JPS6255102B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、増感色素の分光増感特性とハロゲン
化銀との組合わせによる増感色素又は、増感色素
で標識した微量成分の微量検出法に用いられる、
検出されるべき増感色素又は増感色素標識化合物
を含有した微量成分測定用試薬とその安定化方法
及びそれを用いた微量成分の測定方法に関する。 増感色素標識化合物とハロゲン化銀を組合わせ
た微量検出法を用いる微量成分測定法としては、
たとえば、（Ｉ）抗原又は抗体の増感色素による
漂識物と、測定すべき抗原又は抗体とを、その抗
原又は抗体と特異的に反応する抗体又は抗原と競
合的に反応させ、その結果生成した標識された抗
原−抗体反応物あるいは、未反応の標識された抗
原又は抗体のいずれか一方をハロゲン化銀と接触
させ、次に、分光増感色素に対応する分光増感波
長域の光で露光し次いで露光されたハロゲン化銀
を現像し、得られた現像銀又は発色色素の光学濃
度を測定することを特徴とする微量免疫検査方
法、（II）測定されるべき酵素により特異的に接
触される基質構造をもち、しかも増感色素により
標識された合成基質を用い、測定されるべき酵素
との酵素反応により生成した増感色素を含む反応
生成物か又は、未反応合成基質のいずれか一方を
ハロゲン化銀と接触させ、次に分光増感色素の分
光増感波長域の光で露光し、次いで、現像し得ら
れた現像銀又は発色色素の光学濃度を測定するこ
とを特徴とする微量酵素定量方法、（III）（Ｉ）で
使用したと同様の色素標識抗原又は抗体を用い、
特異的な抗原・抗体反応を利用して相対する抗体
や抗原あるいは、それらの受容体の組織内での存
在位置分布などをハロゲン化銀との組み合わせで
検出する方法などがある。 （Ｉ）（III）に示した抗元−抗体反応の特異性
を利用した微量成分の検査方法としては、ラジオ
イムノアツセイ法（radioimmunoassay RIA法）
がある。たとえば、（Ｉ）に相当するRIA法の原理
は、次の如くである。 即ち、ラジオアイソープ（RI）で標識（ラ
ベル）した一定量の物質と一定量の特異的な結合
蛋白を反応させると両者の結合体が形成され、一
部の標識物質は未結合の遊離状態で残る。この反
応は一般の質量作用の法則に基いて起る。それ故
に、この反応系に標識していない物質を加える
と、限られた量の結合蛋白との結合は減少し、両
者の間に或る関係（検量線）が成立する。その結
果、結合体と遊離状態の標識物質を分離し、その
一方又は両方のRI量を測定すれば、検量線から
未知検体量を知ることができる。RIAは高感度で
且つ簡便なため特に血液中の微量蛋白質、ホルモ
ン類の測定検査に応用されている。詳細は熊原、
鎮目著「新版ラジオイムノアツセイ」３〜10頁
（1977年朝倉書店発行）、「基礎生化学実験法(6)生
化学的測定」（1967年丸善発行）などに記載され
ている。 しかしながら、RIAは、RI標識物質（¹²⁵I、
¹³¹Iなど）を使用するため幾つかの欠点を有す
る。即ち、良い標識物質とは、高い比放射能を有
し、免疫活性が保たれ、且つ放射化学的純度の高
いものであると言われている。そのためRIAによ
れば放射線障害を受け易く且つ高価で不安定な
（長期間使用できない）標識物質の管理が必要で
ある。更に、RIAを実施するには、特殊な設備、
機器及び放射線取扱資格保持者が必要であり、処
理に当つては公害上の問題を解決しなければなら
ないという問題点があつた。 また、微量成分としての酵素の活性測定法に関
しては次のような方法があつた。 たとえば高分子物質のケンダク液を用い、酵素
反応による濁度の減少を追跡する比濁法、あるい
は、高分子基質の分解による可溶化分を未分解基
質を沈澱回収したのち吸光度測定により求める吸
光度法、同じく高分子基質に染料やケイ光物質を
結合させておき、酵素反応により低分子化した染
料やケイ光物質を分別して定量する方法、また酵
素反応により基質の一部が脱離したり変化するこ
とにより吸収スペクトルに差を生じたり発色した
り、またケイ光物質を生成したりするしくみをそ
なえた基質を用い、吸光度やケイ光強度を測定す
ることによる方法、などがある。（生化学実験講
座５巻 酵素研究法（日本生化学会編、東京化学
同人刊1979年）） これらの方法の多くは、μｇ／mlオーダーの濃
度の酵素を定量するための方法であり、なかでも
最も高感度な方法とされているケイ光性物質（た
とえばクマリンやウンベルフエロンの誘導体な
ど）を遊離するタイプの基質を用いた方法でも、
ｎｇ／ml程度の酵素量が測定できるにすぎなかつ
た。 微量酵素の血液中や体液中の存在量、生体内分
布、尿への排出量などの定量の重要性がますます
高まつてきており、上記の活性測定法では、測定
不能な領域については酵素分子を一つの抗原とみ
なした前述のRIA法が実施されはじめている。酵
素の定量法としてのRIA法は、前述の問題点とと
もに、(1)イムノアツセイ法であるため必らずしも
酵素の機能特性である活性を反映しない可能性が
あること、(2)同様の抗原性部位を有する類縁酵
素、前駆体を含めて定量してしまう可能性を有す
ること、および(3)たとえば、酵素免疫検査法に用
いられる酵素標識抗原又は抗体中の酵素のよう
な、被測定酵素が他の化合物と結合されていて単
体として存在しない場合には、抗体作製が難しく
実際上測定法を組むことが困難であることなどが
挙げられる。 これらの理由で、アイソトープを用いないで十
分な感度を与える安定な微量免疫検査法や、酵素
活性測定方法が望まれていたが、われわれは、増
感色素の増感特性とハロゲン化銀を組合わせるこ
とにより高感度な検出法を考察し、免疫検査法、
酵素定量法に適用できることを見い出した。 本発明の目的は、たとえば、これらの微量成分
の免疫検査法や酵素定量法などに共通の検出法と
して用いられる、増感色素又は増感色素標識化合
物のハロゲン化銀による検出定量法において水系
溶媒中での色素化合物を安定化させることによ
り、精度の高い検出法を与える試薬とその安定化
方法及びそれを用いた微量成分の測定方法を提供
することにある。 例えば、上記（Ｉ）のように測定される微量成
分が抗原または抗体である場合は次のようにして
行なう。すなわち、分光増感色素標識された抗原
または抗体と測定すべき抗原または抗体を含有す
る試料とを、それぞれの抗原種または抗体種に特
異的に反応する抗体または抗原と競合反応させ、
その結果生じた反応物または未反応物をハロゲン
化銀感光材料と接触させ分光増感色素の吸収する
波長の光で露光し、次いで現像し、得られる銀像
の濃度又は色素濃度から抗原または抗体を定量す
る免疫化学的測定方法である。より詳細には、特
願昭54-23964に記載されている。 また上記（II）のように、測定される微量成分
が酵素である場合には、次のようにして行なう。
すなわち酵素活性を測定するに際し、写真用分光
増感色素即ちハロゲン化銀の固有吸収波長域より
も長波長側に（好ましくは500nmより長波長側
に）吸収域を有しハロゲン化銀粒子に接触（吸
着）し分光増感しうる有機色素構造と、測定す
べき酵素に特異的に接触される構造とを少くと
も一つずつ含有する合成基質を用い、酵素反応に
より生じた分光増感色素構造を含む反応生成物
かまたは未反応合成基質のいずれか一方をハロゲ
ン化銀と接触させたのちに分光増感波長域の光で
感光させ、現像することによつて得られた現像銀
量又は発色色素量を光学濃度として測定すること
よりなる。 本方法に用いられる合成酵素基質に含まれる測
定対象となる酵素により特異的に接触される構造
は一般にたとえば加水分解酵素に対するペプチ
ド結合（酸アミド結合）、エステル結合、りん酸
エステル結合、グルコシド結合、また例えば転移
酵素に対するアミノ基、カルボキシル基などの酵
素の接触部位たとえば、アミノ酸残基、糖、核酸
塩基などの酵素の認識部位（結合部位）から構成
されている。これらは、酵素の基質特異性に対応
する基質構造として、より具体的に、後述の各酵
素について、「生化学データブツク」（第一分冊）
（日本生化学会編 1979、東京化学同人刊）及
び、「The Enzyme」vol.III、IV及びＶ（Paul.D.
