JPS6237958B2 - - Google Patents
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- JPS6237958B2 JPS6237958B2 JP57110999A JP11099982A JPS6237958B2 JP S6237958 B2 JPS6237958 B2 JP S6237958B2 JP 57110999 A JP57110999 A JP 57110999A JP 11099982 A JP11099982 A JP 11099982A JP S6237958 B2 JPS6237958 B2 JP S6237958B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、トリメトプリム耐性の発現を目安と
してプロモータ活性を有するDNA断片を検出す
るためのプラスミドであり、アンピシリン耐性遺
伝子を遺伝標識として有するプラスミドベクター
及びその製造方法に関するものである。
してプロモータ活性を有するDNA断片を検出す
るためのプラスミドであり、アンピシリン耐性遺
伝子を遺伝標識として有するプラスミドベクター
及びその製造方法に関するものである。
近年、分子生物学及び遺伝子工学の発展を背景
に、組替えDNA手法を用いて有用な物質を生み
出す方法が脚光をあびつつある。これまでの分子
生物学の成果より、遺伝子の情報発現は、DNA
からメツセンジヤーRNA（以下、mRNAと略
す）が作られる段階（転写の段階）及びmRNA
が読みとられてタンパク質を作る翻訳の２段階で
その調節が行われており、遺伝子には、タンパク
質の一次構造を暗号化するDNA配列の他に、プ
ロモータと呼ばれる転写翻訳の開始につかさどる
DNA配列の存在が明らかにされている。最近、
遺伝子工学の手法により、微生物を用いたソマト
スタチン、インシユリン、インターフエロン等極
めて有用な物質の生産が行われようとしている
が、異種DNAであるこれら有用ポリペプチドを
暗号化したDNA、例えば、mRNAから逆転写に
よつて得られるDNAをそのままプラスミドに導
入しただけでは有用ポリペプチドの生産が開始さ
れず、導入した異種DNAの読み取り、すなわ
ち、プロモータがなければならないことが明らか
にされてきた。また、プロモータにもその活性に
強弱があり、導入した異種DNAの発現、すなわ
ち、目的ポリペプチドの生産が、プロモータ活性
の強弱に依存するものと考えられるようになつて
きた。遺伝子工学の手法を用いて有用ポリペプチ
ドの生産を異種生物で行う場合、生産量を高める
ためには強力なプロモータを付与することが考え
られるが、導入された異種DNAの遺伝子産物が
多量に生産されることによつて、宿主菌が悪影響
を受けることが予想され、また、実際そのような
例も明らかにされている。このため導入された異
種DNAを宿主菌に害をおよぼさない程度に効率
よく発現させるのに都合のよいプロモータを見い
出し、それを利用して異種DNAの遺伝子産物の
生産を行うことが必要とされる。
に、組替えDNA手法を用いて有用な物質を生み
出す方法が脚光をあびつつある。これまでの分子
生物学の成果より、遺伝子の情報発現は、DNA
からメツセンジヤーRNA（以下、mRNAと略
す）が作られる段階（転写の段階）及びmRNA
が読みとられてタンパク質を作る翻訳の２段階で
その調節が行われており、遺伝子には、タンパク
質の一次構造を暗号化するDNA配列の他に、プ
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DNA配列の存在が明らかにされている。最近、
遺伝子工学の手法により、微生物を用いたソマト
スタチン、インシユリン、インターフエロン等極
めて有用な物質の生産が行われようとしている
が、異種DNAであるこれら有用ポリペプチドを
暗号化したDNA、例えば、mRNAから逆転写に
よつて得られるDNAをそのままプラスミドに導
入しただけでは有用ポリペプチドの生産が開始さ
れず、導入した異種DNAの読み取り、すなわ
ち、プロモータがなければならないことが明らか
にされてきた。また、プロモータにもその活性に
強弱があり、導入した異種DNAの発現、すなわ
ち、目的ポリペプチドの生産が、プロモータ活性
の強弱に依存するものと考えられるようになつて
きた。遺伝子工学の手法を用いて有用ポリペプチ
ドの生産を異種生物で行う場合、生産量を高める
ためには強力なプロモータを付与することが考え
られるが、導入された異種DNAの遺伝子産物が
多量に生産されることによつて、宿主菌が悪影響
を受けることが予想され、また、実際そのような
例も明らかにされている。このため導入された異
種DNAを宿主菌に害をおよぼさない程度に効率
よく発現させるのに都合のよいプロモータを見い
出し、それを利用して異種DNAの遺伝子産物の
生産を行うことが必要とされる。
本発明者らは、このような事情に鑑み、宿主菌
の遺伝子内に存在する種々の強度のプロモータを
取り出し、特定異種DNAの発現には、それに適
したプロモータを見い出すことが必要であると痛
感するようになつた。このためには、プロモータ
の検出が必須である。そこで、プロモータの検出
法について鋭意研究を重ねた結果、すでに本発明
者らが開発したトリメトプリム耐性遺伝子を組み
込んだプラスミドベクターを改造することによ
