JPS625296B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微量成分の免疫検査方法に関し、特に
微量成分を写真化学的により高感度で検査する方
法に関する。 抗原−抗体反応の特異性を利用した微量成分の
検査方法としてラジオイムノアツセイ
（radioimmunoassay、RIA）がある。RIAの原理
は次の如くである。即ち、ラジオアイソトープ
（RI）で標識（ラベル）した一定量の物質と一定
量の特異的な結合蛋白を反応させると両者の結合
体が形成され、一部の標識物質は未結合の遊離状
態で残る。この反応は一般の質量作用の法則に基
いて起る。それ故に、この反応系に標識していな
い物質を加えると、限られた量の結合蛋白との結
合は減少し、両者の間に或る関係（検量線）が成
立する。その結果、結合体と遊離状態の標識物質
を分離し、その一方又は両方のRI量を測定すれ
ば、検量線から未知検体量を知ることができる。
RIAは高感度で且つ簡便なため特に血液中の微量
蛋白質、ホルモン類の測定検査に応用されてい
る。詳細は熊原、鎮目著「新版ラジオイムノアツ
セイ」３〜10頁（1977年朝倉書店発行）、「基礎生
化学実験法(6)生化学的測定」（1967年丸善発行）
などに記載されている。 しかしながら、RIAは、RI標識物質（¹²⁵I、¹³¹I
など）を使用するため幾つかの欠点を有する。即
ち、良い標識物質とは、高い比放射能を有し、免
疫活性が保たれ、且つ放射化学的純度の高いもの
であると言われている。そのためRIAによれば放
射線障害を受け易く且つ高価で不安定な（長期間
使用できない）標識物質の管理が必要である。更
に、RIAを実施するには、特殊な設備、機器及び
放射線取扱資格保持者が必要であり、処理に当つ
ては公害上の問題を解決しなければならない。 それ故に、本発明の目的は放射線障害のない再
現性が高く十分な感度を与える安定な分光増感色
素を標識化合物とした微量免疫検査方法をより高
感度にする方法を提供することにある。 本発明者達は、溶液中の微量成分を分光増感色
素を標識化合物として免疫学的に検出する方法を
探索した結果、写真化学を利用すると上記目的が
効果的に達成できることを見出した。 分光増感色素を標識化合物として溶液中の微量
成分を免疫学的に検出する方法とは、標識化合物
としての写真用分光増感色素、即ちハロゲン化銀
の固有吸収波長域よりも長波長側に（好ましくは
500nｍより長波側に）吸収域を有する増感色素
で抗原又は抗体を標識し、これと測定すべき抗原
又は抗体とを競合的に対応する抗体又は抗原と免
疫反応させた後に、抗原又は抗体と或いは抗原抗
体反応物と結合した増感色素のどちらか一方の増
感色素を、ハロゲン化銀に接触させ露光、現像す
ることによつて得られた現像銀量および／又は発
色色素量を光学濃度とし測定することよりなる。 すなわち、未知量の抗原又は抗体の測定に際し
ては、事前に既知量の標識抗原又は標識抗体と抗
体又は抗原を用いて反応させ、標識された抗原又
は抗体と標識された抗原抗体反応物のうちのいず
れか一方の標識物質の定量をハロゲン化銀を用い
て行ない検量線を作成する。 この検量線に基き、未知量の抗原又は抗体を同
じ系で標識抗原又は抗体と競合反応を行なわせる
ことにより、その量を測定することができる。 本発明者らはすでに、このような新しい原理に
もとずいて、取扱いや廃棄に問題の多いアイソト
ープや標識反応条件が厳しく制限される酵素の代
りに、分光増感剤を標識化合物として利用する抗
原又は抗体の基本的な定量方法を提案した（特開
昭55−116259号）。 本発明者らは今、上記定量法において、特定の
ヒドラジン化合物を、ハロゲン化銀が分光増感剤
標識物と接触させられ、現像されるまでのいずれ
かの段階に共存させると、ハロゲン化銀による検
出感度がより高くなり、より改善された定量法を
提供できることを見出した。 従つて、本発明の目的は、アイソトープや酵素
を使用しない、安全度の高い高感度免疫検査法を
提供することにあり、高感度である故に検査試料
（血液、尿、体液等）の少量化が可能となり、従
つて従来の試料と同量を用いて多項目検査が可能
となる免疫検査方法を提供することにある。 本発明において用いられるヒドラジン化合物と
しては、次の一般式(H)で表わされるヒドラジン化
合物が好ましい。 R¹：置換されてもよいアリール基 R²：水素原子、置換されてもよいアルキル基、
置基されてもよいアリール基 一般式(H)、で表わされる化合物について更に詳
細に説明する。 一般式(H)において、R¹で表わされる置換され
てもよいアリル基は、単環又は２環のアリール基
で、例えばベンゼン環やナフタレン環、特に好ま
しくはベンゼン環を含むものである。 このアリール基は置換されていてもよく、好ま
しくは次のものが挙げられる。 (1) 直鎖、分岐及び環状のアルキル基。好ましく
は炭素数１〜20のもの。例えばメチル基、エチ
ル基、イソプロピル基、ｎ−ドデシル基、シク
ロヘキシル基。 (2) アラルキル基。好ましくはアルキル基部分の
炭素数が１〜３の単環又は２環のもの。例えば
ベンジル基。 (3) アルコキシ基。好ましくは炭素数１〜20のも
の。例えばメトキシ基、エトキシ基。 (4) アミノ基。好ましくは−NH₂基又は炭素数１
〜20のアルキル基でモノ又はジ置換されたもの
（例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ
基）。 (5) アリーロキシ基。好ましくはフエノキシ基。 (6) Ａ−Ｘ（−Ｙ）−_oで表わされる基。 (7)

