【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
産業上の利用分野
本発明は、動物細胞を高密度培養方法に関す
る。
従来の技術
ヒト細胞を培養して、その培養上清液から有用
な生理活性物質を得ることが研究されている。し
かしながら、細胞培養上清液から生理活性物質を
大量に得、それを精製して用いるためには大きな
技術上問題がある。その一つは、細胞が産生する
生理活性物質は、極めて微量であることである。
これは、細胞が増殖し、生理活性物質を産生し得
るための細胞飽和密度が低いことが第一の原因で
あると考えられる。例えばインターフエロン自発
産生細胞株であるUMCL細胞は、細胞増殖性が
良好な株の一つではあるけれども、その飽和密度
は２×106／ml程度にすぎない。そのため、従来
は、培養液量を大量にする方法がとられてきた
が、大量の培養液を取扱うためには培養工学的な
技術開発が必要である上、設備投資及び維持管理
費が大きくなるという問題がある。
そこで培養液量を増大させるかわりに飽和細胞
密度を高めることによつて、細胞の生理活性物質
産生量を増大させる方法が考えられている。例え
ば、培養液をバツチ方式又は連続的に交換するこ
とによつて、５〜10×106／mlまで高密度に細胞
を培養する方法（特開昭55−169261）、インター
フエロン自発産生細胞の培養途中で消費された栄
養成分を添加させることによつて、飽和細胞密度
を増大させ、インターフエロンの産生を増大させ
る方法が知られている（特開昭58−162035）。
二つめの大きな問題点は、細胞培養液に牛胎児
血清（FBS）などの血清を10％前後添加する必要
があることである。これらの血清は非常に高価で
あり、かつ原因不明のロツト差があるため大量に
細胞を培養するには問題があつた。さらに、これ
らの血清は多種類の異種蛋白を含むので、有用活
性物質を分離精製する際に不都合が生じる。
これまでに、血清の代替として、各種の増殖因
子や性格が明らかな蛋白を含む培養液を用いて細
胞を培養する方法が開発されてきた（D.
Barnes、G.H.Sato、Cell、22巻、649頁、1980
年）。また、血清アルブミンの代替物としてサイ
クロデキストリンと不飽和脂肪酸を含有する無血
清培地（特開昭56−81600）などが知られてい
る。
一方、さらにこれまでに20〜150mg／の濃度
でＬ−グルタミン酸を添加した無血清培地が知ら
れている（高岡聰子、組織培養９巻、196頁、
1983年、特開昭56−81600）。
しかしながら、これまでに報告されている無血
清培地は、いずれも細胞を低密度（１〜５×
105／mlから１〜２×106／ml）でしか増殖させら
れなく高密度細胞培養（１×107／ml以上）に適
した培養方法ではない。
問題点を解決するための手段
我々は以上のような問題点を踏まえ、鋭意検討
した結果、0.3〜１ｇ／のＬ−グルタミン酸を
含有し、実質的に血清を含まない培地を用いて、
Ｂリンパ芽球様細胞株を培養することにより、こ
れらの細胞を高密度で培養できることを見出し
た。
本発明に使用する培地としては、従来知られて
いる血清を含まない培地のいずれも用いることが
できる。例えばRITC57−１培地、RITC57−８
培地イスコフ培地、ハムＦ−12とダルベツコ
MEM培地の混合培地に各種増殖因子を添加した
無血清培地などがあけられるが、一般的にアミノ
酸、ビタミン等を含む豊富な無血清培地が好まし
い。
本発明の無血清培養液におけるＬ−グルタミン
酸の濃度範囲は、0.3〜１ｇ／である。この範
囲以下では効果が認められず、これ以上では毒性
が認められる。なお、Ｌ−グルタミン酸の代謝に
関係するＬ−グルタミン酸およびα−ケトグルタ
ル酸の添加は効果がない。Ｌ−グルタミン酸は、
遊離型でもよく、ナトリウム塩などの金属塩およ
び塩酸塩などの塩として添加してもよい。
本発明におけるＢリンパ芽球様細胞株は
Epstein−Barrウイルスで変異したヒトＢリンパ
芽球様細胞株、例えば、UMCL細胞、C5細胞、
TAPC301細胞などやＢリンパ球由来白血病細胞
であるBALL−１細胞、Ｘ−5563細胞などがあ
る。
本発明における培養方法は、公知の培養容器な
らびに装置を用いればよいが、酸素の供給を高
め、かつ、機械的な細胞障害を最小限にするよう
な装置が適している。例えば、フラスコ又はシヤ
ーレでは容器を10〜20回／分の速度でゆつくりと
揺動させる培養や、マイクロキヤリヤー用として
開発された培養槽に酸素ガスを通気させる方法、
又は、エアリフト培養方法などがあげられる。
作 用
従来の培養方法では１×107／mlで12時間まで
しかＢリンパ芽球様細胞株が維持し得えなかつた
のに対し、本発明の方法によれば従来の方法に比
べ３割以上の高密度でＢリンパ芽球様細胞株を培
養できる。
