JPS6312480B2

JPS6312480B2 -

Info

Publication number: JPS6312480B2
Application number: JP56175030A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Morihara; Tatsu Oka; Hiroshige Tsuzuki
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1981-10-30
Filing date: 1981-10-30
Publication date: 1988-03-18
Also published as: JPS57155997A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はインシユリン誘導体に関するものであ
る。本発明者らはトリプシンまたはカルボニル側
塩基性アミノ酸残基に特異性を示すトリプシン様
酵素の作用によりデス―B30―インシユリンに１
〜100倍モル量のスレオニン誘導体を反応させて、
ついで得られる縮合物から保護基を除去してイン
シユリンを得る方法を発見した。

インシユリンは糖尿病の治療薬として代替品の
ない貴重な薬物であり、現在主として牛インシユ
リンおよび豚インシユリンが治療に用いられてい
る。しかし、これらのインシユリンは構成アミノ
酸の一部が人インシユリンと異なつているため、
体内で抗体が産生されることがあり、抗体が産生
されるとそれ以後のインシユリンの治療効果が著
しく低下するなどの問題を生じる。したがつて、
工業的規模で行ないうる人インシユリンの合成方
法の確立が強く希まれている。

本発明者らの方法によれば、人インシユリンと
Ｂ鎖30位のアミノ酸のみが異なる豚インシユリン
を原料に用いて人インシユリンを容易に合成する
ことができる。このようにして得られる人インシ
ユリンが理想的な治療用インシユリンであること
は論を俟たない。

豚デスオクタペプチドインシユリンと人インシ
ユリンオクタペプチドから人インシユリンを得る
試みは、エム・エー・ルツテンベルグ（M.A・
Ruttenberg）がサイエンス（Science）177巻623
頁（1972年）に、およびアール・オーベルマイヤ
ー（R.Obermeier）らがサイツシユリフト・フユ
ア・ヒジオロジツシエ・ヘミー（Zeitschrift fu¨r
Physiologische Chemie）357巻759頁（1976年）
に発表しているように既になされているが、何れ
も化学的手段によるものであり、前者においては
工程の最後にアルカリ処理を含み、これに伴う副
反応がさけられない。また後者の場合は反応が非
特異的で多くの副反応で生じるため、精製が複雑
かつ困難となり収率も著しく低い。従つて、工業
的規模では到底行ない得ない。

一方、本発明者らの方法はデス―B30―インシ
ユリンとＬ―スレオニン誘導体とを酵素反応によ
り縮合させてインシユリンを得る方法で、公知の
化学的手段による方法とは異なり、反応が特異的
で副反応も生ぜず、ラセミ化も起きず、未反応原
料を損なわずに回収できる、等の利点を有する。

さらに同方法では、１〜100倍モル量のＬ―ス
レオニン誘導体を用いることにより、通常の酵素
反応では当然起きるＢ鎖22位のアルギニンのカル
ボニル側切断が防止され、したがつて通常の酵素
反応では必須であるアルギニン側鎖への保護基導
入が不必要である。

同方法は、トリプシンまたはカルボニル側塩基
性アミノ酸残基に特異性を示すトリプシン様酵素
の存在下に、Ｂ鎖30位のアミノ酸が欠けたデス―
B30―インシユリン（以下化合物と記す）に１
〜100倍モル量のＬ―スレオニン誘導体（以下化
合物と記す）を反応させ、ついで得られる縮合
物から保護基を除去することよりなる。化合物
は下記の一般式で表わされる。

（式中、R¹は水素またはヒドロキシ基の保護
基、R²はカルボキシル基の保護基をそれぞれ表
わす。）上記の化合物は豚起源のインシユリンにカル
ボキシペプチダーゼＡを作用させることにより得
られ、例えば、イ・ダブリユー・シユミツト（E.
W.Schmitt）らがホツペーセイラーズ・サイトシ
ユリフト・フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー
（Hoppe―Seyler′sZeitschrift fu¨r
Physiologische Chemie）359巻799頁（1978年）
に記載している方法により製造できる。またアク
ロモバクター・リテイカス（Achromobacter
lyticus）が産生するリジンに特異性を有し、リ
ジンのカルボニル側を切断する酵素を用いても容
易に製造することができる。同酵素の分離および
性状については、正木らがアグリカルチユラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Agricultural and Biological Chemistry）42巻
1443頁（1978年）に発表しており、同論文におい
ては上記性状を有する酵素をプロテアーゼと称
している。