【式】で表わされる基。 (8) R³CONHNH−Ar−Y″−で表わされる基。 上記(6)のＡ−Ｘ（−Ｙ）−_oで表わされる基におい
て、 (イ) Ｘは、次のX₁〜X₁₁の中から選ばれる２価の
連結基を表わす。すなわち、X₁＝−CSNH−、
X₂＝−Ｓ−CSNA−、

【式】 X₄＝−CONH−、X₅＝−Ｏ−Ｅ−CONH−、

【式】 X₇＝−NHCO−、X₈＝−Ｏ−、X₉＝−SO₂NH
−、X₁₀＝−Ｅ−NH−、X₁₁＝−Ｅ＝Ｎ−。 (ロ) Ｙは次のy₁〜y₁₁の中から選ばれる２価の連
結基を表わす。すなわち、y₁＝−CONH−、y₂
＝−Ｅ−CONH−、y₃＝−Ｅ−、y₄＝−Ｅ−Ｏ
−E′−、y₅＝−Ｅ−Ｓ−E′−、y₆＝−SO₂NH
−、y₇＝−Ｅ−SO₂NH−、y₈＝−NHCONH
−、y₉＝−Ｅ−NHCONH−、y₁₀＝−Ｅ−Ｏ−
E′−CONH−、y₁₁＝−Ｅ−E′−。｛ここでR₁₁
は水素原子、脂肪族基（好ましくは炭素数１乃
至20のアルキル基、３乃至12員のシクロアルキ
ル基、炭素数２乃至20のアルケニル基）、又は
芳香族基（好ましくはフエニル基又はナフチル
基）を表わし、R₁₂は水素原子又はR₁₁で例示し
た脂肪族基を表わす。R₁₁とR₁₂は互いに結合し
て環を形成してもよく、その好ましい例として
は、

【式】 【式】

などを挙げることができる（従つて、この場
合、Ａは水素を表わす）。また、R₁₁とR₁₂が環
を形成しない場合、R₁₁とR₁₂のどちらか一方は
水素原子である。 Ｅ及びE′は２価の飽和又は不飽和の脂肪族
基（例えばエチレン基、１−メチルプロピレン
基の如きアルキレン基、プロペニレン基、ブテ
ニレン基の如きアルケニレン基）又は２価の芳
香族基（例えばフエニレン基、ナフチレン基、
５−アミノ−１・２−フエニレン基）などを表
わす。ただしy₁₁の−Ｅ−E′−では、ＥとE′は
互いに異なる２価の基を表わし、X₁₁の−Ｅ＝
Ｎ−においては、Ｅは−（CH₂）_n−CH＝（ただ
しｍは０〜２の整数）を表わす。｝ (ハ) ｎは０又は１なる整数を表わす。ｎ＝１の場
合のＸとＹの組合せとしては、特に、x₃−y₂、
x₇−y₂、x₈−y₂、x₁₂−y₃、x₃−y₇、x₅−y₉、x₉
−y₉、x₃−y₁₀が好ましい。 (ニ) Ａは直鎖、分岐又は環状のアルキル基（好ま
しくは炭素数１乃至20のもの。例えばメチル
基、プロピル基、ｎ−ヘキシル基など）、単環
又は２環のアリール基（例えばフエニル基）、
単環又は２環のアラルキル基（好ましくは炭素
数７乃至26のもの。例えばベンジル基）、複素
環残基（少なくとも１個のヘテロ原子を含む５
乃至６員環であつて、芳香環、特にベンゼン環
と縮合していてもよい。特に、少なくとも１個
の窒素原子を含有する複素環残基が好ましい。
例えば、チアゾリル基、ベンズチアゾリル基、
イミダゾリル基、チアゾリル基、ピリジニル
基、テトラゾリル基、ベンズトリアゾリル基、
インダゾリル基、ベンズイミダゾリル基、ヒド
ロキシテトラザインデン−２又は−３イルなど
の他、２−メルカプトベンズチアゾリル基、２
−メルカプトベンズオキサゾリル基などのメル
カプト基を有する複素環残基や、２−メチルベ
ンズチアゾリニウム−３−イル、２−（Ｎ−ス
ルホエチル−ベンズチアゾリニオ）、Ｎ・Ｎ−
ジメチルベンズイミダゾリニウム−２−イルな
どの４級窒素原子を有する複素環残基）を表わ
す。 Ａで表わされる基は置換基を有していてもよ
い。その例としては、アルコキシ基（好ましく
は炭素数１乃至18のもの。例えばメトキシ
基）、アルコキシカルボニル基（好ましくは炭
素数２乃至19のもの。例えばエトキシカルボニ
ル基）、単環又は２環のアリール基（例えばフ
エニル基）、アルキル基（好ましくは炭素数１
乃至20のもの。例えばメチル基、ｔ−アミル
基）、ジアルキルアミノ基（好ましくは炭素数
１乃至20のもの。例えばジメチルアミノ基）、
アルキルチオ基（好ましくは炭素数１乃至20の
もの。例えばメチルチオ基）、メルカプト基、
ヒドロキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル
基、ニトロ基、シアノ基、スルホニル基（好ま
しくは炭素数１乃至20のもの。例えばメチルス
ルホニル基）、カルバモイル基（好ましくは炭
素数１乃至20のもの。例えばカルバモイル基、
ジメチルカルバモイル基）などがある。 前記(7)の