その結果、例えばUMCL細胞による自発的イ
ンターフエロン産生は、従来の方法に比べ著しく
高めることができた。かつ培地交換頻度を半分以
下に節減することができた。
実施例 １
培養液は、表１に示したRITC57−１培地に0.5
％牛血清アルブミン（BSA）を添加した培地
（RITC57−１＋0.5％BSA）を基礎培地とし、さ
らに表２に示した成分を添加した後、0.22μｍの
ポアサイズをもつメンブレンフイルターで濾過滅
菌した。
表 １
（mg／）
塩化ナトリウム 6240.0
塩化カリウム 390.0
塩化カルシウム（無水） 200.0
硫酸マグネシウム（無水） 97.7
リン酸二水素ナトリウム（二水塩） 125.0
硝酸第二鉄（九水塩） 0.1
ブドウ糖 2000.0
ピルビン酸ナトリウム 110.0
Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0
Ｌ−シスチン二塩酸塩 62.6
グリシン 30.0
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（一水塩） 42.0
Ｌ−イソロイシン 104.8
Ｌ−ロイシン 104.8
Ｌ−リジン塩酸塩 146.2
Ｌ−メチオニン 30.0
Ｌ−フエニルアラニン 66.0
Ｌ−セリン 42.0
Ｌ−スレオニン 95.2
Ｌ−トリプトフアン 16.0
Ｌ−チロシン二ナトリウム（無水） 89.5
Ｌ−バリン 93.6
重酒石酸コリン 7.2
葉 酸 4.0
ニコチン酸アミド 4.0
パントテン酸カルシウム 4.0
ピリドキサール塩酸塩 4.0
リボフラビン 0.4
チアミン塩酸塩 4.0
ｉ−イノシトール 7.2
フエノールレツド 5.0
Ｌ−アラニン一水塩 20.0
Ｌ−アスパラギン 56.0
Ｌ−アスパラギン酸 20.0
Ｌ−システイン塩酸一水塩 40.0
Ｌ−グルタミン酸 20.0
Ｌ−プロリン 20.0
ビチオン 0.2
ビタミンB12 0.1
マンノース 500.0
ガラクトース 500.0
レシチン 2.5
ヒポキサンチン 4.0
チミジン 0.7
デオキシシチジン 0.03
デオキシアデノシン 1.0
6.8ジハイドロオキシプリン 0.3
硫酸亜鉛７水塩 0.02
亜セレン酸ナトリウム 0.004
Ｌ−グルタミン 584
プトレツシン２塩酸塩 0.1
フオルニツク酸 0.01
グルタチオン 1.0
硫酸第一鉄７水塩 0.8
β−グリセリン酸２ナトリウム 1500
HEPES 1200
重炭酸ナトリウム 1300
硫酸カナマイシン 60
結晶インシユリン 10
ヒト・トランスフエリン ５
RITC57−１＋0.5％BSA培地にUMCL細胞を培
養し、培地交換（全量）を４日毎に計２回行なつ
て、細胞密度４×106／mlまで増殖させた後、細
胞を低速遠心（1000R.P.M.、５分）にて集め
た。直ちに細胞を表２に示した各培地中に2.0×
107／mlになるように懸濁し、その５mlをフアル
コン社製3003シヤーレを用い、５％炭酸ガス濃度
のインキユベーター中に設置したベルコ社製ロツ
キングプレートにて15回／分の速度で40時間揺動
培養した。
培養後、各々の細胞密度をエオシンＹ染色法と
血球計算盤にて、生細胞密度を計測した。また、
培養後の細胞懸濁液の一部を遠心分離により培養
上清液を採取しインターフエロン力価を測定し
た。インターフエロン測定は、WISH細胞とベズ
キユラーストマテイテイスウイルスを用い、マイ
クロ・タイタープレートにおける細胞変性阻止率
を標準ヒトインターフエロンを基準として測定し
た。それらの結果を表２に示す。
INDUSTRIAL APPLICATION FIELD The present invention relates to a method for culturing animal cells at high density. BACKGROUND OF THE INVENTION Research has been conducted on culturing human cells and obtaining useful physiologically active substances from the culture supernatant. However, there are major technical problems in obtaining a large amount of physiologically active substances from cell culture supernatants, purifying them, and using them. One of these is that cells produce extremely small amounts of physiologically active substances.
