JPS624117B2 - - Google Patents
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- JPS624117B2 JPS624117B2 JP55070862A JP7086280A JPS624117B2 JP S624117 B2 JPS624117 B2 JP S624117B2 JP 55070862 A JP55070862 A JP 55070862A JP 7086280 A JP7086280 A JP 7086280A JP S624117 B2 JPS624117 B2 JP S624117B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
- C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、インターフエロン産生方法に関する
ものであり、更に詳しくは、正に荷電した化学的
残基を有するミクロキヤリヤ上に増殖した動物細
胞をインターフエロン誘発剤で処理してインター
フエロンを産生させる方法に関するものである。 インターフエロンは各種のウイルスや二重鎖
RNA等の誘起剤の刺〓により動物細胞が産生す
るタンパク質であり、ウイルスの細胞内増殖を抑
制する作用を有する。インターフエロンの作用は
ウイルス種に関しては非特異的であるが、動物種
に関しては特異的である。すなわち、ある動物種
の細胞で産生されたインターフエロンは他の動物
種に対しては作用しない。近年ある種のウイルス
性疾患さらには腫瘍に対するインターフエロンの
治療効果が認められるに至り、その医療薬として
の可能性が注目を集めている。インターフエロン
を医薬として応用するためには、ヒトの何らかの
細胞を用いて生体外でインターフエロンを産生さ
せこれを分離精製することが必要となる。ヒト・
インターフエロンを産生させる為の細胞としてこ
れまでは血液より分離した白血球が用いられるこ
とが多かつたが、次第に胎児あるいは新生児由来
の二倍体細胞がこれに代わろうとしている。白血
球の供給は不特定多数の人間にたよらざるを得
ず、また白血球の産生したインターフエロン標品
中には各種のリンフオカインが混入している恐れ
が多い。従つて白血球から得られるインターフエ
ロン標品の安全性に対する監視は必ずしも容易で
はない。これに対して二倍体細胞にあつては一個
体由来のものを大量に培養することが可能である
ので、得られるインターフエロン標品の安全性の
確認は白血球由来の場合に比して容易であると考
えられている。 従来、二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養方
法としては、ル―瓶もしくはローラ瓶を用いる培
養方法が知られているが、この方法により大量の
係留依存性細胞を培養することはかなり困難であ
ると考えられている。すなわち、この方法におい
ては、細胞はルー瓶の底面もしくはローラ瓶の側
面に単層に増殖するだけであるため大量培養にあ
たつては、極めて多数のルー瓶もしくはローラ瓶
を扱う必要があり、取り扱いが極めて煩雑となる
ためである。 最近、係留依存性細胞の大量培養に適したミク
ロキヤリヤ培養法を称される培養法が開発された
（特開昭53―62889）。 この培養法は、正に荷電した化学的残基を有す
るミクロキヤリヤ（以下、単にミクロキヤリヤと
呼称する）を懸濁させた培地中に種細胞を接種
し、懸濁状態で培養する方法であり、接種された
細胞はミクロキヤリヤ表面に付着し、そこで増殖
する。ミクロキヤリヤ培養法は、細胞付着表面積
を大きくすることが容易であり、かつ、その取り
扱いも容易であるため、特に係留依存性細胞の大
量培養に適した培養法といえる。 一方、培養細胞にインターフエロンを産生させ
る技術として、スーパーインダクシヨン法と呼ば
れる二重鎖RNA等のインターフエロン誘発剤を
用いて細胞を刺激した後、シクロヘキシミド，ア
クチノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処理
することによりインターフエロン産生を一層増強
せしめる方法（米国特許3773924号）、UV法と呼
ばれる、インターフエロン誘発剤を用いて細胞を
刺激する前後数時間の間に細胞に紫外線を照射し
てインターフエロン産生を一層増強せしめる方法
等の方法が知られている。 本発明者等は、二培体細胞等の培養細胞由来の
インターフエロンを大量に産生させる方法とし
て、上記、培養方法およびインターフエロン産生
方法に着目し、ミクロキヤリヤ培養法で培養した
細胞に、スーパーインダクシヨン法により、イン