【式】で表わされる基に おいて、 (イ) Ｚは

【式】 と共に５員又は６員の複素環を形成する非金属
原子群であり、該複素環は具体的には、チアゾ
リン環、ベンズチアゾリン環、ナフトチアゾリ
ン環、チアゾリジン環、オキサゾリン環、ベン
ズオキサゾリン環、オキサゾリジン環、セレナ
ゾリン環、ベンズセレナゾリル環、イミダゾリ
ン環、ベンズイミダゾリン環、テトラゾリン
環、トリアゾリン環、チアジアゾリン環、１・
２−ジヒドロピリジン環、１・２−ジヒドロキ
ノリン環、１・２・３・４−テトラヒドロキノ
リン環、パーヒドロ−１・３−オキサジン環、
２・４−ベンズ〔ｄ〕オキサジン環、パーヒド
ロ−１・３−チアジン環、２・４−ベンズ
〔ｄ〕チアジン環、ウラシル環等が挙げられ
る。 (ロ) Ｂは水素原子または飽和もしくは不飽和の脂
肪族基｛例えばアルキル基（好ましくは炭素数
１乃至20のもの。例えばメチル基エチル基）、
アルケニル基（好ましくは炭素数２乃至22のも
の。例えばアリル基）、アルキニル基（好まし
くは炭素数２乃至20のもの。例えばブチニル
基）｝であり、これは更にアルコキシ基、アル
キルチオ基、アシルアミノ基、アシロキシ基、
メルカプト基、スルホ基、カルボキシル基、ヒ
ドロキシ基、ハロゲン原子、アミノ基などで置
換されていてもよい。 (ハ) Y′は前述(6)で述べたＹと同じ意味を表わ
す。 (ニ) ｎは０又は１を表わす。 前記(8)のR³CONHNH−Ar−Ｙ−で表わされる
基において (イ) R³は後述するR²と同義である。 (ロ) −Ar−は２価のアリール基、好ましくはフ
エニレン基を表わす。この基は置換基を有して
いてもよい。 (ハ) Y″は前述(6)で述べたＹと同じ意味を表わ
す。特にy₃〜y₅で表わされる２価の連結基が好
ましい。 一般式(H)において、R²は水素原子、置換され
てもよいアルキル基又は置換されていてもよいア
リール基を表わす。置換基としては、ハロゲン原
子、シアノ基、カルボキシ基、スルホ基などを挙
げることができる。 R²で表わされる水素原子以外の基の具体例は
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロ
ピル基、フエニル基、４−クロロフエニル基、４
−ブロモフエニル基、３−クロロフエニル基、４
−シアノフエニル基、４−カルボキシフエニル
基、４−スルホフエニル基、３・５−ジクロロフ
エニル基、２・５−ジクロロフエニル基である。 R²で表わされる置換基のうち好ましいのは水
素原子、メチル基、及び置換されたものも含むフ
エニル基である。特に好ましいのは水素原子であ
る。 これらの一般式(H)で表わされる化合物の中で好
ましい化合物は特開昭53−10921、同53−20922、
同53−66732、特開昭55−52050、同55−90940、
特開昭53−20318、リサーチデイスクロージヤー
誌17626号（1978年No.176）などに記載されてい
る。この中で特に好ましいのは特開昭53−
10921、同53−20922、同53−6732に記載された化
合物である。 一般式(H)で表わされる化合物例を以下に示す。
本発明は以下の化合物のみに限定されるものでは
ない。 これらの化合物の合成法は特開昭53−20921、
同53−20922、同53−66732、同53−20318などに
記載されている。 本発明に於いて抗原又は抗体、或いは抗原−抗
体結合物と結合した分光増感色素をハロゲン化銀
と接触させる方法としては、ハロゲン化銀を含む
乳剤層に前記分光増感色素を滴下する方法、或い
はハロゲン化銀を含む乳剤溶液に上記物質を滴下
する方法、ハロゲン化銀を含む乳剤層に接触させ
る方法などがある。 本発明におけるヒドラジン化合物を共存させた
状態でハロゲン化銀に標識用増感色素を接触（吸
着）させ、露光し、現像する方法としては、上記
方法においてヒドラジン化合物を検液やスポツト
液中に存在せしめてもよいし、あらかじめハロゲ
ン化銀感材中に内蔵せしめてもよいし、また、現
像液中に添加してもよい。 本発明における現像処理は一般式(H)で表わされ
る化合物の存在下に実施される。これは、一般式
(H)で表わされる化合物を本発明のハロゲン化銀写
真感光材料の親水性コロイド層中の少なくともひ
とつに含有せしめること、一般式(H)で表わされる
化合物を現像処理前の前浴中や現像処理液中又
は、免疫反応に用いる緩衝液中に含有せしめるこ
と、等の種々の手段によつて達成される。 一般式(H)で表わされる化合物をハロゲン化銀感
