JPS6251114B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6251114B2 JPS6251114B2 JP54060251A JP6025179A JPS6251114B2 JP S6251114 B2 JPS6251114 B2 JP S6251114B2 JP 54060251 A JP54060251 A JP 54060251A JP 6025179 A JP6025179 A JP 6025179A JP S6251114 B2 JPS6251114 B2 JP S6251114B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- interferon
- stimulant
- liter
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
ヒト由来の細胞よりのヒトインターフエロンの
生産は世界的な注目を集めて来た。それは、イン
ターフエロンが、癌の治療に関連して、急性およ
び慢性の感染の治療上の可能性を有しているから
である。組織培養細胞よりの従来法による誘導で
は低濃度のインターフエロンしか生成しないの
で、現在の所、確立された方法によつては、所要
量のインターフエロンは提供されえない。 すでに報告されている方法によるインターフエ
ロンの生産は、ふつうヒト細胞の培養培地に、イ
ンターフエロンの誘導因子（inducer）たとへ
ば、ウイルス性の誘導因子または核酸系の誘導因
子を加えて行なわれている。この誘導時間のあと
で、インターフエロン含有細胞上清より、細胞を
取除き、残存誘導因子は鉱酸を加え数日間処理し
て不活化する。このように得られた粗インターフ
エロンは、その後、既知の方法で濃縮精製しう
る。たとへばDE−OS2724918参照。 インターフエロンの誘導にふつうに用いられて
いるヒトの細胞は、ナマルワ（Nomalwa）細胞
のような淋巴芽由来の永久セルライン（G.Klein
等：Intern.J.Cancer 10、44−57、1972参照）
であるか、ヒトの繊維芽細胞でこの場合、限定さ
れた寿命を有するジプロイドかまたは無限に分裂
可能のヘテロプロイドである。 誘導に用いるウイルスは、ふつう凝血性ウイル
スJapan（HVJ＝センダイウイルス）のようなパ
ラミキソウイルスまたはニユーカツスル病ウイル
ス；レオグループ（Reogroup）ウイルスたとへ
ばレオウイルスまたはブルータング（blue
tongue）ウイルスである。核酸系の誘導因子
は、ふつう、２重らせんリボ核酸たとへばポリ
（Ｉ：Ｃ）で、単独かまたは代謝阻害剤および
（または）ポリカチオンと組合わせて使用する。 驚くべきことに、本発明によれば、或る群のい
わゆる“刺激物質”または刺激物質の混合物を細
胞培地に添加すると、刺激物質にさらさない培養
物に比して、多数倍（４から60倍）のインターフ
エロンを生産することを見出だしたのである。刺
激物質の添加は、なるべくは、インターフエロン
誘導因子でインターフエロンを誘導するより前と
する。本発明に準ずるインターフエロンの増加
は、インターフエロン生成細胞の百分率の増加お
よび細胞１個についてのインターフエロンの収量
の増加にもとづく。 刺激物質には、細胞培養物に添加した際に、イ
ンターフエロン生成細胞の割合を増加させる物質
が含まれる。これらの刺激物質は、至適の栄養条
件とした培地により培養されている細胞培地に添
加した場合に、発育の対数期から休止期に超越さ
す物質として定義される。この休止期は、細胞の
DNA（デオキシリボ核酸）含量に関していえ
ば、DNA合成のない、有糸分裂のあとの段階
（細胞サイクルのGl相類似の段階）となる。 本発明により刺激物質として特に有用であるこ
との分つた物質は、４から８炭素原子数のＮ・
N′−ジアセチル化ジアミン、特に、ペンタ・メ
チレンビスアセトアミド、ヘキサメチレンビスア
セトアミドまたはヘプタメチレンビスアセトアミ
ドのようなα・ω−誘導体、スルホキサイドのよ
うな有機イオウ化合物たとへばジメチルスルホキ
サイド、または、11β−位置が、フツ素、塩素ま
たは臭素原子、またはヒドロキシ基またはヒドロ
キシメチル基で置換されているグルココルチコイ
ド、たとへば、ハイドロコーチゾン、デクサメサ
ゾン（dexamethazone）、プレドニソロン
（prednisolone）、アルドステロン、トリアムシノ
ロン（triamcinolone）、コルテクソロン
（cortexolone）、またはそれらの混合物、あるい
は前記刺激物質と飽和脂肪族カルボン酸またはそ
の塩との混合物である。これらの刺激物質の最終
濃度は0.01マイクロモル／リツトルから300ミリ
モル／リツトルまでとする。しかし、刺激物質と
して用いる場合の最終濃度はジアセチレート化ジ
アミンでは１から10ミリモル／リツトル、ジメチ
ルスルホキサイドのような有機イオウ化合物では
50から300ミリモル／リツトル、グルココルチコ
イドでは0.01から10マイクロモル／リツトルとす
る。 特に強力であることの分つた刺激物質は、ヘキ
サメチレンビスアセトアミド、ジメチルスルホキ
サイド、トリアムシノロン、ハイドロコーチおよ