ターフエロンを産生させることを試みてきたが、
この方法においては、低単位のインターフエロン
しか産生しないことがしばしばあり、安定して高
単位のインターフエロンを産生することができな
いと共に、ルー瓶等を用いる方法に比較して、５
倍から10倍、ないしはそれ以上の高濃度のインタ
ーフエロン誘発剤を使用する必要があるという問
題点を有する。 本発明の目的は、かかる問題点を解消し、大量
産生に適する効果の顕著なインターフエロン産生
方法を提供することにある。 上記本発明の目的は、ミクロキヤリヤ上に増殖
した動物細胞をインターフエロン誘発剤にて処理
するに際し、細胞が付着、増殖したミクロキヤリ
ヤを、負に荷電した水溶性高分子を含む溶液によ
り処理するインターフエロン産生方法により達成
される。 本発明方法は、次のような効果を有し、インタ
ーフエロンの大量産生に好適に利用される。 (1) インターフエロン誘発剤の作用が不充分とな
ることを防止し、比較的安定して、高単位のイ
ンターフエロン産生が可能である。 (2) 高価なインターフエロン誘発剤の濃度を下げ
ることができその使用量を大巾に削減できる。 まず本発明方法の前提となるミクロキヤリヤ培
養法による二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養
方法について説明する。 ミクロキヤリヤを懸濁し、必要に応じて適当な
濃度の血清を含む、培地中に種細胞を接種し、ゆ
るやかに撹拌しながら適当な温度で培養を行な
う。 ミクロキヤリヤとしては、多糖類、たとえば、
デキストラン，デキストリン，澱粉，セルロー
ス，およびこれらの置換基誘導体等あるいはある
種の合成重合体、たとえば、ポリビニルアルコー
ル，ヒドロキシ置換アクリレート又はメタクリレ
ート，ポリスチレン等よりなる微小粒状体に適当
量のアミン残基を結合させたものなどが用いられ
る。 ミクロキヤリヤ濃度は、ミクロキヤリヤ材質、
培養すべき細胞の種類により異なるが、培地１ml
あたりのミクロキヤリヤ表面積がおよそ10cm2〜
100cm2となるような濃度範囲が好ましい。培地組
成，血清濃度等は、培養すべき細胞の種類、細胞
濃度等に応じて適当に選ばれる。 接種された細胞は、ミクロキヤリヤ表面に付着
し、増殖をはじめ、およそ数日間から10日間適当
な温度で培養を続けることにより、細胞がミクロ
キヤリヤ表面をほゞ完全に蓋いつくすまで増殖す
る。その間、必要に応じて、酸素の供給，PH調
整，栄養素の添加、培地交換等を行なう。 次にミクロキヤリヤ培養法で培養した細胞によ
るインターフエロン産生について詳しく説明す
る。 培養された細胞は、必要に応じて、インターフ
エロン誘発に先だち、インターフエロン産生を増
強せしめる目的で、低単位のインターフエロンを
含む培地でおよそ数時間ないしは１日間インキユ
ベートされる。 本発明方法においては、インターフエロン誘発
剤を添加する時期もしくはそれ以前に、細胞が付
着、増殖したミクロキヤリヤが懸濁している培地
中に負に荷電した水溶性高分子を添加することを
本質とする。 負に荷電した水溶性高分子としては、たとえ
ば、カルボキシメチルセルローズ（以下CMCと
略称する）、ポリアルギネート，ポリグルタメー
ト，ペクチン等のカルボキシル基を有する水溶性
高分子、リン酸セルローズ等のリン酸基を有する
水溶液高分子，デキストランサルフエート，ヘパ
リン等の硫酸基を有する水溶性高分子等が好まし
く用いられる。これら水溶性高分子の好適な濃度
および添加の時期は、用いる水溶性高分子の種類
により、異なるためそれぞれ適当な条件が選ばれ
る。たとえば、イオン強度の弱いカルボキシル基
を有するCMCの場合には、0.05％以上１％以
下、さらに好ましくは0.1％以上0.5以下の濃度に
相当する量を、インターフエロン誘発剤添加のお
よそ５時間以上、更に好ましくは、10時間以上前
に添加するのが好適であり、また、イオン強度の
強い硫酸基を有するデキストランサルフエートの
場合には、0.0001％以上0.01％以下の濃度に相当
する量をインターフエロン誘発剤の添加の直前も
しくはせいぜい１時間前に添加するのが好適であ
る。 水溶性高分子は、細胞が付着、増殖した後添加
する必要があり、インターフエロン誘発剤を添加
する時期より著るしく前の、細胞の増殖期に添加
することは好ましくない。例えば表―１に、仔牛
血清５％、各種濃度のCMC、および、ジエチル
アミノエチル化した架橋デキストランミクロキヤ
リヤ0.25％を含むイーグルMEM培地200mlにヒト
二倍体細胞２×107ケを接種し、温度37℃で撹拌
しながら７日間培養した場合の到達細胞数を示し
たが、この表から明らかなように、水溶性高分子