The primary reason for this is thought to be that the saturation density of cells, which allows cells to proliferate and produce physiologically active substances, is low. For example, UMCL cells, which are a cell line that spontaneously produces interferon, are one of the cell lines with good cell proliferation, but their saturation density is only about 2×10 6 /ml. For this reason, the conventional method has been to increase the amount of culture solution, but handling a large amount of culture solution requires the development of culture engineering technology, and requires large capital investment and maintenance costs. There is a problem. Therefore, methods have been considered to increase the amount of physiologically active substances produced by cells by increasing the saturated cell density instead of increasing the amount of culture solution. For example, a method of culturing cells at a high density of 5 to 10 x 10 6 /ml by batchwise or continuous exchange of the culture medium (Japanese Patent Application Laid-Open No. 169261/1983), A method is known in which the saturated cell density is increased and interferon production is increased by adding nutritional components consumed during the culture (Japanese Patent Laid-Open No. 162035/1983). The second major problem is that it is necessary to add approximately 10% serum such as fetal bovine serum (FBS) to the cell culture medium. These serums are very expensive, and there are unexplained differences between lots, making it difficult to culture cells in large quantities. Furthermore, since these serums contain many types of foreign proteins, it is difficult to separate and purify useful active substances. To date, methods have been developed to culture cells using culture media containing various growth factors and proteins with clear characteristics as an alternative to serum (D.
Barnes, GHSato, Cell, vol. 22, p. 649, 1980
Year). Furthermore, as a substitute for serum albumin, a serum-free medium containing cyclodextrin and unsaturated fatty acids (Japanese Unexamined Patent Publication No. 56-81600) is known. On the other hand, a serum-free medium to which L-glutamic acid is added at a concentration of 20 to 150 mg has been known (Satoko Takaoka, Tissue Culture Vol. 9, p. 196,
1983, Japanese Patent Publication No. 56-81600). However, all serum-free media reported so far support cells at low densities (1 to 5×
10 5 /ml to 1 to 2×10 6 /ml), and is not a culture method suitable for high-density cell culture (1×10 7 /ml or more). Measures to Solve the Problems Based on the above problems, we have conducted extensive studies and found that using a medium containing 0.3 to 1 g/L-glutamic acid and substantially free of serum,
We have discovered that by culturing a B lymphoblastoid cell line, these cells can be cultured at high density. As the medium used in the present invention, any conventionally known serum-free medium can be used. For example, RITC57-1 medium, RITC57-8
Medium Iscove's medium, Ham's F-12 and Dulbecco's
A serum-free medium prepared by adding various growth factors to a mixed medium of MEM medium can be used, but a serum-free medium rich in amino acids, vitamins, etc. is generally preferred. The concentration range of L-glutamic acid in the serum-free culture solution of the present invention is 0.3 to 1 g/. Below this range, no effect is observed, and above this range, toxicity is observed. Note that the addition of L-glutamic acid and α-ketoglutaric acid, which are involved in the metabolism of L-glutamic acid, has no effect. L-glutamic acid is
It may be added in a free form or as a metal salt such as a sodium salt or a salt such as a hydrochloride. The B lymphoblastoid cell line in the present invention is
Human B lymphoblastoid cell lines mutated by Epstein-Barr virus, such as UMCL cells, C5 cells,
Examples include TAPC301 cells, B-lymphocyte-derived leukemia cells such as BALL-1 cells, and X-5563 cells. The culture method of the present invention may use known culture vessels and devices, but devices that can increase oxygen supply and minimize mechanical cell damage are suitable. For example, a method of culturing in a flask or a sialet by gently shaking the container at a rate of 10 to 20 times per minute, a method of aerating oxygen gas into a culture tank developed for microcarriers,
Alternatively, an airlift culture method may be used. Effects While conventional culture methods could only maintain B lymphoblastoid cell lines at 1 x 10 7 /ml for up to 12 hours, the method of the present invention maintains 30% more B lymphoblastoid cell lines than conventional methods. B lymphoblastoid cell lines can be cultured at higher densities. As a result, for example, spontaneous interferon production by UMCL cells could be significantly increased compared to conventional methods. Moreover, the frequency of medium replacement could be reduced to less than half. Example 1 The culture solution was 0.5% of the RITC57-1 medium shown in Table 1.