、Boyer、他編、1971 Academic Press刊）に記
載されている。 本発明に用いられる合成基質は、上記基質特異
性に対応する構造と後に述べる分光増感色素構
造が少くとも一つずつ連結されたものである。
連結に際し要求される条件としては、(1)連結によ
り酵素反応性が阻害されないこと及び(2)分光増感
性が失なわれないことなどがある。 また以上の（Ｉ）（II）のほかに本方法は標識
された抗原又は抗体を用いるリセプターアツセイ
などの生体成分の組織内分布の測定（たとえばラ
ジオアイソトープを用いるリセプターアツセイに
ついては入江實編「続ラジオイムノアツセイ」講
談社、12章に詳しく記されている）への適用がで
き、種々の生体成分、薬物、酵素などの微量成分
の定量に応用できるものである。 上記の測定方法などにおいて使用される分光増
感色素は、本来写真用として汎用されているもの
であり、一般に有機溶剤系では安定な化合物であ
る。しかしながら、例えば（Ｉ）の抗原−抗体反
応やIIの酵素反応を実施するのに必要な含水溶媒
中においては、これらの分光増感色素標識物は用
いる条件により不安定であり、そのため、微量成
分を高感度で精度よく定量するという目的を達成
することが困難であることがわかつた。微量成
分、特に生体微量成分の測定は、水媒体中で行な
われているので、そのような系においても安定に
分光増感色素標識物を維持し得る技術が望まれて
いた。 本発明者らは、含水溶媒系においても前記目的
を達成することができる技術について種々検討し
た結果、分光増感色素標識物を、下記一般式
（Ｉ）で示される化合物の共存下、含水溶媒に溶
解すると、分光増感色素標識物の安定性が著しく
改善され、その結果より精度の高い微量成分定量
が可能であることを見出した。 すなわち、本発明は、含水溶媒に、分光増感色
素にて標識された微量成分と下記一般式〔Ｉ〕で
示された化合物とを含有せしめた微量成分測定用
試薬であり、分光増感色素にて標識された微量成
分を含有した含水溶液を下記の一般式〔Ｉ〕で用
いて安定化する方法であり、更に下記の一般式
〔Ｉ〕によつて安定性の改良された微量成分測定
用試薬を用いた微量成分の測定方法である。 一般式〔Ｉ〕 D₁−Ａ−D₂ 〔式中、D₁、D₂は縮合多環芳香族ヘテロ環残基ま
たは芳香族ヘテロ環置換アミノ基を表わし、これ
らは−SO₃M基を含んでもよい。Ｍは、水素、ナ
トリウム原子又はカリウム原子を表わす。−Ａ−
は、２価の芳香族残基を表わし、これらは−
SO₃M基を含んでもよい。ただし、上記D₁、D₂に
−SO₃M基が含まれないときは、−Ａ−に−SO₃M
基を含む必要がある。〕 本発明において用いられる一般式〔Ｉ〕におい
て、D₁、D₂にて示される縮合多環芳香族ヘテロ
環残基としては、２−ベンゾトリアゾリル基、２
−ナフトトリアゾリル基などが、芳香族ヘテロ環
置換アミノ基としては、１，３，５−トリアジン
−２−イルアミノ基、１，３−ジアミン−２−イ
ルアミノ基などを挙げることができる。 Ａで表わされる２価芳香族残基のうち有用なも
のは下記の如くである。 スルホ基を有するもの； 等。 スルホ基を有しないもの： Ａにスルホ基を有しない場合は、D₁、D₂の少
くとも一つはSO₃Mを含有する置換基を有する。 また、Ａで表わされる２価芳香族残基のうちよ
り有用なものとしては を挙げることができる。 Ｍにて表わされるアルカリ金属としてはナトリ
ウム、カリウムなどを、ハロゲン原子としては塩
素、臭素、沃素などを挙げることができる。 一般式（Ｉ）で表わされる化合物中、特に有用
なものは次の一般式（II）または（III）で表わさ
れる化合物である。 一般式（II） 式中、−Ａ−は一般式（Ｉ）の場合と同義であ
る。Ｙは＝ＣＨ−、＝CB₅−、＝Ｎ−を表わす。こ
こでB₅は低級アルキル、ハロゲン等を表わす。
B₁、B₂、B₃、B₄はそれぞれ水素原子、ヒドロキ
シ基、アルコキシ基、低級アルキル基（例えばメ
チル基、エチル基など）、アリーロキシ基（例え
ばフエノキシ基、ｏ−トリルオキシ基、ｐ−スル
ホフエノキシ基）、ハロゲン原子（例えば塩素原
子、臭素原子）、異節環核（例えば、モルホリニ
ル基、ピペリジル基）、アルキルチオ基（例えば
メチルチオ基、エチルチオ基）、ヘテロシクリル
チオ基（例えばベンゾチアゾリルチオ基）、アリ
ールチオ基（例えばフエニルチオ基、トリルチオ
基）、アミノ基、アルキルアミノ基あるいは置換
アルキルアミノ基（例えばメチルアミノ基、エチ
ルアミノ基、プロピルアミノ基、ジメチルアミノ
基、ジエチルアミノ基、ドデシルアミノ基、シク
ロヘキシルアミノ基、β−ヒドロキシエチルアミ
ノ基、ジ−（β−ヒドロキシエチル）アミノ基、
β−スルホエチルアミノ基）、アリールアミノ基
または置換アリールアミノ基（例えばアニリノ
基、ｏ−スルホアニリノ基、ｍ−スルホアニリノ
基、ｐ−スルホアニリノ基、ｏ−アニシルアミノ
基、ｍ−アニシルアミノ基、ｐ−アニシルアミノ
基、ｏ−トルイジノ基、ｍ−トルイジノ基、Ｐ−
トルイジノ基、ｏ−カルボキシアニリン基、ｍ−
カルボキシアニリノ基、ｐ−カルボキシアニリノ
基、ヒドロキシアニリノ基、ジスルホフエニルア
ミノ基、ナフチルアミノ基、スルホナフチルアミ
ノ基）、ヘテロシクリルアミノ基（例えば２−ベ
ンゾチアゾリルアミノ基、２−ピリジル−アミノ
基)、アリール基（例えばフエニル基)、メルカプ
ト基を表わす。B₁、B₂、B₃、B₄は、それぞれ互
いに同じでも、異つてもよい。−Ａ−がスルホ基
を有しないときは、B₁、B₂、B₃、B₄の少くとも
一つは、一つ以上のスルホ基（遊離酸基でもよ
く、塩を形成してもよい）を有していることが必
要である。 一般式（III） Ａは一般式（Ｉ）の場合と同義である。W₁、
W₂はそれぞれベンゼン環又はナフタレン環を形
成する炭素原子群を表わす。該ベンゼン環又はナ
フタレン環は置換されていてよく、その置換基の
うち少くとも１つはスルホ基を含む。 以上の一般式で示される化合物の具体例を以下
に示す。 一般式〔Ｉ〕にて示される化合物は0.001wt％
から1wt％の含水溶液で用いることが好ましく、
0.001wt％から0.01wt％の含水溶液で用いること
がより好ましい。 また、微量成分測定用試薬には、水系溶媒中で
使用される時において分光増感色素によつて標識
された微量成分として10^-12ｇ／ml以上含まれて
いることが好ましく、10^-11ｇ／ml以上含まれて
いることがより好ましい。 本発明の微量成分測定用試薬または測定方法な
どに用いられる微量成分測定用試薬には、分光増
感色素によつて標識された微量成分、前記の一般
式〔Ｉ〕にて示された化合物及び被測定用試料以
外に次のようなものを含有することができる。た
とえば、トリスヒドロキシアミノメタン−塩酸、
トリスヒドロキシアミノメタン−リン酸などのpH
調整剤、アゾ化ナトリウムなどの防腐剤、アルブ
ミン、ゼラチンなどの蛋白質などである。特に、
アルブミン、ゼラチンなどの保護蛋白質は、試料
中の蛋白質による抗原体反応への影響を軽減する
ので好ましく用いられる。このことについては、
次の文献に詳述されている。「有機合成化学」第
38巻、第２号50ページ（1980年）。また、アルブ
ミン、ゼラチンを用いる際には、それぞれ0.1〜
５wt％、0.1〜1wt％にて用いるのが好ましい。 また、微量成分測定用試薬には、後述する一般
式（IX）にて示されているヒドラジン化合物を併
用することができる。これによつて検出感度の向
上などの効果を得ることができる。 本発明に於て用いられる増感色素標識物、たと
えば抗原又は抗体などの微量成分や、酸素活性を
測定するための合成基質などを標識するために用
いる写真用分光増感色素はハロゲン化銀に分光感
度を付与する性質を持つ故、写真感光材料の分光
増感色素として知られており、例えばシアニン色
素、メロシアニン色素、ヘミシアニン色素、スチ
リル色素などがある。これらは具体的には“The
Theory of the Photographic Process（第４
版）”（Edited by T.H.James、1977年
Macmillan社刊）及び、“Cyanine Dyes and
Related Compounds”（F.M.Hamer著、1964年
Interscience Publishers刊）などにに記載されて
いる。さらに具体的には、米国特許第2493748
号、同第2519001号、同第2652330号、西独特許第
1177481号、仏国特許第1412702号、英国特許第
489335号などに記載されているメロシアニン色
素、また米国特許第2238213号、同第2503776号、
同第2537880号、同第3196017号、同第3397060
号、西独特許第929080号、同第1028718号、同第
1113873号、同第1163671号、同第1177482号、仏
国特許第1359683号、英国特許第840223号、同第
886270号、同第886271号、同第904332号、ベルギ
ー国特許第654816号、特公昭40−14112号、特公
昭40−23467号などに記載されているシアニン色
素が何れも本発明に有用な色素である。これらの
色素は少くとも２つ以上併用されてもよい。例え
ば特公昭43−4932号、特公昭43−4936号、特公昭
43−22884号公報などに記載されている色素の併
用を含む強色増感も本発明に有用である。また米
国特許第2947630号、同第2933390号、同第
2937089号、同第3617295号、同第3635721号、仏
国特許第1500218号などの強色増感も有用であ
る。この場合強色増感剤は標識された抗原又は抗
体といつしよに混合されていても、あるいはあら
かじめハロゲン化銀乳剤中に加えられていてもよ
い。 本発明で用いる分光増感色素としては、前述の
分光増感色素たとえばシアニン色素、メロシアニ
ン色素、ヘミシアニン色素、スチリル色素などが
あるが、後述の化学反応を用いて導入するに有利
な構造をもつことが望ましい。具体的には次の一
般式（IV）で示される少くとも１つのメルカプト
基、アミノ基、ヒドロキシル基またはカルボキシ
ル基を有するシアニン色素 ここでｍとｎは各々１又は２を表わし、同一で
も異つてもよく、ｐは２又は３、ｑは１または２
を表わす。L₁、L₂、L₃は同一又は異なつたメチ
ン基（例えば、アルキル基（例えば、メチル、エ
チル等）、アリール基（例えば、フエニル等）、ハ
ロゲン（例えば、クロロ、ブロモ等）などで置換