の細胞増殖期の添加は細胞の増殖を著るしく阻害
する。 表―１ CMC濃度％ 細胞数cells／ml ０ 6.8×105 0.0125 6.1×105 0.025 3.4×105 0.05 2.1×105 本発明方法を特に効果的に実施するためには、
インターフエロン誘発剤の添加に先だつて、前記
水溶性高分子を添加するのが良いが、イオン強度
の強いデキストランサルフエート等の場合はイン
ターフエロン誘発剤の添加と同時にもしくはそれ
に遅れて添加しても、かなりの効果があり、かか
る態様も本発明に包含される。 次に、いわゆるスーパーインダクシヨンもしく
はUV法でインターフエロン誘発処理を行なう。 すなわち、細胞が付着増殖したミクロキヤリヤ
を懸濁した培地中にインターフエロン誘発剤を添
加し、しかる後に、例えばスーパーインダクシヨ
ン法の場合は、シクロヘキシミド，アクチノマイ
シンＤ等の代謝阻害剤を適等な濃度、適当なタイ
ムスケジユールで添加し、適当な期間インキユベ
ートした後に、好ましくは、添加した前記の薬剤
等を含む古い培地を新しい培地と交換し、例えば
およそ１日の間インキユベートして培地中にイン
ターフエロンを産生せしめる。 細胞にインターフエロンを誘発させるインター
フエロン誘発剤としては種々のものが知られてい
るが、本発明方法にあつては、poly(I)：poly(C)，
poly(A)：poly（Ｕ）等の二重鎖RNA等を用いて
最も効果的に実施される。 インターフエロン誘発剤の好適な濃度は、細胞
の種類、インターフエロン誘発剤の種類等により
異なるが、例えば、インターフエロン誘発剤とし
てpoly(I)：poly(C)を用いる場合、ある種の細胞
（ヒト２倍体細胞）に対してはおよそ10μｇ／ml
の濃度で充分である。本発明方法においては、経
済的理由により、インターフエロン誘発剤、代謝
阻害剤等の使用量を削減する目的で、インターフ
エロン誘発処理に先立ち、ミクロキヤリヤ濃度す
なわち細胞密度をある程度高めることができる。 また本発明方法においては、細胞が付着、増殖
したミクロキヤリヤがインターフエロン誘発処理
に先立ち、ある必要な期間負に荷電した水溶性高
分子で処理されればその効果を発揮できる。した
がつてインターフエロン誘発処理中に、培地中に
前記水溶性高分子がインターフエロン誘発剤と共
存する必要性はない。また、培養、インターフエ
ロン誘発処理等いずれも、一般には撹拌下で実施
されるが、流動下であつてもよく、さらに、酸素
の供給等の問題がなければ静置下で実施されても
よい。 次に本発明の実施例について説明する。 実施例 １ 仔牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有す
る架橋デキストランミクロキヤリヤ0.25％を含む
イーグルMEM2にヒト正常二倍体細胞を105
ケ／mlの割合いで接種し、ガラス製スピナーフラ
スコでゆるく撹拌しながら37℃で７日間培養し
た。途中、２回培養培地を仔牛血清５％を含む新
しいイーグルMEM培地と交換した。到達細胞数
は1.05×106ケ／mlであつた。次に、細胞および
ミクロキヤリヤを含む培地100mlづつを10本の小
型スピナーフラスコに分注した。細胞およびミク
ロキヤリヤを沈降させ上澄培地を捨て、インター
フエロン100国際単位／mlおよび仔牛血清２％を
含む培地を捨てた培地量に等しい量加え、さら
に、一部のスピナーフラスコには、それぞれ定め
られた濃度のCMCを添加し、37℃でおよそ20時
間インキユベートした。 次に、10μｇ／mlのシクロヘキシミドおよびそ
れぞれ定められた濃度のpoly(I)：poly(C)を加え、
37℃で４時間インキユベートし、更に４μｇ／ml
のアクチノマイシンＤを加え、37℃で１時間イン
キユベートした後、細胞およびミクロキヤリヤを
沈降させ、上澄液を捨て、イーグルMEM培地を
捨てた量と同量加え、更に、この操作をもう１回
繰り返えした。最終的に加えた培地中に0.05％の
メチルセルロースを添加し37℃で、約20時間イン
キユベートした。最終的に用いた培地中に産生さ
れたインターフエロンの量をFL細胞およびヴエ
スキユラー・ストマテイテイス・ウイルスを用い
たCPE Inhibition法で測定し、国際単位に換算し
た。結果を図１および図２に示す。 実施例 ２ 仔牛血清５％ジエチルアミノエチル基を有する
架橋デキストランミクロキヤリヤ0.25％を含むイ
ーグルMEM2にヒト正常２倍体細胞を1.5×105
ケ／mlの割合で接種し、グラス製スピナーフラス
コでゆるく撹拌しながら、37℃で４日間培養し
た。途中１回培養培地を仔牛血清５％を含む新し
いイーグルMEM培地と交換した。到達細胞数は