光材料中に含有させる場合の量は、10^-8ないし
10^-1mol／molAg、好ましくは10^-6ないし５×
10^-2mol／molAgである。 一般式(H)で表わされる化合物を感光材料中に含
有せしめるには、写真乳剤に添加剤を加える場合
に通常用いられる方法を適用できる。たとえば、
水溶性の化合物は適当な濃度の水溶液とし、水に
不溶または難溶性の化合物は水と混和しうる適当
な有機溶媒、たとえばアルコール類、グリコール
類、ケトン類、エステル類、アミド類などのうち
で、写真特性に悪い影響を与えない溶媒に溶解
し、溶液として、写真乳剤もしくは、非感光性の
親水性コロイド溶液に添加することができる。ま
た、水不溶性（いわゆる油溶性）のカプラーを乳
剤中に分散物の形で加えるときの、よく知られた
方法を用いることもできる。 一般式(H)で表わさる化合物を前浴又は現像処理
液又は、免疫反応に用いる、緩衝液に含有せしめ
る場合の量は、前浴又は現像処理液又は、上記緩
衝液１当り５mgないし15ｇ、好ましくは10mgな
いし５ｇである。 本発明において、最も好ましい方法は、ヒドラ
ジン化合物をあらかじめハロゲン化銀乳剤混合し
て塗布しておく方法である。本発明の方法におい
てブランクの濃度をおさえるために、同時に検液
中、スポツト液中、ハロゲン化銀感材中、または
現像液中に後述の通常乳剤用として用いられるカ
ブリ防止剤を併用してもよい。 本発明の方法に於て、抗原又は抗体を標識する
ために用いる写真用分光増感色素は、ハロゲン化
銀に分光感度を付与する性質を持つので、写真感
光材料の分光増感色素として知られており、例え
ばシアニン色素、メロシアニン色素、ヘミシアニ
ン色素、スチリル色素などがある。これらは具体
的には“The Theory of the Photographic
Process（第４版）”（Edited by T.H.James、
1977年 Macmillan社刊）及び“Cyanine Dyes
and Related Compounds”（F.M.Hamer著、
1964年Interscience Publishers刊）などに記載さ
れている。さらに具体的には、米国特許第
2493748号、同第2519001号、同第2652330号、西
独特許第1177481号、仏国特許第1412702号、英国
特許第489335号などに記載されているメロシアニ
ン色素、また米国特許第2238213号、同第2503776
号、同第2537880号、同第3196017号、同第
3397060号、西独特許第929080号、同第1028718
号、同第1113873号、同第1163671号、同第
1177482号、仏国特許第1359683号、英国特許第
840223号、同第886270号、同第886271号、同第
904332号、ベルギー国特許第654816号、特公昭40
−14112号、特公昭40−23467号などに記載されて
いるシアニン色素が何れも本発明に有用な色素で
ある。これらの色素は少くとも２つ以上併用され
てもよい。例えば、特公昭43−4932号、特公昭43
−4936号、特公昭43−22884号公報などに記載さ
れている色素の併用を含む強色増感も本発明に有
用である。また米国特許第2947630号、同第
2933390号、同第2937089号、同第3617295号、同
第3635721号、仏国特許第1500218号などの強色増
感も有用である。この場合強色増感材は標識され
た抗原又は抗体といつしよに混合されていても、
あるいはあらかじめハロゲン化銀乳剤中に加えら
れていてもよい。 これらの分光増感剤のうち、下記の色素は、抗
原または抗体との結合力にすぐれ、殊に有利な標
識化合物である。 (1) 複素環に、少くとも一つのメルカプト基、ア
ミノ基、ヒドロキシ基またはカルボキシ基を有
する下記式（）のシアニン色素。 ここでｍとｎは各々１又は２を表わし、ｐ
は、２又は３、ｑは１または２を表わす。
L₁、L₂、L₃は、同一又は異なつて、メチン基
（アルキル基、ハロゲン、アリール基などで置
換されていてもよい）を表わし、Ｚ及びZ₁は、
各々５員または６員の含窒素ヘテロ環核を完成
するに必要な非金属原子群を表わし、同一でも
異なつていてもよい。ＲおよびR₁は、同一で
も異なつていてもよく、置換又は無置換アルキ
ルアルコール残基を表わす。 R₂はＺの置換基であり、水素または −Ｐ_i−Ｑ_j−Ｗ （式中、Ｐは