されていてもよい）、Ｚ及びZ₁は各々５員または
６員の含窒素ヘテロ環核を完成するに必要な非金
属原子群を表わし、同一でも異つていてもよい。
該ヘテロ環としては例えばチアゾール核、ベンゾ
チアゾール核、ナフトチアゾール核、オキサゾー
ル核、ベンズオキサゾール核、ナフトオキサゾー
ル核、オキサゾリン核、セレナゾール核、ベンゾ
セレナゾール核、ナフトセレナゾール核、３，３
−ジアルキルインドレニン核、イミダゾール核、
前述のアルキルは特に炭素原子１〜８のもの、例
えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル等の無置換アルキル基やヒドロキシア
ルキル基（例えば、２−ヒドロキシアルキル、３
−ヒドロキシプロピル等）等が望ましい。前述の
アリールは、フエニル、ハロゲン（例えばクロ
ル）置換フエニル、アルキル（例えばメチル）置
換フエニル、アルコキシ（例えばメトキシ）置換
フエニルなどを表わす。）、ピリジン核（例えば、
２−ピリジン、４−ピリジン、５−メチル−２−
ピリジン、３−メチル−４−ピリジンなど）、キ
ノリン核、イミダゾ〔４，５−ｂ〕キノキザリン
核、オキサジアゾール核、チアジアゾール核、テ
トラゾール核、ピリミジン核などを表わす。 Ｘは無機又は有機酸アニオン例えば、クロライ
ド、ブロマイド、アイオダイド、ｐ−トルエンス
ルホネート、ｐ−ニトロベンゼンスルホネート、
メタンスルホネート、メチルサルフエート、エチ
ルサルフエート、パークロレートなどを表わす。 Ｒ及びR₁は同一でも異つていてもよく、それ
ぞれ、アルコール残基例えば炭素原子１〜18好ま
しくは１〜７のアルキル基、無置換アルキル基、
置換アルキル基、例えばアラルキル基、ヒドロキ
シアルキル基、カルボキシアルキル基、スルホ基
で置換されたアルキル基、サルフエートアルキル
基またはアリール基、複素環置換アルキル基を表
わす。 ｑが１のときは、色素はベタイン型構造を型成
する。 R₂はＺの置換基であり、水素または−P_i−Q_j
−Ｗを表わす。式中Ｐは

【化】

【化】−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わ し、R₄は水素、炭素数１〜８のアルキル基、置
換アルキル基を表わす。またＱは炭素数１〜10の
アルキレン、置換アルキレン

【化】R₅はメ
チル、エチル、プロピル、メルカプトエチル、ベ
ンジル、アリーレン（例えばフエニレン）置換ア
リーレン（例えば置換フエニレン）、アラルキレ
ン、アルカリーレンあるいは、ジペプチド、トリ
ペプチド残基を表わす。ｉおよびｊはそれぞれ０
または１を表わし同じでも異つてもよい。Ｗは、
マルカプト基、アミノ基、ヒドロキシル基または
カルボキシル基を表わす。Ｒ、R₁、R₂の少くと
も１つはメルカプト基、アミノ基、ヒドロキシル
基、カルボキシル基などからなる基の中から選ば
れる少くとも１つの基を含む。 次の一般式（Ｖ）で示される少くとも１つのメ
ルカプト基、アミノ基、ヒドロキシル基またはカ
ルボキシル基を有するメロシニアン色素 式中、Z₂は前述のＺ、Z₁と同意義。 R₃とR₄はＲ、R₁と同意義。R₅はR₂と同意義。
ｒはｎと同意義、L₁、L₂は前記と同意義であ
る。m_iは２、３または４を表わす。 ｄは１、２または３を表わす。Q₁は酸素原
子、イオウ原子、または

【化】（R₆は脂肪
族基）、を表わす。 Ｑは５員または６員の含窒素ヘテロ環核を完成
するに必要な非金属原子群を表わし、該ヘテロ環
としては例えば２−ピラゾリン−５−オン核（例
えば、３−メチル−１−フエニル−２−ピラゾリ
ン−５−オン核、など）、イソオキサゾロン核
オキシインドール核、バルビツル酸核または２−
チオバルビツル酸核、ローダニン核（例えばロー
ダニン核、３−スルホアルキルローダニン核、３
−スルホアリールローダニン核、３−アルキルロ
ーダニン核など）、２，４−チアゾリジンオン
核、チアゾリジノン核、２，４−イミダゾリジオ
ン（ヒダイントイン）核、２−チオ−２，４−イ
ミダゾリジンジオン核がある。 R₃、R₄、R₅、Q₁、Ｑの少くとも少くとも１
つはメルカプト基、アミノ基、ヒドロキシル基、
２はカルボキシル基からなる基から選ばれる少く
とも１つの基を含む。 次の一般式（VI）で示される少くとも１つのメ
ルカプト基、アミノ基またはヒドロキシル基、カ
ルボキシル基を有するロダシアニン色素 式中、Z₃とZ₄は前述のＺ、Z₁と同意義、R₇とR₈
はＲ、R₁と同意義、R₉はR₂と同意義、ｓとｔは
ｍ、ｎと同意義、Ｌ_１〜５は前記と同意義である。
R₁₀はR₄と同意義、Q₂はQ₁と同意義、ｋとｌはそ
れぞれ１、２、又は３を表わし、同一でも異つて
もよい。 R₇、R₈、R₉、R₁₀、Ｑの少くとも１つはメルカ
プト基、アミノ基、ヒドロキシル基またはカルボ
キシル基からなる基の中から選ばれる少くとも１
つの基を含む、 がある。 本発明において用いる分光増感色素としては、
より好ましくは、次の一般式（VII）で示される酸
性核にカルボキシル基を有するメロシアニン色素
及び一般式（VIII）で示されるシアニン色素があ
る。 一般式（VII） ここでｎは１又は２を表わし、ｐは２又は３、
を表わす。ｚは５員または６員の含窒素ヘテロ環
核を完成するに必要な非金属原子群を表わし、該
ヘテロ環としては例えばチアゾール核、ベンゾチ
アゾール核（例えば６−ニトロベンゾチアゾー
ル、４−メチルベンゾチアゾール、など）、ナフ
トチアゾール核、チアゾリン核、オキサゾール
核、ベンズオキサゾール核、ナフトオキサゾール
核、オキサゾリン核、セレナゾール核、ベンゾセ
レナゾール核、３，３−ジアルキルインドレニン
核、イミダゾール核、〔前述のアルキルは特に炭
素原子１〜８のもの、例えば、メチル、エチル、
プロピル、イソプロピル、ブチル等の無置換アル
キル基やヒドロキシアルキル基（例えば、２−ヒ
ドロキシアルキル、３−ヒドロキシプロピル等）
等が望ましい。前述のアリールは、フエニル、ハ
ロゲン（例えばクロル）置換フエニル、アルキル
（例えばメチル）置換フエニル、アルコキシ（例
えばメトキシ）置換フエニルなどを表わす。］、ピ
リジン核（例えば、２，−ピリジン、４−ピリジ
ン、５−メチル−２−ピリジン、３−メチル−４
−ピリジンなど）、キノリン核、イミダゾ〔４，
５−ｂ〕キノキザリン核、オキサジアゾール核、
チアジアゾール核、テトラゾール核、ピリミジン
核などを表わす。 Ｒは、アルコール残基例えば炭素原子１〜18好
ましくは１〜７のアルキル基、無置換アルキル
基、置換アルキル基、例えばアラルキル基、ヒド
ロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、スル
ホ基で置換されたアルキル基、サルフエートアル
キル基、またはアリール基、複素置換アルキル基
を表わす。 Ｑは５ないし６員含窒素複素環を形成するのに
必要な非金属原子群を表わし、複素原子としては
代表的な窒素、硫黄、セレンおよび酸素から選択
され、そのうちの１つの窒素原子はカルボキシル
基を有する置換基と直接又はアルキレン、置換ア
ルキレン、アリーレン、置換アリーレン、アラル
キレン、アルカリレンを介して結合している。
（例えば、２−ピラゾリン−５−オン核、バルビ
ツール酸核または２−チオバルビツール酸核、ロ
ダニン核、２−チオ−２，４−オキサゾリジンジ
オン核、チアゾリジノン核、イソオキサゾロン
核、２，４−イミダゾリジンジオン（ヒダントイ
ン）核、２−チオ−２，４−イミダゾリジンジオ
ン核、２−イミダゾリン−５−オン核。 一般式（VIII） ここでｍとｎは各々１又は２を表わし、同一で
も異つてもよく、ｐは２又は３、ｑは１または２
を表わす。Ｌはメチン基（例えば、アルキル基
（例えば、メチル、エチル等）、アリール基（例え
ば、フエニル等）、ハロゲン（例えば、クロロ、
ブロモ等）などで置換されていてもよい）、Ｚ及
びZ₁は各々５員または６員の含窒素ヘテロ環核を
完成するに必要な非金属原子群を表わし、同一で
も異つていてもよい。該ヘテロ環としては例えば
チアゾール核、ベンゾチアゾール核、ナフトチア
ゾール核、チアゾリン核、オキサゾール核、ベン
ズオキサゾール核、ナフトオキサゾール核、オキ
サゾリン核、セレナゾール核、ベンゾセレナゾー
ル核、ナフトセレナゾール核、３，３−ジアルキ
ルインドレニン核、イミダゾール核、前述のアル
キルは特に炭素原子１〜８のもの、例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル等
の無置換アルキルやヒドロキシアルキル基（例え
ば、２−ビドロキシアルキル、３−ヒドロキシプ
ロピル等）等が望ましい。前述のアリールは、フ
エニル、ハロゲン（例えばクロル）置換フエニ
ル、アルキル（例えばメチル）置換フエニル、ア
ルコキシ（例えばメトキシ）置換フエニルなどを
表わす。）ピリジン核（例えば、２−ピリジン、
４−ピリジン、５−メチル−２−ピリジン、３−
メチル−４−ピリジンなど）、キノリン核、イミ
ダゾ〔４，５−ｂ〕キノキザリン核、オキサジア
ゾール核、チアジアゾール核、テトラゾール核、
ピリミジン核などを表わす。 Ｘは無機又は有機酸アニオン例えば、クロライ
ド、ブロマイド、アイオダイド、ｐ−トルエンス
ルホネート、ｐ−ニトロベンゼンスルホネート、
メタンスルホネート、メチルサルフエート、エチ
ルサルフエート、パークロレートなどを表わす。 Ｒ及びR₁は同一でも異つていてもよく、それ
ぞれ、アルコール残基例えば炭素原子１〜18好ま
しくは１〜７のアルキル基、無置換アルキル基、
置換アルキル基、例えばアラルキル基、ヒドロキ
シアルキル基、アルコキシアルキル基、スルホ基
で置換されたアルキル基、サルフエートアルキル
基またはアリール基、複素環置換アルキル基を表
わす。ｑが１のときは、色素はベタイン型構造を
型成する。 R₂はＺの置換基であり、−P_i−Q_j−ＣＯＯＨを
表わす。式中、Ｐは

【化】−
Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−を表わし、R₄は水素、炭素
数１〜８のアルキル基、置換アルキル基を表わ
す。またＱは炭素数１〜10のアルキレン、置換ア
ルキレン

【化】R₅はメチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、イソブチル、ターシヤリー
ブチル、ヒドロキシメチル、１−ヒイドロキシエチ
ル、メルカプトメチル、２−メチルチオエチル、
ベンジル、γ−ヒドロキシベンジル、３−インド
リルメチル等）、アリーレン（例えばフエニレ
ン）、置換アリーレン（例えば置換フエニレン）、
アラルキレン、アルカリーレンあるいは、ジペプ
チド、トリペプチド残基を表わす。ｉおよびｊは
それぞれ０または１を表わし同一でも異なつても
よい。 前記一般式（VII）で示されるカルボキシル基を
有するメロシアニン色素及び一般式（VIII）で示さ
れるカルボキシル基を有するシアニン色素は、本
発明において用いられれる合成用色素としてたと
えば、溶解性、反応収率などが優れている。 写真用分光増感色素を抗原、抗体又は、合成基
質に標識する方法は通常の化学反応である。即
ち、分光増感色素は共有結合によつて抗原又は抗
体又は、酵素により特異的に接触される標識構造
に導入されそれぞれ標識抗原、標識抗体及び合
成基質をつくる。反応に関与する官能基としては
分光増感色素及び抗原、抗体又は上記構造は、
アミノ基、イミノ基、メルカプト基、カルボキシ
ル基、カルボン酸アミド基又はヒドロキシル基及
びこれらと直接反応できる官能基を含むことが好
ましい。また、これら両者においてこれらの官能
基はあらかじめ存在していてもよいし、化学反応
により導入されてもよい。また、これらの官能基
の間の結合は官能基間に直接形成されてもよい
し、適当な連結基を介して形成されてもよい。
連結基を与える化合物には、上記抗原、抗体又
は、構造と同様の官能基及びそれと直接反応し
得る官能基を含むことが好ましい。また連結基
を与える化合物には、アミノ酸、ペプチド、ポリ
アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌ
クレオシド、ポリヌクレオチド等を含んでもよ
い。これらの官能基の間の結合方法は次のいずれ
に依ることもできる。 (1) 分光増感色素と前記の官能基とを直接反応さ
せる。 (2) 活性化剤を用いて分光増感色素と前記の官能
基とを反応させる。 (3) 二官能基を有する化合物を単数又は複数個介
して分光増感色素と前記の官能基とを反応させ
る。 上述した抗原又は抗体の基に対する反応基及び
その反応方法については「生化学実験講座第１巻
(タンパク質の化学)」（日本生化学会編、東京化
学同人発行)、「生化学実験講座第２巻（核酸の化
学)」同所発行、「生化学実験講座第３巻（脂質の
化学)」同所発行、「生化学実験講座第４巻（糖質
の化学）」同所発行、及び泉屋著「ペプチド合
成」等に詳述されており、当業者であれば容易に
結合反応を行なうことができるであろう。更に、
上記官能基と反応する基を有する化合物として
は、例えば活性エステル、活性ハロゲン、アルデ
ヒド、活性ビニル、酸無水物、酸ハロゲン化物、
チオイソシアネート、イソシアネート、カルボン
酸、アミノ、ハロゲン化アルキル、ニトロフエニ
ルハライド等が例示できる。従つて、増感色素が
その置換基としてこれらの基も直接有していても
良いし、あるいは二官能基を有する化合物と増感
色素とを結合させたときに上記の置換基が残留し
てもよい。 これら標識反応の条件は、抗原、抗体、酸素基
質構造の種類、分光増感剤の種類等によつて異
なるが、標識される抗原又は抗体の生物活性、合
成基質に付与されるべき基質特異性をそこなわな
いような条件を設定することが重要である。従つ
て、反応温度は通常、−40°から60℃の範囲、好
ましくは、−20°から40℃がよく、反応時間は、
およそ10分ないし16時間の範囲から選択される。
反応の圧力は、大気圧が好ましいが、１ないし20
気圧の範囲から適宜選択することができる。溶媒
としては、水またはpH緩衝液を使用すると好都合
である。DMFやメチレンクロリド等の有機溶媒
も適宜使用することができる。これらの反応条件
は、一般に蛋白質や酵素の修飾に適用される条件
と共通であり、上記文献にその詳細が述べられて
いる。 標識に使用される分光増感剤の使用量は、上記
被標識物の種類によつて変るが、通常、抗原、抗
体、酵素基質構造１モルに対し、1/100ないし
100倍、好ましくは1/20ないし20倍、さらに好ま
しくは1/2ないし２倍である。 標識の確認法としては、種々のスペクトル例え
ば紫外、可視、赤外、マス、NMRなどを測定す
る方法と標識が導入された末端基の消失を分析に
より確認する方法が代表的である。スペクトル法
においては、標識反応終了後、生成物を分離精製
した後、その標識物に固有のスペクトルを測定確
認する。たとえば可視吸収スペクトルを測定しそ
のスペクトルが、溶媒は会合等を考慮した上で、
標識に使用された分光増感剤の可視部の固有吸収
スペクトルと一致すればよい。また、ペプチドや
蛋白質及びそれらを含む抗原、抗体、酵素基質構
造の標識においては標識が行われていれば、微
量成分の末端アミノ基やカルボキシ基が末端基分
析において検出されないので、これにより標識の
遂行を確認することができる。 本発明の方法（Ｉ）に於て、標識された抗原抗
体反応物（Ｂ）と遊離した標識抗原又は抗体の分
離には、各種液体クロマト法（ゲル過法、イオ
ン交換法、分配クロマト法、吸着クロマト法（ア
フイニテイクロマトを含む）等）、微孔径フイル
ター過法、透析法、セルロース、タルク、デキ
ストラン粉末などを用いた吸着法、塩析法、沈澱
法、遠心分離法、結晶化法、抽出法、固相法など
を用いることができる。また、本発明の方法
（II）において、酵素反応後に分光増感色素構造
を有する酵素反応生成物と未反応合成基質のい
ずれか一方を定量的にハロゲン化銀と接触させる
ことは、酵素反応により生じた酵素反応生成物と
未反応合成基質との間の物理的・化学的性質性状
の差を利用して実現できる。たとえば、両者のハ
ロゲン化銀への吸着の差を利用したり、たとえ
ば、適当な分離方法（たとえば、イオン交換クロ
マトグラフイー、ゲルロ過、吸着クロマトグラフ
イー、高速液体クロマトグラフイー、アフイニテ
イー、クロマトグラフイー、ＴＬＣ、塩析、分離
膜、遠心分離、ポリマーによる共沈、デカンテー
シヨン、限外ロ過、免疫反応、活性炭などの吸着
剤など）を用いることができる。詳細には、「生
化学データブツク」(第２分冊10章：日本生化学
会編、東京化学同人・1980年刊）参照。 本発明において、上記いずれの分離法に対して
も、ハロゲン化銀含有層の上層に分離用の補助層
を設けてその一部又は全部を代用することができ
る。 本発明に於いて抗原又は抗体、或いは抗原−抗
体結合物と結合した又は合成基質や酵素反応生成
物に組みこまれた分光増感色素をハロゲン化銀と
接触させる方法としては、ハロゲン化銀を含む乳
剤層に前記分光増感色素標識物を滴下する方法、
或いはハロゲン化銀を含む乳剤溶液に上記物質を
滴下する方法、ハロゲン化銀を含む乳剤層に接触
させる方法などがある。 好ましくは、ハロゲン化銀を含む乳剤面上に、
上記物質を滴下する方法である。これらの方法に
よつて増感色素が加えられたハロゲン化銀また
は、それを含む乳剤は必要に応じて従来の方法に
て紙、セルローズアセテート、ポリエステルなど
の支持体上に塗布される。 本発明の方法（Ｉ）及び（III）などに適用され
る微量成分としては、たとえば生体微量成分や薬
物などが挙げられる。 たとえばペプチドホルモン、例えば、インシユ
リン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、副甲状腺ホル
モン、カルシトニン、エリトロポエチン、セクレ
チン、コレシストキニン、ガストリン、アンジオ
チンシンII、バゾプレツシン、オキシトシン、メ
ラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモ
ン、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、TSH分泌促進
ホルモン（TRH）、成長ホルモン、プロラクチ
ン、黄体形成ホルモン（LH）、LH分泌促進ホル
モン（LHRH）、繊毛性性腺刺激ホルモン、卵胞
刺激ホルモン、非ペプチドホルモン例えばステロ
イドホルモン類のグルココルチコイド、アルドス
テロン、副腎性アンドロジエン、エストロジエ
ン、プロジエステロン、テストステロンあるいは
その他のホルモン例えば甲状腺ホルモン（サイロ
キシン、トリヨードサイロニン、リバース・トリ
ヨードサイロニン）、コーチゾール、エステリオ
ール、アドレナリン、ノルアドレナリン、メラト
ニン、アセチルコリン、酵素例えばC₁エステラ
ーゼ、アルカリホスフアターゼ、ペプシノーゲ
ン、トリプシン、カイネース、ビールス、特異抗
原、腫瘍抗原例えばα−フエトプロテイン、癌胎
児性抗原（CEA）、血清蛋白成分例えばチロキシ
ン結合グロブリン、β₂−マイクログロブリン、
IgG、IgE、IgM、IgA、ヒト・リゾチーム、薬品
例えばLSDなど）、その他（例えばリウマチ因
子、HBs抗原、HBs抗体、ミオシンなど）であ
る。 また之等の増感色素標識物質を調製するのに、
原料として同じ物質を用いてもよいが、之等の物
質から誘導した、等価な免疫反応性をもつ物質
（天然物）からの誘導体あるいは合成物）を用い
てもよい。 本発明の方法（II）において測定対称となる酵
素としては、具体的には、たとえば、トリプシ
ン、プラスミン、カリクレイン、トロンビン、キ
モトリプシン、ウロキナーゼ、カテプシン、スト
レプトマイセス・アルカリプロテアーゼ、パパイ
ン、フイシン、ブロメライン、レニン、コラゲナ
ーゼ、エラスターゼ、などの蛋白質分解酵素、た
とえば、ロイシンアミノペプチターゼ、アミノペ
プチターゼ、アシルアミノ酸遊離酵素、カルボキ
シペプチターゼ、ジペプチジルＸペプチターゼな
どのペプチド分解酵素、たとえば、リボヌクレア
ーゼＡ、リボヌタレアーゼT₁、デオキシリボヌ
クレアーゼA₁、エンドヌクレアーゼなどの核酸
分解酵素、たとえば、アミラーゼ、リゾチーム、
グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダ
ーゼ、ホスホリラーゼ、グルカナーゼ、ヒアルロ
ニダーゼ、コンドロイチナーゼ、アルギン酸リア
ーゼなどの糖質分解酵素（脱離型酵素を含む）、
たとえば、リパーゼ、ホスホリパーゼ、などの脂
質分解酵素、トランスカルバミラーゼ、アミノト
ランスフエラーゼ、アシルトランスフエラーゼ、
ホスホトランスフエラーゼ、などの転移酵素、カ
ルボキシリアーゼ、ヒドロリアーゼ、アンモニア