びプレドニソロンである。 本発明によれば有利な方法はつぎのようであ
る。 Namalwa細胞を、発育培地、有利には培地
RPMI1640（Gibco社、アメリカ合衆国または
Flow社、アメリカ合衆国、GB）である。この培
地は、トリプト−スホスフエートブロス（10から
20容量％、しかし、有利には20容量％）、部分的
に精製されたヒト血清（１から20容量％、しか
し、有利には２から６容量％）を含有する。別様
にはヒト血清に代えて、他の種の血清または血清
分画たとへば牛胎児血清を５から15容量％に使用
しうる。 懸濁液中の細胞増殖を0.2から５×106細胞／
c.c.、なるべくは0.5から１×106細胞／c.c.の密度に
維持するこのような培地に、刺激物質をなるべく
は１ミリモル／ミリリツトルの濃度に加える。細
胞は、これらの条件で35から37度Ｃの有利の温度
に６から72時間インキユベートする。24から48時
間が有利である。この刺激期間のあと、なるべく
は遠心して細胞を採取し、刺激物質を添加するか
添加しないままで約50×106細胞／ミリリツトル
培地に再懸濁させる。この懸濁液にインターフエ
ロン誘導物質たとへばHVJ（センダイウイルス）
を加え、約１から３時間インキユベートする。こ
のように処理された細胞は遠心して集め、血清不
含細胞培養培地（Gibco社、アメリカ合衆国また
は、Flow社、アメリカ合衆国、GB）、たとへば
Eagle′s Minimal essential培地に再懸濁させ、
35から39度Ｃで、6.7から8.0なるべくは7.3のPH
で、15から24時間、なるべくは18から20時間、刺
激物質を存在さすか存在させないで培養する。粗
淋巴芽インターフエロンを含有するこのように得
られた懸濁液は、細胞および細胞残渣より分離す
る。残存する誘導ウイルスを不活化するために、
上清には塩酸のような鉱酸を加えて、０から４度
Ｃで３から５日培養する。 粗ヒト淋巴芽インターフエロンをさらに精製
し、濃縮しそして安定化するには、つぎの精製段
階を適用しうる。 (a) 得られた溶液はたとへば水酸化ナトリウムで
中和し、酢酸亜鉛のような亜鉛塩を加えて溶液
よりインターフエロンを沈殿させ、遠心により
塊状とする。得られた塊状物は、0.1規定塩酸
のような冷希塩酸中で可溶化する。 (b) 溶液は遠心し清澄としイオン交換体なるべく
はSP−Sephadex Ｃ−25（Pharmacia Fine
Chemicals Uppsala、Sweden）と混合し、数
時間機械的にかくはんする。 イオン交換体にインターフエロンが吸着した
あと、残存する亜鉛は緩衝溶液で反復洗浄で除
去する。たとへば、PH2.5の0.1モル／リツトル
のグリシン／塩酸塩緩衝液で３度洗い、つい
で、0.1モル／リツトルのくえん酸カリウムお
よび0.005モル／リツトルのエチレンジアミン
テトラ酢酸ジナトリウムを含有するPH＝4.0の
緩衝液で３度洗う。 洗浄操作のあと、吸着されているインターフ
エロンをあわせたイオン交換体は、くえん酸緩
衝液中に懸濁させてクロマトグラフカラムに移
す。インターフエロンは中程度に塩基性の緩衝
液でイオン交換体より溶出する。たとへば、１
モル／リツトルの塩化カリウムを含有する0.1
モル／リツトルのりん酸カリウム（PH＝8.0）
を使用する。 (c) 溶出液の蛋白質を含有する分画は、低温で捕
集し、PH3.5に調整する。遠心して澄明化して
から、チオシアン酸カリウム溶液を添加して澄
明上清よりインターフエロンを沈殿させる。沈
殿した蛋白質は放置して沈殿させ、遠心して集
め、小容量の中程度に塩基性の緩衝液たとへば
0.1モル／リツトルのPH８のりん酸カリウムに
溶解し、超遠心する。 (d) 上清はカラムクロマトグラフイーで精製す
る。なるべくは、40から120マイクロメーター
の粒子の大きさのSephadex Ｇ−100
（Pharmacia Fine Chemi cals、Uppsala、
Sweden）を用い0.001モル／リツトルのジナト
リウムエチレンジアミンテトラアセテートを含
有する、りん酸塩緩衝生理食塩水で溶出する。
インターフエロンの溶液を施すより前に、カラ
ムは、ふつう、既知の分子量の蛋白質で標準化
しておく。10000から35000ダルトンの範囲の分
子量の蛋白質に相当する溶出液を集める。 (e) 集めた分画は、塩酸でなるべくはPH３とし、
0.1モル／リツトルのPH＝３のくえん酸カリウ
ムであらかじめ洗つてある、SP−Sephadexの
イオン交換体（段階ｂをみよ）を含有する小さ
いカラムに施す。 このPHでインターフエロンはイオン交換体に
吸着されるので、くえん酸塩緩衝液で洗つたあ
と、りん酸塩緩衝液たとへば0.1モル／リツト
ルのPH＝８のりん酸塩緩衝液で溶出しうる。蛋
白質を含有する分画をプールし、りん酸塩緩衝
生理食塩水に対し透析する。 つぎの実施例は、本発明を説明するためのもの
で、本発明の範囲を限定するものでない。 予備調製 Namalwaの細胞は、発酵容器中で懸濁培養に
より増殖させる。培地は、20容量％のトリプトー
スホスフエートブロスおよび２から４容量％の分
画ヒト血清を加えたRPMI1640培地を含有する。
ヒト血清を分画するには、血清蛋白質を６％ポリ
エチレングリコール6000で部分沈殿させる。