【式】 〔式中、D₁、D₂は縮合多環芳香族ヘテロ環残基または芳香族ヘテロ環置換アミノ基を表わし、これらは−SO₃M基を含んでもよい。Ｍは、水素、、アルカリ金属またはアンモニウムを表わす。−Ａ−は、２価の芳香族残基を表わし、これらは−SO₃M基を含んでもよい。ただし、上記D₁、D₂に−SO₃M基が含まれないときは、−Ａ−に−SO₃M基を含む必要がある。〕

本発明において用いられる一般式〔〕におい
て、D₁、D₂にて示される縮合多環芳香族ヘテロ
環残基としては、２−ベンゾトリアゾリル基、２
−ナフトトリアゾリル基などが、芳香族ヘテロ環
置換アミノ基としては、１・３・５−トリアジン
−２−イルアミノ基、１・３−ジアジン−２−イ
ルアミノ基などを挙げることができる。 Ａで表わされる２価芳香族残基のうち有用なも
のは下記の如くである。 スルホ基を有するもの； 等。 スルホ基を有しないもの； 等。 Ａにスルホ基を有しない場合は、D₁、D₂の少
くとも一つはSO₃Mを含有する置換基を有する。 また、Ａで表わされる２価芳香族残基のうちよ
り有用なものとしては