リアーゼ、などの脱離酵素として、「酵素」(船津
勝編、講談社刊1977年)、「生化学データブツク」
(第一分冊)（日本生化学会編、東京化学同人1979
年刊）及び「The Enzyme」Vol.III、IV及びＶ、
（Paul.D.、Boyer他編、1971年、アカデミツクプ
レス刊）などに記載されている。 さらに本発明の方法は、生体中の酵素だけでな
く、たとえば、土壌、培養液、培地、などの中の
酵素や、生物体や、上記物質からとり出した酵素
またはこれらの酵素を種々の可溶性又は、不溶性
担体に固定したもの及びこれらの酵素を標識した
抗原や抗体などにおける酵素（たとえば、酵素免
疫検査法における標識物中の酵素など）に対して
も広く用いることができる。 また本発明の用いる合成基質としては、分光増
感色素構造を含む酵素反応生成物と未反応合成
基質との分離を容易にするために、酸素反応によ
り低分子量化した分光増感色素構造を含む酵素
反応生成物が遊離するような高分子量合成基質
（たとえば、天然の高分子量基質などの増感色素
標識物など）や固定化基質（たとえば、ラテツク
ス、ガラスビーズ、マイクロカプセル、樹脂、ロ
紙、繊維などの担体に分光増感色素を直接又は連
結基を介して結合させたものなど）を用いるこ
とができる。 本発明に於いて用いられるハロゲン化銀として
は塩化銀、塩臭化銀、臭化銀、沃臭化銀、塩沃臭
化銀、塩沃化銀、沃化銀などが用いられる。 これらのハロゲン化銀は親水性コロイドバイン
ダー溶液中に分散または懸濁せしめられた乳剤で
もよくあるいはバインダーなしで支持体上に（例
えば真空蒸着等で支持体上にハロゲン化銀層をも
うけたもの）支えられていてもよい。 本発明において用いられる写真乳剤中のハロゲ
ン化銀は慣用の方法、例えばシングルジエツト
法、ダブルジエツト法、又はそれらの組合せによ
つてつくることができる。ハロゲン化銀乳剤の調
製法は例えばTrivelliとSmith著「The
Photographic Journal」vol.79、pp.330〜338
(1939)；C.E.K.Mees著「The Theory of the
Photographic Process」Macmillan；や
Glafkides著「Photographic Chemistry」vol.1、
pp.327〜336（Fauntain Press）に記載されてい
る。 本発明において用いられる乳剤中のハロゲン化
銀粒子は、通常粒子サイズでも微粒子サイズのも
のでも用いることができるが、粒子の平均直径
（例えばプロジエクテツド・エリア法数平均によ
る測定）で0.04μ〜４μのものが好ましい。 本発明において用いられるハロゲン化銀乳剤は
化学熟成しない乳剤でもよいが、通常用いられて
いる化学増感法、例えば金増感（米国特許第
25400785、同第2597876、同第2597915、同第
2399083など)、第VIII族金属イオンによる増感；硫
黄増感（米国特許第1574944、同第2278947、同第
244026、同第2410689、同第3189458、同第
3415649など）、還元増感（米国特許第2518698、
同第2419974、同第2983610など）、またはその複
合された各種増感法が適用される。 更に具体的な化学増感剤としては、アリルチオ
カルバミド（allyl thio carbamide）、チオ尿素、
ソジユウム・チオサルフエートやシスチンなどの
硫黄増感剤；ポタシウムクロロオーレイト、オー
ラス・チオサルフエートやポタシウムクロロパラ
デート（potassium chloropalladate）など、の
貴金属増感剤；塩化スズ、フエニルヒドラジンや
レダクトンなどの還元増感剤などを含んでよい。
ポリオキシエチレン誘導体（英国特許第981470、
特公昭31−6475、米国特許第2716062など）、ポリ
オキシプロピレン誘導体、４級アンモニウム基を
もつ誘導体などの増感剤を含んでいてもよい。 本発明において用いられるハロゲン化銀乳剤
は、適当なカブリ防止剤（antifoggant）やハロ
ゲン化銀乳剤の安定剤（stabilizer）を含有しう
る。例えば米国特許第2131038や同第2694716など
で記載されているチアゾリウム塩（thiazolium
salts）；米国特許第2886437や同第2444605など
で記載されているアザインデン類
（azaindenes）；米国特許第3287135などで記載
されているウラゾール類（urazoles）；米国特許
第3236652などで記載されているスルホカテコー
ル類（sulfocatechols）；英国特許第623448など
で記載されているオキシム類（oximes）；米国
特許第2403927、同第3266897、同第3397987など
に記載されているメルカプトテトラゾール類
（mercaptotetrazoles）、ニトロン（nitron）；ニ
トロインダゾール類（nitroindazoles）；米国特
許第2839405などで記載されている多価金属塩
（polyvalent metal salts）；米国特許第3220839
などで記載されているチウロニウム塩
（thiuronium salts）；米国特許第2566263、同第
2597915などで記載されているパラジウム、白金
および金の塩など用いられる。 本発明にて用いられるハロゲン化銀乳剤は現像
主薬（例えばハイドロキノン類、カテコール類、
アミノフエノール類、３−ピラゾリドン類、アス
コルビン酸やその誘導体、リダクトン類
（reductones）やフエニレンジアミン類
（phenylenediamines）など）、または像主薬の組
合せを含有させることができる。現像主薬
（developing agents）は感光性乳剤中そして／ま
たは写真要素中の他の適当なところへ入れられう
る。現像主薬は適当な溶媒からまたは米国特許第
2592368や仏国特許第1505778に記載されている分
散物の形で添加することができる。 用いられる感光性乳剤は塗布助剤例えばサポニ
ン、米国特許第2600831などに記載されているア
ルキルアリールスルホン酸塩（alkyl aryl
sulfonates）、米国特許第3133816などに記載され
ているアンホテリツク化合物（amphoteric
compounds）などを含有しうる。 用いられる感光性乳剤はアンチスタチツク剤、
可塑剤、螢光増白剤、現像促進剤、空気カブリ防
止剤、色調剤などを含有しうる。 本発明に於いて、通常のゼラチンハロゲン化銀
乳剤が用いられるが、ゼラチンの代りにたとえば
アルブミン、寒天、アラビアゴム、アルギン酸、
アシル化ゼラチン（例えばフタル化ゼラチン、マ
ロン化ゼラチン等）など、またポリビニールアル
コール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルア
ミド、ポリスチレンスルホン酸のごとき親水性ポ
リマーまたはセルロース化合物（例えばヒドロキ
シエチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストリン等）、水可溶性澱粉のような感
光性ハロゲン化銀に対し有害な作用をおよぼすこ
とのない物質も使用されてよい。 本発明に使用される写真感光材料の写真乳剤層
には色像形成カプラー、すなわち芳香族アミン
（通常第一級アミン）現像主薬の酸化生成物と反
応して色素を形成する化合物（以下カプラーと略
記する）を含んでもよい。カプラーは分子中にバ
ラスト基とよばれる疎水基を有する非拡散のもの
が望ましい。カプラーは銀イオンに対し４当量性
あるいは２当量性のどちらでもよい。また色補正
の効果をもつカラードカプラー、あるいは現像に
ともなつて現像抑制剤を放出するカプラー（いわ
ゆるDIRカプラー）を含んでもよい。カプラーは
カツプリング反応の生成物が無色であるようなカ
プラーでもよい。 本発明に於いて増感色素標識物と接触している
ハロゲン化銀の露光には種々の光源が用いられ
る。但しいずれの場合にもハロゲン化銀の固有吸
収域の波長の光を除き有機色素のみが吸収する波
長の光だけが用いられる。例えば、タングステン
ランプ、ハロゲンランプ、水銀ランプ、キセノン
ランプなどは適当な光学フイルター（例えば富士
フイルム製シヤープカツトホフイルター、金属干
渉フイルターなど）と組み合せて用いられる。ま
た、固体レーザー（例えばルビーレーザーな
ど）、半導体レーザー（例えば硫化鉛レーザーな
ど）、色素レーザー、ガスレーザー（例えばネオ
ンヘリウムレーザー、アルゴンレーザーなど）な
ども有利に用いられる。 本発明において行なわれる現像処理には次のよ
うな方法を用いることができる。すなわち支持体
上に乳剤が塗布されている場合においては、従来
より写真の現像で実施されている現像処理法によ
つて行なうことができる。より具体的には一般の
写真フイルム、印画紙を現像処理する方法などを
用いることができる。また乳剤が塗布された支持
体上に写真処理剤を展開又は塗布又は浸漬又は吹
き付けることなどによつて写真処理を行なうこと
もできる。更に、乳剤が液状である場合において
は、これに現像処理液を添加・混合することによ
り写真処理を行なうこともなしえる。 上記の如く露光された乳剤層は従来行なわれて
いる写真処理法によつて処理される。処理液には
公知のものを用いることができる。処理温度は普
通18℃から50℃の間に選ばれるが、18℃より低い
温度または50℃をこえる温度としてもよい。 現像処理温度の上昇に伴つて、黒化度が高くな
る。従つて通常、予め定められた恒温で処理する
ことが望ましい。しかし恒温現像処理の代わりに
中和層と温度補償ポリマー層とを組合わせること
によつて、温度変化によつて実質上、黒化度が変
化しない方法もある。たとえば米国特許3362819
号、4028103号にあるような酸ポリマー層と米国
特許4056394号、4061496号に、日本特開昭53−
72622にみられる温度補償層とを組合わせた塗布
層に接して、現像を進行させることができる。 黒色写真処理する場合に用いる現像液は、知ら
れている現像主薬を含むことができる。現像主薬
としては、ジヒドロキシベンゼン類（たとえばハ
イドロキノン）、３−ピラゾリドン類（たとえば
１−フエニル−３−ピラゾリドン）、アミノフエ
ノール類（たとえばＮ−メチル−ｐ−アミノフエ
ノール）、１−フエニル−３−ピラゾリン類、ア
スコルビン酸及び米国特許4067872号に記載の
