを特徴とする、Ｂリンパ芽球
様細胞株の高密度培養方法。