【式】を挙げることが できる。 ハロゲン化銀乳剤の調製法は例えばTrivelliと
Smith著「The Photographic Journal」vol.79、
pp.330〜338（1939）；C.E.K.Mees著「The
Theory of the Photographic Process」
Macmillan；やGlafkides著「Photographic
chemistry」vol.1、pp.327〜336（Fauntain
Press）に記載されている。 本発明において用いられる乳剤中のハロゲン化
銀粒子は、通常粒子サイズでも微粒子サイズのも
のでも用いることができるが、粒子の平均直径
（例えばプロジエクテツド・ニリア法数平均によ
る測定）で0.04μ〜４μのものが好ましい。ま
た、乳剤中のハロゲン化銀粒子のサイズ分布は狭
い方が望ましい。そのために、ハロゲン化銀の粒
子形成には、ダブルジエツト法、コンバージヨン
法、粒子形成中のpAgを制御しながら粒子形成さ
せる、いわゆるコントロールド・ダブルジエツト
法を用いることができる。 本発明において用いられるハロゲン化銀乳剤は
化学熟成しない乳剤でもよいが、通常用いられて
いる化学増感法、例えば金増感（米国特許第
2540085、同第2597876、同第2597915、同第
2399083など）、第族金属イオンによる増感；硫
黄増感（米国特許第1574944、同第2278947、同第
2440206、同第2410689、同第3189458、同第
3415649など）、還元増感（米国特許第2518698、
同第2419974、同第2983610など）、またはその複
合された各種増感法が適用される。 更に具体的な化学増感剤としては、アリルチオ
カルバミド（allyl thio carbamide）、チオ尿素、
ソジユウム、・チオサルフエートやシスチンなど
の硫黄増感剤；ポタシウムクロロオーレイト、オ
ーラス、・チオサルフエートやポタシウムクロロ
パラデート（potassium chloropalladate）など
の貴金属増感剤；塩化スズ、フエニルヒドラジン
やレダクトンなどの還元増感剤などを含んでよ
い。ポリオキシエチレン誘導体（英国特許第
981470、特公昭31−6475、米国特許第2716062な
ど）、ポリオキシプロピレン誘導体、４級アンモ
ニウム基をもつ誘導体などの増感剤を含んでいて
よい。 本発明において用いられるハロゲン化銀乳剤
は、適当なカブリ防止剤（antifoggant）や安定
剤（stabilizer）を含有しうる。例えば米国特許
第2131038や同第2694716などで記載されているチ
アゾリウム塩（thiazolium salts）；米国特許第
2886437や同第2444605などで記載されているアザ
インデン類（azaindenes）；米国特許第3287135
などで記載されているラウゾール類
（urazoles）；米国特許第3236652などで記載され
ているスルホカテコール類（sulfocatechols）；
英国特許第623448などで記載されているオキシウ
ム類（oximes）；米国特許第2403927、同第
3266897、同第3397987などに記載されているメル
カプトテトラゾール類（mercaptotetrazoles）、
ニトロン（nitron）；ニトロインダゾール類
（nitroindazoles）；米国特許第2839405などで記
載されている多価金属塩（polyvalent metal
salts）；米国特許第3220839などで記載されてい
るチウロニウム塩（thiuronium salts）；米国特
許第2566263、同第2597915などで記載されている
パラジウム、白金および金の塩など用いられる。 本発明にて用いられるハロゲン化銀乳剤は現像
主薬（例えばハイドロキノン類、カテコール類、
アミノフエノール類、３−ピラゾリドン類、アス
コルビン酸やその誘導体、リダクトン類
（reductones）やフエニレンジアミン類
（phenylenediamines）など）、または現像主薬の
組合せを含有させることができる。現像主薬
（developing agents）は感光性乳剤中そして／ま
たは写真要素中の他の適当なところへ入れられう
る。現像主薬は適当な溶媒からまたは米国特許第
2592368や仏国特許第1505778に記載されている分
散物の形で添加することができる。このような現
像主薬を内蔵させた感光性塗布フイルムを用いる
場合、露光後、通常の写真現像液を用いることが
できるが通常の写真現像液成分の中、現像主薬成
分を除いた組成の処理液（アルカリアクチベータ
ー）を用いることもできる。 本発明において、支持体上に塗布されるハロゲ
ン化銀乳剤層のバインダーとしては通常のゼラチ
ン（アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン）
が、用いられる。さらにまた皮膜形成可能な高分
子材料をゼラチンの一部または全量を置換して使
用することもできる。このような皮膜形成可能な
高分子材料として、たとえばアルブミン、寒天、
アラビアゴム、アルギン酸、アシル化ゼラチン
（例えばフタル化ゼラチン、マロン化ゼラチン
等）など、またビニールアルコール、ビニルピロ
リドン、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ア
クリル酸のごとき親水性ビニル化合物のホモポリ
マーまたは２等のビニル化合物を含むコポリマ
ー、またはセルロース化合物（例えばヒドロキシ
エチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストリン等）、水可溶性澱粉のような感
光性ハロゲン化銀に対し有害な作用をおよぼすこ
とのない物質も使用される。 ハロゲン化銀乳剤層以外の塗布層（たとえば
過層、フイルター層、下びき層）にも乳剤層と同
じような皮膜形成可能な高分子材料を用いること
ができる。 本発明に於いて抗原または抗体と結合した分光
増感色素を吸着しているハロゲン化銀の露光には
種々の光源が用いられる。但しいずれの場合にも
ハロゲン化銀の固有吸収域の波長の光を除き分光
増感色素のみが吸収する波長の光だけが用いられ
る。例えば、タングステンランプ、ハロゲンラン
プ、水銀ランプ、キセノンランプなどは適当な光
学フイルター（例えば富士フイルム製シヤープカ
ツトフイルター、金属干渉フイルターなど）と組
み合せて用いられる。また、固体レーザー（例え
ばルビーレーザーなど）、半導体レーザー（例え
ば硫化鉛レーザーなど）、色素レーザー、ガスレ
ーザー（例えばネオンヘリウムレーザー、アルゴ
ンレーザーなど）なども有利に用いられる。 本発明において行なわれる現像処理には次のよ
うな方法を用いることができる。すなわち支持体
上に乳剤が塗布されている場合においては、従来
より写真の現像で実施されている現像処理法によ
つて行なうことができる。より具体的には一般の
写真フイルム、印画紙を現像処理する方法などを
用いることができる。また乳剤が塗布された支持