１，２，３，４−テトラヒドロキノリン環とイン
ドレン環とが縮合したような複素環化合物類など
を、単独もしくは組合せて用いることができる。
現像液には一般にこの他公知の保恒剤、アルカリ
剤、pH緩衝剤、カブリ防止剤などを含み、さらに
必要に応じ溶解助剤、色調剤、現像促進剤、界面
活性剤、消泡剤、硬水軟化剤、硬膜剤、粘性付与
剤などを含んでもよい。 本発明の写真乳剤には、いわゆる「リス型」の
現像処理を適用することができる。「リス型」現
像処理とは線画像の写真的再現、あるいはハーフ
トーン画像の網点による写真的再現のために、通
常ジヒドロキシベンゼン類を現像主薬とし、低い
亜硫酸イオン濃度の下で、現像過程を伝染的に行
なわせる現像処理のことをいう（詳細はメースン
著「フオトグラフイツク・プロセツシング・ケミ
ストリー」（1966年）163〜165ページに記述され
ている）。 現像処理の特殊な形式として、現像主薬を感光
材料中、たとえば乳剤層中に含み、感光材料をア
ルカリ水溶液中で処理して現像を行なわせる方法
を用いてもよい。現像主薬のうち、疎水性のもの
はリサーチデイスクロージヤ（Research
Disclosure）169号にRD−16928として開示され
ているようにラテツクス分散して乳剤層中に含ま
せることができる。このような現像処理は、チオ
シアン酸塩による銀塩安定化処理と組合せてもよ
い。 定着液としては一般に用いられる組成のものを
用いることができる。 定着剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩の
ほか、定着剤としての効果が知られている有機硫
黄化合物を用いることができる。 定着液には硬膜剤として水溶性アルミニウム塩
を含んでもよい。 色素像を形成させる場合には常法が適用でき
る。 ネガポジ法（例えば“Journal of the Society
of Motion Picture and Telvision Engineers”
61巻（1953年）、667〜701頁に記載されている）、
黒白現像主薬を含む現像液で現像してネガ銀像を
つくり、ついで少なくとも一回の一様な露光また
は他の適当なカブリ処理を行ない、引き続いて発
色現像を行なうことにより色素陽画像を得るカラ
ー反転法、色素を含む写真乳剤層を露光現像して
銀画像をつくり、これを標白触媒として色素を漂
白する銀色素漂白法などが用いられる。 カラー現像液は、一般に発色現像主薬を含むア
ルカリ性水溶液から成る。発色現像主薬は公知の
一級芳香族アミン現像剤、例えばフエニレンジア
ミン類（例えば４−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン、３−メチル−４−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアニリン、４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β
−ヒドロキシエチルアニリン、３−メチル−４−
アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル
アニリン、３−メチル−４−アミノ−Ｎ−エチル
−Ｎ−β−メタンスルホアミドエチルアニリン、
４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−β−
メトキシエチルアニリンなど）を用いることがで
きる。 この他L.F.A Mason著“Photographic
Prcessing Chemistry”（Focal Press刊、1966
年）の226〜229頁、米国特許2193015号、同
2592364号、特開昭48−64933号などに記載のもの
を用いてもよい。 カラー現像液はそのほかアルカリ金属の亜硫酸
塩、炭酸塩、ホウ酸塩およびリン酸塩の如きpH緩
衝剤、臭化物、沃化物および有機カブリ防止剤の
如き現像抑制剤ないしカブリ防止剤などを含むこ
とができる。また必要に応じて、硬水軟化剤、ヒ
ドロキシルアミンの如き保恒剤、ベンジルアルコ
ール、ジエチレングリコールの如き有機溶剤、ポ
リエチレングリコール、四級アンモニウム塩、ア
ミン類の如き現像促進剤、色素形成カプラー、競
争カプラー、ナトリウムボロハイドライドの如き
かぶらせ剤、１−フエニル−３−ピラゾリドンの
如き補助現像薬、粘性付与剤、米国特許4083723
号に記載のポリカルボン酸系キレート剤、西独公
開（OLS）2622950号に記載の酸化防止剤などを
含んでもよい。 発色現像後の写真乳剤層は通常、漂白処理され
る。漂白処理は定着処理と同時に行なわれてもよ
いし、個別に行なわれてもよい。漂白剤としては
鉄（III）、コバルト（III）、クロム（VI）、銅
（II）などの多価金属の化合物、過酸類、キノン
類、ニトロソ化合物などが用いられる。たとえば
フエリシアン化合物、重クロム酸塩、鉄（III）ま
たはコバルト（III）の有機錯塩、たとえばエチレ
ンジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、１，３−
ジアミノ−２−プロパノール四酢酸などのアミノ
ポリカルボン酸類あるいはクエン酸、酒石酸、リ
ンゴ酸などの有機酸の錯塩；過硫酸塩、過マンガ
ン酸塩；ニトロソフエノールなどを用いることが
できる。これらのうちフエリシアン化カリ、エチ
レンジアミン四酢酸鉄（III）ナトリウムおよびエ
チレンジアミン四酢酸鉄（III）アンモニウムは特
に有用である。エチレンジアミン四酢酸鉄（III）
錯塩は独立の漂白液においても、一浴漂白定着液
においても有用である。 漂白または漂白定着液には、米国特許3042520
号、同3241966号、特公昭45-8506号、特公昭45
−8836号などに記載の漂白促進剤、特開昭53−
65732号に記載のチオール化合物の他、種々の添
加剤を加えることもできる。 また本発明に使用する処理液としては次のよう
な処理組成物であつてもよい。すなわちハロゲン
化銀乳剤の現像と拡散転写色素像の形成とに必要
な処理成分を含有した液状組成物であつて、溶媒
の主体は水であり、他にメタノール、メチルセロ
ソルブの如き親水性溶媒を含むこともある。処理
組成物は、乳剤層の現像を起させるに必要なpHを
維持し、現像と色素像形成の諸過程中に生成する
酸（例えば臭化水素酸等のハロゲン化水素酸、酢
酸等のカルボン酸等）を中和するに足りる量のア
ルカリを含有している。アルカリとしては水酸化
リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
水酸化カルシウム分散物、水酸化テトラメチルア
ンモニウム、炭酸ナトリウム、リン酸３ナトリウ
ム、ジエチルアミン等のアルカリ金属もしくはア
ルカリ土類金属塩、又はアミン類が使用され、好
ましくは室温において約12以上のpHをもつ、特に
pH14以上になるような濃度の苛性アルカリを含有
させることが望ましい。さらに好ましくは処理組
成物は高分子量のポリビニルアルコール、ヒドロ
キシエチルセルローズ、ナトリウムカルボキシメ
チルセルローズの如き親水性ポリマーを含有して
いる。これらのポリマーは処理組成物に室温で１
ポイス以上、好ましくは数百（500〜600）乃至
1000ポイズ程度の粘度を与え、処理時の組成物の
均一な展開を容易にするばかりでなく、処理の過
程で感光要素と受像要素に水性溶媒が移動して処
理組成が濃縮されたときには非流動性の膜を形成
して、処理後のフイルムユニツトが一体化するの
を助ける。このポリマー膜は、拡散転写色素像の
形成が実質的に終了したのちには、それ以上の着
色成分の受像層への移動を抑制して画像の変化を
防止するのに役立てることもできる。処理組成物
はこの他に、処理中にハロゲン化銀乳剤が外部光
によつてカブるのを防止するためにTiO₂、カー
ボンブラック、pH指示色素のような吸光性物質
や、米国特許3579333号に記載されているような
減感剤を含有していることが場合によつては有利
である。さらに処理液組成物中にはベンゾトリア
ゾールの如き現像抑制剤を添加することができ
る。上記の処理組成物は、米国特許2543181号、
同2643886号、同2653732号、同2723051号、同
3056491号、同3056492号、同3152515号等に記載
されているような破裂可能な容器に入れて使用す
ることもなしえる。 本発明の方法によれば、微量成分の検出感度が
高く且つ優れた測定分析結果の精度及び再現性が
得られる。 本発明の方法に使用される標識化合物、即ち分
光増感色素は放射性を有しないため、ラジオイム
ノアツセイ法のような放射能障害を与えず、放射
線取扱資格保持者でなくても測定検査を行なうこ
とができるだけでなく、しかも標識化合物の安定
性が優れているため、標識化合物の長期保存が可
能となる。また、測定機器として通常写真分野で
使用されている濃度計でも充分使用できるため、
簡便且つ低コストで測定できる。 本発明の方法を実施するにあたり分光増感色素
を標識した抗原又は抗体又は抗原抗体反応物や分
光増感色素構造を含む酵素反応生成物又は未反
応基質（増感色素標識物）を検出するために用い
られるハロゲン化銀を含有する検査用フイルムに
おいてより好ましい実施態様としては、ハロゲン
化銀を含有する層の下層に補助層を設けてスポツ
トした検液の吸収量を増加させる方法がある。こ
こに言う補助層の働きはスポツト検液の膜中への
吸収を促進し、検液中の上記被測定化合物の感光
膜中への取りこみ量を増加させ、ひいては、これ
らのハロゲン化銀への吸着量を増加させるもので
ある。このような補助層は、多孔性膜、ロ紙、繊
維、ゼラチンおよび／またはポリマーからなり、
その膜厚は１μｍないし100μｍ、より好ましく
は５μｍ〜40μｍが用いられる。本補助層にはゼ
ラチンやポリマーの他にハロゲン化銀や通常のハ
ロゲン化銀感光材料用の添加剤たとえばカブリ防
止剤、染料、界面活性剤およびコロイド銀などを
含ませることができる。 本発明に用いられるゼラチンは、通常の石灰処
理ゼラチン、酸処理ゼラチン、これらを酵素で処
理した酵素処理ゼラチン、さらにこれらを化学的
に修飾した、たとえばフタル化ゼラチンなどの誘
導体ゼラチン、これらのゼラチンの共存下にモノ
マーをグラフト重合させたグラフトゼラチンなど
を単独で又は任意の比率で混合して用いてもよ
い。本発明に用いられるポリマーとしては膨潤し
