JPS6250120B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、魚肉や畜肉等の鮮度の低下に伴い生
成するイノシンとヒポキサンチンを簡易かつ迅速
に測定する方法、およびこの方法に使用する試験
紙に関するものである。 近年、生鮮食品の流通において、特に魚肉等の
鮮度を科学的に判定することが品質管理および価
格の適正化の観点から重要な問題となつてきてい
る。 従来から魚肉等の鮮度を判定する指標として、
魚肉中のトリメチルアミン、PH、揮発性塩基性窒
素等を測定することが提案されてきたが、いわゆ
る“生きの良さ”を知るうえでは必ずしも満足す
べき指標とは言えない。 魚肉等の生きの良さを判定するためのより一層
有効な指標としては、動物のエネルギー源である
アデノシン三リン酸（ATP）の分解生成物の消
長を調べることが知られている。アデノシン三リ
ン酸は次のように分解し、鮮度の低下に伴いイノ
シンやヒポキサンチンが生成し、魚肉中に蓄積す
る。 アデノシン三リン酸（ATP）→アデノシン二
リン酸（ADP）→アデノシン一リン酸（AMP）
→イノシン酸（IMP）→イノシン（HxR）→ヒポ
キサンチン（Hx）従つて鮮度を判定するうえ
で、魚肉中のイノシン（以下HxRと略記する）
とヒポキサンチン（以下Hxと略記する）を定量
することが重要となる。 HxRとHxの簡易定量法の１つとして、本題と
同一出願人により酵素を用いる次のような方法が
提案されており、既に特許出願されている。特願
昭57−225491）。すなわちこの先願発明は、ヌク
レオシドホスホリラーゼとキサンチンオキシダー
ゼとテトラゾリウム塩と脱酸素剤とをHxRおよ
び／またはHxを含む試料液に作用させて、生成
するホルマザン色素の濃淡から試料液中のHxR
および／またはHx濃度を測定することを特徴と
するものである。 この先願発明で使用するヌクレオシドホスホリ
ラーゼは酵素分類表２・４・２・１の酵素であ
り、HxRをHxに加リン酸分解する。一方、キサ
ンチンオキシダーゼは酵素分類表１・２・３・２
の酵素であり、Hxを酸化して尿酸に分解する。
これら２種の酵素を併用する理由は次の通りであ
る。すなわち魚種によつてはATPをHxまで分解
するものとHxRまでしか分解しないものとがあ
り、キサンチンオキシダーゼのみを使用した場合
にはHxRには作用せず従つてHxR量は測定でき
ないが、ヌクレオシドホスホリラーゼを併用すれ
ばHxRはHxに分解されるから、この分解により
生成されたHxと試料中に本来含有されていたHx
との合計量がキサンチンオキシダーゼによる酸化
分解を受けて尿酸とされるのである。上述のごと
き酸素反応系に酸化還元色素であるテトラゾリウ
ム塩を存在させてあるから、キサンチンオキシダ
ーゼがHxを尿酸に酸化する際に同時にテトラゾ
リウム塩を環元してホルマザン色素を生成する。
ホルマザン色素の生成量は反応系中に存在する
Hx量によつて変化し、Hx量が多ければホルマザ
ン色素の生成量も増加して濃色に発色し、Hx量
が少なければホルマザン色素の生成量も減少して
発色は淡くなる。従つてホルマザン色素の濃淡を
測定すれば、これから反応系中のHx量を求める
ことができるのである。このときの反応系中の
Hx量は試料液中のHxRとHxの合計量に相当す
る。 この先願発明においては、テトラゾリウム塩と
してネオテトラゾリウムクロライドやトリフエニ
ルテトラゾリウムクロライドを使用するが、これ
らのテトラゾリウム塩の還元によるホルマザン色
素の生成反応は、反応系に酸素が存在すると効果
的に進行しないため、この測定方法を大気下で行
なえるようにするには反応系に亜硫酸ナトリウム
等の脱酸素剤を存在させておく必要がある。 しかしながら、上記先願発明の方法をより一層
簡便・迅速に実施するために、濾紙等の固定化材
に予め酵素とテトラゾリウム塩と脱酸素剤とを吸
収せしめた試験紙を用いる場合には、２種類の酵
素とテトラゾリウム塩とを吸収させた酵素−色素
紙と、脱酸素剤を吸収させた脱酸素紙とを各々別
個に作製しなければならない。同一の固定材に吸
収させると、試験紙の作製中および保存中に脱酸
素剤による酵素の失活が起るからである。また、
試験紙を使用するに際しては、酵素−色素紙と脱
酸素紙とを重ね合せ、魚肉等をホモジナイズした
試料液を必ず試験紙の脱酸素紙側から接触させた
のち酵素−色素紙側の発色の濃淡を伴定する必要
がある。酵素−色素紙側から接触させると、脱酸
素状態でのテトラゾリウム塩の還元によるホルマ
ザン色素の生成反応が確実になされないからであ
る 上述したように先願発明の方法においては、特
に試験紙を用いて実施する場合に、脱酸素剤の使
用が不可欠であるがための試験紙作製上あるいは
使用上の繁雑さがあつた。 そこで本発明は、上述の先願発明において不可
欠であつた脱酸素剤を使用しなくとも、テトラゾ
リウム塩の還元およびホルマザン色素の生成反応
が確実かつ効果的になされるように改良された
HxRおよびHxの測定方法と測定用試験紙を提供
することを目的としてなされたものである。 本発明者等は、テトラゾリウム塩のなかで特に
ヨードニトロテトラゾリウムクロライド（正式
名：２−ｐ−ヨードフエニル−３−ｐ−ニトロフ
エニル−５−フエニル−2H−テトラゾリウムク
ロライド）およびニトロブル−テトラゾリウムク
ロライド（正式名：３・3′−（３・3′−ジメトキ
シ−４・4′−ビフエニリレン）−ビス（２−（ｐ−
ニトルフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウムクロライド））を用いた場合には、酸素が
存在する状態でも還元されてホルマザン色素を解
実に生成することを見出し、本発明を完成させた
のである。 すなわち本発明は、ヌクレオシドホスホリラー
ゼとキサンチンオキシダーゼとヨードニトロテト
ラゾリウムクロライドまたはニトロブルーテトラ
ゾリウムクロライドから選ばれテトラゾリウム塩
とをHxRおよび／またはHxを含む試料液に作用
させて、生成するホルマザン色素の濃淡から試料
中のHxRおよび／またはHx濃度を測定すること
を特徴とするHxRおよび／またはHxの測定方法
である。これによつて、脱酸素剤を用いずとも酸
素の存在下でHxRおよびHxの測定を効果的に行
なうことができる。 本発明を実施するに際しては、先ず上記した２
種類の酵素とテトラゾリウム塩とを溶解せしめた
溶液を調製する。なお、溶液中での酵素の活性を
安定に保つため、PH7.5〜８のリン酸緩衝液を溶
液中に添加することが望ましい。次いで、魚肉等
をホモジナイズした試料液を前記の溶液と接触せ
しめて数分間放置する。この間、酵素による試料
液中のHxRのHxへの分解、Hxの尿酸への酸化、
これに伴うテトラゾリウム塩の還元が起り、可視
部に吸収をもつホルマザン色素が生成するのは上
述した先願発明と同じである。なお、上記の発色
反応は必要に応じて真空状態のものでも行なわせ
ることができるのは勿論である。 生成したホルマザン色素の濃淡を肉眼的に観察
することも可能であるが、より精度よく測定する
には、酢酸エチル等の抽出溶媒を用いて反応液中
の不溶性ホルマザン色素を抽出し、この抽出液の
可視部吸収を測定することによつて発色の濃淡を
伴定することが望ましい。 本発明はまた、先願発明と同様に、酵素とテト
ラゾリウム塩とを予め吸収せしめた試験紙を用い
ることによつて、より一層簡便、迅速に実施する
ことができる。。すなわち、２種類の酵素とテト
ラゾリウム塩とを水溶液にして濾紙等に吸収させ
たのち、酵素の失活を防ぐため凍結真空乾燥機を
用いて乾燥し試験紙を作製する。なおこの場合に
も、酵素の活性を安定に保つためリン酸緩衝液を
用いたり、さらには酵素の失活を防ぐために酸化
防止剤および安定剤を水溶液中に添加しておくこ
とが望ましい。 かくして得られた試験紙を使用するに際して
は、魚肉等をホモジナイズした試料液を試験紙に
接触させて５〜10分間放置後、試験紙の発色の濃
淡を判定する。試験紙上の発色の濃淡は色票など
を用いて肉眼的に容易に判定することができ、色
票の読みとHxR、Hxの濃度との関係を予め求め
ておけば、色票の読みから試料液中のHxR、Hx
濃度を定量することができる。 試験紙作製用の固定化材としては濾紙以外にも
ゼラチンやコラーゲン等を必要に応じて使用する
ことができる。 以上の説明からわかるように本発明方法によれ
ば、テトラゾリウム塩として酸素存在下でも還元
されてホルマザン色素を生成しうるヨードニトロ
テトラゾリウムクロライドまたはニトロブル−テ
トラゾリウムクロライドを用いたから、脱酸素剤
を使用せずともHxRおよびHxの測定を効果的に
行なうことができる。特に試験紙を用いて本発明
を実施するに際しては、脱酸素剤を用いる先願発
明の場合のように酵素−色素紙と脱酸素紙とを別
個に作製する必要やこれらを重ね合せて脱酸素紙
側から試料を接触させたりする必要がなく、酵素
とテトラゾリウム塩とを同一の固定化材に吸収さ
せた単一の試験紙を作製し使用すればよいという
利点がある。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明す
る。 実施例 １ 10ｍＭヨードニトロテトラゾリウムクロライド
0.1ml、キサンチンオキシダーゼ0.1酵素単位、ヌ
クレオシドホスホリラーゼ0.4酵素単位を混合
し、さらにPH7.8のリン酸緩衝液で一定量とし
た。この混合溶液中のHxRまたはHx濃度がそれ
ぞれ２、５、10、20、40、60μＭ程度となるよう
に基質溶液を添加して放置し、上記テトラゾリウ
ム塩の還元により生成する発色不溶性ホルマザン
を生成させた。次いでこの溶液に同量の酢酸エチ
ルを加えて振とうし、発色不溶性ホルマザンを酢
酸エチル相に抽出させ、この抽出液の吸光度を
505nｍの波長で測定した。Hx濃度と吸光度との
関係を第１図に、HxR濃度と吸光度との関係を
第２図に示す。 第１図および第２図のグラフからわかるよう
に、本発明の測定方法によつてHxRまたはHxを
可視部の発色で、しかも大気下で精度よく定量す
ることが可能である。 実施例 ２ 10ｍＭニトロブルーテトラゾリウムクロライド
0.1ml、キサンチンオキシダーゼ0.1酵素単位、ヌ
クレオシドホスホリラーゼ0.4酵素単位を混合
し、さらにPH7.8のリン酸緩衝液で一定量とし
た。この混合溶液中のHxRまたはHx濃度がそれ
ぞれ２、５、10、20、40、60μＭ程度となるよう
に基質溶液を添加して放置し、上記テトラゾリウ
ム塩の還元により生成する発色不溶性ホルマザン
を生成させた。次いでこの溶液に同量の酢酸エチ
ルを加えて振とうし、発色不溶性ホルマザンを酢
酸エチル相に抽出させ、この抽出液の吸光度を
550nｍの波長で測定した。HxR濃度と吸光度と
の関係を第３図に、Hx濃度と吸光度との関係を
第４図に示す。 第３図および第４図のグラフからわかるよう
に、本発明の測定方法によつてHxRまたはHxを
可視部の発色で、しかも大気下で精度よく定量す
ることが可能である。 実施例 ３ PH7.8のリン酸緩衝液５ml、ヨードニトロテト
ラゾリウムクロライド0.1ｍmoles、キサンチンオ
キシダーゼ10酵素単位、ヌクレオシドホスホリラ
ーゼ20酵素単位、シヨ糖（安定剤）１ｇ、１％メ
ルカプトエタノール（酸化防止剤）0.2mlに水を
加えて15mlとし酵素−色素溶液を調製した。この
溶液をクロマト用濾紙に吸収させたのち、凍結真
空乾燥して本発明の試験紙を作製した。 HxRまたはHx濃度がそれぞれ0.02、0.05、
0.10、0.15、0.20、0.30、0.40ｍＭとなるように
調製した基質溶液を本発明試験紙に滴下し、５〜
10分後に試験紙の発色の濃淡を色票（JIS Ｚ−
8721）を用いて測定した。結果を第１表に示す。 第１表からわかるように、本発明試験紙によれ
ばHxRまたはHx濃度を試験紙の発色（可視部の
赤紫色）の濃淡によつて測定することができる。

【表】 実施例 ４ 鯉を即殺後氷冷保存し、一定時間経過する毎に
試料を採取し、この試料の９倍量の水を加えてホ
モジナイズして試料液を調製した。この試料液を
実施例３で作製した本発明試験紙に滴下し、実施
例３と同様にして試験紙の発色の濃淡を色票を用
いて測定し、色票の読みから試料液中のHxRと
Hxの合計量濃度を求めた。結果を第２表に示
す。 上記の本発明試験紙を用いた測定と並行して、
従来のカラム法を用いてHxRとHxの濃度を測定
した。このカラム法による測定においては、上記
で調製した試料液を過塩素酸処理して除タンパク
したのち、イオン交換樹脂（強塩基性陰イオン交
換樹脂）を充填したカラムで分離分画後、紫外部
の吸光度を測定することによつて試料液中の
HxRとHxの合計量濃度を求めた。結果を第２表
に併記する。

【表】 第２表からわかるように、本発明試験紙を用い
る方法はカラム法よりも精度は劣るが、現場にお
いてきわめて簡易にしかも迅速に行なえるため、
流通過程における魚肉の鮮度の良否判定に有効に
利用できるものである。 実施例 ５ 小売店にて販売されているサンマ、マイワシ、
マサバ、サケ、マグロおよびハマチの生身６種類
14検体の試料（試料番号No.1〜No.14）から筋肉
部を採取し、実施例４と同様にしてそれぞれの試
料液を調製した。 これらの試料液中のHxRとHxの合計濃度を、
実施例３で得た本発明試験紙による方法と従来の
カラム法を用いて実施例４と同様にして測定し
た。 さらに、本発明試験紙法と従来のカラム法を用
いてＫ値（鮮度恒数）を求めた。Ｋ値は特に魚類
の生鮮度判定の尺度となるもので、総ATP関連
化合物（ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx）
全量に対するHxR＋Hx量の百分率であり、次式
によつて算出される： Ｋ（％） ＝ＨｘＲ＋Ｈｘ／ＡＴＰ＋ＡＤＰ＋ＡＭＰ＋ＩＭＰ＋
ＨｘＲ＋Ｈｘ×100 なお、カラム法によるＫ値は、個々に総ATP
関連化合物濃度を測定して算出したが、本発明試
験紙法によるＫ値の算出は、本実施例で用いた以
外の魚種毎の試料について予め総ATP関連化合
物濃度を測定し、この平均値を上式の分母として
用いた。 結果を第３表に示す。これらの結果からわかる
ように、本発明試験紙法による数値はカラム法に
よる数値と実質的に一致しており、このことか
ら、本発明試験紙法によつて魚肉のHxRとHxの
合計濃度およびＫ値をきわめて簡便、迅速に測定
できることがわかる。

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は、ヨードニトロテトラゾリウムクロラ
イドを用いて本発明方法により反応液中に生成し
た発色不溶性ホルマザン色素を酢酸エチルで抽出
した抽出液の波長505nｍにおける吸光度とHx濃
度との関係を示すグラフであり、第２図は第１図
におけると同様にして測定した吸光度とHxR濃
度との関係を示すグラフである。第３図は、ニト
ロブルーテトラゾリウムクロライドを用いて第１
図と同様にして抽出し抽出液の波長550nｍにお
ける吸光度とHxR濃度との関係を示すグラフで
あり、第４図は第３図におけると同様にして測定
した吸光度とHx濃度との関係を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヌクレオシドホスホリラーゼとキサンチンオ
   キシダーゼとヨードニトロテトラゾリウムクロラ
   イドまたはニトロブル−テトラゾリウムクロライ
   ドから選ばれたテトラゾリウム塩とをイノシンお
   よび／またはヒポキサンチンを含む試料液に作用
   させて、生成するホルマザン色素の発色の濃淡か
   ら前記試料液中のイノシンおよび／またはヒポキ
   サンチン濃度を測定することを特徴とするイノシ
   ンおよび／またはヒポキサンチンの測定方法。 ２ ヌクレオシドホスホリラーゼとキサンチンオ
   キシダーゼと前記テトラゾリウム塩とを含む溶液
   を前記試料液と接触させ、生成するホルマザン色
   素の発色の濃淡を吸光度によつて測定する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ ヌクレオシドホスホリラーゼとキサンチンオ
   キシダーゼと前記テトラゾリウム塩とを固定化材
   に保持せしめて酵素−色素固定化物を作製し、こ
   の酸素−色素固定化物に前記試料液を浸したの
   ち、この酵素−色素固定化物に生成するホルマザ
   ン色素の発色の濃淡を肉眼的に測定する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ４ ヌクレオシドホスホリラーゼとキサンチンオ
   キシダーゼとヨードニトロテトラゾリウムクロラ
   イドまたはニトロブルーテトラゾリウムクロライ
   ドから選ばれたテトラゾリウム塩とを固定化材に
   保持せしめた酵素−色素固定化物からなることを
   特徴とするイノシンおよび／またはヒポキサンチ
   ン測定用試験紙。