6.8×105ケ／mlであつた。次に細胞およびミクロ
キヤリヤを沈降させ上澄培地を捨て、インターフ
エロン100国際単位／mlおよび仔牛血清２％を含
む培地を捨てた量と等量加え、37℃でおよそ20時
間インキユベートした。次に細胞およびミクロキ
ヤリヤを含む培地200mlづつを６本の小型スピナ
ーフラスコに分注し、さらに一部のフラスコには
それぞれ定められた濃度のデキストランサルフエ
ートを加え、37℃で１時間インキユベートした。 次に、細胞およびミクロキヤリヤを沈降させ、
上澄培地を捨て、２％仔牛血清を含むイーグル
MEM培地を捨てた量と等量加え、さらにそれぞ
れ定められた量のpoly(I)：poly(C)よび10μｇ／ml
のシクロヘキシミドを加え、37℃で４時間インキ
ユベートした後、以下実施例１と同様の方法でイ
ンターフエロンを産生させた。産生されたインタ
ーフエロンの量をヴエスキユラー・ストマテイテ
イス・ウイルスを用いてウイルス核酸合成半減法
により測定し、国際単位に換算した。 結果を表―２に示す。 【表】
ものであり、更に詳しくは、正に荷電した化学的
残基を有するミクロキヤリヤ上に増殖した動物細
胞をインターフエロン誘発剤で処理してインター
フエロンを産生させる方法に関するものである。 インターフエロンは各種のウイルスや二重鎖
RNA等の誘起剤の刺〓により動物細胞が産生す
るタンパク質であり、ウイルスの細胞内増殖を抑
制する作用を有する。インターフエロンの作用は
ウイルス種に関しては非特異的であるが、動物種
に関しては特異的である。すなわち、ある動物種
の細胞で産生されたインターフエロンは他の動物
種に対しては作用しない。近年ある種のウイルス
性疾患さらには腫瘍に対するインターフエロンの
治療効果が認められるに至り、その医療薬として
の可能性が注目を集めている。インターフエロン
を医薬として応用するためには、ヒトの何らかの
細胞を用いて生体外でインターフエロンを産生さ
せこれを分離精製することが必要となる。ヒト・
インターフエロンを産生させる為の細胞としてこ
れまでは血液より分離した白血球が用いられるこ
とが多かつたが、次第に胎児あるいは新生児由来
の二倍体細胞がこれに代わろうとしている。白血
球の供給は不特定多数の人間にたよらざるを得
ず、また白血球の産生したインターフエロン標品
中には各種のリンフオカインが混入している恐れ
が多い。従つて白血球から得られるインターフエ
ロン標品の安全性に対する監視は必ずしも容易で
はない。これに対して二倍体細胞にあつては一個
体由来のものを大量に培養することが可能である
ので、得られるインターフエロン標品の安全性の
確認は白血球由来の場合に比して容易であると考
えられている。 従来、二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養方
法としては、ル―瓶もしくはローラ瓶を用いる培
養方法が知られているが、この方法により大量の
係留依存性細胞を培養することはかなり困難であ
ると考えられている。すなわち、この方法におい
ては、細胞はルー瓶の底面もしくはローラ瓶の側
面に単層に増殖するだけであるため大量培養にあ
たつては、極めて多数のルー瓶もしくはローラ瓶
を扱う必要があり、取り扱いが極めて煩雑となる
ためである。 最近、係留依存性細胞の大量培養に適したミク
ロキヤリヤ培養法を称される培養法が開発された
（特開昭53―62889）。 この培養法は、正に荷電した化学的残基を有す
るミクロキヤリヤ（以下、単にミクロキヤリヤと
呼称する）を懸濁させた培地中に種細胞を接種
し、懸濁状態で培養する方法であり、接種された
細胞はミクロキヤリヤ表面に付着し、そこで増殖
する。ミクロキヤリヤ培養法は、細胞付着表面積
を大きくすることが容易であり、かつ、その取り
扱いも容易であるため、特に係留依存性細胞の大
量培養に適した培養法といえる。 一方、培養細胞にインターフエロンを産生させ
る技術として、スーパーインダクシヨン法と呼ば
れる二重鎖RNA等のインターフエロン誘発剤を
用いて細胞を刺激した後、シクロヘキシミド，ア
クチノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処理
することによりインターフエロン産生を一層増強
せしめる方法（米国特許3773924号）、UV法と呼
ばれる、インターフエロン誘発剤を用いて細胞を
刺激する前後数時間の間に細胞に紫外線を照射し
てインターフエロン産生を一層増強せしめる方法
等の方法が知られている。 本発明者等は、二培体細胞等の培養細胞由来の
インターフエロンを大量に産生させる方法とし
て、上記、培養方法およびインターフエロン産生