やすくまた溶けにくいものが望ましく、アルブミ
ン、寒天、アラビアゴム、アルギン酸、など、ま
た、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、アク
リルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、スチレ
ンスルホン酸、スチレン、メチルメタクリレート
のごとき重合可能なビニル化合物のモノマーを重
合させた親水性のホモポリマー又はこれらのコポ
リマーまたは、セルロース化合物（例えばヒドロ
キシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、デキストリン等）、水可溶性澱粉などを用
いることができる。必要によりこれらに硬化剤を
添加しとけにくくしてもよい。 本発明において、下記の一般式（IX）にで表わ
されるヒドラジン化合物の存在下にて、前記増感
色素標識物とハロゲン化銀を接触させ、対応する
分光増感波長の光で露光しついで現像し、得られ
た現像銀又は発色色素濃度を測定することにより
微量成分の測定を行なうことができる。これによ
り、検出感度の向上などで行なうことができる。 一般式〔IX〕 式中、R¹¹は置換されてもよいアルール基を表
わし、R₁₂は、水素原子、置換されてもよいアル
キル基、置換されてもよいアリール基を表わす。 上記一般式（IX）の化合物は、試薬中たとえば
反応に用いる緩衝液中などに含有されていてもよ
いし、ハロゲン化銀乳剤中に含有されていても、
現像液中に含有されていてもよい。 一般式（IX）で表わされる化合物をハロゲン化
銀感光材料中に含有させる場合の量は、10^-8ない
し10^-1mol／mol Ａｇ、好ましくは10^-6ないし５×
10^-2mol／mol Ａｇである。 また、一般式（IX）で表わされる化合物を前浴
又は現像処理液又は、免疫反応に用いる緩衝液に
含有せしめる場合の量は、前浴又は現像処理液又
は、上記緩衝液１当り５mgないし15ｇ、好まし
くは10mgないし５ｇである。 一般式（IX）、すなわちR¹¹NHNHCOR¹²で表わ
される化合物について更に詳細に説明する。 一般式（IX）において、R¹¹で表わされる置換
されてもよいアリール基は、単環又は２環のアリ
ール基で、例えばベンゼン環やナフタレン環、特
に好ましくはベンゼン環を含むものである。 このアリール基は置換されていてもよく、好ま
しくは次のものが挙げられる。 (1) 直鎖、分岐及び環状のアルキル基、好ましく
は炭素数１〜20のもの、例えばメチル基、エチ
ル基、イソプロピル基、ｎ−ドデシル基、シク
ロヘキシル基。 (2) アラルキル基。好ましくはアルキル基部分の
炭素数が１〜３の単環分は２環のもの。例えば
ベンジル基。 (3) アルコキシ基。好ましくは炭素数１〜20のも
の。例えばメトキシ基、エトキシ基。 (4) アミノ基。好ましくは−ＮＨ₂基又は炭素数１
〜20のアルキル基でモノ又はジ置換されたもの
（例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ
基）。 (5) アリーロキシ基。好ましくはフエノキシ基。 (6) A¹−ＸＹ_nで表わされる基。 (7)

【化】で表わされる基。 (8) R¹³CONHNH−Ａｒ−Ｙ″で表わされる基。 上記(6)のA¹−ＸＹ_nで表わされる基におい
て、 (イ) Ｘは、次のX₁〜X₁₁の中から選ばれる２価の
連結基を表わす。すなわち、X₁＝−CSNH−、
X₂＝−Ｓ−ＣＳＮA¹−、 X₄＝−CONH−、X₅＝−Ｏ−Ｅ−ＣＯＮＨ−、 X₇＝−NHCO−、X₈＝−Ｏ−、X₉＝−ＳＯ₂ＮＨ
−、X₁₀＝−Ｅ−NH−、X₁₁＝−Ｅ＝Ｎ−。 (ロ) Ｙは次のy₁〜y₁₁の中から選ばれる２価の連
結基を表わす。すなわち、y₁＝−CONH−、y₂
＝−Ｅ−CONH−、y₃＝−Ｅ−、y₄＝−Ｅ−Ｏ
−Ｅ′−、y₅＝−Ｅ−Ｓ−Ｅ′−、y₆＝−ＳＯ₂ＮＨ
−、y₇＝−Ｅ−SO₂ＮＨ−、y₈＝ＮＨＣＯＮＨ
−、y₉＝−ＮＨＣＯＮＨ−、y₁₀＝−Ｅ−Ｏ−
Ｅ′−ＣＯＮＨ−、y₁₁＝−Ｅ−Ｅ′−。 ｛ここでR₁₄は水素原子、脂肪族基（好ましくは
炭素数１乃至20のアルキル基、３乃至12員のシ
クロアルキル基、炭素数２乃至20のアルケニル
基）、又は芳香族基（好ましくはフエニル基又
はナフチル基）を表わし、R₁₅は水素原子又は
R₁₁で示した脂肪族基を表わす。R₁₄とR₁₅は互
いに結合して環を形成してもよく、その好まし
い例としては などを挙げることができる（従つて、この場
合、A¹は水素を表わす）。また、R₁₄とR₁₅が環
を形成しない場合、R₁₄とR₁₅のどちらか一方は
水素原子である。 Ｅ及びＥ′は２価の飽和又は不飽和の脂肪族
基（例えばエチレン基、１−メチルプロピレン
基の如きアルキレン基、プロペニレン基、ブテ
ニレン基の如きアルケニレン基）又は２価の芳
香族基（例えばフエニレン基、ナフチレン基、
５−アミノ−１，２−フエニレン基）などを表
わす。ただしy₁₁の−Ｅ−Ｅ′−では、ＥとＥ′は
互いに異なる２価の基を表わし、X₁₁の−Ｅ＝
Ｎ−においては、Ｅは−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ＝（ただ
しｍは０〜２の整数）を表わす。｝ (ハ) ｎは０又は１なる整数を表わす。ｎ＝１の場
合とＸとＹの組合せとしては、特に、x₃−y₂、
x₇−y₂、x₈−y₂、x₁₂−y₃、x₃−y₇、x₅−y₉、x₉
−y₉、x₃−y₁₀が好ましい。 (ニ) A¹は直鎖、分岐又は環状のアルキル基（好
ましくは炭素数１乃至20のもの。例えばメチル
基、プロピル基、ｎ−ヘキシル基など）、単環
又は２環のアリール基（例えばフエニル基）、
単環又は２環のアラルキル基（好ましくは炭素
数７乃至26のもの。例えばベンジル基）、複素
環残基（少なくとも１個のヘテロ原子を含む５
乃至６員環であって、芳香環、特にベンゼン環
と縮合していてもよい。特に、少なくとも１個
の窒素原子を含有する複素環残基が好ましい。
例えば、チアゾリル基、ベンズチアゾリル基、
イミダゾリル基、チアゾリニル基、ピリジニル
基、テトラゾリル基、ベンズトリアゾリル基、
インダゾリル基、ベンズイミダゾリル基、ヒド
ロキシテトラザインデン−２又は−３イルなど
の他、２−メルカプトベンズチアゾリル基、２
−メルカプトベンズオキサゾリル基などのメル
キカプト基を有する複素環残基や、２−メチル
ベンズチアゾリニウム−３−イル、２−（Ｎ−
スルホエチル−ベンズチアゾリニオ）、Ｎ，Ｎ
−ジメチルベンズイミダゾリニウム−２−イル
などの４級窒素原子を有する複素環残基）を表
わす。 Ａで表わされる基は置換基を有していてもよ
い。その例としては、アルコキシ基（好ましくは
炭素数１乃至18のもの。例えばメトキシ基）、ア
ルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数２乃至
19のもの。例えばエトキシカルボニル基）．単環
又は２環のアリール基（例えばフエニル基）、ア
ルキル基（好ましくは炭素数１乃至20のもの。例
えばメチル基、ｔ−アミル基）、ジアルキルアミ
ノ基（好ましくは炭素数１乃至20のもの。例えば
ジメチルアミノ基）、アルキルチオ基（好ましく
は炭素数１乃至20のもの。例えばメチルチオ
基）、メルカプト基、ヒドロキシ基、ハロゲン原
子、カルボキシル基、ニトロ基、シアノ基、スル
ホニル基（好ましくは炭素数１乃至20のもの。例
えばメチルスルホニル基）、カルバモイル基（好
ましくは炭素数１乃至20のもの。例えばカルバモ
イル基、ジメチルカルバモイル基）などがある。 前記(7)の

【化】で表わされる基に
おいて、 (イ) Z¹¹は と共に５員又は６員の複素環を形成する非金属
原子群であり、該複素環は具体的には、チアゾ
リン環、ベンズチアゾリン環、ナフトチアゾリ
ン環、チアゾリジン環、オキサゾリン環、ベン
ズオキサゾリン環、オキサゾリジン環、セレナ
ゾリジン環、ベンズセレナゾリン環、イミダゾ
リン環、ベンズイミダゾリン環、テトラゾリン
環、トリアゾリン環、チアジアゾリン環、１，
２−ジヒドロピリジン環、１，２−ジヒドロキ
ノリン環、１，２，３，４−テトラヒドロキノ
リン環、パーヒドロ−１，３−オキサジン環、
２，４−ベンズ〔ｄ〕オキサジン環，パーヒド
ロ−１，３−チアジン環，２，４−ベンズ
〔ｄ〕チアジン環、ウラシル環等が挙げられ
る。 (ロ) Ｂは水素原子または飽和もしくは不飽和の脂
肪族基｛例えばアルキル基（好ましくは炭素数
１乃至20のもの。例えばメチル基、エチル
基）、アルケニル基（好ましくは炭素数２乃至
22のもの。例えばアリル基）、アルキニル基
（好ましくは炭素数２乃至20のもの。例えばブ
チニル基）｝であり、これは更にアルコキシ
基、アルキルチオ基、アシルアミノ基、アシロ
キシ基、メルカプト基、スルホ基、カルボキシ
ル基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、アミノ基
などで置換されていてもよい。 (ハ) Ｙ′は前述(6)で述べたＹと同じ意味を表わ
す。 (ニ) ｎは０又は１を表わす。 前記(8)のR¹³CONHNH−Ａｒ−Ｙ−で表わされ
る基において (イ) R¹³は後述するR¹²と同義である。 (ロ) −Ａｒ−は２価のアリール基、好ましくはフ
エニレン基を表わす。この基は置換基を有して
いてもよい。 (ハ) Ｙ″は前述(6)で述べたＹと同じ意味を表わ
す。特にy₃〜y₅で表わされる２価の連結基が好
ましい。 一般式（IX）において、R¹²は水素原子、置換
されてもよいアルキル基又は置換されていてもよ
いアリール基を表わす。置換基としては、ハロゲ
ン原子、シアノ基、カルボキシ基、スルホ基など
を挙げることができる。 R¹²で表わされる水素原子以外の基の具体例は
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロ
ピル基、フエニル基、４−クロロフエニル基、４
−ブロモフエニル基、３−クロロフエニル基、４
−シアノフエニル基、４−カルボキシフエニル
基、４−スルホフエニル基、３，５−ジクロロフ
エニル基、２，５−ジクロロフエニル基である。 R¹²で表わされる置換基のうち好ましいのは水
素原子、メチル基、及び置換されてものも含むフ
エニル基である。特に好ましいのは水素原子であ
る。 これらの一般式（IX）で表わされる化合物の中