体上に写真処理剤を展開又は塗布又は浸漬又は吹
き付けることなどによつて写真処理を行なうこと
もできる。更に、乳剤が液状である場合において
は、これに現像処理液を添加・混合することによ
り写真処理を行なうこともなしえる。 上記の如く露光された乳剤層は従来行なわれて
いる写真処理法によつて処理される。処理液には
公知のものを用いることができる。処理温度は普
通18℃から50℃の間に選ばれるが、18℃より低い
温度または50℃をこえる温度としてもよい。 現像処理温度の上昇に伴つて、黒化度が高くな
る。従つて通常、予め定められた恒温で処理する
ことが望ましい。しかし恒温現像処理の代わりに
中和層と温度補償ポリマー層とを組合わせること
によつて、温度変化によつて実質上、黒化度が変
化しない方法もある。たとえば米国特許3362819
号、4028103号にあるような酸ポリマー層と米国
特許4056394号、4061496号に、日本特開昭53−
72622にみられる温度補償層とを組合わせた塗布
層に接して、現像を進行させることができる。 黒白写真処理する場合に用いる現像液は、知ら
れている現像主薬を含むことができる。現像主薬
としては、ジヒドロキシベンゼン類（たとえばハ
イドロキノン）、３−ピラゾリドン類（たとえば
１−フエニル−３−ピラゾリドン）、アミノフエ
ノール類（たとえばＮ−メチル−ｐ−アミノフエ
ノール）、１−フエニル−３−ピラゾリン類、ア
スコルビン酸及び米国特許4067872号に記載の
１・２・３・４−テトラヒドロキノリン環とイン
ドレン環とが縮合したような複素環化合物類など
を、単独もしくは組合せて用いることができる。
現像液には一般にこの他公知の保恒剤、アルカリ
剤、PH緩衝剤、カブリ防止剤などを含み、さらに
必要に応じ溶解助剤、色調剤、現像促進剤、界面
活性剤、消泡剤、硬水軟化剤、硬膜剤、粘性付与
剤などを含んでもよい。 現像処理の特殊な形式として、現像主薬を感光
材料中、たとえば乳剤層中に含み、感光材料をア
ルカリ水溶液中で処理して現像を行なわせる方法
を用いてもよい。現像主薬のうち、疎水性のもの
はリサーチデイスクロージヤ（Research
Disclosure）169号にRD−16928として開示され
ているようにラテツクス分散して乳剤層中に含ま
せることができる。このような現像処理は、チオ
シアン酸塩による銀塩安定化処理と組合せてもよ
い。 上述の黒白写真写理に代えて、通常のカラー写
真法で用いられているような、カラー現像処理を
行わせることもできる。この場合カプラーは予
め、現像液の中に溶解させておくか、あるいは予
め乳剤塗布層の中に含有させておく（例えばT.
H.James編“The Theory of the Photographic
Process：4th Edition”p335〜362、
1977Macmillan Pub.Co.、Inc.参照）。 カラー現像処理によつて、露光された部分は、
銀による黒化と発色々材による着色がみられるの
で、銀のみによる黒化よりも高い光学濃度が得ら
れる利点がある。カラー現像処理によつて得られ
た現像部分は、発色々材の光吸収波長の光で、銀
による黒化と発色々材による着色の光吸収量を測
定できる。 停止液には、現像を停止しうる薬剤、たとえ
ば、鉱酸、有機酸などのPH低下剤、メルカプト化
合物の水溶液を用いることができる。また、定着
液が現像を停止しうるほど十分に低PHである、い
わゆる酸性定着液の場合には停止液を省略しても
よい。定着液は定着剤を主剤とする水溶液からな
る。 定着剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩の
ほか、定着剤としての効果が知られている有機硫
黄化合物を用いることができる。 定着液には硬膜剤として水溶性アルミニウム塩
を含んでもよい。 本発明の方法に使用される標識化合物、即ち分
光増感色素は放射性を有しないため、ラジオイム
ノアツセイ法のような放射能障害を与えず、放射
線取扱資格保持者でなくても測定検査を行なうこ
とができるだけでなく、しかも標識化合物の安定
性が優れているため、標識化合物の長期保存が可
能となる。また、黒化度の測定機器として通常写
真画像の測定で使用されている光学濃度計でも充
分使用できるため、簡便且つ低コストで測定でき
る。 本発明は、このように有用な方法の感度をさら
に高める方法を提供するものである。光学濃度の
測定には光路に適当なカラーフイルターを挿入し
て黒化度を測定できる。通常の写真処理を完了し
た乾燥フイルムの黒化度を測定できる。あるい
は、現像過程の終了時あるいは停止過程の終了時
あるいは定着過程の終了時に、液中に浸漬したフ
イルムの黒化度を測定できる。 実施例 １ 精製ブタインシユリン（シグマ社製）20mgを、
4M尿素１mlに溶解し、さらにDMF（ジメチルホ
ルムアミド）８mlを加え、氷冷下（０〜４℃）で
撹拌する（Ａ液）。色素（） ５mgをDMF2mlに溶解したものを３組用意し、−
15〜−20℃に冷却下、クロロギ酸イソブチル各５
μ及びトリエチルアミン各1.5μを添加し、
次に同じく冷却下にヒドロキシサクシイミド各２
mgを添加する（Ｂ液）。次に、Ａ液を氷冷撹拌
下、上記Ｂ液を５分間隔で添加反応させる。氷冷
下30分間、室温30分間反応させた後に、0.2Nア
ンモニア水で平衡化したセフアデツクスＧ−10カ
ラムで脱塩後、凍結乾燥して色素標識インシユリ
ンを得た。 収量24.6mg λ^２％^ＳＤＳ _ｎａｘ＝660nｍ ε_660om
≒3.2
×10⁵本標識物のアミノ末端分析において、ブタ
インシユリンのアミノ末端であるグリシン及びフ
エニルアラニンは検出されなかつた。また、セフ
アデツクスＧ−50（１％SDSで平衡化）カラムで
のクロマトグラフイーにおいて、本標識物は、単
一ピークを示した。 このようにして得られた精製物を一定量採取
し、これに既知濃度（５μＵ／ml〜320μＵ／
ml）のインシユリンを含有する溶液を添加混合し
平衡化した後、力価の定められた一定量の抗イン
シユリンモルモツト血清と抗原抗体反応を起こさ
せ、ついで抗モルモツトＩｇＧウサギ血清反応後
反応混合物を遠心分離してＢ（反応物）／Ｆ（未
反応物）分離を行う。未感光のAgBrCl乳剤（Cl
＝20モル％、平均粒子サイズ0.8μ）を支持体上
に塗布した写真フイルム（）上の5nｍφの面
積に、遠心分離した液の上澄液（Ｆ＝未反応物）
10μを滴下する。15分放置後、富士フイルム製
SC−60フイルターを通して5000Lux1秒露光し、
下記処方の現像液Ａにより20℃10分現像した後、
常法により、定着水洗乾燥し、得られた写真フイ
ルム上の黒化濃度を富士フイルム製写真濃度計に
て測定を行ない検量線を作成した。 上と同じ乳剤にパラトリル−ホルミルヒドラジ
ン（Ｈ−２）を2.5×10^-2モル／モルAg添加し、
塗布銀量、膜厚、Ag／GCl比が上記ハロゲン化
銀感材と同じになるように塗布したフイルム
（）を用い、上と同一の上澄を用いて、以下同
一の条件で検量線を作成し、両者を比較した（第
１表）。

【表】

【表】 この結果より、明らかにヒドラジン化合物によ
り検出感度上昇がみとめられた。 現像液Ａ メトール 0.31ｇ 亜硫酸水素ナトリウム 39.6ｇ ハイドロキノン 6.0ｇ 炭素ナトリウム（一水塩） 21.9ｇ 臭化カリウム 0.86ｇ クエン酸 0.68ｇ メタ重亜硫酸カリウム 1.50ｇ 水を加えて １ 実施例 ２ ヒトリゾチーム（白血病患者の尿より精製）50
mgを２mlの2M尿素に溶解し、さらにDMFを６ml
加え、氷冷下（０〜４℃）で撹拌する。色素
（） 各２mgを３本の小試験管に秤取し、各２mlの
DMFを加えて溶解する。これを、−15〜−20℃に
冷却下、クロロギ酸イソブチル各２μ及びトリ
エチルアミン各１μを添加し、活性化する。次
に、上記ヒトリゾチーム溶液を氷冷、撹拌しなが
ら、活性化した色素（）を、５分間隔で添加、
反応させる。氷冷下30分反応させた後、0.2Nア
ンモニア水で平衡化したセフアデツクスＧ−10カ
ラムで脱塩後、凍結乾燥して色素標識ヒトリゾチ
ームを得た。収量約52mg。 λ^２％^ＳＤＳ _ｎａｘ＝665nｍ ε_660om≒1.64×10⁵本
標識
物のアミノ末端分析において、ヒトリゾチームの
アミノ末端であるリジンは検出されなかつた。ま
た、セフアデツクスＧ−50（１％SDSで平衡化）
カラムでのクロマトにより、本標品は、単一ピー
クを与えた。また、ミクロコツカス・リゾデイツ
クテイカス（Micrococcus LysodeiKticus）の菌
体を基質にした溶菌活性において、未修飾の酵素
とほぼ同等の活性を示した。 上記方法によつて得た色素標識ヒトリゾチーム
を0.05Mトリス塩酸バツフアーPH8.0に溶解し、
1nｇ／ml、0.5nｇ／mlの２種の溶液を調製した。
これを用いて、実施例１と同じ乳剤を用い塗布条
件を同じにして塗布した３種類のフイルムを用い
て、その検出感度を調べた。結果を第２表に示
す。

【表】 Ｈ−２：2.5×10^-2モル／モルAg又は、100mg／
スポツト液 Ｈ−９：2.5×10^-4モル／モルAg又は、１mg／
スポツト液 から行なつた（10⁵lux×10^-3secに担当）。現像液
は下記に示す処方の現像液(B)を用い、20℃、10分
間現像し、常法により定着水洗乾燥後、スポツト
部の黒化濃度を測定した。結果を第３表に示す。
表中、黒化濃度差（△Ｄ）は上記バツフアーのみ
を滴下した部分と各スポツト部の濃度差を表わ
す。

【表】

【表】 現像液処方(B) メトール ２ｇ 亜硫酸ナトリウム 40ｇ ハイドロキノン ４ｇ 炭酸ナトリウム 28ｇ 臭化カリ １ｇ 水を加えて １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗原又は抗体に標識化合物を標識することに
   より微量成分を免疫検査する方法において、測定
   されるべき抗原又は抗体と、分光増感色素により
   標識したそれらの抗原又は抗体とを競合的に、対
   応する抗体又は抗原と免疫反応させ、標識された
   抗原又は抗体或いは標識された抗原−抗体反応物
   のどちらか一方をハロゲン化銀と接触させ、分光
   増感色素の吸収する波長の光で露光し、次いで露
   光されたハロゲン化銀を現像し、得られる現像銀
   又は発色色素の光学濃度を測定することにより微
   量成分を検査する方法において、標識された抗原
   又は抗体或いは標識された抗原抗体反応物のどち
   らか一方を下記に示す一般式(H)で示されるヒドラ
   ジン化合物の共存下でハロゲン化銀に接触させ標
   識に用いた分光増感色素の分光増感波長の光で露
   光し、現像することを特徴とする微量免疫検査方
   法。 R¹：アリール基、置換アリール基 R²：水素、アルキル基、置換アルキル基、アリ
   ール基、置換アリール基