方法に着目し、ミクロキヤリヤ培養法で培養した
細胞に、スーパーインダクシヨン法により、イン
ターフエロンを産生させることを試みてきたが、
この方法においては、低単位のインターフエロン
しか産生しないことがしばしばあり、安定して高
単位のインターフエロンを産生することができな
いと共に、ルー瓶等を用いる方法に比較して、５
倍から10倍、ないしはそれ以上の高濃度のインタ
ーフエロン誘発剤を使用する必要があるという問
題点を有する。 本発明の目的は、かかる問題点を解消し、大量
産生に適する効果の顕著なインターフエロン産生
方法を提供することにある。 上記本発明の目的は、ミクロキヤリヤ上に増殖
した動物細胞をインターフエロン誘発剤にて処理
するに際し、細胞が付着、増殖したミクロキヤリ
ヤを、負に荷電した水溶性高分子を含む溶液によ
り処理するインターフエロン産生方法により達成
される。 本発明方法は、次のような効果を有し、インタ
ーフエロンの大量産生に好適に利用される。 (1) インターフエロン誘発剤の作用が不充分とな
ることを防止し、比較的安定して、高単位のイ
ンターフエロン産生が可能である。 (2) 高価なインターフエロン誘発剤の濃度を下げ
ることができその使用量を大巾に削減できる。 まず本発明方法の前提となるミクロキヤリヤ培
養法による二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養
方法について説明する。 ミクロキヤリヤを懸濁し、必要に応じて適当な
濃度の血清を含む、培地中に種細胞を接種し、ゆ
るやかに撹拌しながら適当な温度で培養を行な
う。 ミクロキヤリヤとしては、多糖類、たとえば、
デキストラン，デキストリン，澱粉，セルロー
ス，およびこれらの置換基誘導体等あるいはある
種の合成重合体、たとえば、ポリビニルアルコー
ル，ヒドロキシ置換アクリレート又はメタクリレ
ート，ポリスチレン等よりなる微小粒状体に適当
量のアミン残基を結合させたものなどが用いられ
る。 ミクロキヤリヤ濃度は、ミクロキヤリヤ材質、
培養すべき細胞の種類により異なるが、培地１ml
あたりのミクロキヤリヤ表面積がおよそ10cm2〜
100cm2となるような濃度範囲が好ましい。培地組
成，血清濃度等は、培養すべき細胞の種類、細胞
濃度等に応じて適当に選ばれる。 接種された細胞は、ミクロキヤリヤ表面に付着
し、増殖をはじめ、およそ数日間から10日間適当
な温度で培養を続けることにより、細胞がミクロ
キヤリヤ表面をほゞ完全に蓋いつくすまで増殖す
る。その間、必要に応じて、酸素の供給，PH調
整，栄養素の添加、培地交換等を行なう。 次にミクロキヤリヤ培養法で培養した細胞によ
るインターフエロン産生について詳しく説明す
る。 培養された細胞は、必要に応じて、インターフ
エロン誘発に先だち、インターフエロン産生を増
強せしめる目的で、低単位のインターフエロンを
含む培地でおよそ数時間ないしは１日間インキユ
ベートされる。 本発明方法においては、インターフエロン誘発
剤を添加する時期もしくはそれ以前に、細胞が付
着、増殖したミクロキヤリヤが懸濁している培地
中に負に荷電した水溶性高分子を添加することを
本質とする。 負に荷電した水溶性高分子としては、たとえ
ば、カルボキシメチルセルローズ（以下CMCと
略称する）、ポリアルギネート，ポリグルタメー
ト，ペクチン等のカルボキシル基を有する水溶性
高分子、リン酸セルローズ等のリン酸基を有する
水溶液高分子，デキストランサルフエート，ヘパ
リン等の硫酸基を有する水溶性高分子等が好まし
く用いられる。これら水溶性高分子の好適な濃度
および添加の時期は、用いる水溶性高分子の種類
により、異なるためそれぞれ適当な条件が選ばれ
る。たとえば、イオン強度の弱いカルボキシル基
を有するCMCの場合には、0.05％以上１％以
下、さらに好ましくは0.1％以上0.5以下の濃度に
相当する量を、インターフエロン誘発剤添加のお
よそ５時間以上、更に好ましくは、10時間以上前
に添加するのが好適であり、また、イオン強度の
強い硫酸基を有するデキストランサルフエートの
場合には、0.0001％以上0.01％以下の濃度に相当
する量をインターフエロン誘発剤の添加の直前も
しくはせいぜい１時間前に添加するのが好適であ
る。 水溶性高分子は、細胞が付着、増殖した後添加
する必要があり、インターフエロン誘発剤を添加
する時期より著るしく前の、細胞の増殖期に添加
することは好ましくない。例えば表―１に、仔牛
血清５％、各種濃度のCMC、および、ジエチル
アミノエチル化した架橋デキストランミクロキヤ
リヤ0.25％を含むイーグルMEM培地200mlにヒト
二倍体細胞２×107ケを接種し、温度37℃で撹拌
しながら７日間培養した場合の到達細胞数を示し
たが、この表から明らかなように、水溶性高分子
の細胞増殖期の添加は細胞の増殖を著るしく阻害
する。 表―１ CMC濃度％ 細胞数cells／ml ０ 6.8×105 0.0125 6.1×105 0.025 3.4×105 0.05 2.1×105 本発明方法を特に効果的に実施するためには、
インターフエロン誘発剤の添加に先だつて、前記
水溶性高分子を添加するのが良いが、イオン強度
の強いデキストランサルフエート等の場合はイン
ターフエロン誘発剤の添加と同時にもしくはそれ
に遅れて添加しても、かなりの効果があり、かか
る態様も本発明に包含される。 次に、いわゆるスーパーインダクシヨンもしく
はUV法でインターフエロン誘発処理を行なう。 すなわち、細胞が付着増殖したミクロキヤリヤ
を懸濁した培地中にインターフエロン誘発剤を添
加し、しかる後に、例えばスーパーインダクシヨ
ン法の場合は、シクロヘキシミド，アクチノマイ
シンＤ等の代謝阻害剤を適等な濃度、適当なタイ
ムスケジユールで添加し、適当な期間インキユベ
ートした後に、好ましくは、添加した前記の薬剤
等を含む古い培地を新しい培地と交換し、例えば
およそ１日の間インキユベートして培地中にイン
ターフエロンを産生せしめる。 細胞にインターフエロンを誘発させるインター
フエロン誘発剤としては種々のものが知られてい
るが、本発明方法にあつては、poly(I)：poly(C)，
poly(A)：poly（Ｕ）等の二重鎖RNA等を用いて
最も効果的に実施される。 インターフエロン誘発剤の好適な濃度は、細胞
の種類、インターフエロン誘発剤の種類等により
異なるが、例えば、インターフエロン誘発剤とし
てpoly(I)：poly(C)を用いる場合、ある種の細胞
（ヒト２倍体細胞）に対してはおよそ10μｇ／ml
の濃度で充分である。本発明方法においては、経
済的理由により、インターフエロン誘発剤、代謝
阻害剤等の使用量を削減する目的で、インターフ
エロン誘発処理に先立ち、ミクロキヤリヤ濃度す
なわち細胞密度をある程度高めることができる。 また本発明方法においては、細胞が付着、増殖
したミクロキヤリヤがインターフエロン誘発処理
に先立ち、ある必要な期間負に荷電した水溶性高
分子で処理されればその効果を発揮できる。した
がつてインターフエロン誘発処理中に、培地中に
前記水溶性高分子がインターフエロン誘発剤と共
存する必要性はない。また、培養、インターフエ
ロン誘発処理等いずれも、一般には撹拌下で実施
されるが、流動下であつてもよく、さらに、酸素
の供給等の問題がなければ静置下で実施されても
よい。 次に本発明の実施例について説明する。 実施例 １ 仔牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有す
る架橋デキストランミクロキヤリヤ0.25％を含む
イーグルMEM2にヒト正常二倍体細胞を105
ケ／mlの割合いで接種し、ガラス製スピナーフラ
スコでゆるく撹拌しながら37℃で７日間培養し
た。途中、２回培養培地を仔牛血清５％を含む新
しいイーグルMEM培地と交換した。到達細胞数
は1.05×106ケ／mlであつた。次に、細胞および
ミクロキヤリヤを含む培地100mlづつを10本の小
型スピナーフラスコに分注した。細胞およびミク
ロキヤリヤを沈降させ上澄培地を捨て、インター
フエロン100国際単位／mlおよび仔牛血清２％を
含む培地を捨てた培地量に等しい量加え、さら
に、一部のスピナーフラスコには、それぞれ定め
られた濃度のCMCを添加し、37℃でおよそ20時
間インキユベートした。 次に、10μｇ／mlのシクロヘキシミドおよびそ
れぞれ定められた濃度のpoly(I)：poly(C)を加え、
37℃で４時間インキユベートし、更に４μｇ／ml
のアクチノマイシンＤを加え、37℃で１時間イン
キユベートした後、細胞およびミクロキヤリヤを
沈降させ、上澄液を捨て、イーグルMEM培地を
捨てた量と同量加え、更に、この操作をもう１回
繰り返えした。最終的に加えた培地中に0.05％の
メチルセルロースを添加し37℃で、約20時間イン
キユベートした。最終的に用いた培地中に産生さ
れたインターフエロンの量をFL細胞およびヴエ
スキユラー・ストマテイテイス・ウイルスを用い
たCPE Inhibition法で測定し、国際単位に換算し
た。結果を図１および図２に示す。 実施例 ２ 仔牛血清５％ジエチルアミノエチル基を有する
架橋デキストランミクロキヤリヤ0.25％を含むイ
ーグルMEM2にヒト正常２倍体細胞を1.5×105
ケ／mlの割合で接種し、グラス製スピナーフラス
コでゆるく撹拌しながら、37℃で４日間培養し
た。途中１回培養培地を仔牛血清５％を含む新し
いイーグルMEM培地と交換した。到達細胞数は
6.8×105ケ／mlであつた。次に細胞およびミクロ
キヤリヤを沈降させ上澄培地を捨て、インターフ
エロン100国際単位／mlおよび仔牛血清２％を含
む培地を捨てた量と等量加え、37℃でおよそ20時
間インキユベートした。次に細胞およびミクロキ
ヤリヤを含む培地200mlづつを６本の小型スピナ
ーフラスコに分注し、さらに一部のフラスコには
それぞれ定められた濃度のデキストランサルフエ
ートを加え、37℃で１時間インキユベートした。 次に、細胞およびミクロキヤリヤを沈降させ、
上澄培地を捨て、２％仔牛血清を含むイーグル
MEM培地を捨てた量と等量加え、さらにそれぞ
れ定められた量のpoly(I)：poly(C)よび10μｇ／ml
のシクロヘキシミドを加え、37℃で４時間インキ
ユベートした後、以下実施例１と同様の方法でイ
ンターフエロンを産生させた。産生されたインタ
ーフエロンの量をヴエスキユラー・ストマテイテ
イス・ウイルスを用いてウイルス核酸合成半減法
により測定し、国際単位に換算した。 結果を表―２に示す。 【表】
図１および図２は実施例１の結果を示すもので
ある。図１はカルボキシ メチルセルローズ添加
濃度が0.25％の場合（〇印）と０％の場合（△
印）のpoly(I)：poly(C)添加濃度に対するインター
フエロン産生量を示すもので、横軸がpoly(I)：
poly(C)濃度（μｇ／ml）、縦軸がインターフエロ
ン力価（国際単位／ml）を示す。図２はpoly(I)：
poly(C)添加濃度が10μｇ／mlの場合のカルボキシ
メチルセルローズ添加濃度に対するインターフ
エロン産生量を示すもので、横軸がカルボキシ
メチルセルローズ添加濃度（％）、縦軸がインタ
ーフエロン力価（国際単位／ml）を示す。
ある。図１はカルボキシ メチルセルローズ添加
濃度が0.25％の場合（〇印）と０％の場合（△
印）のpoly(I)：poly(C)添加濃度に対するインター
フエロン産生量を示すもので、横軸がpoly(I)：
poly(C)濃度（μｇ／ml）、縦軸がインターフエロ
ン力価（国際単位／ml）を示す。図２はpoly(I)：
poly(C)添加濃度が10μｇ／mlの場合のカルボキシ
メチルセルローズ添加濃度に対するインターフ
エロン産生量を示すもので、横軸がカルボキシ
メチルセルローズ添加濃度（％）、縦軸がインタ
ーフエロン力価（国際単位／ml）を示す。
Claims (1)
- １ 正に荷電した化学的残基を有するミクロキヤ
リヤ上に増殖した動物細胞をインターフエロン誘
発剤にて処理するに際し、細胞が付着、増殖した
ミクロキヤリヤを、負に荷電した水溶性高分子を
含む溶液により処理することを特徴とするインタ
ーフエロン産生方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7086280A JPS56167624A (en) | 1980-05-29 | 1980-05-29 | Method of interferon production |
| US06/265,369 US4433052A (en) | 1980-05-29 | 1981-05-20 | Process for producing interferon |
| EP81302263A EP0041344B1 (en) | 1980-05-29 | 1981-05-21 | Process for producing interferon |
| DE8181302263T DE3163366D1 (en) | 1980-05-29 | 1981-05-21 | Process for producing interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7086280A JPS56167624A (en) | 1980-05-29 | 1980-05-29 | Method of interferon production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56167624A JPS56167624A (en) | 1981-12-23 |
| JPS624117B2 true JPS624117B2 (ja) | 1987-01-28 |
Family
ID=13443790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7086280A Granted JPS56167624A (en) | 1980-05-29 | 1980-05-29 | Method of interferon production |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4433052A (ja) |
| EP (1) | EP0041344B1 (ja) |
| JP (1) | JPS56167624A (ja) |
| DE (1) | DE3163366D1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0041313B1 (en) | 1980-04-03 | 1990-09-12 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon |
| US4614651A (en) * | 1981-07-12 | 1986-09-30 | Damon Biotech, Inc. | Interferon epsilon |
| EP0097907A3 (en) * | 1982-06-25 | 1985-01-09 | Flow General, Inc. | Cell culture microcarriers |
| DK319883A (da) * | 1982-07-12 | 1984-01-13 | Damon Biotech Inc | Interferonpraeparat |
| SE9700983D0 (sv) * | 1997-03-18 | 1997-03-18 | Ascendia Ab | Stimulering, odling och preservation av pankreas- och andra celler |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3773924A (en) * | 1970-12-24 | 1973-11-20 | M Ho | Interferon production |
| US4007086A (en) * | 1975-01-23 | 1977-02-08 | The Upjohn Company | Interferon induction |
| GB1525022A (en) * | 1975-05-21 | 1978-09-20 | Beecham Group Ltd | Cell culture method |
| US4036693A (en) * | 1976-02-02 | 1977-07-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Treatment of cell culture microcarries |
| US4189534A (en) * | 1976-11-11 | 1980-02-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell culture microcarriers |
| EP0005476B1 (de) * | 1978-05-17 | 1981-12-30 | Dr. Karl Thomae GmbH | Verfahren zur Herstellung von Humaninterferon |
-
1980
- 1980-05-29 JP JP7086280A patent/JPS56167624A/ja active Granted
-
1981
- 1981-05-20 US US06/265,369 patent/US4433052A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-05-21 DE DE8181302263T patent/DE3163366D1/de not_active Expired
- 1981-05-21 EP EP81302263A patent/EP0041344B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3163366D1 (en) | 1984-06-07 |
| JPS56167624A (en) | 1981-12-23 |
| EP0041344A2 (en) | 1981-12-09 |
| EP0041344B1 (en) | 1984-05-02 |
| US4433052A (en) | 1984-02-21 |
| EP0041344A3 (en) | 1981-12-16 |
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