化合物は、その側鎖官能基であるヒドロキシ
基が保護されていなくとも反応に供しうるが、保
護基を導入するならば、ペプチド合成反応で通常
利用される保護基、例えば、ｔ―ブチル、ベンジ
ル、アセチルなどを用いるとよい。また、化合物
のカルボキシル基は保護されていることが必要
で、通常用いられるカルボキシル基の保護基を使
用すればよい。例えば、ｔ―ブチル、ベンジルな
どのアルキルおよびアラルキルエステルの形で修
飾する。

上記の保護基の選択においては、それらの保護
基の導入または除去処理において、インシユリン
を変性したり失活したりしないものを選択するよ
う考慮すべきである。ペプチド合成に用いる保護
基については、エム・ボダンスツキー（M.
Bodanszky）らがペプチド・シンセシス
（Peptide Synthesis）第２版（1976年）（ジヨ
ン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wiley＆
Sons））に詳しく記載している。

なお、保護基の選択においては、一回の保護基
脱離操作により同時に除去できるものを選ぶのが
好ましいことは論を俟たない。

同方法で使用する酵素は、トリプシンまたは各
種動植物および微生物起源のカルボキシル側塩基
性アミノ酸に特異性を示すトリプシン様酵素など
を含む。トリプシン様酵素としては、例えば、ス
トレプトマイセス属菌から抽出分離された酵素が
ある。同酵素については森原らがアーキバス・オ
ブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフイジ
クス（Arch.Biochem.Biophys.）126巻971頁
（1968年）に、吉田らがエフイービーエス・レタ
ーズ（FEBS Lett.）15巻129頁（1971年）に記載
している。使用する酵素は混在するキモトリプシ
ンまたはキモトリプシン様の活性を除去する目的
でトシル―Ｌ―フエニルアラニンクロロメチルケ
トン（TPCK）などで処理するとよい。

化合物と化合物の縮合反応は上記の酵素の
ペプチド結合形成反応に適した条件で行なわれ
る。PHは５〜８、特に６〜７付近が好ましく、反
応温度は０〜50℃、とくに20〜40℃がよい。化合
物と化合物の濃度は可能なかぎり高いことが
のぞましい。さらに化合物と化合物は１：１
〜100：１のモル比で反応させるのがよく、とく
に20：１〜100：１付近がよい。反応液には水と
混合しうる適当な有機溶媒を加える。有機溶媒の
添加は、反応液中の水の濃度を下げて、逆反応で
ある加水分解反応を抑えるだけでなく、化合物
および化合物の溶解性を著しく高める点で効果
がある。有機溶媒としては、例えば、メタノー
ル、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、グリセリンなどを単独でまたは
組合せて用いる。とくに０〜65％、とくに40〜60
％の濃度で用いるとよい。一般に、有機溶媒を用
いる場合は、原料の溶解度、酵素の変性や加水分
解反応などを考慮して水に対する割合を決定す
る。反応液の緩衝剤としては、トリスヒドロキシ
メチルアミノメタン（トリス）や炭酸塩などが用
いられる。

反応液の酵素濃度は基質濃度や酵素の活性で異
なつてくるが、市販結晶トリプシンを用いる場合
は１mg／ml〜10mg／ml付近がよい。酵素はそのま
ま用いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又は
包含させた固定化酵素として用いてもよい。

反応時間は、反応条件により異なるが、通常は
酵素反応が平衡に達するに要する時間をとればよ
く、通常３〜72時間、多くの場合６〜24時間程度
である。

反応終了後はペプチドの分離法として通常用い
られる方法を組合せて利用し、Ｂ鎖30位スレオニ
ンがカルボキシル基に保護基を有しかつヒドロキ
シ基に保護基を有していてもよい人インシユリン
を得、ついで目的とする人インシユリンを得る。

例えば、反応終了後反応液をゲル過にかけ、
未反応の化合物および酵素を単離回収する。回
収した化合物および酵素はそのまま再使用が可
能である。残部を適当なクロマトグラフイーに付
し、生成したＢ鎖30位スレオニンがカルボキシル
基に保護基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有
していてもよい人インシユリンと未反応デス―
B30―インシユリンを分離する。後者は化合物
として再使用できる。前者は更に保護基脱離反応
に付し、人インシユリンとする。

保護基の脱離方法は用いる保護基によつて異な
るが、通常の脱離方法に準じて行えばよく、例え
ば、ヒドロキシ基やカルボキシル基の保護基とし
て使用されるｔ―ブチル基は、カチオン捕捉剤
（例えばアニソール）の存在下トリフルオロ酢酸
で処理すると脱離する。前記のように単一の脱離
処理で除去できる保護基をスレオニンの側鎖官能
基およびカルボキシル基の保護に用いると、脱離
処理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末端
がその他のエステルになつている場合も適当な加
水分解処理により保護基を除去できる。

本発明のＢ鎖30位スレオニンがカルボキシル基
に保護基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有し
ていてもよい人インシユリンから得られるインシ
ユリンは先に記載したように血糖降下作用を有す
る糖尿病治療薬としてまたは試薬として有用であ
る。本発明者らの方法で豚インシユリンより合成
した人インシユリンはマウスに対する血糖降下作
用試験において牛インシユリンと同等の効果を示
した。

本発明化合物より合成した人インシユリンは、
市販の豚インシユリンや牛インシユリンと同様に
製剤化し、人に投与される。すなわち、塩化亜鉛
などを加えて亜鉛複合体にしたり、リン酸水素ナ
トリウムや酢酸ナトリウム等の緩衝剤を加えたり
等張液とするため塩化ナトリウムを加えるなど、
さらに、クレゾール、フエノール、パラオキシ安
息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチルエステルなど）などの防腐
剤を加えるなどの市販インシユリン製剤に用いら
れる調製法を利用し、注射剤を製造する。かかる
注射剤の投与量は患者の症状に応じて異なるが、
市販のインシユリン製剤の投与と同様に行えばよ
く、成人１日約１〜100単位を投与するようにす
るとよい。

以下に実施例において、本発明化合物の製造例
を示すが、実施例は本発明を何ら限定するもので
ない。

なお、実施例で用いる略号は下記の意味を表わ
す。

Ala アラニン Ile イソロイシン Arg アルギニン Leu ロイシン Asn アスパラギン Lys リジン Asp アスパラギン酸
Phe フエニルアラニン CySO₃H システイン酸 Pro プロリン Glu グルタミン酸 Ser セリン Gln グルタミン Thr スレオニン Gly グリシン Tyr チロシン His ヒスチジン Val バリン OBu^t ｔ―ブチルエステル残基また、デス―B30―インシユリンとはインシユ
リンＢ鎖の30位アミノ酸が欠損しているインシユ
リン、例えば、豚インシユリンではアラニンが欠
損しているインシユリンをいう。

実施例１ (1) デス―B30―インシユリン（豚型）豚インシユリン500mgを0.1M炭酸水素アンモニ
ウム（PH8.3）100mlに溶解し、結晶カルボキシペ
プチダーゼＡ（ワーシングトン社製、ジイソプロ
ピルフルオロホスヘート処理、49u／mg）５mgを
添加して室温で８時間反応させる。アラニンの生
成量が0.77M／1Mインシユリンのときに反応を
止め、反応物を凍結乾燥後、0.5M酢酸に溶解し
超微細粒のセフアデツクスG50のカラム（3.5×
95cm）に吸着させ、0.5M酢酸で１フラクシヨン
あたり11.5mlで溶出する。フラクシヨンの40〜60
番を集め凍結乾燥し標起化合物460mgを得る。収
率92％。

生成物を酸加水分解（6M塩酸、110℃、24時
間）に付して得たアミノ酸分析値は下記のとおり
である。括弧内の数値は理論値を示す。以下にお
いても同様。

Lys 1.00(1)， His 1.91(2)， Arg 0.95(1)， Asp 3.21(3)， Thr 2.09(2)， Ser 2.97(3)， Glu 7.35(7)， Gly 4.29(4)， Ala 1.26(1)， CySO₃H 5.94(6)， Val 3.86(4)， Ile 1.55(2) Leu 6.53(6)， Tyr 4.08(4) Phe 3.22(3)， Pro 1.2(1)。