（Inglot等、Acta Virol.19、250−254、1975）を
みよ。細胞は２から７×106細胞／ミリリツトル
まで増殖する。 センダイウイルス（HVJ）は、鶏胚に増殖さ
せ、高速遠心で精製する。センダイウイルスは超
音波処理により細胞培養物中に懸濁させマイナス
70度Ｃに保存する。 例 １ 対数増殖期にあるNamalwa細胞を、５×105細
胞／ミリリツトルの密度に発育培地中に懸濁させ
る。この細胞懸濁液に、刺激物質を添加し、Ｃミ
リモル／リツトル濃度としてｔ時間37度Ｃで処理
する。刺激物質で処理しているあいだに、細胞
DNA合成の速度は、対照培養物（刺激物質はな
い）の２％より低くなる。細胞は休止状態とな
り、これは細胞サイクルのGl相に相当する。こ
の処理のあと細胞は遠心（700×ｇ、15分）して
集め、210凝血単位／ミリリツトルHVJとあわせ
て、1.7リツトルの発育培地中５×107細胞／ミリ
リツトルとして、ローラーびん中で、37度Ｃでさ
らに２時間インキユベートする。このようにして
誘導処理された細胞は遠心して集め、17リツトル
の血清不含Eagle′s Minimum essential培地
（Earleの塩類を使用する）中に５×106細胞／ミ
リリツトルの密度でPH7.3で35.5度Ｃで30時間さ
らにインキユベートする。この段階では、機械か
くはん装置により20リツトルのびんを用いる。細
胞性材料を2000×ｇで30分遠心して塊状とし、粗
溶液（細胞上清）を、10度Ｃより低い温度で５規
定塩酸でPH２とし、３から５日間４度Ｃに貯蔵
し、インターフエロンの誘導に用いたHVJを不活
性化する。 つぎの表はｎ−らく酸をＣミリモル／リツトル
に加えた時のインターフエロンの増加を示す。
生産は世界的な注目を集めて来た。それは、イン
ターフエロンが、癌の治療に関連して、急性およ
び慢性の感染の治療上の可能性を有しているから
である。組織培養細胞よりの従来法による誘導で
は低濃度のインターフエロンしか生成しないの
で、現在の所、確立された方法によつては、所要
量のインターフエロンは提供されえない。 すでに報告されている方法によるインターフエ
ロンの生産は、ふつうヒト細胞の培養培地に、イ
ンターフエロンの誘導因子（inducer）たとへ
ば、ウイルス性の誘導因子または核酸系の誘導因
子を加えて行なわれている。この誘導時間のあと
で、インターフエロン含有細胞上清より、細胞を
取除き、残存誘導因子は鉱酸を加え数日間処理し
て不活化する。このように得られた粗インターフ
エロンは、その後、既知の方法で濃縮精製しう
る。たとへばDE−OS2724918参照。 インターフエロンの誘導にふつうに用いられて
いるヒトの細胞は、ナマルワ（Nomalwa）細胞
のような淋巴芽由来の永久セルライン（G.Klein
等：Intern.J.Cancer 10、44−57、1972参照）
であるか、ヒトの繊維芽細胞でこの場合、限定さ
れた寿命を有するジプロイドかまたは無限に分裂
可能のヘテロプロイドである。 誘導に用いるウイルスは、ふつう凝血性ウイル
スJapan（HVJ＝センダイウイルス）のようなパ
ラミキソウイルスまたはニユーカツスル病ウイル
ス；レオグループ（Reogroup）ウイルスたとへ
ばレオウイルスまたはブルータング（blue
tongue）ウイルスである。核酸系の誘導因子
は、ふつう、２重らせんリボ核酸たとへばポリ
（Ｉ：Ｃ）で、単独かまたは代謝阻害剤および
（または）ポリカチオンと組合わせて使用する。 驚くべきことに、本発明によれば、或る群のい
わゆる“刺激物質”または刺激物質の混合物を細
胞培地に添加すると、刺激物質にさらさない培養
物に比して、多数倍（４から60倍）のインターフ
エロンを生産することを見出だしたのである。刺
激物質の添加は、なるべくは、インターフエロン
誘導因子でインターフエロンを誘導するより前と
する。本発明に準ずるインターフエロンの増加
は、インターフエロン生成細胞の百分率の増加お
よび細胞１個についてのインターフエロンの収量
の増加にもとづく。 刺激物質には、細胞培養物に添加した際に、イ
ンターフエロン生成細胞の割合を増加させる物質
が含まれる。これらの刺激物質は、至適の栄養条
件とした培地により培養されている細胞培地に添
加した場合に、発育の対数期から休止期に超越さ
す物質として定義される。この休止期は、細胞の
DNA（デオキシリボ核酸）含量に関していえ
ば、DNA合成のない、有糸分裂のあとの段階
（細胞サイクルのGl相類似の段階）となる。 本発明により刺激物質として特に有用であるこ
との分つた物質は、４から８炭素原子数のＮ・
N′−ジアセチル化ジアミン、特に、ペンタ・メ
チレンビスアセトアミド、ヘキサメチレンビスア
セトアミドまたはヘプタメチレンビスアセトアミ
ドのようなα・ω−誘導体、スルホキサイドのよ
うな有機イオウ化合物たとへばジメチルスルホキ
サイド、または、11β−位置が、フツ素、塩素ま
たは臭素原子、またはヒドロキシ基またはヒドロ
キシメチル基で置換されているグルココルチコイ
ド、たとへば、ハイドロコーチゾン、デクサメサ
ゾン（dexamethazone）、プレドニソロン
（prednisolone）、アルドステロン、トリアムシノ
ロン（triamcinolone）、コルテクソロン