で好ましい化合物は特開昭53−10921、同53−
20922、同53−66732、特願昭53−125602、同54−
82、特開昭53−20318、リサーチデイスクロージ
ヤー誌17626号（1978年No.176）などに記載されて
いる。この中で特に好ましいのは特開昭53−
10921、同53−20922、同53−66732に記載された
化合物である。 一般式（IX）で表わされる化合物例を以下に示
す。本発明は以下の化合物のみに限定されるもの
ではない。 これらの化合物の合成法は特開昭53−20921、
同53−20922、同53−66732、同53−20318などに
記載されている。 次に、本発明を実施例に基づいて、詳細に説明
するが、本発明は下記の実施例のみに限定される
ものではない。 実施例 １ 増感色素標識インシユリンの合成法 ブタインシユリンの末端アミノ基に増感色素
（Ｉ）のカルボキシル基を混合酸無水物を経由し
た活性エステル化法によつて化学結合させた反応
物をクロマトカラムを通して精製し、増感色素
（Ｉ）標識インシユリンを調製する。（ブタインシ
ユリン１分子に対して２分子の増感色素が結合し
た分画を得る） 増感色素（Ｉ） 増感色素（Ｉ）標識インシユリンは塩臭化銀乳
剤に吸着して、約685ｎｍに感度極大を賦与する。
またこのものは約630ｎｍにも小さな感度極大を賦
与する。 塩臭化銀乳剤の調整 KBr49ｇ、NaCl17ｇを含む70℃の１％ゼラチ
ン水溶液300mlにＡｇＮＯ₃100gを含む水溶液400ml
を添加し、平均粒子サイズ0.8μの塩臭化銀粒子
を形成し、次いで反応副生物を除去した後、５ｇ
のゼラチンと適量の含硫増感剤を加え熟成し約１
kgの塩臭化銀乳剤を得た。 乳剤層 塩臭化銀乳剤100gに少量の増粘剤、少量の塗
布助剤と少量のハロゲン化銀乳剤の安定化剤
(0.1％１−フエニル−５−メルカプトテトラゾー
ル液６ml)を加えた組成物。 上記の方法で合成した増感色素標識インシユリ
ンをpH8.5に調製したトリスヒドロキシアミノメ
タン−塩酸緩衝液、又は化合物１〜５及び35〜36
を0.005重量パーセント溶解した上記緩衝液に4n
ｇ／cc（＝10^-9ｇ／cc）になるよう調製した。但
し化合物５は水に難溶性のためメタノール99％、
1NNaOH1％の混合溶媒に0.5％になるよう溶解
し、これを希釈して0.005％とした。以上の方法
で調製した4nｇ／ccの色素標識インシユリンと
これを含まない前記緩衝液（ブランク）を調製後
直ちに各25μｌ、前記塩臭化銀乳剤含有感光材料
に滴下し、10分放置後富士フイルム製ＳＣ66フイ
ルターを通してナシヨナルストロボＰＥ−563（松
下電器製）を用いて距離30cmでストロボ露光し下
記処方の現像液Ａにより20℃５分現像した後、常
法により定着、水洗し、得られた写真フイルム上
の黒化濃度を富士フイルム製写真濃度計にて測定
しブランクとの濃度差を求めた。さらに上記の溶
液を５℃の暗所に24時間保存後、全く同様に滴
下、露光、処理、濃度測定を実施した。以上の結
果を表１にまとめる。

【表】 現像液Ａ メトール 0.31ｇ 亜硫酸水素ナトリウム 39.6ｇ ハドロキノン 6.0ｇ 炭酸ナトリウム（１水塩） 21.9ｇ 臭化カリウム 0.86ｇ クエン酸 0.68ｇ メタ重亜硫酸カリウム 1.50ｇ 水を加えて １ 化合物１〜５、35、36の添加により分光増感色
素により標識された微量成分の保存による濃度の
低下が著しく改善された。更には濃度値の上昇、
すなわち検出感度の向上も見られた。 実施例 ２ 蒸留水のかわりに0.1％アルブミン、0.1％ゼラ
チンを用いて実施例１と同内容の試験をした。24
時間後の濃度値の調製直後に対する割合を表２に
示す。

【表】 化合物１〜５、35、36の添加よる保存安定化
効果は明らかである。またアルブミン、またはゼ
ラチン自体にも標識物の保存安定性の効果があつ
た。実施例１との比較から、また、一般式〔Ｉ〕
の化合物にゼラチンまたはアルブミンを共存させ
ても保存安定性を低下させることはなかつた。 実施例 ３ 増感色素でＮ末端を修飾したグリシルフエニル
アラニルアミドの合成 色素（構造下記）131mg（250μmol）を12.5ml
のＤＭＦに溶解し−15℃に冷却した。これにクロ
ロギ酸イソブチル33μｌ（250μmol）を加え、
更にトリエチルアミン35μｌ（250μmol）を加
え−15℃〜−10℃で５分間反応させた。次にグリ
シルフエニルアラニルアミドの酢酸塩70mg（250
μmol）とトリエチルアミン35μｌ（250μmol）
を加え０℃で１時間、室温で１時間反応させた。
反応混合物に酢酸エチル25mlを加え生じた沈澱を
取し酢酸エチルで洗浄した。ここで得られた粉
末をシリカゲルカラムクロマトグラフイー（溶出
液クロロホルム／マタノール＝３／１）で繰返し
精製した後、更にクロロホルム／メタノール＝
１／１で再結晶して目的化合物128mg（収率71
％）を得た。 融点 199〜201℃

【式】 マススペクトル（ＦＤ）ｍ／ｚ＝600（Ｍ−Ｉ） 色素構造 上記、合成物を0.2nｇ／ccになるようにpH8.5に
調製したトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩
衝液又は化合物１〜５、35、及び36を0.005重量
％溶解した上記緩衡液に溶解し実施例１と同様な
試験を行なつた。結果を表３に示す。

【表】 表３により示されているように、化合物１〜
５、35及び36の添加により標識物の含水溶媒中で
の経時安定性が著しく改善された。 実施例 ４ 化合物１、化合物２の濃度を下表のように変え
て実施例１と同内容の試験を実施した。結果を下
表４に示す。

【表】 上の結果から0.0001％から１％の範囲で濃度の
低下は未添加にくらべて著しく小さく、すなわち
標識物の安定性が向上したことを示していた。と
くに0.001％から0.1％の範囲のとき上記の効果が
より著しかつた。 実施例 ５ 実施例１に記載の色素標識ブタインシユリン
と、抗ブタインシユリン、モルモツト血清及び抗
モルモツト１ｇＧウサギ血清をそれぞれ第一抗
体、第２抗体として用いた二抗体法で、種々の濃
度の標準インシユリンに対する検量線を下記の方
法で作成した。 種々の濃度（0.2nｇ〜12.8nｇ／ml）の標準イ
ンシユリン溶液0.1mlを小試験管に分注し、
0.1MNaCl％牛血清アルブミン（BSA）含有の
0.1Ｍトリス塩酸緩衝液pH8.5（Ｃ液）各0.4mlを加
える。さらに、あらかじめ力価を定めた抗ブタイ
ンシユリンモルモツト血清の希釈液各0.1mlを加
え、ついで色素標識インシユリンを本発明の化合
物１を0.1％含むＣ液で溶解希釈したものを各0.1
ml加え、よく攪拌したのち４℃で16時間放置す
る。次に抗モルモツト1gGウサギ血清の希釈液を
0.1ml加え、充分攪拌し、さらに４℃で24時間反
応させる。生じた沈澱物を遠心分離（3000rpm10
分間）し、各上澄を、未露光のAgBrCl乳剤
（Br80モル％、平均粒子サイズ0.8μｍ）をＴＡＣ
支持体に塗布したフイルム上の５mmφの面積に20
μｌ滴下し10分間放置後、市販のストロボ（ガイ
ドNo.56）を用い、富士フイルム製ＳＣ−66フイル
ターを通して30cmの距離より露光（10⁵lux×10^-3
秒に相当）し、下記処方の現像液Ｂにより20℃10
秒間現像して得られたフイルム上の黒化濃度を富
士フイルム製写真濃度計にて測定を行ない、以下
の結果を得た。（各抗血清標識インシユリンの希
釈は、標準インシユリン濃度12.8nｇ／mlの場合
の現像銀の黒化濃度が2.5〜3.0の間になるように
定めた。）

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 含水溶媒に、分光増感色素にて標識された微
   量成分と下記の一般式［Ｉ］で示される化合物と
   を含有したことを特徴とする微量成分測定用試
   薬。 一般式［Ｉ］ D₁−Ａ−D₂ 式中、D₁、D₂は縮合多環芳香族ヘテロ環残基
   または芳香族ヘテロ環置換アミノ基を表し、−Ａ
   −は、２価の芳香族残基を表し、D₁、D₂は−Ａ
   −の少なくとも一つは、少なくとも一つの−
   SO₃M基を含み、その際、Ｍは、水素原子、ナト
   リウム原子又はカリウム原子を表す。 ２ 分光増感色素にて標識された抗原または抗体
   と測定すべき抗原または抗体を含有する試料と
   を、それぞれの抗原種または抗体種に特異的に反
   応する抗体または抗原と競合反応させ、その結果
   生じた反応物または未反応物をハロゲン化銀感光
   材料と接触させ、分光増感色素の吸収する波長の
   光で露光し、次いで現像し、得られる銀像濃度ま
   たは色素濃度から抗原または抗体を定量する免疫
   化学的測定方法において、該分光増感色素にて標
   識された抗原または抗体を、下記の一般式［Ｉ］
   で示される化合物の存在下、含水溶媒に溶解する
   ことを特徴とする免疫化学的測定方法。 一般式［Ｉ］ D₁−Ａ−D₂ 式中、D₁、D₂は縮合多環芳香族ヘテロ環残基
   または芳香族ヘテロ環置換アミノ基を表し、−Ａ
   −は、２価の芳香族残基を表し、D₁、D₂又は−
   Ａ−の少なくとも一つは、少なくとも一つの−
   SO₃M基を含み、その際、Ｍは、水素原子、ナト
   リウム原子又はカリウム原子を表す。 ３ 光測定酵素により特異的に接触される構造
   と分光増感色素構造とを少なくとも１つずつ、
   同一分子内に含んだ合成基質を用い、それと被測
   定酵素との酵素反応によつて生じた分光増感色素
   構造を含む反応生成物か、または未反応の合成
   基質のいずれか一方を、ハロゲン化銀と接触させ
   たのちに用いた分光増感色素の吸収する波長の光
   で露光し、次いでこれを現像し、その黒化濃度ま
   たは色素濃度から酵素活性を測定する方法におい
   て、該合成基質を下記の一般式［Ｉ］で示される
   化合物の存在下に含水溶媒に溶解することを特徴
   とする酵素測定方法。 一般式［Ｉ］ D₁−Ａ−D₂ 式中、D₁、D₂は縮合多環芳香族ヘテロ環残基
   または芳香族ヘテロ環置換アミノ基を表し、−Ａ
   −は、２価の芳香族残基を表し、D₁、D₂又は−
   Ａ−の少なくとも一つは、少なくとも一つの−
   SO₃M基を含み、その際、Ｍは、水素原子、ナト
   リウム原子又はカリウム原子を表す。