(2) 〔B30―Thr―OBu^t〕―インシユリン（豚
型） (1)の生成物100mg（10mM）とＬ―スレオニン
―ｔ―ブチルエステル154mg（500mM）をエタノ
ール／ジメチルホルムアミド混液（１：１）1.05
mlに溶解し、結晶トリプシン（ワーシングトン社
製、３回再結晶）４mgを含有する0.5M硼酸塩緩
衝液（PH6.5）0.75mlと混合する。なお、この混
合液にはトシル―Ｌ―フエニルアラニンクロロメ
チルケトン（以下TPCKと記す）が最終濃度
0.01mMで含有されるようにしておく。同混合液
を37℃で１晩保つ。高速液体クロマトグラフイー
により目的化合物の生成を確認し収率を求めると
75％であつた。混合液を氷酢酸で酸性としたのち
超微細粒のセフアデツクスG50のカラム（4.2×
130cm）でゲル過を行い、トリプシン含有分画、
標記インシユリン誘導体を含有する分画、Ｌ―ス
レオニン―ｔ―ブチルエステル含有分画に分け
る。酵素活性およびニンヒドリン反応を測定し、
トリプシンおよびスレオニンｔ―ブチルエステル
は各々50％回収されることが確認された。インシ
ユリン誘導体を含有する分画を凍結乾燥し、標記
化合物の粗粉末89mgを得る。

次いで、0.01Mトリス緩衝液（PH7.6）と7M尿
素で緩衝化したDEAE―セフアデツクスA25のカ
ラム（1.9×24.5cm）に上記生成物を４℃でかけ、
上記緩衝液を800ml流したのち食塩濃度0.3Mまで
直線的に濃度勾配をつけた溶出を行い、0.08〜
0.09M濃度付近の分画Ａと0.13〜0.14濃度付近の
分画Ｂを順次得る。各分画を直ちに３〜４日間冷
所で0.01M酢酸アンモニウム溶液に対して透析し
た後凍結乾燥し、分画Ａより粉末35mgを、分画Ｂ
より27mgを得る。高速液体クロマトグラフイーお
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動により、前
者が標記化合物であり後者がデス―B30―インシ
ユリン（豚型）と標記化合物の混合物であること
が確認された。

標記化合物の高速液体クロマトグラフイーおよ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定値
を以下に示す。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PH８；10％
ゲル；18.1mA／cm²；泳動時間100分）：移動距離
4.3cm。

高速液体クロマトグラフイー［ヌクレオシル
（Nucleosil）7C₁₈（Macherey―Nagel社製）；４
mm×50mm（プレカラム）および４mm×250mm（メ
インカラム）；32％アセトニトリル―バツフアー
溶液（2mMリン酸、5mM・ｎ―ブチルスルホン
酸ナトリウム、50mM硫酸ナトリウム、PH3.0）；
流速：毎分２ml］：保持時間13.2分。

参考例人インシユリンアニソール0.2mlを含むトリフルオロ酢酸２ml
を上記(2)で得た化合物30mgに加え、室温で30分保
つ。窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除き、1N
酢酸２mlの存在下、エーテル15mlでアニソールを
抽出した後、酢酸部を凍結乾燥し標記化合物28mg
を得る。原料の純度を77％とすると収率43％であ
る。

本品はアミノ酸分析値、スラブゲル電気泳動、
高速液体クロマトグラムにより標記化合物と同定
した。

(1)と同様の条件で行つたアミノ酸分析の結果は
下記のとおりである。

LyS 1.00(1)， His 1.89(2)， Arg 0.87(1)， Asp 3.32(3)， Thr 3.16(3)， Ser 2.99(3)， Glu 7.35(7)， Pro 1.29(1)， Gly 4.39(4)， Ala 1.26(1)， CySO₃H 4.6(6)， Val 3.93(4)， Ile 1.61(2)， Leu 6.51(6)， Tyr 3.68(4)， Phe 3.19(3)。

スラブゲル電気泳動（PH８；10％ゲル；
18.1mA／cm²；泳動時間100分）：移動距離6.0cm。
高速液体クロマトグラフイー〔ヌクレオシル
（Nucleosil）7C₁₈（Macherey―Nagel社製）；４
mm×50mm（プレカラム）および４mm×250mm（メ
インカラム）；32％アセトニトリル―バツフアー
溶液（5mMリン酸、5mM・ｎ―ブチルスルホン
酸ナトリウム、50mM硫酸ナトリウム、PH3.0）；
流速：毎分２ml〕：保持時間4.97分。

Claims

【特許請求の範囲】１Ｂ鎖30位スレオニンがカルボキシル基に保護
基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有していて
もよい人インシユリン。２カルボキシル基の保護基がアルキルである特
許請求の範囲１の人インシユリン。３ヒドロキシ基に保護基を有さない特許請求の
範囲１の人インシユリン。４ヒドロキシ基に保護基を有さない特許請求の
範囲２の人インシユリン。