A medium supplemented with % bovine serum albumin (BSA) (RITC57-1 + 0.5% BSA) was used as a basal medium, and the components shown in Table 2 were further added, followed by filtration sterilization using a membrane filter with a pore size of 0.22 μm. Table 1 (mg/) Sodium chloride 6240.0 Potassium chloride 390.0 Calcium chloride (anhydrous) 200.0 Magnesium sulfate (anhydrous) 97.7 Sodium dihydrogen phosphate (dihydrate) 125.0 Ferric nitrate (nanahydrate) 0.1 Glucose 2000.0 Sodium pyruvate 110.0 L-arginine hydrochloride 84.0 L-cystine dihydrochloride 62.6 Glycine 30.0 L-histidine hydrochloride (monohydrate) 42.0 L-isoleucine 104.8 L-leucine 104.8 L-lysine hydrochloride 146.2 L-methionine 30.0 L-phenylalanine 66.0 L-serine 42.0 L-threonine 95.2 L-tryptophan 16.0 L-tyrosine disodium (anhydrous) 89.5 L-valine 93.6 Choline bitartrate 7.2 Folic acid 4.0 Nicotinamide 4.0 Calcium pantothenate 4.0 Pyridoxal hydrochloride 4.0 Riboflavin 0.4 Thiamine hydrochloride 4.0 i-Inositol 7.2 Phenol Red 5.0 L-Alanine Monohydrate 20.0 L-Asparagine 56.0 L-Aspartic Acid 20.0 L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate 40.0 L-Glutamic Acid 20.0 L-Proline 20.0 Bithion 0.2 Vitamin B 12 0.1 Mannose 500 .0 galactose 500.0 Lecithin 2.5 Hypoxanthine 4.0 Thymidine 0.7 Deoxycytidine 0.03 Deoxyadenosine 1.0 6.8 Dihydroxypurine 0.3 Zinc sulfate heptahydrate 0.02 Sodium selenite 0.004 L-Glutamine 584 Putrescine dihydrochloride 0.1 Fornicic acid 0.01 Glutathione 1.0 Ferrous sulfate 7 Water salt 0.8 Disodium β-glycerate 1500 HEPES 1200 Sodium bicarbonate 1300 Kanamycin sulfate 60 Crystalline insulin 10 Human transferrin 5 UMCL cells were cultured in RITC57-1 + 0.5% BSA medium, and the medium was replaced (total amount) every 4 days. After the cells were grown to a cell density of 4×10 6 /ml twice in total, the cells were collected by low-speed centrifugation (1000 R.PM, 5 minutes). Immediately place cells 2.0x in each medium listed in Table 2.
10 7 /ml, and 5 ml of the suspension was suspended at a speed of 15 times/min using a Falcon 3003 Schare with a Belco locking plate installed in an incubator with a 5% carbon dioxide concentration. Culture was performed with rocking for 40 hours. After culturing, the viable cell density of each cell was measured using an eosin Y staining method and a hemocytometer. Also,
After culturing, a portion of the cell suspension was centrifuged to collect the culture supernatant, and the interferon titer was measured. Interferon was measured using WISH cells and Bezukyulastomateisis virus, and the cytopathic inhibition rate in a microtiter plate was measured using standard human interferon as a standard. The results are shown in Table 2.
【表】
実施例 ２
培養液として、表１に示したRITC57−１＋0.5
％BSA培地を基礎培地とし、さらに表３に示し
た成分を添加した培養液を使用した。RITC57−
１＋0.5％BSA培地でBALL−１細胞を培養し、
６×106まで増殖させた後、細胞を低速遠心
（1000R.P.M.、５分）にて集めた。直ちに細胞を
表３に示した各培地に５×107／mlになるよう懸
濁し、その10mlをフアルコン社製3024フラスコを
用い実施例１と同様に48時間培養した。培養後、
実施例１と同様に、細胞密度と培養上清液中の
IgM産生量を測定した。結果を表３に示す。
BALL−１細胞が産生する免疫グロブリン−ク
ラスＭ（IgM）は、バイオラド社製イムノフロー
ビーズを用い螢光測定法によつて測定した。[Table] Example 2 As a culture solution, RITC57-1+0.5 shown in Table 1
%BSA medium was used as the basal medium, and a culture solution to which the components shown in Table 3 were added was used. RITC57−
BALL-1 cells were cultured in 1+0.5% BSA medium,
After growing to 6×10 6 cells , the cells were collected by low speed centrifugation (1000 R.PM, 5 minutes). Immediately, the cells were suspended in each medium shown in Table 3 to a concentration of 5×10 7 /ml, and 10 ml of the suspension was cultured in a Falcon 3024 flask for 48 hours in the same manner as in Example 1. After culturing,
As in Example 1, cell density and culture supernatant
The amount of IgM produced was measured. The results are shown in Table 3. Immunoglobulin class M (IgM) produced by BALL-1 cells was measured by a fluorescence measurement method using ImmunoFlow beads manufactured by Bio-Rad.
【表】【table】
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