（cortexolone）、またはそれらの混合物、あるい
は前記刺激物質と飽和脂肪族カルボン酸またはそ
の塩との混合物である。これらの刺激物質の最終
濃度は0.01マイクロモル／リツトルから300ミリ
モル／リツトルまでとする。しかし、刺激物質と
して用いる場合の最終濃度はジアセチレート化ジ
アミンでは１から10ミリモル／リツトル、ジメチ
ルスルホキサイドのような有機イオウ化合物では
50から300ミリモル／リツトル、グルココルチコ
イドでは0.01から10マイクロモル／リツトルとす
る。 特に強力であることの分つた刺激物質は、ヘキ
サメチレンビスアセトアミド、ジメチルスルホキ
サイド、トリアムシノロン、ハイドロコーチおよ
びプレドニソロンである。 本発明によれば有利な方法はつぎのようであ
る。 Namalwa細胞を、発育培地、有利には培地
RPMI1640（Gibco社、アメリカ合衆国または
Flow社、アメリカ合衆国、GB）である。この培
地は、トリプト−スホスフエートブロス（10から
20容量％、しかし、有利には20容量％）、部分的
に精製されたヒト血清（１から20容量％、しか
し、有利には２から６容量％）を含有する。別様
にはヒト血清に代えて、他の種の血清または血清
分画たとへば牛胎児血清を５から15容量％に使用
しうる。 懸濁液中の細胞増殖を0.2から５×106細胞／
c.c.、なるべくは0.5から１×106細胞／c.c.の密度に
維持するこのような培地に、刺激物質をなるべく
は１ミリモル／ミリリツトルの濃度に加える。細
胞は、これらの条件で35から37度Ｃの有利の温度
に６から72時間インキユベートする。24から48時
間が有利である。この刺激期間のあと、なるべく
は遠心して細胞を採取し、刺激物質を添加するか
添加しないままで約50×106細胞／ミリリツトル
培地に再懸濁させる。この懸濁液にインターフエ
ロン誘導物質たとへばHVJ（センダイウイルス）
を加え、約１から３時間インキユベートする。こ
のように処理された細胞は遠心して集め、血清不
含細胞培養培地（Gibco社、アメリカ合衆国また
は、Flow社、アメリカ合衆国、GB）、たとへば
Eagle′s Minimal essential培地に再懸濁させ、
35から39度Ｃで、6.7から8.0なるべくは7.3のPH
で、15から24時間、なるべくは18から20時間、刺
激物質を存在さすか存在させないで培養する。粗
淋巴芽インターフエロンを含有するこのように得
られた懸濁液は、細胞および細胞残渣より分離す
る。残存する誘導ウイルスを不活化するために、
上清には塩酸のような鉱酸を加えて、０から４度
Ｃで３から５日培養する。 粗ヒト淋巴芽インターフエロンをさらに精製
し、濃縮しそして安定化するには、つぎの精製段
階を適用しうる。 (a) 得られた溶液はたとへば水酸化ナトリウムで
中和し、酢酸亜鉛のような亜鉛塩を加えて溶液
よりインターフエロンを沈殿させ、遠心により
塊状とする。得られた塊状物は、0.1規定塩酸
のような冷希塩酸中で可溶化する。 (b) 溶液は遠心し清澄としイオン交換体なるべく
はSP−Sephadex Ｃ−25（Pharmacia Fine
Chemicals Uppsala、Sweden）と混合し、数
時間機械的にかくはんする。 イオン交換体にインターフエロンが吸着した
あと、残存する亜鉛は緩衝溶液で反復洗浄で除
去する。たとへば、PH2.5の0.1モル／リツトル
のグリシン／塩酸塩緩衝液で３度洗い、つい
で、0.1モル／リツトルのくえん酸カリウムお
よび0.005モル／リツトルのエチレンジアミン
テトラ酢酸ジナトリウムを含有するPH＝4.0の
緩衝液で３度洗う。 洗浄操作のあと、吸着されているインターフ
エロンをあわせたイオン交換体は、くえん酸緩
衝液中に懸濁させてクロマトグラフカラムに移
す。インターフエロンは中程度に塩基性の緩衝
液でイオン交換体より溶出する。たとへば、１
モル／リツトルの塩化カリウムを含有する0.1
モル／リツトルのりん酸カリウム（PH＝8.0）
を使用する。 (c) 溶出液の蛋白質を含有する分画は、低温で捕
集し、PH3.5に調整する。遠心して澄明化して
から、チオシアン酸カリウム溶液を添加して澄
明上清よりインターフエロンを沈殿させる。沈
殿した蛋白質は放置して沈殿させ、遠心して集
め、小容量の中程度に塩基性の緩衝液たとへば
0.1モル／リツトルのPH８のりん酸カリウムに
溶解し、超遠心する。 (d) 上清はカラムクロマトグラフイーで精製す
る。なるべくは、40から120マイクロメーター
の粒子の大きさのSephadex Ｇ−100
（Pharmacia Fine Chemi cals、Uppsala、
Sweden）を用い0.001モル／リツトルのジナト
リウムエチレンジアミンテトラアセテートを含
有する、りん酸塩緩衝生理食塩水で溶出する。
インターフエロンの溶液を施すより前に、カラ
ムは、ふつう、既知の分子量の蛋白質で標準化
しておく。10000から35000ダルトンの範囲の分
子量の蛋白質に相当する溶出液を集める。 (e) 集めた分画は、塩酸でなるべくはPH３とし、
0.1モル／リツトルのPH＝３のくえん酸カリウ
ムであらかじめ洗つてある、SP−Sephadexの
イオン交換体（段階ｂをみよ）を含有する小さ
いカラムに施す。 このPHでインターフエロンはイオン交換体に
吸着されるので、くえん酸塩緩衝液で洗つたあ
と、りん酸塩緩衝液たとへば0.1モル／リツト
ルのPH＝８のりん酸塩緩衝液で溶出しうる。蛋
白質を含有する分画をプールし、りん酸塩緩衝
生理食塩水に対し透析する。 つぎの実施例は、本発明を説明するためのもの
で、本発明の範囲を限定するものでない。 予備調製 Namalwaの細胞は、発酵容器中で懸濁培養に
より増殖させる。培地は、20容量％のトリプトー
スホスフエートブロスおよび２から４容量％の分
画ヒト血清を加えたRPMI1640培地を含有する。
ヒト血清を分画するには、血清蛋白質を６％ポリ
エチレングリコール6000で部分沈殿させる。
（Inglot等、Acta Virol.19、250−254、1975）を
みよ。細胞は２から７×106細胞／ミリリツトル
まで増殖する。 センダイウイルス（HVJ）は、鶏胚に増殖さ
せ、高速遠心で精製する。センダイウイルスは超
音波処理により細胞培養物中に懸濁させマイナス
70度Ｃに保存する。 例 １ 対数増殖期にあるNamalwa細胞を、５×105細
胞／ミリリツトルの密度に発育培地中に懸濁させ
る。この細胞懸濁液に、刺激物質を添加し、Ｃミ
リモル／リツトル濃度としてｔ時間37度Ｃで処理
する。刺激物質で処理しているあいだに、細胞
DNA合成の速度は、対照培養物（刺激物質はな
い）の２％より低くなる。細胞は休止状態とな
り、これは細胞サイクルのGl相に相当する。こ
の処理のあと細胞は遠心（700×ｇ、15分）して
集め、210凝血単位／ミリリツトルHVJとあわせ
て、1.7リツトルの発育培地中５×107細胞／ミリ
リツトルとして、ローラーびん中で、37度Ｃでさ
らに２時間インキユベートする。このようにして
誘導処理された細胞は遠心して集め、17リツトル
の血清不含Eagle′s Minimum essential培地
（Earleの塩類を使用する）中に５×106細胞／ミ
リリツトルの密度でPH7.3で35.5度Ｃで30時間さ
らにインキユベートする。この段階では、機械か
くはん装置により20リツトルのびんを用いる。細
胞性材料を2000×ｇで30分遠心して塊状とし、粗
溶液（細胞上清）を、10度Ｃより低い温度で５規
定塩酸でPH２とし、３から５日間４度Ｃに貯蔵
し、インターフエロンの誘導に用いたHVJを不活
性化する。 つぎの表はｎ−らく酸をＣミリモル／リツトル
に加えた時のインターフエロンの増加を示す。
【表】
例 ２
Namalwa細胞を85リツトルの発育培地中に培
養して、５×105細胞／ミリリツトルの細胞の密
度とする。この段階で、細胞は対数期となり
DNA合成は最大となる。刺激物質は、水溶液と
して細胞培養液にＣミリモル／リツトルになるよ
うに加え、35.5から37度Ｃでｔ時間処理する。こ
の処理のあいだに、DNA合成は未処理培養物の
12％より低くなり、細胞の大部分は、細胞サイク
ルのGl相に相当する休止相となる。細胞は、連
続流方式の遠心操作により700×ｇで塊状とす
る。このように集めた細胞は、９リツトルの発育
培地中に１×107細胞／ミリリツトルの密度に再
懸濁させる。この培地は刺激物質はＣミリモル／
リツトルに含有している。また、28凝血単位／ミ
リリツトルのHVJを加え、機械的かくはんびん中
で35.5から37度Ｃで４時間インキユベートする。
このようにして誘導された細胞は遠心して集め、
18リツトルの血清不含Eagle′s minimum
essential培地（Earleの塩類使用）に５×106細
胞／ミリリツトルに懸濁させ、機械的かくはん式
の容器20リツトル中でPH7.1で36度Ｃでインキユ
ベートする。 細胞材料は遠心（2000×ｇ、30分）して除き、
粗インターフエロン調製物として細胞上清をう
る。５規定塩酸を加えてPH２とし、４度Ｃに３か
ら５日保つて、ウイルス誘導物質を不活化する。
つぎの表に示すように、刺激物質であるヘキサメ
チレンビスアセトアミドをＣミリモル／リツトル
に添加したあとインターフエロンの収量が増加す
る。
養して、５×105細胞／ミリリツトルの細胞の密
度とする。この段階で、細胞は対数期となり
DNA合成は最大となる。刺激物質は、水溶液と
して細胞培養液にＣミリモル／リツトルになるよ
うに加え、35.5から37度Ｃでｔ時間処理する。こ
の処理のあいだに、DNA合成は未処理培養物の
12％より低くなり、細胞の大部分は、細胞サイク
ルのGl相に相当する休止相となる。細胞は、連
続流方式の遠心操作により700×ｇで塊状とす
る。このように集めた細胞は、９リツトルの発育
培地中に１×107細胞／ミリリツトルの密度に再
懸濁させる。この培地は刺激物質はＣミリモル／
リツトルに含有している。また、28凝血単位／ミ
リリツトルのHVJを加え、機械的かくはんびん中
で35.5から37度Ｃで４時間インキユベートする。
このようにして誘導された細胞は遠心して集め、
18リツトルの血清不含Eagle′s minimum
essential培地（Earleの塩類使用）に５×106細
胞／ミリリツトルに懸濁させ、機械的かくはん式
の容器20リツトル中でPH7.1で36度Ｃでインキユ
ベートする。 細胞材料は遠心（2000×ｇ、30分）して除き、
粗インターフエロン調製物として細胞上清をう
る。５規定塩酸を加えてPH２とし、４度Ｃに３か
ら５日保つて、ウイルス誘導物質を不活化する。
つぎの表に示すように、刺激物質であるヘキサメ
チレンビスアセトアミドをＣミリモル／リツトル
に添加したあとインターフエロンの収量が増加す
る。
【表】
単位
例 ３ Namalwa細胞を、１×106細胞／ミリリツトル
の密度となるまで、85リツトルの発育培地中に培
養する。細胞は対数発育相となり、DNA合成は
最高速度となる。プロピオン酸の2.5ミリモル／
リツトルとハイドロコーチゾン１マイクロモル／
リツトルとを混合した刺激物質の混合物を中性溶
液に加え、35.5から37度Ｃで48時間処理する。
DNA合成の速度は48時間のうちに未処理対照物
の５％より低くなる。細胞の大部分はGl相様の
休止期となる。細胞は連続流式の遠心機で700×
ｇで沈降させる。このように集めた細胞は２リツ
トルの発育培地中に4.5×107細胞／ミリリツトル
の密度に懸濁させて、HVJを210凝血単位／ミリ
リツトルになるように加えて、37度Ｃで２時間イ
ンキユベートする。そのあと細胞を集め、85リツ
トルの血清不含培地中に１×106細胞／ミリリツ
トルの密度に再懸濁させる。PH7.3で35.5から37
度Ｃで36時間懸濁培養する細胞は連続流式遠心
（2000×ｇ）で除き、細胞懸濁液には、10度Ｃよ
り低い温度で５規定塩酸でPH＝２とする。そして
４度Ｃに３から５日保つ。このように得られた粗
インターフエロン調製物は、刺激物質であらかじ
め処理してない対照培養物の22倍のインターフエ
ロンを含有している。（対照培養物：1050IUイン
ターフエロン／106細胞；プロピオン酸＋ハイド
ロコーチゾン処理培養物：23200IUインターフエ
ロン／106細胞）。 例 ４ 前記の例と同様にして、５×105細胞／ミリリ
ツトルの密度のNamala細胞をつぎの刺激物質で
処理する。この処理で、インターフエロンの収量
は、未処理対照培養物に比して係数ｘだけ増加す
る。
例 ３ Namalwa細胞を、１×106細胞／ミリリツトル
の密度となるまで、85リツトルの発育培地中に培
養する。細胞は対数発育相となり、DNA合成は
最高速度となる。プロピオン酸の2.5ミリモル／
リツトルとハイドロコーチゾン１マイクロモル／
リツトルとを混合した刺激物質の混合物を中性溶
液に加え、35.5から37度Ｃで48時間処理する。
DNA合成の速度は48時間のうちに未処理対照物
の５％より低くなる。細胞の大部分はGl相様の
休止期となる。細胞は連続流式の遠心機で700×
ｇで沈降させる。このように集めた細胞は２リツ
トルの発育培地中に4.5×107細胞／ミリリツトル
の密度に懸濁させて、HVJを210凝血単位／ミリ
リツトルになるように加えて、37度Ｃで２時間イ
ンキユベートする。そのあと細胞を集め、85リツ
トルの血清不含培地中に１×106細胞／ミリリツ
トルの密度に再懸濁させる。PH7.3で35.5から37
度Ｃで36時間懸濁培養する細胞は連続流式遠心
（2000×ｇ）で除き、細胞懸濁液には、10度Ｃよ
り低い温度で５規定塩酸でPH＝２とする。そして
４度Ｃに３から５日保つ。このように得られた粗
インターフエロン調製物は、刺激物質であらかじ
め処理してない対照培養物の22倍のインターフエ
ロンを含有している。（対照培養物：1050IUイン
ターフエロン／106細胞；プロピオン酸＋ハイド
ロコーチゾン処理培養物：23200IUインターフエ
ロン／106細胞）。 例 ４ 前記の例と同様にして、５×105細胞／ミリリ
ツトルの密度のNamala細胞をつぎの刺激物質で
処理する。この処理で、インターフエロンの収量
は、未処理対照培養物に比して係数ｘだけ増加す
る。
【表】
サイド
ジメチルスルホキ 280 16
サイド
例 ５ 前記の実施例と同様にして、５×105細胞／ミ
リリツトルの密度のNamalwa細胞をつぎに示す
刺激物質で処理する。未処理の対照培養物に比し
て係数Ｘだけインターフエロンの収量が増加す
る。
ジメチルスルホキ 280 16
サイド
例 ５ 前記の実施例と同様にして、５×105細胞／ミ
リリツトルの密度のNamalwa細胞をつぎに示す
刺激物質で処理する。未処理の対照培養物に比し
て係数Ｘだけインターフエロンの収量が増加す
る。
【表】
〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓
プレドニソン 10 3.5
〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓 〓
プレドニソン 10 3.5
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 淋巴芽球由来の永久的に培養できるセルライ
ンの細胞をウイルスインターフエロン誘導因子と
インキユベートする前に、対数増殖期にある前記
淋巴芽球細胞をその増殖期からこの細胞がそれら
のDNA含量について有糸分裂後（G1期）の細胞
に相当し、しかもDNA合成は生起していない期
として定義される休止期に移動させる刺激物質で
最適増殖条件下に処理し、次いで所望によりイン
キユベーシヨン中に産生されたインターフエロン
をそれ自体既知の方法で分離および（または）精
製することよりなり、そして前記刺激物質とし
て、ジアセチレート化ジアミン化合物、有機スル
ホキサイド化合物または11β−位が親水性の基で
置換されているグルココルチコイド化合物ならび
にそれらの混合物あるいはこれらの刺激物質と飽
和脂肪族カルボン酸またはその塩よりなる混合物
を使用し、但し直鎖状飽和脂肪族カルボン酸また
はその塩を単独刺激物質として使用する場合を除
く、ことを特徴とするインターフエロンの製造方
法。 ２ 刺激物質が炭素原子数４〜８のＮ・N′−ジ
アセチレート化α・ω−ジアミン化合物、ジメチ
ルスルホキサイドまたは11β−位がヒドロキシ基
またはヒドロキシメチル基で置換されているグル
ココルチコイド化合物ならびにそれらの混合物あ
るいはこれらの刺激物質と炭素原子数３〜６のア
ルカン酸またはそれらの塩とよりなる混合物であ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 刺激物質として、ペンタメチレンビスアセト
アミド、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヘプ
タメチレンビスアセトアミド、ジメチルスルホキ
サイド、プレドニソロン、デクサメサゾン、トリ
アムシノロン、ハイドロコーチゾン、11−デスオ
キシコーチゾンおよびプレドニソロンならびにそ
れらの混合物あるいはこれらの刺激物質とプロピ
オン酸、ｎ−らく酸、イソらく酸、ｎ−バレリア
ン酸、カプロン酸、またはそれらの無機または有
機塩基との塩よりなる混合物を使用し、そして刺
激物質はインターフエロン誘導因子を加えるに先
行して、６〜72時間、なるべくは24〜48時間のあ
いだに細胞に添加する、特許請求の範囲第１項に
記載の方法。 ４ 刺激物質の最終濃度を0.01マイクロモル／リ
ツトル〜300ミリモル／リツトルとする、特許請
求の範囲第１項〜第３項のいづれか一項に記載の
方法。 ５ 該刺激物質として炭素原子数４〜８のＮ・
N′−ジアセチレート化ジアミン化合物および
（または）ジメチルスルホキサイドを0.1マイクロ
モル／リツトル〜250ミリモル／リツトルの最終
濃度で使用する、特許請求の範囲第１項〜第３項
のいづれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19782821466 DE2821466A1 (de) | 1978-05-17 | 1978-05-17 | Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5568296A JPS5568296A (en) | 1980-05-22 |
| JPS6251114B2 true JPS6251114B2 (ja) | 1987-10-28 |
Family
ID=6039526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6025179A Granted JPS5568296A (en) | 1978-05-17 | 1979-05-16 | Production of interferon |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5568296A (ja) |
| AT (1) | AT370132B (ja) |
| DE (1) | DE2821466A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4198479A (en) * | 1979-03-30 | 1980-04-15 | Merck & Co., Inc. | Replacement of animal serum proteins by human albumin for growth and interferon production by Namalva cells |
| JPS5794290A (en) * | 1980-12-02 | 1982-06-11 | Toray Ind Inc | Method for producing interferon |
| JPS57188524A (en) * | 1981-05-15 | 1982-11-19 | Thomae Gmbh Dr K | Interferon |
| IT1172270B (it) * | 1982-06-21 | 1987-06-18 | Wellcome Found | Procedimento per la produzione di interferon |
| JPS59179074A (ja) * | 1983-03-30 | 1984-10-11 | Toray Ind Inc | 細胞培養方法 |
| DE3930140A1 (de) * | 1989-09-09 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von biologischen materialien in zellkulturen und vorrichtungen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1475883A (en) * | 1973-10-08 | 1977-06-10 | Searle & Co | Purification of interferon by means of density gradient centri fugation |
| JPS50140689A (ja) * | 1974-04-30 | 1975-11-11 |
-
1978
- 1978-05-17 DE DE19782821466 patent/DE2821466A1/de not_active Withdrawn
-
1979
- 1979-05-07 AT AT0337779A patent/AT370132B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-16 JP JP6025179A patent/JPS5568296A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA337779A (de) | 1982-07-15 |
| DE2821466A1 (de) | 1979-11-29 |
| JPS5568296A (en) | 1980-05-22 |
| AT370132B (de) | 1983-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4266024A (en) | Process for the production of human interferon | |
| RU2222547C2 (ru) | Получение рекомбинантного фактора viii в среде, не содержащей белка | |
| JP4131554B2 (ja) | 疎水性ポリペプチドの細菌生産 | |
| EP0099871B1 (en) | Separation of plasma proteins from cell culture systems | |
| JPH11511324A (ja) | 細胞培養でインターフェロン産生を高める方法 | |
| NL7907791A (nl) | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. | |
| FI72143B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenniskointerferon | |
| JPH0515435B2 (ja) | ||
| JPH06113879A (ja) | ヒト第ｖｉｉｉ因子及びヒト第ｖｉｉｉ因子のアナログの製造方法 | |
| Guan et al. | Use of aqueous two-phase systems in the purification of human interferon-α1 from recombinant Escherichia coli | |
| JP3360315B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの高度精製方法 | |
| EP0591605B1 (en) | Method for suppressing coloring of human serum albumin | |
| JPS6251114B2 (ja) | ||
| JPH07102148B2 (ja) | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法、およびそれにより得られるヒト血清アルブミン含有組成物 | |
| JPH0630610B2 (ja) | 組み換え蛋白質の生産 | |
| JPH0428279B2 (ja) | ||
| EP0097353B1 (en) | Improved process for interferon production | |
| US5286716A (en) | Inhibitor of the proliferation of endothelial cells | |
| JP2885212B2 (ja) | 遺伝子操作由来のヒト血清アルブミンより得られる高純度ヒト血清アルブミン含有組成物 | |
| WO1991018925A1 (en) | Novel megakaryocyte colony stimulating factor and production thereof | |
| US4526782A (en) | Process for recovering interferon | |
| CA1279593C (en) | Cholesterol-rich fraction, process therefor and use thereof in cell culture | |
| JPH0432078B2 (ja) | ||
| EP0041344A2 (en) | Process for producing interferon | |
| JP2869417B2 (ja) | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン |