JPS6233876B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6233876B2 JPS6233876B2 JP59182841A JP18284184A JPS6233876B2 JP S6233876 B2 JPS6233876 B2 JP S6233876B2 JP 59182841 A JP59182841 A JP 59182841A JP 18284184 A JP18284184 A JP 18284184A JP S6233876 B2 JPS6233876 B2 JP S6233876B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture
- medium
- serum
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、動物細胞を高密度培養方法に関す
る。 従来の技術 ヒト細胞を培養して、その培養上清液から有用
な生理活性物質を得ることが研究されている。し
かしながら、細胞培養上清液から生理活性物質を
大量に得、それを精製して用いるためには大きな
技術上問題がある。その一つは、細胞が産生する
生理活性物質は、極めて微量であることである。
これは、細胞が増殖し、生理活性物質を産生し得
るための細胞飽和密度が低いことが第一の原因で
あると考えられる。例えばインターフエロン自発
産生細胞株であるUMCL細胞は、細胞増殖性が
良好な株の一つではあるけれども、その飽和密度
は２×106／ml程度にすぎない。そのため、従来
は、培養液量を大量にする方法がとられてきた
が、大量の培養液を取扱うためには培養工学的な
技術開発が必要である上、設備投資及び維持管理
費が大きくなるという問題がある。 そこで培養液量を増大させるかわりに飽和細胞
密度を高めることによつて、細胞の生理活性物質
産生量を増大させる方法が考えられている。例え
ば、培養液をバツチ方式又は連続的に交換するこ
とによつて、５〜10×106／mlまで高密度に細胞
を培養する方法（特開昭55−169261）、インター
フエロン自発産生細胞の培養途中で消費された栄
養成分を添加させることによつて、飽和細胞密度
を増大させ、インターフエロンの産生を増大させ
る方法が知られている（特開昭58−162035）。 二つめの大きな問題点は、細胞培養液に牛胎児
血清（FBS）などの血清を10％前後添加する必要
があることである。これらの血清は非常に高価で
あり、かつ原因不明のロツト差があるため大量に
細胞を培養するには問題があつた。さらに、これ
らの血清は多種類の異種蛋白を含むので、有用活
性物質を分離精製する際に不都合が生じる。 これまでに、血清の代替として、各種の増殖因
子や性格が明らかな蛋白を含む培養液を用いて細
胞を培養する方法が開発されてきた（D.
Barnes、G.H.Sato、Cell、22巻、649頁、1980
年）。また、血清アルブミンの代替物としてサイ
クロデキストリンと不飽和脂肪酸を含有する無血
清培地（特開昭56−81600）などが知られてい
る。 一方、さらにこれまでに20〜150mg／の濃度
でＬ−グルタミン酸を添加した無血清培地が知ら
れている（高岡聰子、組織培養９巻、196頁、
1983年、特開昭56−81600）。 しかしながら、これまでに報告されている無血
清培地は、いずれも細胞を低密度（１〜５×
105／mlから１〜２×106／ml）でしか増殖させら
れなく高密度細胞培養（１×107／ml以上）に適
した培養方法ではない。 問題点を解決するための手段 我々は以上のような問題点を踏まえ、鋭意検討
した結果、0.3〜１ｇ／のＬ−グルタミン酸を
含有し、実質的に血清を含まない培地を用いて、
Ｂリンパ芽球様細胞株を培養することにより、こ
れらの細胞を高密度で培養できることを見出し
た。 本発明に使用する培地としては、従来知られて
いる血清を含まない培地のいずれも用いることが
できる。例えばRITC57−１培地、RITC57−８
培地イスコフ培地、ハムＦ−12とダルベツコ
MEM培地の混合培地に各種増殖因子を添加した
無血清培地などがあけられるが、一般的にアミノ
酸、ビタミン等を含む豊富な無血清培地が好まし
い。 本発明の無血清培養液におけるＬ−グルタミン
酸の濃度範囲は、0.3〜１ｇ／である。この範
囲以下では効果が認められず、これ以上では毒性
が認められる。なお、Ｌ−グルタミン酸の代謝に
関係するＬ−グルタミン酸およびα−ケトグルタ
ル酸の添加は効果がない。Ｌ−グルタミン酸は、
遊離型でもよく、ナトリウム塩などの金属塩およ
び塩酸塩などの塩として添加してもよい。 本発明におけるＢリンパ芽球様細胞株は
Epstein−Barrウイルスで変異したヒトＢリンパ
芽球様細胞株、例えば、UMCL細胞、C5細胞、
TAPC301細胞などやＢリンパ球由来白血病細胞
であるBALL−１細胞、Ｘ−5563細胞などがあ
る。 本発明における培養方法は、公知の培養容器な
らびに装置を用いればよいが、酸素の供給を高
め、かつ、機械的な細胞障害を最小限にするよう
な装置が適している。例えば、フラスコ又はシヤ
ーレでは容器を10〜20回／分の速度でゆつくりと
揺動させる培養や、マイクロキヤリヤー用として
開発された培養槽に酸素ガスを通気させる方法、
又は、エアリフト培養方法などがあげられる。 作 用 従来の培養方法では１×107／mlで12時間まで
しかＢリンパ芽球様細胞株が維持し得えなかつた
のに対し、本発明の方法によれば従来の方法に比
べ３割以上の高密度でＢリンパ芽球様細胞株を培
養できる。 その結果、例えばUMCL細胞による自発的イ
ンターフエロン産生は、従来の方法に比べ著しく
高めることができた。かつ培地交換頻度を半分以
下に節減することができた。 実施例 １ 培養液は、表１に示したRITC57−１培地に0.5
％牛血清アルブミン（BSA）を添加した培地
（RITC57−１＋0.5％BSA）を基礎培地とし、さ
らに表２に示した成分を添加した後、0.22μｍの
ポアサイズをもつメンブレンフイルターで濾過滅
菌した。 表 １ （mg／） 塩化ナトリウム 6240.0 塩化カリウム 390.0 塩化カルシウム（無水） 200.0 硫酸マグネシウム（無水） 97.7 リン酸二水素ナトリウム（二水塩） 125.0 硝酸第二鉄（九水塩） 0.1 ブドウ糖 2000.0 ピルビン酸ナトリウム 110.0 Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0 Ｌ−シスチン二塩酸塩 62.6 グリシン 30.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（一水塩） 42.0 Ｌ−イソロイシン 104.8 Ｌ−ロイシン 104.8 Ｌ−リジン塩酸塩 146.2 Ｌ−メチオニン 30.0 Ｌ−フエニルアラニン 66.0 Ｌ−セリン 42.0 Ｌ−スレオニン 95.2 Ｌ−トリプトフアン 16.0 Ｌ−チロシン二ナトリウム（無水） 89.5 Ｌ−バリン 93.6 重酒石酸コリン 7.2 葉 酸 4.0 ニコチン酸アミド 4.0 パントテン酸カルシウム 4.0 ピリドキサール塩酸塩 4.0 リボフラビン 0.4 チアミン塩酸塩 4.0 ｉ−イノシトール 7.2 フエノールレツド 5.0 Ｌ−アラニン一水塩 20.0 Ｌ−アスパラギン 56.0 Ｌ−アスパラギン酸 20.0 Ｌ−システイン塩酸一水塩 40.0 Ｌ−グルタミン酸 20.0 Ｌ−プロリン 20.0 ビチオン 0.2 ビタミンB12 0.1 マンノース 500.0 ガラクトース 500.0 レシチン 2.5 ヒポキサンチン 4.0 チミジン 0.7 デオキシシチジン 0.03 デオキシアデノシン 1.0 6.8ジハイドロオキシプリン 0.3 硫酸亜鉛７水塩 0.02 亜セレン酸ナトリウム 0.004 Ｌ−グルタミン 584 プトレツシン２塩酸塩 0.1 フオルニツク酸 0.01 グルタチオン 1.0 硫酸第一鉄７水塩 0.8 β−グリセリン酸２ナトリウム 1500 HEPES 1200 重炭酸ナトリウム 1300 硫酸カナマイシン 60 結晶インシユリン 10 ヒト・トランスフエリン ５ RITC57−１＋0.5％BSA培地にUMCL細胞を培
養し、培地交換（全量）を４日毎に計２回行なつ
て、細胞密度４×106／mlまで増殖させた後、細
胞を低速遠心（1000R.P.M.、５分）にて集め
た。直ちに細胞を表２に示した各培地中に2.0×
107／mlになるように懸濁し、その５mlをフアル
コン社製3003シヤーレを用い、５％炭酸ガス濃度
のインキユベーター中に設置したベルコ社製ロツ
キングプレートにて15回／分の速度で40時間揺動
培養した。 培養後、各々の細胞密度をエオシンＹ染色法と
血球計算盤にて、生細胞密度を計測した。また、
培養後の細胞懸濁液の一部を遠心分離により培養
上清液を採取しインターフエロン力価を測定し
た。インターフエロン測定は、WISH細胞とベズ
キユラーストマテイテイスウイルスを用い、マイ
クロ・タイタープレートにおける細胞変性阻止率
を標準ヒトインターフエロンを基準として測定し
た。それらの結果を表２に示す。
る。 従来の技術 ヒト細胞を培養して、その培養上清液から有用
な生理活性物質を得ることが研究されている。し
かしながら、細胞培養上清液から生理活性物質を
大量に得、それを精製して用いるためには大きな
技術上問題がある。その一つは、細胞が産生する
生理活性物質は、極めて微量であることである。
これは、細胞が増殖し、生理活性物質を産生し得
るための細胞飽和密度が低いことが第一の原因で
あると考えられる。例えばインターフエロン自発
産生細胞株であるUMCL細胞は、細胞増殖性が
良好な株の一つではあるけれども、その飽和密度
は２×106／ml程度にすぎない。そのため、従来
は、培養液量を大量にする方法がとられてきた
が、大量の培養液を取扱うためには培養工学的な
技術開発が必要である上、設備投資及び維持管理
費が大きくなるという問題がある。 そこで培養液量を増大させるかわりに飽和細胞
密度を高めることによつて、細胞の生理活性物質
産生量を増大させる方法が考えられている。例え
ば、培養液をバツチ方式又は連続的に交換するこ
とによつて、５〜10×106／mlまで高密度に細胞
を培養する方法（特開昭55−169261）、インター
フエロン自発産生細胞の培養途中で消費された栄
養成分を添加させることによつて、飽和細胞密度
を増大させ、インターフエロンの産生を増大させ
る方法が知られている（特開昭58−162035）。 二つめの大きな問題点は、細胞培養液に牛胎児
血清（FBS）などの血清を10％前後添加する必要
があることである。これらの血清は非常に高価で
あり、かつ原因不明のロツト差があるため大量に
細胞を培養するには問題があつた。さらに、これ
らの血清は多種類の異種蛋白を含むので、有用活
性物質を分離精製する際に不都合が生じる。 これまでに、血清の代替として、各種の増殖因
子や性格が明らかな蛋白を含む培養液を用いて細
胞を培養する方法が開発されてきた（D.
Barnes、G.H.Sato、Cell、22巻、649頁、1980
年）。また、血清アルブミンの代替物としてサイ
クロデキストリンと不飽和脂肪酸を含有する無血
清培地（特開昭56−81600）などが知られてい
る。 一方、さらにこれまでに20〜150mg／の濃度
でＬ−グルタミン酸を添加した無血清培地が知ら
れている（高岡聰子、組織培養９巻、196頁、
1983年、特開昭56−81600）。 しかしながら、これまでに報告されている無血
清培地は、いずれも細胞を低密度（１〜５×
105／mlから１〜２×106／ml）でしか増殖させら
れなく高密度細胞培養（１×107／ml以上）に適
した培養方法ではない。 問題点を解決するための手段 我々は以上のような問題点を踏まえ、鋭意検討
した結果、0.3〜１ｇ／のＬ−グルタミン酸を
含有し、実質的に血清を含まない培地を用いて、
Ｂリンパ芽球様細胞株を培養することにより、こ
れらの細胞を高密度で培養できることを見出し
た。 本発明に使用する培地としては、従来知られて
いる血清を含まない培地のいずれも用いることが
できる。例えばRITC57−１培地、RITC57−８
培地イスコフ培地、ハムＦ−12とダルベツコ
MEM培地の混合培地に各種増殖因子を添加した
無血清培地などがあけられるが、一般的にアミノ
酸、ビタミン等を含む豊富な無血清培地が好まし
い。 本発明の無血清培養液におけるＬ−グルタミン
酸の濃度範囲は、0.3〜１ｇ／である。この範
囲以下では効果が認められず、これ以上では毒性
が認められる。なお、Ｌ−グルタミン酸の代謝に
関係するＬ−グルタミン酸およびα−ケトグルタ
ル酸の添加は効果がない。Ｌ−グルタミン酸は、
遊離型でもよく、ナトリウム塩などの金属塩およ
び塩酸塩などの塩として添加してもよい。 本発明におけるＢリンパ芽球様細胞株は
Epstein−Barrウイルスで変異したヒトＢリンパ
芽球様細胞株、例えば、UMCL細胞、C5細胞、
TAPC301細胞などやＢリンパ球由来白血病細胞
であるBALL−１細胞、Ｘ−5563細胞などがあ
る。 本発明における培養方法は、公知の培養容器な
らびに装置を用いればよいが、酸素の供給を高
め、かつ、機械的な細胞障害を最小限にするよう
な装置が適している。例えば、フラスコ又はシヤ
ーレでは容器を10〜20回／分の速度でゆつくりと
揺動させる培養や、マイクロキヤリヤー用として
開発された培養槽に酸素ガスを通気させる方法、
又は、エアリフト培養方法などがあげられる。 作 用 従来の培養方法では１×107／mlで12時間まで
しかＢリンパ芽球様細胞株が維持し得えなかつた
のに対し、本発明の方法によれば従来の方法に比
べ３割以上の高密度でＢリンパ芽球様細胞株を培
養できる。 その結果、例えばUMCL細胞による自発的イ
ンターフエロン産生は、従来の方法に比べ著しく
高めることができた。かつ培地交換頻度を半分以
下に節減することができた。 実施例 １ 培養液は、表１に示したRITC57−１培地に0.5
％牛血清アルブミン（BSA）を添加した培地
（RITC57−１＋0.5％BSA）を基礎培地とし、さ
らに表２に示した成分を添加した後、0.22μｍの
ポアサイズをもつメンブレンフイルターで濾過滅
菌した。 表 １ （mg／） 塩化ナトリウム 6240.0 塩化カリウム 390.0 塩化カルシウム（無水） 200.0 硫酸マグネシウム（無水） 97.7 リン酸二水素ナトリウム（二水塩） 125.0 硝酸第二鉄（九水塩） 0.1 ブドウ糖 2000.0 ピルビン酸ナトリウム 110.0 Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0 Ｌ−シスチン二塩酸塩 62.6 グリシン 30.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（一水塩） 42.0 Ｌ−イソロイシン 104.8 Ｌ−ロイシン 104.8 Ｌ−リジン塩酸塩 146.2 Ｌ−メチオニン 30.0 Ｌ−フエニルアラニン 66.0 Ｌ−セリン 42.0 Ｌ−スレオニン 95.2 Ｌ−トリプトフアン 16.0 Ｌ−チロシン二ナトリウム（無水） 89.5 Ｌ−バリン 93.6 重酒石酸コリン 7.2 葉 酸 4.0 ニコチン酸アミド 4.0 パントテン酸カルシウム 4.0 ピリドキサール塩酸塩 4.0 リボフラビン 0.4 チアミン塩酸塩 4.0 ｉ−イノシトール 7.2 フエノールレツド 5.0 Ｌ−アラニン一水塩 20.0 Ｌ−アスパラギン 56.0 Ｌ−アスパラギン酸 20.0 Ｌ−システイン塩酸一水塩 40.0 Ｌ−グルタミン酸 20.0 Ｌ−プロリン 20.0 ビチオン 0.2 ビタミンB12 0.1 マンノース 500.0 ガラクトース 500.0 レシチン 2.5 ヒポキサンチン 4.0 チミジン 0.7 デオキシシチジン 0.03 デオキシアデノシン 1.0 6.8ジハイドロオキシプリン 0.3 硫酸亜鉛７水塩 0.02 亜セレン酸ナトリウム 0.004 Ｌ−グルタミン 584 プトレツシン２塩酸塩 0.1 フオルニツク酸 0.01 グルタチオン 1.0 硫酸第一鉄７水塩 0.8 β−グリセリン酸２ナトリウム 1500 HEPES 1200 重炭酸ナトリウム 1300 硫酸カナマイシン 60 結晶インシユリン 10 ヒト・トランスフエリン ５ RITC57−１＋0.5％BSA培地にUMCL細胞を培
養し、培地交換（全量）を４日毎に計２回行なつ
て、細胞密度４×106／mlまで増殖させた後、細
胞を低速遠心（1000R.P.M.、５分）にて集め
た。直ちに細胞を表２に示した各培地中に2.0×
107／mlになるように懸濁し、その５mlをフアル
コン社製3003シヤーレを用い、５％炭酸ガス濃度
のインキユベーター中に設置したベルコ社製ロツ
キングプレートにて15回／分の速度で40時間揺動
培養した。 培養後、各々の細胞密度をエオシンＹ染色法と
血球計算盤にて、生細胞密度を計測した。また、
培養後の細胞懸濁液の一部を遠心分離により培養
上清液を採取しインターフエロン力価を測定し
た。インターフエロン測定は、WISH細胞とベズ
キユラーストマテイテイスウイルスを用い、マイ
クロ・タイタープレートにおける細胞変性阻止率
を標準ヒトインターフエロンを基準として測定し
た。それらの結果を表２に示す。
【表】
実施例 ２
培養液として、表１に示したRITC57−１＋0.5
％BSA培地を基礎培地とし、さらに表３に示し
た成分を添加した培養液を使用した。RITC57−
１＋0.5％BSA培地でBALL−１細胞を培養し、
６×106まで増殖させた後、細胞を低速遠心
（1000R.P.M.、５分）にて集めた。直ちに細胞を
表３に示した各培地に５×107／mlになるよう懸
濁し、その10mlをフアルコン社製3024フラスコを
用い実施例１と同様に48時間培養した。培養後、
実施例１と同様に、細胞密度と培養上清液中の
IgM産生量を測定した。結果を表３に示す。 BALL−１細胞が産生する免疫グロブリン−ク
ラスＭ（IgM）は、バイオラド社製イムノフロー
ビーズを用い螢光測定法によつて測定した。
％BSA培地を基礎培地とし、さらに表３に示し
た成分を添加した培養液を使用した。RITC57−
１＋0.5％BSA培地でBALL−１細胞を培養し、
６×106まで増殖させた後、細胞を低速遠心
（1000R.P.M.、５分）にて集めた。直ちに細胞を
表３に示した各培地に５×107／mlになるよう懸
濁し、その10mlをフアルコン社製3024フラスコを
用い実施例１と同様に48時間培養した。培養後、
実施例１と同様に、細胞密度と培養上清液中の
IgM産生量を測定した。結果を表３に示す。 BALL−１細胞が産生する免疫グロブリン−ク
ラスＭ（IgM）は、バイオラド社製イムノフロー
ビーズを用い螢光測定法によつて測定した。
【表】
Claims (1)
- １ 0.3〜１ｇ／のＬ−グルタミン酸を含有
し、血清を実質的に含まない培地を用いて、Ｂリ
ンパ芽球様細胞株を培養することを特徴とする動
物細胞の高密度培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59182841A JPS6163280A (ja) | 1984-09-03 | 1984-09-03 | 動物細胞の高密度培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59182841A JPS6163280A (ja) | 1984-09-03 | 1984-09-03 | 動物細胞の高密度培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6163280A JPS6163280A (ja) | 1986-04-01 |
| JPS6233876B2 true JPS6233876B2 (ja) | 1987-07-23 |
Family
ID=16125392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59182841A Granted JPS6163280A (ja) | 1984-09-03 | 1984-09-03 | 動物細胞の高密度培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6163280A (ja) |
-
1984
- 1984-09-03 JP JP59182841A patent/JPS6163280A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6163280A (ja) | 1986-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109337861B (zh) | 一种支持产物高表达的cho细胞无血清培养基 | |
| KR101264940B1 (ko) | 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물 | |
| US5405772A (en) | Medium for long-term proliferation and development of cells | |
| KR20070058584A (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 배양 | |
| US6048728A (en) | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression | |
| US5143842A (en) | Media for normal human muscle satellite cells | |
| US5766951A (en) | Serum-free medium supporting growth and proliferation of normal bone marrow cells | |
| CN110934132A (zh) | 一种无血清无dmso细胞冻存液及其制备方法 | |
| JPS63267269A (ja) | 細胞培養のための基礎栄養培地 | |
| CN106834229B (zh) | 用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基 | |
| TR201802355T4 (tr) | Mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortamının hazırlanmasına yönelik yöntem, menzenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamı ve benzerini kullanarak kültürlenmiş ve farklılaştırılmış hücre terapötik ajanı. | |
| CN109294976A (zh) | 一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清培养基 | |
| JP7173007B2 (ja) | リボフラビン誘導体含有培地 | |
| CA2091443A1 (en) | Medium for culture of mammalian cells | |
| JPH0120867B2 (ja) | ||
| JP7644527B2 (ja) | ペプチド、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法 | |
| IL292933A (en) | Serum-free human pluripotent stem cell culture medium | |
| JPS6233876B2 (ja) | ||
| CN118086199A (zh) | 一种无血清培养基及其应用 | |
| JPS6233875B2 (ja) | ||
| JPWO2020067502A1 (ja) | 動物細胞の培養用添加物、培養用培地および培養方法 | |
| Agy et al. | Protein-free medium for C-1300 mouse neuroblastoma cells | |
| US5916809A (en) | Medium for culturing normal human epidermal melanocytes | |
| US20240150715A1 (en) | Optimized cell culture medium utilizing iron (III) citrate as an iron delivery method for the in vitro, bioreactor-centric production of manufactured blood | |
| JP2850430B2 (ja) | 細胞培養用無血清培地 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |