JPH0515435B2 - - Google Patents
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- JPH0515435B2 JPH0515435B2 JP58227750A JP22775083A JPH0515435B2 JP H0515435 B2 JPH0515435 B2 JP H0515435B2 JP 58227750 A JP58227750 A JP 58227750A JP 22775083 A JP22775083 A JP 22775083A JP H0515435 B2 JPH0515435 B2 JP H0515435B2
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、インターフエロンの製造法に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、ヒトインターフ
エロン遺伝子を組み入れた発現ベクターを持つ微
生物を、特定の合成培地に培養し、該インターフ
エロンを著量蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とするヒトインターフエロンの製造法に関す
る。 インターフエロン（以下、「IF」と略称するこ
ともある。）は、高等動物の細胞がウイルスや核
酸などの刺激によつて誘発されて生産する蛋白質
であり、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用などを有す
る。 ヒトのIFには、現在、α型、β型およびγ型
の３種の性状の異なるタイプが存在することが知
られており、α型およびβ型はウイルスや核酸
で、γ型はマイト−ジエンなどで誘発される。従
つてその製造法としてはヒト細胞または株化細胞
の培養による方法がとられてきたが、その生産量
は極めて少なく、大規模な臨床試験や治療薬とし
て使用するに必要な量の供給は不可能である。し
かるに、近年、遺伝子操作技術の進歩によつて、
α，β，γ型のいずれも、IF産生遺伝子を組入
れた発現ベクターを持つ大腸菌などの培養物から
生物学的に活性な蛋白質として、比較的容易に得
られるようになつた〔ネイチヤー（Nature）
284，316（1980）；ネイチヤー287，411（1980）；プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイ
テツド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America，
以下において、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.Aと略称
する。）77，5230（1980）；ヌクレイツク・アシツ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）８，
4057（1980）；ネイチヤー295，503（1982）〕。しか
し、その生産量は、工業的なヒトIFの製造法と
しては、必ずしも十分なものとはいえない。 このような状況に鑑み、本発明者らは、IF産
生遺伝子を組入れた発現ベクターを持つ微生物の
培養法について、種々検討を重ねたところ、上記
微生物は従来主として天然物を有機窒素源とする
培地において培養されてきたが、これを特定の完
全合成培地に変換し、培養することによつて著し
く高収量のIFが得られることを見い出し、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。 本発明は、インターフエロン産生遺伝子を組入
れた発現ベクターを持つ微生物を、Ｌ−グルタミ
ン酸と鉄イオン源とを成分既知の状態で添加した
合成培地において培養し、培養物からインターフ
エロンを採取することを特徴とするインターフエ
ロンの製造法である。 ヒトIFには、α型、β型およびγ型の３種が
知られ、特にα型については多くの分子種が存在
し、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｊなどの遺伝
子がクローニングされ、大腸菌で発現することが
知られている（日本特開昭57−79897号公報、ヨ
ーロツパ特許出願公開No.43980公報参照）。またβ
型IF遺伝子（日本特開昭57−140793号公報参照）
およびγ型IF遺伝子（日本特開昭58−90514号公
報参照）も大腸菌で発現されるに至つているが、
これらいずれの遺伝子、またはその他のヒトIF
遺伝子であつても、宿主微生物で発現するもので
あれば、そのいずれのIF生産にも本発明を適用
することが可能である。 IF遺伝子を宿主微生物特に大腸菌で効率よく
発現させるために、その発現ベクター用のプラス
ミドとしては、ColEI 由来のpBR 322〔ジーン
（Gene）２，95（1977）〕が最もよく利用される
が、その他のプラスミドであつても、大腸菌内で
複製保持されるものであれば、いずれも用いるこ
とができる。その例としては、pBR313〔ジーン
２，75（1977）〕，pBR324，pBR325〔ジーン４，
121（1978）〕，pBR327，pBR328〔ジーン９，287
（1980）〕，pKY2289〔ジーン３，１（1987）〕，
pKY2700〔生化学52，770（1980）〕，pACYC177，
pACYC184〔ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（Journal of Bacteriology）134，1141
（1978）〕，pRK248，pRK646，pDF41〔メソツ
ズ・イン・エンジ−モロジー（Meshods in
Enzymology）68，268（1979）〕などが挙げられ
る。 また、バクテリオフアージ、たとえばλフアー
ジを使用したλgt系のλgt・λC〔Proc.Nat.Acad.
Sci.U.S.A.71，4579（1974）〕，λgt・λB〔Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.A.72，3416（1975）〕，λDam
〔ジーン１，255（1977）〕やシヤロンベクター〔サ
イエンス（Science）196，161（1977）；ジヤーナ
ル・オブ・ビーロロジー（Journal of
Virology）29，555（1979）〕、繊維状フアージを
使用したベクターなども発現ベクターとして使用
可能である。 IF遺伝子はプロモーターの下流に連結されて
いることが好ましく、該プロモーターとしては、
トリプトフアン（trp）プロモーター、ラクトー
ス（Iac）プロモーター、蛋白質鎖伸長因子Tu
（tufB）プロモーター、recA遺伝子プロモータ
ー、λフアージの増殖に関与するλPL，λPRプロ
モーターなどがあげられるが、これらのいずれを
用いたものであつてもよい。 IF産生遺伝子を組み入れた発現ベクターの構
築は、公知の方法に従つて行なえばよい。たとえ
ば、α型IFに関しては、ネイチヤー（Nature）
第287巻411頁（1980年）、DNA第１巻125頁
（1982年）、ニユークレイツク・アシツズ・リサー
チ第11巻2927頁（1983年）、日本特開昭57−79897
号公報（ヨーロツパ特許出願公開第43980号公報）
などに記載の方法、β型IFに関しては、ニユー
クレイツク・アシツズ・リサーチ第８巻4057頁
（1980年）、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.第77巻5230
頁（1980年）．ニユークレイツク・アシツズ・リ
サーチ第11巻4677頁（1983年）、日本特開昭57−
140793号公報などに記載の方法、γ型IFに関し
ては、ネイチヤー第295巻503頁（1982年）、日本
特開昭58−90514号公報、日本特開昭58−189197
号公報、日本特許出願昭58−176090号明細書（日
本特開昭59−186995号公報）、日本特許出願昭58
−45723号明細書（日本特開昭59−169494号公報）
に記載された方法などが挙げられる。 IF生産遺伝子を組入れた発現ベクターを導入
する宿主菌としては、大腸菌が用いられるが、な
かでも大腸菌Ｋ−12株由来のものが、取扱い、安
全性の面から特に好ましい。該大腸菌Ｋ−12株由
来のものとしては、たとえば大腸菌294株、
W31110株、Ｃ−600株、X1776株などが挙げられ
る。また、これらの変異株でもよい。 上記294株としては、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.
A.73，4174（1976）に記載されている株が挙げら
れる。また、上記294株としては、ジ・アメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（The
American Type Culture Collection、以下、
ATCCと略称する。）カタログ・オブ・ストレイ
ンズ（Catalogue of Strains）第15版1982年に
ATCC 31446として掲載されている株が挙げられ
る。さらに上記294株としては、財団法人発酵研
究所に昭和57年３月23日付けでIFO 14171として
寄託されている（日本特開昭58−189197号公報参
照）株が挙げられる。 上記W31110株としては、ATCCカタロク・オ
ブ・ストレインズ第15版1982年にATCC 27325
として掲載されている株が挙げられる。 上記Ｃ−600株としては、ATCCカタロク・オ
ブ・ストレインズ第15版1982年にATCC 23724
として掲載されている株が挙げられる。 上記X1776株としては、ザ・ジヤーナル・オ
ブ・インフエクシヤス・デイジージス（The
Journal of Infectious Diseases）137，668
（1978）に掲載されている株が挙げられる。また
上記X1776株としては、米国特許第4190495号公
報にATCC 31244（ATCCカタログ・オブ・スト
レインズ第15版1982年に掲載。）として掲載さ
れている株などが挙げられる。 IF産生遺伝子を組入れた発現ベクター（プラ
スミド、ベクターまたはフアージベクター）を宿
主菌に導入する方法としては、公知の方法に従え
ばよい。該方法としては、たとえばジヤーナル・
オブ・モレキユラー・バイオロジー（Journal of
Molecular Biology）53，159（1970）、メリツ
ズ・イン・エンジーモロジー68，253（1979）、ジ
ーン３，279（1978）などに記載の方法などが挙げ
られる。 本発明に用いられる合成培地とは、その成分が
すべて分かつているものをいう。 該合成培地は、たとえば公知の無機塩を主体と
する培地〔例、Ｍ−９培地（下記表１参照）、
Davis培地など〕を用いることができるが、また
下記の表３に示す無機塩組成のTSM−３培地な
ども有利に利用できる。 なお、種培養培地としては、通常の天然培地た
とえばニユートリエントブロスやＬ−ブロスなど
を用いてもよく、また表４に示す合成培地（SS
−１培地）もより有利に使用出来る。 【表】 【表】 【表】 【表】 本発明方法において用いられるＬ−グルタミン
酸、鉄イオン源、亜鉛イオン源および銅イオン源
は、それぞれ、成分既知の状態で添加する。 本発明方法において用いられるＬ−グルタミン
酸は、塩の形のものを使用してもよい。該塩とし
ては、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、アン
モニウム塩などが挙げられる。該Ｌ−グルタミン
酸またはその塩の添加量は、合成培地１リツター
あたり、Ｌ−グルタミン酸として、約0.1ないし
10ｇである。 本発明方法で用いられる鉄イオン源とは、溶液
にしたときに鉄イオンとなる物質あるいは鉄イオ
ンの形で利用される物質をいう。該鉄イオン源の
例としては、たとえば塩化第１鉄、塩化第２鉄、
硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、リン酸第２鉄、硝酸第
２鉄、クエン酸第２鉄、乳酸第１鉄などが挙げら
れる。該鉄イオン源の添加量は、合成培地１リツ
ターあたり鉄イオンとして約10-5ないし10-3モル
である。 本発明においては、合成培地に、さらに亜鉛イ
オン源、銅イオン源、または亜鉛イオン源および
銅イオン源を添加すると、より目的物の収量が増
大することがあるので有利である。 上記亜鉛イオン源とは、溶液にしたときに亜鉛
イオンとなる物質あるいは亜鉛イオンの形で利用
される物質をいう。該亜鉛イオン源の例として
は、たとえば塩化亜鉛、塩基性炭酸亜鉛、硝酸亜
鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛などが挙げられる。該
亜鉛イオン源の添加量は、合成培地１リツターあ
たり亜鉛イオンとして約10-5ないし10-3モルであ
る。 上記銅イオン源とは、溶液にしたときに銅イオ
ンとなる物質あるいは銅イオンの形で利用される
物質をいう。該銅イオン源の例としては、たとえ
ば硫酸銅、塩化第２銅、塩化第１銅、炭酸銅、酢
酸銅などが挙げられる。該銅イオン源の添加量
は、合成培地１リツターあたり銅イオンとして約
10-5ないし10-3モルである。 また宿主菌が栄養要求性を示す場合には要求す
るアミノ酸（例、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、
Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトフ
アンなど）を約10ないし1000mg／の割合で適宜
添加することが必要である。ビタミン類（例、パ
ントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−
イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキサール
塩酸、リボフラビン、ビタミンB1など）はビタ
ミン要求性変異株を用いない限り特に必要でない
が、ビタミンB1の約１ないし100mg／添加によ
つて醗酵が安定化する傾向があり、適宜添加する
ことが望ましい。また宿主菌がビタミン要求性で
ある場合には要求ビタミンを約１ないし100mg／
添加することが必要である。 培地に添加する炭素源は、培養期間中、約0.1
ないし５％（Ｗ／Ｖ）に保つようにすると、目的
とするIFが著量蓄積されるので有利である。該
炭素源としては、たとえばグルコース、グリセロ
ール、マルトース、ソルビトールなどが挙げられ
る。 インターフエロン遺伝子を組入れたプラスミド
には、通常抗生物質耐性の選択マークが付与され
ており、この場合には、耐性を示す抗生物質
（例、テトラサイクリン、アンピシリンなど）を
培地に添加すると、プラスミドを保持した株のみ
選択的に増殖させるために有利である。 培養は、通常、攪拌培養によつて行なれる。培
地中の酸素濃度を飽和溶存酸素濃度の約５％
（Ｖ／Ｖ）以上になるように保ちつつ培養を行な
うと、目的とするIFの生産量が増大されるので
有利である。そのために、培養途中に純酸素を空
気と混合して通気することも効果的である。 本発明の培養における培地のPHは、通常約５な
いし7.5に調製するのが好ましい。培養温度は約
15ないし45℃、さらに好ましくは約20ないし42℃
である。培養時間は、約３ないし72時間である。 本発明の発酵に於てIFは通常菌体内に蓄積さ
れるので、培養物中に蓄積されたIFを採取する
には、まず菌体を遠心分離や過によつて集め、
これによりIFを抽出することにより行なわれる。
IFを効率よく抽出させるためには、たとえば超
音波処理、リゾチーム処理、界面活性剤などの化
学薬品による処理などが行われる。 このようにして抽出されたIFの精製は、従来
からの蛋白質あるいはペプチドの精製法、たとえ
ば硫安塩析、アルコール沈澱、イオン交換カラム
クロマトグラフイー、セルロースカラムクロマト
グラフイー、ゲル過法などの適用により行なわ
れる。特にモノクローナル抗体法組合せることに
よつて極めて高純度の標品を得ることが可能であ
る。 すなわち、たとえば抽出操作を施した液を遠心
分離して上清を得、これをたとえば、モノクロー
ナル抗体カラムにかけ、カラムを洗滌後、たとえ
ば0.2M酢酸、0.1％トリトン（Triton）×100およ
び0.15M Naclで溶出する。この操作において、
インターフエロンはモノクローナル抗体カラムに
特異的に吸着されるため、高純度の標品を容易に
得ることが出来る。〔α型IFの精製については、
サイエンテイフイツク・アメリカン（Scientific
American）243，66（1980）参照。γ型IFの精製
については、日本特許出願昭58−176091号明細書
（日本特開昭59−80646号公報参照。〕 かくして得られるたとえばヒト白血球IFαA蛋
白質は、ウイ腎臓由来MDBK細胞に対する水泡
性口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止
試験による抗ウイルス活性測定において108Ｕ／
mg以上の比活性を示す。また、ヒト免疫IF蛋白
質は、ヒト羊膜由来のWISH細胞に対する水泡性
口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止試
験による抗ウイルス活性測定において107Ｕ／mg
以上の比活性を示す〔日本特許出願昭58−176091
号明細書（日本特開昭59−80646号公報参照〕。 本発明によつて製造されるヒトIF蛋白質類は、
同じ組換え体を用い、天然培地で培養して得られ
るものと、その理化学的性質、生物学的性質が全
く同じである。 したがつて、本発明の方法により製造された
IFは、従来の方法で製造されたIFと同様の目的
に同様の用法により使用することができる。 IFは、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増
殖阻害作用、免疫抑制作用などを有するので、
IFは、哺乳動物（例、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、
マウス、ラツトなど）のウイルス感染症、腫瘍な
どの治療に用いることができる。たとえばヒト
IF抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、細胞増殖阻害剤、
免疫抑制剤として用いるには、たとえばIFを自
体公知の薬理的に許容しうる担体、賦形剤、希釈
剤などと混合して、注射剤として非経口的に静脈
注射又は筋肉注射などにより投与する。その投与
量は正常人１日当り約10万ないし１億単位好まし
くは約100万ないし5000万単位である。また、上
記ヒト以外の哺乳動物に対しての投与量は、2000
ないし200万単位／Kg／日、さらに好ましくは約
２万ないし100万単位／Kg／日である。 以下に、実験例および実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明する。 実験例 １ 前記したＭ−９培地またはTSM−３培地に、
炭素源としてグルコースを10ｇ／の割合で添加
し、これにグルタミン酸ナトリウムを添加した培
地と添加しない培地とに大腸菌294
（ATCC31446）／pLe IF Ａ trp 25株（特開昭
57−79897号公報、ヨーロツパ特許出願公開第
43980号公報参照）を接種し37℃で16時間培養し
て、その生育を調べ、表５の結果を得た。 【表】 実験例 ２ TSM−３培地に25ｇ／のグルコースおよび
４ｇ／のＬ−グルタミン酸ナトリウムを添加し
た培地2.5を５容ジヤーフアーメンターに仕
込み、これに表６に記した金属塩を夫々添加した
培地に、ヒト白血球IF−αA遺伝子を組入れたプ
ラスミドを持つ大腸菌294（ATCC31446）／pLe
IF Ａ trp 25株の種培養物50mlを接種し、通気
量2.5／分、攪拌1000rpm，37℃で培養した。
培養途中、菌の生育につれて培養温度を37℃から
たとえば33℃，29℃，25℃と遂次低下させ、更に
培養途中でグルコース濃度が１％以下になつた時
2.5％宛新しくグルコースを添加して27時間培養
を続けた。また培養中PHはアンモニア水にてPH
6.8に保つた。その時の菌の生育およびヒト白血
球インターフエロンαAの生産量を調べ、表６の
結果を得た。 【表】 実験例 ３ 表７のＬ−シード培地または前記したSS−１
シード培地50mlを200ml容三角フラスコに仕込み、
これに５mg／の塩酸テトラサイクリンを添加し
た後、ヒト白血球IF−αA遺伝子を組入れたプラ
スミドを持つ大腸菌294（ATCC31446）／pLe IF
Ａ trp 25を接種し、37℃で12時間および16時間
夫々培養した。 【表】 次に前記したTSM−３培地に25ｇ／のグル
コース、４ｇ／のＬ−グルタミン酸ナトリウ
ム、27mg／のFeCl3・6H2Ｏ，８mg／の
CuSO4・5H2Ｏ，８mg／のZnSO4・7H2Ｏ，70
mg／の塩酸チアミンおよび５mg／のテトラサ
イクリン塩酸塩を添加した培地2.5を５容ジ
ヤーフアーメンターに仕込み、これに上記種培養
物を接種して実験例２と同じ条件で培養し、生育
およびヒト白血球IFの生産性を測定し、表８の
結果を得た。 【表】 表８から明らかなように、天然培地（Ｌ−シー
ド培地）の種培養物を用いるよりも、合成培地
（SS−１シード培地）の種培養を用いた方が主醗
酵での菌の増殖が早まり、IFの生産量が増大す
ることがわかる。 実験例 ４ SS−１シード培地50mlを200ml容三角フラスコ
に仕込み、これに５mg／の塩酸テトラサイクリ
ンを添加した後、ヒト白血球IF−αA遺伝子を組
入れたプラスミドを持つ大腸菌294
（ATCC31446）／pLe IF Ａ trp 25株を接種
し、37℃で16時間培養した。次にTSM−３培地
に４ｇ／のＬ−グルタミン酸ナトリウム、27
mg／の塩化第２鉄、８mg／の硫酸銅、８mg／
の硫酸亜鉛、70mg／の塩酸チアミンおよび５
mg／のテトラサイクリン塩酸塩を添加した培地
2.5宛を５容ジヤーフアーメンターに仕込み、
これにグルコースを表９に示す条件で添加した。
上記種培養物を接種した後、通気量2.5／分、
攪拌1000r.p.m.，37℃で培養を開始し、菌の増殖
につれて培養温度を37℃から33℃，29℃，25℃と
遂次低下させることによつて溶存酸素濃度が飽和
酸素濃度の10％以上になる様に保つた。培養中PH
はアンモニア水にてPH6.8に調整し、27時間培養
を続けた。その時の菌の生育およびヒト白血球
IF−αAの生産量を調べ、表９の結果を得た。 【表】 【表】 表９から明らかなように、実験No.４−１，４−
２，４−３の場合には、菌の生育およびIF−αA
の生産性が著しく高いことが分かる。 実施例 １ ヒト白血球IF−αA遺伝子を組入れた発現プラ
スミドを持つ大腸菌294（ATCC31446）／pLe IF
Ａ trp 25株を、(1)Ｍ−９培地にグルコース５
ｇ／、カザミノ酸５ｇ／、ビタミンB1塩酸
塩70mg／および塩酸テトラサイクリン５mg／
添加した培地（天然培地）あるいは(2)Ｍ−９培地
にグルコース25ｇ／，Ｌ−グルタミン酸ナトリ
ウム４ｇ／，FeCl3・6H2Ｏ 27mg／，
CuSO4・5H2Ｏ，８mg／，ZnSO4・7H2Ｏ ８
mg／、ビタミン1塩酸塩70mg／、塩酸テトラ
サイクリン５mg／，Ｌ−プロリン50mg／およ
びＬ−ロイシン50mg／を添加した培地（合成培
地）夫々2.5を仕込んだ５容ジヤーフアーメ
ンターへ接種し、通気2.5／分、攪拌1000r.p.
m.，37℃で培養を開始し、途中OD3000KUで33
℃，5000KUで29℃，7000KUで25℃に温度を下
げて48時間培養を続けた。培養中容存酵素濃度は
５％以上に保たれた。途中培養液中のグルコース
濃度が１％以下に低下した時、25ｇ／の割合で
グルコースを添加した。その結果を表10に示す。 【表】 た場合の相対的な値で表わした。
上記表10から明らかなように、(2)合成培地に本
発明の化合物を添加した培地を用いると、IFの
生産性は著しく増大した。 実施例 ２ 実施例１で得られた(2)合成培地培養液２を遠
心分離して菌体を集め、これを100mlの10％シユ
クロース、0.2M NaCl，10mMエチレンジアミ
ンテトラアセート（EDTA），10mMスペルミジ
ン、2mMフエニルメチルスルホニルフルオライ
ド（PMSF），0.2mg／mlリゾチームを含む50mM
Tris−HCl（PH7.6）に懸濁し、４℃で１時間攪拌
したのち、37℃で５分間保温し、これをさらに超
音波破砕器（アルテツク社製、米国）で、０℃40
秒処理した。この溶菌液を11300×１時間遠心分
離して上清95mlを集めた。 この上清95mlを1mM EDTA，0.15M NaClを
含む20mM Tris−HCl（PH7.6）（TEN）で300ml
に希釈したのち、抗IF−αA抗体カラム（29ml）
にかけた。 TENで十分洗浄したのち、さらに0.1％トウイ
ーン20（和光純薬工業株式会社製）を含む0.2M酢
酸でIF−αAを溶出し活性画分を集め、PH4.5に調
整したのちCMセルロースカラムに吸着させ、十
分洗浄後、0.15MNaClを含む0.025M酢酸アンモ
ニウム緩衝液（PH5.0）にて溶出した。再び活性
画分を集めて凍結乾燥に付し320mgのヒト白血球
IF−αA粉末を得た。 このもののSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による分子量は、19000±1000であつた。
また、ここで得られた最終のヒト白血球IF蛋白
質の比活性は２×108 Ｕ／mgであつた。また、
その他の理化学的性状、アミノ酸組成、ペプチド
マツピングにおいて、従来の培地で生産される遺
伝子組換えヒト白血球IFと全く同一の挙動を示
した。 実施例 ３ ヒト免疫IF遺伝子を組入れた発現プラスミド
を持つ大腸菌294（IFO 14171）／pHIT・trp
2101株〔日本特許出願昭58−176090号明細書（日
本特開昭59−186995号公報）参照〕を、(1)TSM
−３培地にグルコース25ｇ／、酵母エキス20
ｇ／および塩酸テトラサイクリン５mg／添加
した培地（天然培地）と(2)TSM−３培地にグル
コース25ｇ／、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム４
ｇ／，FeCl3・6H2Ｏ 27mg／，CuSO4・
5H2Ｏ ８mg／，ZnSO4・7H2Ｏ ８mg／、
塩酸チアミン70mg／および塩酸テトラサイクリ
ン５mg／を添加した培地（合成培地）夫々2.5
を仕込んだ５容ジヤーフアーメンターに接種
し、通気2.5／分、攪拌1000r.p.m.，37℃で培養
を開始し、途中ODが2000クレツト単位になつた
時33℃に、4000クレツト単位になつた時29℃に、
6000クレツト単位になつた時25℃に下げ、26時間
培養を行つた。培養液のPHはアンモニア水で6.8
に保ち、途中培養液中のグルコース濃度が１％以
下になつた時、25ｇ／の割合でグルコースを添
加した。その結果、天然培地(1)でIF−γ生産性
を100とすると合成培地(2)での生産性は550であつ
た。 実施例 ４ 実施例３で得られた合成培地培養液2.4を遠
心分離して菌体を集め、これを120mlの10％シユ
クロース、10mM EDTA，10mMスペルミヂン、
2mM PMSF，0.2mg／mlリゾチームを含む50mM
Tris−HCl（PH7.6）に懸濁し、４℃で１時間攪拌
したのち、37℃で５分間保温し、これを更に超音
波破砕器（アルテツク社製、米国）で、０℃40秒
処理した。この溶菌液を11300×ｇで１時間遠心
分離して上清115mlを集めた。 この上清115mlをTENで360mlに希釈したのち、
抗IF−γ抗体カラム（25ml）〔日本特許出願昭58
−176091号明細書の実施例12および13参照。〕に
かけ、TENで十分洗浄したのち、1M NaCl，
0.1％トウイーン20を含む20mMTris−HCl（PH
7.0）でさらに洗浄し、次に2Mグアニジン、塩酸
塩（シグマ社製、米国）を含むTris−HCl（PH
7.0）で溶出し、得られた活性画分100mlを0.115
％Na2HPO4，0.02％KH2PO4，0.8％NaCl，0.02
％KClからなる緩衝液に対して、４℃で18時間透
析した。 ここで得られた最終のヒト免疫IF蛋白質の量
は47mgであり、その比活性は２×107 Ｕ／mgで
あつた。 また、ここで得られた標品のSDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法による分子量は、18000±
1000であり、それ以外の理化学的性状、アミノ酸
組成、ペプチドマツピングにおいて、従来の培地
で生産される遺伝子組換えヒト免疫IFと全く同
一の挙動を示した。
る。さらに詳しくは、本発明は、ヒトインターフ
エロン遺伝子を組み入れた発現ベクターを持つ微
生物を、特定の合成培地に培養し、該インターフ
エロンを著量蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とするヒトインターフエロンの製造法に関す
る。 インターフエロン（以下、「IF」と略称するこ
ともある。）は、高等動物の細胞がウイルスや核
酸などの刺激によつて誘発されて生産する蛋白質
であり、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用などを有す
る。 ヒトのIFには、現在、α型、β型およびγ型
の３種の性状の異なるタイプが存在することが知
られており、α型およびβ型はウイルスや核酸
で、γ型はマイト−ジエンなどで誘発される。従
つてその製造法としてはヒト細胞または株化細胞
の培養による方法がとられてきたが、その生産量
は極めて少なく、大規模な臨床試験や治療薬とし
て使用するに必要な量の供給は不可能である。し
かるに、近年、遺伝子操作技術の進歩によつて、
α，β，γ型のいずれも、IF産生遺伝子を組入
れた発現ベクターを持つ大腸菌などの培養物から
生物学的に活性な蛋白質として、比較的容易に得
られるようになつた〔ネイチヤー（Nature）
284，316（1980）；ネイチヤー287，411（1980）；プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイ
テツド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America，
以下において、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.Aと略称
する。）77，5230（1980）；ヌクレイツク・アシツ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）８，
4057（1980）；ネイチヤー295，503（1982）〕。しか
し、その生産量は、工業的なヒトIFの製造法と
しては、必ずしも十分なものとはいえない。 このような状況に鑑み、本発明者らは、IF産
生遺伝子を組入れた発現ベクターを持つ微生物の
培養法について、種々検討を重ねたところ、上記
微生物は従来主として天然物を有機窒素源とする
培地において培養されてきたが、これを特定の完
全合成培地に変換し、培養することによつて著し
く高収量のIFが得られることを見い出し、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。 本発明は、インターフエロン産生遺伝子を組入
れた発現ベクターを持つ微生物を、Ｌ−グルタミ
ン酸と鉄イオン源とを成分既知の状態で添加した
合成培地において培養し、培養物からインターフ
エロンを採取することを特徴とするインターフエ
ロンの製造法である。 ヒトIFには、α型、β型およびγ型の３種が
知られ、特にα型については多くの分子種が存在
し、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｊなどの遺伝
子がクローニングされ、大腸菌で発現することが
知られている（日本特開昭57−79897号公報、ヨ
ーロツパ特許出願公開No.43980公報参照）。またβ
型IF遺伝子（日本特開昭57−140793号公報参照）
およびγ型IF遺伝子（日本特開昭58−90514号公
報参照）も大腸菌で発現されるに至つているが、
これらいずれの遺伝子、またはその他のヒトIF
遺伝子であつても、宿主微生物で発現するもので
あれば、そのいずれのIF生産にも本発明を適用
することが可能である。 IF遺伝子を宿主微生物特に大腸菌で効率よく
発現させるために、その発現ベクター用のプラス
ミドとしては、ColEI 由来のpBR 322〔ジーン
（Gene）２，95（1977）〕が最もよく利用される
が、その他のプラスミドであつても、大腸菌内で
複製保持されるものであれば、いずれも用いるこ
とができる。その例としては、pBR313〔ジーン
２，75（1977）〕，pBR324，pBR325〔ジーン４，
121（1978）〕，pBR327，pBR328〔ジーン９，287
（1980）〕，pKY2289〔ジーン３，１（1987）〕，
pKY2700〔生化学52，770（1980）〕，pACYC177，
pACYC184〔ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（Journal of Bacteriology）134，1141
（1978）〕，pRK248，pRK646，pDF41〔メソツ
ズ・イン・エンジ−モロジー（Meshods in
Enzymology）68，268（1979）〕などが挙げられ
る。 また、バクテリオフアージ、たとえばλフアー
ジを使用したλgt系のλgt・λC〔Proc.Nat.Acad.
Sci.U.S.A.71，4579（1974）〕，λgt・λB〔Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.A.72，3416（1975）〕，λDam
〔ジーン１，255（1977）〕やシヤロンベクター〔サ
イエンス（Science）196，161（1977）；ジヤーナ
ル・オブ・ビーロロジー（Journal of
Virology）29，555（1979）〕、繊維状フアージを
使用したベクターなども発現ベクターとして使用
可能である。 IF遺伝子はプロモーターの下流に連結されて
いることが好ましく、該プロモーターとしては、
トリプトフアン（trp）プロモーター、ラクトー
ス（Iac）プロモーター、蛋白質鎖伸長因子Tu
（tufB）プロモーター、recA遺伝子プロモータ
ー、λフアージの増殖に関与するλPL，λPRプロ
モーターなどがあげられるが、これらのいずれを
用いたものであつてもよい。 IF産生遺伝子を組み入れた発現ベクターの構
築は、公知の方法に従つて行なえばよい。たとえ
ば、α型IFに関しては、ネイチヤー（Nature）
第287巻411頁（1980年）、DNA第１巻125頁
（1982年）、ニユークレイツク・アシツズ・リサー
チ第11巻2927頁（1983年）、日本特開昭57−79897
号公報（ヨーロツパ特許出願公開第43980号公報）
などに記載の方法、β型IFに関しては、ニユー
クレイツク・アシツズ・リサーチ第８巻4057頁
（1980年）、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.第77巻5230
頁（1980年）．ニユークレイツク・アシツズ・リ
サーチ第11巻4677頁（1983年）、日本特開昭57−
140793号公報などに記載の方法、γ型IFに関し
ては、ネイチヤー第295巻503頁（1982年）、日本
特開昭58−90514号公報、日本特開昭58−189197
号公報、日本特許出願昭58−176090号明細書（日
本特開昭59−186995号公報）、日本特許出願昭58
−45723号明細書（日本特開昭59−169494号公報）
に記載された方法などが挙げられる。 IF生産遺伝子を組入れた発現ベクターを導入
する宿主菌としては、大腸菌が用いられるが、な
かでも大腸菌Ｋ−12株由来のものが、取扱い、安
全性の面から特に好ましい。該大腸菌Ｋ−12株由
来のものとしては、たとえば大腸菌294株、
W31110株、Ｃ−600株、X1776株などが挙げられ
る。また、これらの変異株でもよい。 上記294株としては、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.
A.73，4174（1976）に記載されている株が挙げら
れる。また、上記294株としては、ジ・アメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（The
American Type Culture Collection、以下、
ATCCと略称する。）カタログ・オブ・ストレイ
ンズ（Catalogue of Strains）第15版1982年に
ATCC 31446として掲載されている株が挙げられ
る。さらに上記294株としては、財団法人発酵研
究所に昭和57年３月23日付けでIFO 14171として
寄託されている（日本特開昭58−189197号公報参
照）株が挙げられる。 上記W31110株としては、ATCCカタロク・オ
ブ・ストレインズ第15版1982年にATCC 27325
として掲載されている株が挙げられる。 上記Ｃ−600株としては、ATCCカタロク・オ
ブ・ストレインズ第15版1982年にATCC 23724
として掲載されている株が挙げられる。 上記X1776株としては、ザ・ジヤーナル・オ
ブ・インフエクシヤス・デイジージス（The
Journal of Infectious Diseases）137，668
（1978）に掲載されている株が挙げられる。また
上記X1776株としては、米国特許第4190495号公
報にATCC 31244（ATCCカタログ・オブ・スト
レインズ第15版1982年に掲載。）として掲載さ
れている株などが挙げられる。 IF産生遺伝子を組入れた発現ベクター（プラ
スミド、ベクターまたはフアージベクター）を宿
主菌に導入する方法としては、公知の方法に従え
ばよい。該方法としては、たとえばジヤーナル・
オブ・モレキユラー・バイオロジー（Journal of
Molecular Biology）53，159（1970）、メリツ
ズ・イン・エンジーモロジー68，253（1979）、ジ
ーン３，279（1978）などに記載の方法などが挙げ
られる。 本発明に用いられる合成培地とは、その成分が
すべて分かつているものをいう。 該合成培地は、たとえば公知の無機塩を主体と
する培地〔例、Ｍ−９培地（下記表１参照）、
Davis培地など〕を用いることができるが、また
下記の表３に示す無機塩組成のTSM−３培地な
ども有利に利用できる。 なお、種培養培地としては、通常の天然培地た
とえばニユートリエントブロスやＬ−ブロスなど
を用いてもよく、また表４に示す合成培地（SS
−１培地）もより有利に使用出来る。 【表】 【表】 【表】 【表】 本発明方法において用いられるＬ−グルタミン
酸、鉄イオン源、亜鉛イオン源および銅イオン源
は、それぞれ、成分既知の状態で添加する。 本発明方法において用いられるＬ−グルタミン
酸は、塩の形のものを使用してもよい。該塩とし
ては、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、アン
モニウム塩などが挙げられる。該Ｌ−グルタミン
酸またはその塩の添加量は、合成培地１リツター
あたり、Ｌ−グルタミン酸として、約0.1ないし
10ｇである。 本発明方法で用いられる鉄イオン源とは、溶液
にしたときに鉄イオンとなる物質あるいは鉄イオ
ンの形で利用される物質をいう。該鉄イオン源の
例としては、たとえば塩化第１鉄、塩化第２鉄、
硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、リン酸第２鉄、硝酸第
２鉄、クエン酸第２鉄、乳酸第１鉄などが挙げら
れる。該鉄イオン源の添加量は、合成培地１リツ
ターあたり鉄イオンとして約10-5ないし10-3モル
である。 本発明においては、合成培地に、さらに亜鉛イ
オン源、銅イオン源、または亜鉛イオン源および
銅イオン源を添加すると、より目的物の収量が増
大することがあるので有利である。 上記亜鉛イオン源とは、溶液にしたときに亜鉛
イオンとなる物質あるいは亜鉛イオンの形で利用
される物質をいう。該亜鉛イオン源の例として
は、たとえば塩化亜鉛、塩基性炭酸亜鉛、硝酸亜
鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛などが挙げられる。該
亜鉛イオン源の添加量は、合成培地１リツターあ
たり亜鉛イオンとして約10-5ないし10-3モルであ
る。 上記銅イオン源とは、溶液にしたときに銅イオ
ンとなる物質あるいは銅イオンの形で利用される
物質をいう。該銅イオン源の例としては、たとえ
ば硫酸銅、塩化第２銅、塩化第１銅、炭酸銅、酢
酸銅などが挙げられる。該銅イオン源の添加量
は、合成培地１リツターあたり銅イオンとして約
10-5ないし10-3モルである。 また宿主菌が栄養要求性を示す場合には要求す
るアミノ酸（例、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、
Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトフ
アンなど）を約10ないし1000mg／の割合で適宜
添加することが必要である。ビタミン類（例、パ
ントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−
イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキサール
塩酸、リボフラビン、ビタミンB1など）はビタ
ミン要求性変異株を用いない限り特に必要でない
が、ビタミンB1の約１ないし100mg／添加によ
つて醗酵が安定化する傾向があり、適宜添加する
ことが望ましい。また宿主菌がビタミン要求性で
ある場合には要求ビタミンを約１ないし100mg／
添加することが必要である。 培地に添加する炭素源は、培養期間中、約0.1
ないし５％（Ｗ／Ｖ）に保つようにすると、目的
とするIFが著量蓄積されるので有利である。該
炭素源としては、たとえばグルコース、グリセロ
ール、マルトース、ソルビトールなどが挙げられ
る。 インターフエロン遺伝子を組入れたプラスミド
には、通常抗生物質耐性の選択マークが付与され
ており、この場合には、耐性を示す抗生物質
（例、テトラサイクリン、アンピシリンなど）を
培地に添加すると、プラスミドを保持した株のみ
選択的に増殖させるために有利である。 培養は、通常、攪拌培養によつて行なれる。培
地中の酸素濃度を飽和溶存酸素濃度の約５％
（Ｖ／Ｖ）以上になるように保ちつつ培養を行な
うと、目的とするIFの生産量が増大されるので
有利である。そのために、培養途中に純酸素を空
気と混合して通気することも効果的である。 本発明の培養における培地のPHは、通常約５な
いし7.5に調製するのが好ましい。培養温度は約
15ないし45℃、さらに好ましくは約20ないし42℃
である。培養時間は、約３ないし72時間である。 本発明の発酵に於てIFは通常菌体内に蓄積さ
れるので、培養物中に蓄積されたIFを採取する
には、まず菌体を遠心分離や過によつて集め、
これによりIFを抽出することにより行なわれる。
IFを効率よく抽出させるためには、たとえば超
音波処理、リゾチーム処理、界面活性剤などの化
学薬品による処理などが行われる。 このようにして抽出されたIFの精製は、従来
からの蛋白質あるいはペプチドの精製法、たとえ
ば硫安塩析、アルコール沈澱、イオン交換カラム
クロマトグラフイー、セルロースカラムクロマト
グラフイー、ゲル過法などの適用により行なわ
れる。特にモノクローナル抗体法組合せることに
よつて極めて高純度の標品を得ることが可能であ
る。 すなわち、たとえば抽出操作を施した液を遠心
分離して上清を得、これをたとえば、モノクロー
ナル抗体カラムにかけ、カラムを洗滌後、たとえ
ば0.2M酢酸、0.1％トリトン（Triton）×100およ
び0.15M Naclで溶出する。この操作において、
インターフエロンはモノクローナル抗体カラムに
特異的に吸着されるため、高純度の標品を容易に
得ることが出来る。〔α型IFの精製については、
サイエンテイフイツク・アメリカン（Scientific
American）243，66（1980）参照。γ型IFの精製
については、日本特許出願昭58−176091号明細書
（日本特開昭59−80646号公報参照。〕 かくして得られるたとえばヒト白血球IFαA蛋
白質は、ウイ腎臓由来MDBK細胞に対する水泡
性口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止
試験による抗ウイルス活性測定において108Ｕ／
mg以上の比活性を示す。また、ヒト免疫IF蛋白
質は、ヒト羊膜由来のWISH細胞に対する水泡性
口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止試
験による抗ウイルス活性測定において107Ｕ／mg
以上の比活性を示す〔日本特許出願昭58−176091
号明細書（日本特開昭59−80646号公報参照〕。 本発明によつて製造されるヒトIF蛋白質類は、
同じ組換え体を用い、天然培地で培養して得られ
るものと、その理化学的性質、生物学的性質が全
く同じである。 したがつて、本発明の方法により製造された
IFは、従来の方法で製造されたIFと同様の目的
に同様の用法により使用することができる。 IFは、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増
殖阻害作用、免疫抑制作用などを有するので、
IFは、哺乳動物（例、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、
マウス、ラツトなど）のウイルス感染症、腫瘍な
どの治療に用いることができる。たとえばヒト
IF抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、細胞増殖阻害剤、
免疫抑制剤として用いるには、たとえばIFを自
体公知の薬理的に許容しうる担体、賦形剤、希釈
剤などと混合して、注射剤として非経口的に静脈
注射又は筋肉注射などにより投与する。その投与
量は正常人１日当り約10万ないし１億単位好まし
くは約100万ないし5000万単位である。また、上
記ヒト以外の哺乳動物に対しての投与量は、2000
ないし200万単位／Kg／日、さらに好ましくは約
２万ないし100万単位／Kg／日である。 以下に、実験例および実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明する。 実験例 １ 前記したＭ−９培地またはTSM−３培地に、
炭素源としてグルコースを10ｇ／の割合で添加
し、これにグルタミン酸ナトリウムを添加した培
地と添加しない培地とに大腸菌294
（ATCC31446）／pLe IF Ａ trp 25株（特開昭
57−79897号公報、ヨーロツパ特許出願公開第
43980号公報参照）を接種し37℃で16時間培養し
て、その生育を調べ、表５の結果を得た。 【表】 実験例 ２ TSM−３培地に25ｇ／のグルコースおよび
４ｇ／のＬ−グルタミン酸ナトリウムを添加し
た培地2.5を５容ジヤーフアーメンターに仕
込み、これに表６に記した金属塩を夫々添加した
培地に、ヒト白血球IF−αA遺伝子を組入れたプ
ラスミドを持つ大腸菌294（ATCC31446）／pLe
IF Ａ trp 25株の種培養物50mlを接種し、通気
量2.5／分、攪拌1000rpm，37℃で培養した。
培養途中、菌の生育につれて培養温度を37℃から
たとえば33℃，29℃，25℃と遂次低下させ、更に
培養途中でグルコース濃度が１％以下になつた時
2.5％宛新しくグルコースを添加して27時間培養
を続けた。また培養中PHはアンモニア水にてPH
6.8に保つた。その時の菌の生育およびヒト白血
球インターフエロンαAの生産量を調べ、表６の
結果を得た。 【表】 実験例 ３ 表７のＬ−シード培地または前記したSS−１
シード培地50mlを200ml容三角フラスコに仕込み、
これに５mg／の塩酸テトラサイクリンを添加し
た後、ヒト白血球IF−αA遺伝子を組入れたプラ
スミドを持つ大腸菌294（ATCC31446）／pLe IF
Ａ trp 25を接種し、37℃で12時間および16時間
夫々培養した。 【表】 次に前記したTSM−３培地に25ｇ／のグル
コース、４ｇ／のＬ−グルタミン酸ナトリウ
ム、27mg／のFeCl3・6H2Ｏ，８mg／の
CuSO4・5H2Ｏ，８mg／のZnSO4・7H2Ｏ，70
mg／の塩酸チアミンおよび５mg／のテトラサ
イクリン塩酸塩を添加した培地2.5を５容ジ
ヤーフアーメンターに仕込み、これに上記種培養
物を接種して実験例２と同じ条件で培養し、生育
およびヒト白血球IFの生産性を測定し、表８の
結果を得た。 【表】 表８から明らかなように、天然培地（Ｌ−シー
ド培地）の種培養物を用いるよりも、合成培地
（SS−１シード培地）の種培養を用いた方が主醗
酵での菌の増殖が早まり、IFの生産量が増大す
ることがわかる。 実験例 ４ SS−１シード培地50mlを200ml容三角フラスコ
に仕込み、これに５mg／の塩酸テトラサイクリ
ンを添加した後、ヒト白血球IF−αA遺伝子を組
入れたプラスミドを持つ大腸菌294
（ATCC31446）／pLe IF Ａ trp 25株を接種
し、37℃で16時間培養した。次にTSM−３培地
に４ｇ／のＬ−グルタミン酸ナトリウム、27
mg／の塩化第２鉄、８mg／の硫酸銅、８mg／
の硫酸亜鉛、70mg／の塩酸チアミンおよび５
mg／のテトラサイクリン塩酸塩を添加した培地
2.5宛を５容ジヤーフアーメンターに仕込み、
これにグルコースを表９に示す条件で添加した。
上記種培養物を接種した後、通気量2.5／分、
攪拌1000r.p.m.，37℃で培養を開始し、菌の増殖
につれて培養温度を37℃から33℃，29℃，25℃と
遂次低下させることによつて溶存酸素濃度が飽和
酸素濃度の10％以上になる様に保つた。培養中PH
はアンモニア水にてPH6.8に調整し、27時間培養
を続けた。その時の菌の生育およびヒト白血球
IF−αAの生産量を調べ、表９の結果を得た。 【表】 【表】 表９から明らかなように、実験No.４−１，４−
２，４−３の場合には、菌の生育およびIF−αA
の生産性が著しく高いことが分かる。 実施例 １ ヒト白血球IF−αA遺伝子を組入れた発現プラ
スミドを持つ大腸菌294（ATCC31446）／pLe IF
Ａ trp 25株を、(1)Ｍ−９培地にグルコース５
ｇ／、カザミノ酸５ｇ／、ビタミンB1塩酸
塩70mg／および塩酸テトラサイクリン５mg／
添加した培地（天然培地）あるいは(2)Ｍ−９培地
にグルコース25ｇ／，Ｌ−グルタミン酸ナトリ
ウム４ｇ／，FeCl3・6H2Ｏ 27mg／，
CuSO4・5H2Ｏ，８mg／，ZnSO4・7H2Ｏ ８
mg／、ビタミン1塩酸塩70mg／、塩酸テトラ
サイクリン５mg／，Ｌ−プロリン50mg／およ
びＬ−ロイシン50mg／を添加した培地（合成培
地）夫々2.5を仕込んだ５容ジヤーフアーメ
ンターへ接種し、通気2.5／分、攪拌1000r.p.
m.，37℃で培養を開始し、途中OD3000KUで33
℃，5000KUで29℃，7000KUで25℃に温度を下
げて48時間培養を続けた。培養中容存酵素濃度は
５％以上に保たれた。途中培養液中のグルコース
濃度が１％以下に低下した時、25ｇ／の割合で
グルコースを添加した。その結果を表10に示す。 【表】 た場合の相対的な値で表わした。
上記表10から明らかなように、(2)合成培地に本
発明の化合物を添加した培地を用いると、IFの
生産性は著しく増大した。 実施例 ２ 実施例１で得られた(2)合成培地培養液２を遠
心分離して菌体を集め、これを100mlの10％シユ
クロース、0.2M NaCl，10mMエチレンジアミ
ンテトラアセート（EDTA），10mMスペルミジ
ン、2mMフエニルメチルスルホニルフルオライ
ド（PMSF），0.2mg／mlリゾチームを含む50mM
Tris−HCl（PH7.6）に懸濁し、４℃で１時間攪拌
したのち、37℃で５分間保温し、これをさらに超
音波破砕器（アルテツク社製、米国）で、０℃40
秒処理した。この溶菌液を11300×１時間遠心分
離して上清95mlを集めた。 この上清95mlを1mM EDTA，0.15M NaClを
含む20mM Tris−HCl（PH7.6）（TEN）で300ml
に希釈したのち、抗IF−αA抗体カラム（29ml）
にかけた。 TENで十分洗浄したのち、さらに0.1％トウイ
ーン20（和光純薬工業株式会社製）を含む0.2M酢
酸でIF−αAを溶出し活性画分を集め、PH4.5に調
整したのちCMセルロースカラムに吸着させ、十
分洗浄後、0.15MNaClを含む0.025M酢酸アンモ
ニウム緩衝液（PH5.0）にて溶出した。再び活性
画分を集めて凍結乾燥に付し320mgのヒト白血球
IF−αA粉末を得た。 このもののSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による分子量は、19000±1000であつた。
また、ここで得られた最終のヒト白血球IF蛋白
質の比活性は２×108 Ｕ／mgであつた。また、
その他の理化学的性状、アミノ酸組成、ペプチド
マツピングにおいて、従来の培地で生産される遺
伝子組換えヒト白血球IFと全く同一の挙動を示
した。 実施例 ３ ヒト免疫IF遺伝子を組入れた発現プラスミド
を持つ大腸菌294（IFO 14171）／pHIT・trp
2101株〔日本特許出願昭58−176090号明細書（日
本特開昭59−186995号公報）参照〕を、(1)TSM
−３培地にグルコース25ｇ／、酵母エキス20
ｇ／および塩酸テトラサイクリン５mg／添加
した培地（天然培地）と(2)TSM−３培地にグル
コース25ｇ／、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム４
ｇ／，FeCl3・6H2Ｏ 27mg／，CuSO4・
5H2Ｏ ８mg／，ZnSO4・7H2Ｏ ８mg／、
塩酸チアミン70mg／および塩酸テトラサイクリ
ン５mg／を添加した培地（合成培地）夫々2.5
を仕込んだ５容ジヤーフアーメンターに接種
し、通気2.5／分、攪拌1000r.p.m.，37℃で培養
を開始し、途中ODが2000クレツト単位になつた
時33℃に、4000クレツト単位になつた時29℃に、
6000クレツト単位になつた時25℃に下げ、26時間
培養を行つた。培養液のPHはアンモニア水で6.8
に保ち、途中培養液中のグルコース濃度が１％以
下になつた時、25ｇ／の割合でグルコースを添
加した。その結果、天然培地(1)でIF−γ生産性
を100とすると合成培地(2)での生産性は550であつ
た。 実施例 ４ 実施例３で得られた合成培地培養液2.4を遠
心分離して菌体を集め、これを120mlの10％シユ
クロース、10mM EDTA，10mMスペルミヂン、
2mM PMSF，0.2mg／mlリゾチームを含む50mM
Tris−HCl（PH7.6）に懸濁し、４℃で１時間攪拌
したのち、37℃で５分間保温し、これを更に超音
波破砕器（アルテツク社製、米国）で、０℃40秒
処理した。この溶菌液を11300×ｇで１時間遠心
分離して上清115mlを集めた。 この上清115mlをTENで360mlに希釈したのち、
抗IF−γ抗体カラム（25ml）〔日本特許出願昭58
−176091号明細書の実施例12および13参照。〕に
かけ、TENで十分洗浄したのち、1M NaCl，
0.1％トウイーン20を含む20mMTris−HCl（PH
7.0）でさらに洗浄し、次に2Mグアニジン、塩酸
塩（シグマ社製、米国）を含むTris−HCl（PH
7.0）で溶出し、得られた活性画分100mlを0.115
％Na2HPO4，0.02％KH2PO4，0.8％NaCl，0.02
％KClからなる緩衝液に対して、４℃で18時間透
析した。 ここで得られた最終のヒト免疫IF蛋白質の量
は47mgであり、その比活性は２×107 Ｕ／mgで
あつた。 また、ここで得られた標品のSDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法による分子量は、18000±
1000であり、それ以外の理化学的性状、アミノ酸
組成、ペプチドマツピングにおいて、従来の培地
で生産される遺伝子組換えヒト免疫IFと全く同
一の挙動を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ インターフエロン産生遺伝子を組入れた発現
ベクターを持つ微生物を、Ｌ−グルタミン酸と鉄
イオン源とを成分既知の状態で添加した合成培地
において培養し、培養物からインターフエロンを
採取することを特徴とするインターフエロンの製
造法。 ２ 培地にさらに亜鉛イオン源を成分既知の状態
で添加することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の製造法。 ３ 培地にさらに銅イオン源を成分既知の状態で
添加することを特徴とする特許請求の範囲第１項
または第２項記載の製造法。 ４ インターフエロン生産遺伝子がヒト白血球イ
ンターフエロン遺伝子である特許請求の範囲第１
項ないし３項記載の製造法。 ５ インターフエロン産生遺伝子がヒト免疫イン
ターフエロン遺伝子である特許請求の範囲第１項
ないし３項記載の製造法。 ６ Ｌ−グルタミン酸を約0.1ないし10ｇ／、
鉄イオン源を約10-5ないし10-3mol／添加する
特許請求の範囲第１項ないし５項記載の製造法。 ７ 亜鉛イオン源を約10-5ないし10-3mol／添
加する特許請求の範囲第２ないし６項記載の製造
法。 ８ 銅イオン源を約10-5ないし10-3mol／添加
する特許請求の範囲第３ないし７項記載の製造
法。 ９ 培地中の炭素源を約0.1ないし５％に保ちつ
つ培養する特許請求の範囲第１ないし８項記載の
製造法。 １０ 培地中の酸素濃度を飽和溶存酸素濃度の約
５％以上になるように保ちつつ培養する特許請求
の範囲第１ないし９項記載の製造法。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP58227750A JPS60118196A (ja) | 1983-11-30 | 1983-11-30 | インタ−フェロンの製造法 |
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| JP58227750A JPS60118196A (ja) | 1983-11-30 | 1983-11-30 | インタ−フェロンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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