り、プロモータ検出用プラスミドが得られること
を見い出し、本発明を完成するに至つた。
の遺伝子内に存在する種々の強度のプロモータを
取り出し、特定異種DNAの発現には、それに適
したプロモータを見い出すことが必要であると痛
感するようになつた。このためには、プロモータ
の検出が必須である。そこで、プロモータの検出
法について鋭意研究を重ねた結果、すでに本発明
者らが開発したトリメトプリム耐性遺伝子を組み
込んだプラスミドベクターを改造することによ
り、プロモータ検出用プラスミドが得られること
を見い出し、本発明を完成するに至つた。
すなわち、本発明は、プロモータ活性を有する
DNA断片を特定制限酵素部位に導入することに
より、トリメトプリム耐性を発現するプラスミド
ベクター、及びすでに本発明者らが開発したトリ
メトプリム耐性遺伝子を組み込んだプラスミドベ
クターの特定DNAを除去した後、特定制限酵素
によつて切断される配列を結合することによつて
プロモータ検出用プラスミドベクターを製造する
方法を提供するものである。
DNA断片を特定制限酵素部位に導入することに
より、トリメトプリム耐性を発現するプラスミド
ベクター、及びすでに本発明者らが開発したトリ
メトプリム耐性遺伝子を組み込んだプラスミドベ
クターの特定DNAを除去した後、特定制限酵素
によつて切断される配列を結合することによつて
プロモータ検出用プラスミドベクターを製造する
方法を提供するものである。
本発明に用いられる宿主菌は、大腸菌である
が、該プラスミドが自立的に複製される宿主、例
えば、大腸菌の近緑菌であれば応用可能である。
以下は、大腸菌について記載している。
が、該プラスミドが自立的に複製される宿主、例
えば、大腸菌の近緑菌であれば応用可能である。
以下は、大腸菌について記載している。
トリメトプリムは、ジヒドロ葉酸還元酵素（以
下、DHFRと略す。）の強力な拮抗阻害剤であ
り、DHFRが阻害されることによりアミノ酸及び
核酸の合成反応に必須なテトラヒドロ葉酸の供給
が止められる。このことからトリメトプリムは、
抗細菌剤として用いられるが、トリメトプリムに
対する抵抗性を宿主に付与させるためには、すで
に発明者らが明らかにしているように（特許出
願、56−143520）DHFR遺伝子を多コピープラス
ミドに組み込んで宿主に導入し、細胞内における
この遺伝子の含量を高めてDHFRを多量に生産さ
せることによつて達成できる。DHFR遺伝子は、
作られるタンパク質のアミノ酸配列を暗号化して
いるDNA配列と、この暗号を読み取らせるため
の配列であるプロモータ配列とから成り立つてい
る。従つて後者すなわち、プロモータ配列を除く
ことによりDHFR遺伝子は、DHFRを作らなくな
るが、前者すなわちDHFR自体を暗号化している
DNA配列の前に、他のプロモータ活性を有する
DNAを接続すると、この再生遺伝子は、DHFR
を生産するようになる。従つて、プロモータ活性
を検出するためには、DHFR遺伝子を組み込んだ
プラスミドを改造して、DHFR遺伝子のプロモー
タ配列を除き、DHFR自体を暗号化している
DNA配列の前に他のDNAを接続やすいように特
定制限酵素部位を形成すればよい。このようにし
て形成したプラスミドは、プロモータ配列を接続
することによりDHFRを生産することができるよ
うになるので、宿主にトリメトプリム耐性を付与
することができる。従つて、トリメトプリムを含
む培地に生育する宿主菌からのみ、プロモータ配
列が導入されたプラスミドを得ることができ、プ
ロモータ配列をもたないDNAが導入されたプラ
スミドを有する宿主菌は、トリメトプリムを含む
培地に生育できないので、プロモータの検出を容
易に行うことができる。しかしながら、現在まで
トリメトプリム耐性の生現をマーカーとしたプロ
モータ検出プラスミドベクターはまだ開発されて
いなかつた。
下、DHFRと略す。）の強力な拮抗阻害剤であ
り、DHFRが阻害されることによりアミノ酸及び
核酸の合成反応に必須なテトラヒドロ葉酸の供給
が止められる。このことからトリメトプリムは、
抗細菌剤として用いられるが、トリメトプリムに
対する抵抗性を宿主に付与させるためには、すで
に発明者らが明らかにしているように（特許出
願、56−143520）DHFR遺伝子を多コピープラス
ミドに組み込んで宿主に導入し、細胞内における
この遺伝子の含量を高めてDHFRを多量に生産さ
せることによつて達成できる。DHFR遺伝子は、
作られるタンパク質のアミノ酸配列を暗号化して
いるDNA配列と、この暗号を読み取らせるため
の配列であるプロモータ配列とから成り立つてい
る。従つて後者すなわち、プロモータ配列を除く
ことによりDHFR遺伝子は、DHFRを作らなくな
るが、前者すなわちDHFR自体を暗号化している
DNA配列の前に、他のプロモータ活性を有する
DNAを接続すると、この再生遺伝子は、DHFR
を生産するようになる。従つて、プロモータ活性
を検出するためには、DHFR遺伝子を組み込んだ
プラスミドを改造して、DHFR遺伝子のプロモー
タ配列を除き、DHFR自体を暗号化している
DNA配列の前に他のDNAを接続やすいように特
定制限酵素部位を形成すればよい。このようにし
て形成したプラスミドは、プロモータ配列を接続
することによりDHFRを生産することができるよ
うになるので、宿主にトリメトプリム耐性を付与
することができる。従つて、トリメトプリムを含
む培地に生育する宿主菌からのみ、プロモータ配
列が導入されたプラスミドを得ることができ、プ
ロモータ配列をもたないDNAが導入されたプラ
スミドを有する宿主菌は、トリメトプリムを含む
培地に生育できないので、プロモータの検出を容
易に行うことができる。しかしながら、現在まで
トリメトプリム耐性の生現をマーカーとしたプロ
モータ検出プラスミドベクターはまだ開発されて
いなかつた。
次に本発明の実施態様について説明する。
プラスミドベクターpTP5―３は、プラスミド
ベクターpTP30―５（特願昭56−143520に記
載。）を改良する目的で本発明者が既に作製して
いたもので参考例にその製造工程を示している。
pTP5―３は宿主にトリメトプリム、テトラサイ
クリン、及びアンピシリンの３種の薬剤に対する
耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドベクタ
ーであり、大腸菌に安定状態に保たれ、pTP5―
３を含有する大腸菌は微工研にFERM Ｐ―8648
として寄託されている。
ベクターpTP30―５（特願昭56−143520に記
載。）を改良する目的で本発明者が既に作製して
いたもので参考例にその製造工程を示している。
pTP5―３は宿主にトリメトプリム、テトラサイ
クリン、及びアンピシリンの３種の薬剤に対する
耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドベクタ
ーであり、大腸菌に安定状態に保たれ、pTP5―
３を含有する大腸菌は微工研にFERM Ｐ―8648
として寄託されている。
まず、プラスミドベクターpTP5―３をSalに
よつて切断し、その後再びT4DNAリガーゼを用
いて再結合することにより、約4300塩基対より成
るプラスミドDNAを作成する。Salは、pTP5
―３を３ケ所で切断し、約4300、1200及び600塩
基対の３つのDNA断片を形成する。このうち約
4300塩基対のDNA断片は、アンピシリン耐性遺
伝子、プラスミドの複製に関与する遺伝子及び
DHFR遺伝子のうちプロモータのごく一部を欠い
た遺伝子を含んでいる。よつて、得られる約4300
塩基対のプラスミド（pTP6―６と呼称する。）
は、アンピシリン耐性を宿主に付与するが、トリ
メトプリム耐性を付与することはできない。しか
し、このプラスミドにおいては、DHFR遺伝子の
プロモータの大部分を含んでいるためプロモータ
活性をもたないDNA断片が導入された場合でも
DHFRを作る可能性が考えられるので、pTP6―
６をSalで切断し、次いで二本鎖DNAに特異的
に働いて両端から核酸を分解する酵素エキソヌク
レアーゼBAL31を作用させることにより、プロ
モータの大部分を除く。この際、エキソヌクレア
ーゼの作用はその酵素量、温度及び作用させる時
間に依存する。本発明者は最終濃度２ユニツト／
400μの酵素量、25℃反応条件においては、約
120−180塩基対／分の速度で酵素反応が進行する
ことを確認して、この結果に基づいてプロモータ
配列の欠失を計画している。この条件に従うと、
pTP6―６のSal切断配列約100塩基対下流から
存在するジヒドロ葉酸還元酵素を暗号化する配列
を保つためには、33秒（100／180分）以内に反応
を停止することが必要である。得られる直鎖状
DNAの両端は平滑末端である。さらに、異種
DNAを導入しやすいように特定制限酵素によつ
て切断されるDNA配列を付け加えて、環状DNA
とし目的プラスミドベクターを得る。
よつて切断し、その後再びT4DNAリガーゼを用
いて再結合することにより、約4300塩基対より成
るプラスミドDNAを作成する。Salは、pTP5
―３を３ケ所で切断し、約4300、1200及び600塩
基対の３つのDNA断片を形成する。このうち約
4300塩基対のDNA断片は、アンピシリン耐性遺
伝子、プラスミドの複製に関与する遺伝子及び
DHFR遺伝子のうちプロモータのごく一部を欠い
た遺伝子を含んでいる。よつて、得られる約4300
塩基対のプラスミド（pTP6―６と呼称する。）
は、アンピシリン耐性を宿主に付与するが、トリ
メトプリム耐性を付与することはできない。しか
し、このプラスミドにおいては、DHFR遺伝子の
プロモータの大部分を含んでいるためプロモータ
活性をもたないDNA断片が導入された場合でも
DHFRを作る可能性が考えられるので、pTP6―
６をSalで切断し、次いで二本鎖DNAに特異的
に働いて両端から核酸を分解する酵素エキソヌク
レアーゼBAL31を作用させることにより、プロ
モータの大部分を除く。この際、エキソヌクレア
ーゼの作用はその酵素量、温度及び作用させる時
間に依存する。本発明者は最終濃度２ユニツト／
400μの酵素量、25℃反応条件においては、約
120−180塩基対／分の速度で酵素反応が進行する
ことを確認して、この結果に基づいてプロモータ
配列の欠失を計画している。この条件に従うと、
pTP6―６のSal切断配列約100塩基対下流から
存在するジヒドロ葉酸還元酵素を暗号化する配列
を保つためには、33秒（100／180分）以内に反応
を停止することが必要である。得られる直鎖状
DNAの両端は平滑末端である。さらに、異種
DNAを導入しやすいように特定制限酵素によつ
て切断されるDNA配列を付け加えて、環状DNA
とし目的プラスミドベクターを得る。
プラスミドpTP6―６は、大腸菌に安定状態に
保たれ、pTP6―６を含有する大腸菌は微工研に
FERM Ｐ―8647として寄託されている。特定制
限酵素によつて切断される部位の創設は、例え
ば、Hindによつて切断される部位は、Hind
リンカーと呼ばれるｄ（pCAAGCTTG）なる配
列をもつDNAをエキソヌクレアーゼBAL31によ
つて得られる直鎖状DNAの平滑末端にT4DNAリ
ガーゼを用いて結合し、これを再びHindによ
つて切断するとDNAの両端は接着末端となる。
両端をT4DNAリガーゼで結合すると環状DNAが
得られ、T4DNAリガーゼで結合された部位は
Hindによつて切断される配列が形成される。
このようにして得られるプラスミドベクターが果
たしてプロモータ検出ベクターであるか否かは、
次に示されるようにして確かめることができる。
すなわち、pBR322をHincで切断し、さらに、
切断点にHindリンカーを結合し、再びHind
で切断する。これと、上記において得られたプラ
スミドをHindで切断したものとをT4DNAリガ
ーゼで結合し、宿主に取り込ませる。この操作に
よつて宿主がトリメトプリム耐性を獲得したとす
れば、用いたプラスミドはプロモータを検出した
ことになり、プロモータ検出プラスミドベクター
であることが判明する。｛pBR322のHincと
Hindによる切断によつて得られる断片のうち
少なくとも一つはプロモータ構造を完全に有す
る。〔J.G.Sutcliffe、Cold Spring Harbor
Symbosium、43、77（1979）〕｝ また、次の方法によつても本発明のプラスミド
ベクターは得られる。
保たれ、pTP6―６を含有する大腸菌は微工研に
FERM Ｐ―8647として寄託されている。特定制
限酵素によつて切断される部位の創設は、例え
ば、Hindによつて切断される部位は、Hind
リンカーと呼ばれるｄ（pCAAGCTTG）なる配
列をもつDNAをエキソヌクレアーゼBAL31によ
つて得られる直鎖状DNAの平滑末端にT4DNAリ
ガーゼを用いて結合し、これを再びHindによ
つて切断するとDNAの両端は接着末端となる。
両端をT4DNAリガーゼで結合すると環状DNAが
得られ、T4DNAリガーゼで結合された部位は
Hindによつて切断される配列が形成される。
このようにして得られるプラスミドベクターが果
たしてプロモータ検出ベクターであるか否かは、
次に示されるようにして確かめることができる。
すなわち、pBR322をHincで切断し、さらに、
切断点にHindリンカーを結合し、再びHind
で切断する。これと、上記において得られたプラ
スミドをHindで切断したものとをT4DNAリガ
ーゼで結合し、宿主に取り込ませる。この操作に
よつて宿主がトリメトプリム耐性を獲得したとす
れば、用いたプラスミドはプロモータを検出した
ことになり、プロモータ検出プラスミドベクター
であることが判明する。｛pBR322のHincと
Hindによる切断によつて得られる断片のうち
少なくとも一つはプロモータ構造を完全に有す
る。〔J.G.Sutcliffe、Cold Spring Harbor
Symbosium、43、77（1979）〕｝ また、次の方法によつても本発明のプラスミド
ベクターは得られる。
すなわち、pTP6―６をSalで切断し、エキソ
ヌクレアーゼBAL31を作用させて得られる直鎖
状DNAにHindリンカーを結合する。これと、
大腸菌の染色体DNAを混合し、Hindによつて
切断後、T4DNAリガーゼで結合し種々のプラス
ミドDNAを作り、これを大腸菌に取り込ませ、
トリメトプリム耐性となつた大腸菌を分離し、こ
れからプラスミドを単離する。このプラスミドを
Hindによつて切断し、再びT4DNAリガーゼで
結合し、大腸菌に取り込ませ、アンピシリン耐性
でかつ、トリメトプリムには耐性のない菌株を分
離する。この菌株からプラスミドを分離すると目
的のプロモータ検出用プラスミドベクターが得ら
れる。
ヌクレアーゼBAL31を作用させて得られる直鎖
状DNAにHindリンカーを結合する。これと、
大腸菌の染色体DNAを混合し、Hindによつて
切断後、T4DNAリガーゼで結合し種々のプラス
ミドDNAを作り、これを大腸菌に取り込ませ、
トリメトプリム耐性となつた大腸菌を分離し、こ
れからプラスミドを単離する。このプラスミドを
Hindによつて切断し、再びT4DNAリガーゼで
結合し、大腸菌に取り込ませ、アンピシリン耐性
でかつ、トリメトプリムには耐性のない菌株を分
離する。この菌株からプラスミドを分離すると目
的のプロモータ検出用プラスミドベクターが得ら
れる。
なお、このようにして得られるプラスミドベク
ターのHind切断部位は、いわゆるアダプター
DNAと呼ばれる合成DNAを用いて他の制限酵素
によつて切断される部位に変換することができ
る。よつて、本発明における特定制限酵素部位は
Hind部位に限定されないことは自明である。
ターのHind切断部位は、いわゆるアダプター
DNAと呼ばれる合成DNAを用いて他の制限酵素
によつて切断される部位に変換することができ
る。よつて、本発明における特定制限酵素部位は
Hind部位に限定されないことは自明である。
次に、実施例によつて本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
なお、実施例における菌体からのプラスミドの
分離はTanaka及びWeisblumの方法｛T.
Tanaka、B.Weisbum；J.Bacteriology、121、
354、（1975）｝に、DNAの宿主への取り込みは、
Norgardらの方法｛M.V.Norgard、K.Keem、J.J.
Monahan；Gene、３、279、（1979）｝に従つた。
分離はTanaka及びWeisblumの方法｛T.
Tanaka、B.Weisbum；J.Bacteriology、121、
354、（1975）｝に、DNAの宿主への取り込みは、
Norgardらの方法｛M.V.Norgard、K.Keem、J.J.
Monahan；Gene、３、279、（1979）｝に従つた。
実施例
プラスミドベクターpTP5―３は宿主にトリメ
トプリム、テトラサイクリン及びアンピシリンの
３種の薬剤に対する耐性を付与するプラスミドベ
クターであり発明者らが開発したものである。第
１図にpTP5―３の制限酵素による切断地図を示
す。約0.3μｇのpTP5―３を75μの反応液
｛6mM MgCl2、0.2mMエチレンジアミンテトラ
酢酸（以下、EDTAと略す。）及び150mM Nacl
を含む8mM Tris―HCl緩衝液（PH7.6）｝中で、
５ユニツトの制限酵素Salを用いて37℃２時間
反応させた。さらに、65℃で５分間保つことによ
り制限酵素Salを失活させた後、氷中に保ち、
15μの50mM MgCl2、15μの0.1Mジチオト
レイトール（以下、DTTと略す。）15μの5mM
ATP、７μの1M Tris―HCl緩衝液（PH7.4）、
23μの水及び0.2ユニツトのT4DNAリガーゼを
加え、４℃で18時間反応させ、DNA末端を連結
させることにより再環化反応を行わせた。この反
応生成物をNorgardらの方法に従つて
Escherichia coli Ｋ―12 C600株に取り込ませ
た。この処理をした菌体を20μｇ/mlアンピシリ
ンナトリウムを含む栄養寒天培地（２ｇ/グル
コース、１ｇ/K2HPO4、５ｇ/ポリペプト
ン、５ｇ/イーストエキス及び15ｇ/寒天より
なる培地）上にまき、生長する菌体を約1000個得
た。これらの菌体のうち100個を適当に選んで、
２μｇ/mlトリメトプリム及び20μｇ/mlアンピシ
リンナトリウムを含む栄養寒天培地上に移し、ト
リメトプリムに対して耐性を示すかを調べたとこ
ろ、72個の菌体は、この培地では生長できなかつ
た。このような菌体、すなわち、アンピシリン耐
性でトリメトプリムに感受性である菌体から一株
選んでプラスミドを単離した。得られたプラスミ
ドの大きさは、約4300塩基対であり、制限酵素
Sal、EcoR及びPstによつてそれぞれ一ケ
所切断されたが、Hind及びBamHによつては
切断されなかつた。このプラスミドをpTP6―６
と名づけた。第２図にpTP6―６の制限酵素によ
る切断地図を示す。
トプリム、テトラサイクリン及びアンピシリンの
３種の薬剤に対する耐性を付与するプラスミドベ
クターであり発明者らが開発したものである。第
１図にpTP5―３の制限酵素による切断地図を示
す。約0.3μｇのpTP5―３を75μの反応液
｛6mM MgCl2、0.2mMエチレンジアミンテトラ
酢酸（以下、EDTAと略す。）及び150mM Nacl
を含む8mM Tris―HCl緩衝液（PH7.6）｝中で、
５ユニツトの制限酵素Salを用いて37℃２時間
反応させた。さらに、65℃で５分間保つことによ
り制限酵素Salを失活させた後、氷中に保ち、
15μの50mM MgCl2、15μの0.1Mジチオト
レイトール（以下、DTTと略す。）15μの5mM
ATP、７μの1M Tris―HCl緩衝液（PH7.4）、
23μの水及び0.2ユニツトのT4DNAリガーゼを
加え、４℃で18時間反応させ、DNA末端を連結
させることにより再環化反応を行わせた。この反
応生成物をNorgardらの方法に従つて
Escherichia coli Ｋ―12 C600株に取り込ませ
た。この処理をした菌体を20μｇ/mlアンピシリ
ンナトリウムを含む栄養寒天培地（２ｇ/グル
コース、１ｇ/K2HPO4、５ｇ/ポリペプト
ン、５ｇ/イーストエキス及び15ｇ/寒天より
なる培地）上にまき、生長する菌体を約1000個得
た。これらの菌体のうち100個を適当に選んで、
２μｇ/mlトリメトプリム及び20μｇ/mlアンピシ
リンナトリウムを含む栄養寒天培地上に移し、ト
リメトプリムに対して耐性を示すかを調べたとこ
ろ、72個の菌体は、この培地では生長できなかつ
た。このような菌体、すなわち、アンピシリン耐
性でトリメトプリムに感受性である菌体から一株
選んでプラスミドを単離した。得られたプラスミ
ドの大きさは、約4300塩基対であり、制限酵素
Sal、EcoR及びPstによつてそれぞれ一ケ
所切断されたが、Hind及びBamHによつては
切断されなかつた。このプラスミドをpTP6―６
と名づけた。第２図にpTP6―６の制限酵素によ
る切断地図を示す。
次に、約５μｇのpTP6―６を400μの反応液
｛6mM Mgcl2、0.2mM EDTA、及び150mM
Naclを含む8mM Tris―HCl緩衝液（PH7.6）｝中
で10ユニツトの制限酵素Salを用いて37℃で２
時間反応させた後、８μの1M Tris―HCl緩衝
液（PH8.0）、４μの1M MgCl2、５μの1M
CaCl2、８μの5M NaCl及び１μの0.25M
EDTAを加え、25℃に保ち、２ユニツトのエキソ
ヌクレアーゼBAL31を20秒作用させた。エキソ
ヌクレアーゼの反応は、400μの水飽和フエノ
ールを加えることにより停止させ、3000回転／分
の遠心分離により水層とフエノール層とに分け、
水層を取り、これを50mMのNaClを含む50mM
Tris―HCl緩衝液（PH7.4）に透析した。透析液
DNA液400μに、40μの3M CH3COONaを加
え、さらに１mlのエタノールを加え、−20℃に一
晩保ち、DNAを沈でんさせた。12000回転、15分
間の遠心分離により沈でんを集め、75μの
50mM Tris―HCl緩衝液（PH7.4）に溶解した。
これに、15μの50mM MgCl2、15μの0.1M
DTT、15μの5mM ATP、７μの1M Tris
―HCl緩衝液（PH7.4）、23μの水、７μの3.5
μＭ Hindヌクレオチドリンカー｛ｄ
（pCAAGCTTG）｝及び10ユニツトのT4DNAリガ
ーゼを加えて、４℃で18時間反応させた。これを
DNA混液と名ずけた。
｛6mM Mgcl2、0.2mM EDTA、及び150mM
Naclを含む8mM Tris―HCl緩衝液（PH7.6）｝中
で10ユニツトの制限酵素Salを用いて37℃で２
時間反応させた後、８μの1M Tris―HCl緩衝
液（PH8.0）、４μの1M MgCl2、５μの1M
CaCl2、８μの5M NaCl及び１μの0.25M
EDTAを加え、25℃に保ち、２ユニツトのエキソ
ヌクレアーゼBAL31を20秒作用させた。エキソ
ヌクレアーゼの反応は、400μの水飽和フエノ
ールを加えることにより停止させ、3000回転／分
の遠心分離により水層とフエノール層とに分け、
水層を取り、これを50mMのNaClを含む50mM
Tris―HCl緩衝液（PH7.4）に透析した。透析液
DNA液400μに、40μの3M CH3COONaを加
え、さらに１mlのエタノールを加え、−20℃に一
晩保ち、DNAを沈でんさせた。12000回転、15分
間の遠心分離により沈でんを集め、75μの
50mM Tris―HCl緩衝液（PH7.4）に溶解した。
これに、15μの50mM MgCl2、15μの0.1M
DTT、15μの5mM ATP、７μの1M Tris
―HCl緩衝液（PH7.4）、23μの水、７μの3.5
μＭ Hindヌクレオチドリンカー｛ｄ
（pCAAGCTTG）｝及び10ユニツトのT4DNAリガ
ーゼを加えて、４℃で18時間反応させた。これを
DNA混液と名ずけた。
DNA混液を20μ取り、これに水48μを加
え、さらに７μの0.6M NaCl、70mM ２―メ
ルカプトエタノール及び70mM MgCl2を含む
70mM Tris―HCl緩衝液（PH7.4）を加え、37℃
に保ち、これに５ユニツトのHindを加え２時
間反応させた。この反応液を65℃、５分間の熱処
理をしてHindを失活させた後、15μの50mM
MgCl2、15μの0.1M DTT、15μの5mM
ATP、７μの1M Tris―HCl緩衝液（PH7.4）、
23μの水及び２ユニツトのT4DNAリガーゼを
加え、４℃で18時間反応させた。このような処理
をしたDNA液をEscherichia coli Ｋ―12 C600株
に取り込ませた。この処理をした菌体を20μｇ/
mlのアンピシリンナトリウムを含む栄養寒天培地
上にまき、生長する菌体を約500個得た。この菌
体から24個適当に選びプラスミドを単離し、
Hindで切断したところ、３種のプラスミドが
Hindによつて切断された。３種のプラスミド
をそれぞれpTP7―２、pTP7―８及びpTP7―16
と名ずけた。
え、さらに７μの0.6M NaCl、70mM ２―メ
ルカプトエタノール及び70mM MgCl2を含む
70mM Tris―HCl緩衝液（PH7.4）を加え、37℃
に保ち、これに５ユニツトのHindを加え２時
間反応させた。この反応液を65℃、５分間の熱処
理をしてHindを失活させた後、15μの50mM
MgCl2、15μの0.1M DTT、15μの5mM
ATP、７μの1M Tris―HCl緩衝液（PH7.4）、
23μの水及び２ユニツトのT4DNAリガーゼを
加え、４℃で18時間反応させた。このような処理
をしたDNA液をEscherichia coli Ｋ―12 C600株
に取り込ませた。この処理をした菌体を20μｇ/
mlのアンピシリンナトリウムを含む栄養寒天培地
上にまき、生長する菌体を約500個得た。この菌
体から24個適当に選びプラスミドを単離し、
Hindで切断したところ、３種のプラスミドが
Hindによつて切断された。３種のプラスミド
をそれぞれpTP7―２、pTP7―８及びpTP7―16
と名ずけた。
Saito及びMiuraの方法（H.Saito、K.Miura；
Biochim、Biophys.Acta、72、619（1963）｝に従
つて、Escherichia coli Ｋ―12 C600株から得た
DNA約１μｇとpTP7―２（もしくは、pTP7―
８またはpTP7―16）約１μｇを75μの反応液
｛7mM Tris―HCl緩衝液（PH7.4）、7mM
MgCl2、7mM ２―メチルカプトエタノール、
60mM NaCl｝中で、５ユニツトのHindを用い
て37℃、１時間消化させた。さらに、65℃で５分
間保つてHindを失活させた後、氷中に保ち、
15μの50mM MgCl2、15μのDTT、15μ
の5mM ATP、７μの1M Tris―HCl緩衝液
（PH7.4）、23μの水及び１ユニツトのT4DNAリ
ガーゼを加え、４℃で18時間反応させた。この反
応液をEscherichia coli Ｋ―12 C600株に取り込
ませた。この処理をした菌株を20μｇ/mlのアン
ピシリンナトリウム及び２μｇ/mlトリメトプリ
ムを含む栄養寒天培地上にまいたところ、pTP7
―２及びpTP7―８を用いた場合は生長する菌体
が得られたが、pTP7―16では得られなかつた。
Biochim、Biophys.Acta、72、619（1963）｝に従
つて、Escherichia coli Ｋ―12 C600株から得た
DNA約１μｇとpTP7―２（もしくは、pTP7―
８またはpTP7―16）約１μｇを75μの反応液
｛7mM Tris―HCl緩衝液（PH7.4）、7mM
MgCl2、7mM ２―メチルカプトエタノール、
60mM NaCl｝中で、５ユニツトのHindを用い
て37℃、１時間消化させた。さらに、65℃で５分
間保つてHindを失活させた後、氷中に保ち、
15μの50mM MgCl2、15μのDTT、15μ
の5mM ATP、７μの1M Tris―HCl緩衝液
（PH7.4）、23μの水及び１ユニツトのT4DNAリ
ガーゼを加え、４℃で18時間反応させた。この反
応液をEscherichia coli Ｋ―12 C600株に取り込
ませた。この処理をした菌株を20μｇ/mlのアン
ピシリンナトリウム及び２μｇ/mlトリメトプリ
ムを含む栄養寒天培地上にまいたところ、pTP7
―２及びpTP7―８を用いた場合は生長する菌体
が得られたが、pTP7―16では得られなかつた。
pTP7―２とpTP7―８の分子サイズをアガロー
スゲル電気泳動で比較したところpTP7―８が小
さかつた。すでに本明細書に述べてあるように
pTP7―２及びpTP7―８はいずれも、プロモータ
検出プラスミドベクターとして使用できることは
明白である。
スゲル電気泳動で比較したところpTP7―８が小
さかつた。すでに本明細書に述べてあるように
pTP7―２及びpTP7―８はいずれも、プロモータ
検出プラスミドベクターとして使用できることは
明白である。
pTP7―２及びpTP7―８共に、Hind以外に
EcoR、Pst、Pvuによつて各一ケ所切断さ
れたが、BamH、Salによつては切断されな
かつた。pTP7―８の制限酵素による切断地図を
第３図に示す。pTP7―８は、大腸菌に安定状態
に保たれ、pTP7―８を含有する大腸菌は微工研
にFERM Ｐ―8646として寄託されている。
EcoR、Pst、Pvuによつて各一ケ所切断さ
れたが、BamH、Salによつては切断されな
かつた。pTP7―８の制限酵素による切断地図を
第３図に示す。pTP7―８は、大腸菌に安定状態
に保たれ、pTP7―８を含有する大腸菌は微工研
にFERM Ｐ―8646として寄託されている。
参考例
TP5―３の作製方法
１μｇのpTP30―５を１ユニツトの制限酵素
BstEで切断した後、２ユニツトのエキソヌク
レアーゼBAL31を、25℃で30秒作用させ、
pTP30―５のBstE部位の近傍に位置するPst
部位を欠失させた。欠失させたDNAをT4―DNA
リガーゼを用いて環状にし、これをEscherichia
coliK12C600株にNorgardらの方法に従つて取り
込ませた。この処理をした菌体を20μｇ/mlアン
ピシリンナトリウム、10μｇ/ml塩酸テトラサイ
クリン及び５μｇ/mlトリメトプリムを含む栄養
寒天培地上にまき生長する菌体を50個以上得た。
このなかから適当に６個選びプラスミドを分離
し、制限酵素Pstによる切断様式を調べ、１ケ
所だけ切断されるものを選んだ、調べた６個由来
のプラスミドのうち５個はPst部位を１ケ所だ
け有し、他の１個は２ケ所有していた。５個のう
ち１個を適当に選び、これにpTP5―３と名ずけ
た。
BstEで切断した後、２ユニツトのエキソヌク
レアーゼBAL31を、25℃で30秒作用させ、
pTP30―５のBstE部位の近傍に位置するPst
部位を欠失させた。欠失させたDNAをT4―DNA
リガーゼを用いて環状にし、これをEscherichia
coliK12C600株にNorgardらの方法に従つて取り
込ませた。この処理をした菌体を20μｇ/mlアン
ピシリンナトリウム、10μｇ/ml塩酸テトラサイ
クリン及び５μｇ/mlトリメトプリムを含む栄養
寒天培地上にまき生長する菌体を50個以上得た。
このなかから適当に６個選びプラスミドを分離
し、制限酵素Pstによる切断様式を調べ、１ケ
所だけ切断されるものを選んだ、調べた６個由来
のプラスミドのうち５個はPst部位を１ケ所だ
け有し、他の１個は２ケ所有していた。５個のう
ち１個を適当に選び、これにpTP5―３と名ずけ
た。
第１図は、pTP5―３の制限酵素による切断地
図、第２図は、pTP6―６の制限酵素による切断
地図及び第３図は、pTP7―８の制限酵素による
切断地図であり、図中符号は制限酵素を表わし、
ＥはEcoR、ＨはHind、ＢはBamH、Ｓは
Sal及びＰはPstを示す。また、数字の単位は
キロ塩基であり、還状のDNA構造を便宜上直線
状で表わしているが、本来は、両端が同一部位で
ある。
図、第２図は、pTP6―６の制限酵素による切断
地図及び第３図は、pTP7―８の制限酵素による
切断地図であり、図中符号は制限酵素を表わし、
ＥはEcoR、ＨはHind、ＢはBamH、Ｓは
Sal及びＰはPstを示す。また、数字の単位は
キロ塩基であり、還状のDNA構造を便宜上直線
状で表わしているが、本来は、両端が同一部位で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 宿主にアンピシリン耐性を付与し、プロモー
タを欠いた大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
を有し、ジヒドロ葉酸還元酵素を暗号化する配列
の上流にプロモータ活性を有するDNAを挿入す
るための特定制限酵素部位を有し、かつ特定制限
酵素部位にプロモータ活性を有するDNA断片を
挿入することにより、宿主にトリメトプリム耐性
を付与することを特徴とするプロモータ検出用プ
ラスミドベクター。 ２ プラスミドの大きさが約4.3キロ塩基対であ
り、プロモータ活性を有するDNA断片を挿入す
るための特定制限酵素部位が切断部位であり、
下図に記載される制限酵素切断地図を有する特許
請求範囲第１項記載のプロモータ検出用プラスミ
ドベクターpTP7―８。 【表】 ３ 大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を組み
込んだプラスミドベクターから、そのプロモータ
活性を特定制限酵素による切断とエキソヌクレア
ーゼによる切断を用いて欠落させ、その後ジヒド
ロ葉酸還元酵素を暗号化する配列の直前に特定制
限酵素によつて切断されるDNA配列を付加する
ことを特徴とするプロモータ検出用プラスミドベ
クターの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57110999A JPS591500A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57110999A JPS591500A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS591500A JPS591500A (ja) | 1984-01-06 |
| JPS6237958B2 true JPS6237958B2 (ja) | 1987-08-14 |
Family
ID=14549830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57110999A Granted JPS591500A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS591500A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200108655A (ko) * | 2019-03-11 | 2020-09-21 | 주식회사 만도 | 전동 파워스티어링 시스템의 오버레이 제어 장치 및 그 방법 |
-
1982
- 1982-06-28 JP JP57110999A patent/JPS591500A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200108655A (ko) * | 2019-03-11 | 2020-09-21 | 주식회사 만도 | 전동 파워스티어링 시스템의 오버레이 제어 장치 및 그 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS591500A (ja) | 1984-01-06 |
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