JPS6359464B2

JPS6359464B2 -

Info

Publication number: JPS6359464B2
Application number: JP56092639A
Authority: JP
Priority date: 1981-06-15
Filing date: 1981-06-15
Publication date: 1988-11-18
Also published as: JPS57206860A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は血液中のヘモグロビンとくに異化ヘモ
グロビンを診断等のために分離定量する方法に関
するものである。

成人のヘモグロビン（以下Hbと略す）は分子
量約68000の蛋白質で、４個のヘムが１個のグロ
ビン蛋白に結合した形で存在している。ところが
アルカリ性のPH（PH8.6）の条件下で正常ヒトHb
を電気泳動させると90〜95％を占めるHb、すな
わちHbA₀の他に、該HbA₀よりも移動度が少し
遅れてHbF及びHbA₁cが、さらに遅れてHbA₁a、
HbA₁b等が分離され、これらの存在が認められ
ている。さらに、より精密な電気泳動試験等の結
果から、HbA₁d、HbA₁e等の存在も確認されて
いる。これら異常ヘモグロビンは正常ヘモグロビ
ン（HbA₀）に比して、蛋白の一次構造が違つて
いるものか或いはHbA₀に糖が化合しているもの
等である。これらの異化ヘモグロビンの分離定量
は種々の病気の病態指標として重要であることが
分つており、例えばHbA₁cの増減のチエツクは
糖尿病の治療に欠かせない。又、HbA₂と称され
る成分はHbFと同様に遺伝性のものであり、さ
らにアセチル化ヘモグロビン（Ac、Hb）と称さ
れる異常ヘモグロビンはアセチル基を有する薬剤
例えばアスピリン等の服用により生成することが
判明してきており、これらの異化ヘモグロビンの
分離定量は医学的な見地からしてますます重要性
の度合が高まつている。

しかしながら現在までに、上記の様な異化ヘモ
グロビンを短時間で精度よく分離、定量すること
の出来る方法は提案されていなかつた。

本発明は上記の如き現状にかんがみ、異化ヘモ
グロビンを糖度よくしかも短時間に分離、定量す
ることの出来る方法を提供することを目的として
なされたものであり、その要旨は、分子中に１個
の重合性２重結合と１個以上のアミノ基を有する
重合性モノマー(A)５〜90重量％、分子中に２個以
上の重合性２重結合を有しかつ疎水性パラメータ
ーが２，３以下の架橋重合性モノマー(B)10〜95重
量％、分子中に１個の重合性２重結合を有し疎水
性パラメーターが2.3以下にして上記重合性モノ
マー(A)とは異なるモノマー(C)０〜85重量％からな
るモノマー混合物が共重合されてなる親水性イオ
ン交換体を固定相とする液体クロマトグラフイー
によつて行われることを特徴とする異化ヘモグロ
ビンの分離方法に存する。

本発明において特定の組成のモノマー混合物が
共重合されてなる親水性イオン交換体が、液体ク
ロマトグラフイーの固定相として用いられるので
ある。そして上記共重合されたイオン交換体を固
定相すなわち充填剤として用いるには、例えば共
重合により得られた共重合体粒子を粒径を揃える
等してそのまゝ充填剤として用いてもよく、バル
ク重合の場合は共重合体を粉砕したものを粒径を
揃えて用いてもよく、又はガラス球等の適宜な芯
材の表面に上記共重合体を適宜な方法でコーテイ
ングしたものを用いてもよい。

しかして本発明充填剤を構成する共重合体は、
分子中に１個の重合性２重結合と１個以上のアミ
ノ基を有するを重合性モノマー(A)が５〜90重量
％、分子中に２個以上の重合性２重結合を有しか
つ疎水性パラメーターが2.3以下の架橋の重合性
モノマー(B)が10〜95重量％、分子中に１個の重合
性２重結合を有し疎水性パラメーターが2.3以下
にして上記重合性モノマー(A)とは異なるモノマー
(C)が０〜85重量％からなるモノマー混合物が共重
合されたものであり、この共重合には懸濁重合、
エマルジヨン重合、溶液重合、バルク重合等の従
来において行われている重合法が採用可能である
が、重合体粒子をそのまゝ充填剤として用いるこ
とが出来る点で懸濁重合法が好適である。又、懸
濁重合の際に、モノマーは溶解するが重合体を溶
解しない有機溶剤を少量加えておけば生成した共
重合体粒子は多孔質のものとなり、移動相との接
触面積が増大した充填剤が得られる。

ここで疎水性パラメーターとは或る化合物のオ
クチルアルコール水系への溶解度比の対数であ
り、その化合物特有の値である。そして該パラメ
ーターは実験によつても求められるが、分子中の
各フラグメントの寄与（疎水性フラグメント定
数）が計算によつて求められることが出来、これ
らの総和としてその化合物の疎水性パラメーター
値が算出できる。

疎水性パラメーター値の計算法については、
R.F.Rekker著「The Hydrophobic Fragmental
Constant」（Elsevier Scientific Publishing
Co.1977年発行）の第３章に述べられており、本
発明におけるパラメーター値はこの計算法に基づ
いている。

次に本発明において好適に用いられる重合性モ
ノマー(A)の例としてはメタクリル酸ジメチルアミ
ノエチル、メタクリル酸ジエチルアミノエチル等
が挙げられ、疎水性パラメーターが2.3以下のも
のが好適に用いられる。

又、本発明に用いられる架橋重合性モノマー(B)
の例としてはテトラメチロールメタントリアクリ
レート（疎水性パラメーター＝−0.73、以下括弧
内はパラメーター値を示す。）、テトラメチロール
メタントリメタクリレート（0.59）、テトラメチ
ロールメタンジアクリレート（−1.70）、テトラ
メチロールメタンジメタクリレート（0.82）、テ
トラメチロールメタンテトラアクリレート
（0.24）、テトラメチロールメタンテトラメタクリ
レート（0.20）、トリメチロールエタントリアク
リレート（0.88）、トリメチロールエタントリメ
タクリレート（2.20）、ジペンタエリスリトール
ヘキサアクリレート（−0.09）等が挙げられ、そ
の他テトラエチレングリコールジメタクリレート
（−0.30）などのポリエチレングライコールジア
クリレート（又はメタクリレート）やポリプロピ
レングライコールジアクリレート（又はメタクリ
レート）等のアルキレングライコールジアクリレ
ート（又はメタクリレート）も使用出来る。又、
前記モノマー(A)とは異なるモノマー(C)は本発明に
おいて必要に応じて85重量％の量的範囲まで用い
ることが出来るのであるが、該モノマー(C)として
はNN―ジメチルメタアクリルアミド（−0.88）、
２―ヒドロキシエチルメタアクリレート（−
0.41）、グリシジルメタアクリレート（−0.48）
などが好適に用いられ、その他NN―ジメチルア
クリルアミド、２―ヒドロキシエチルアクリレー
ト、グリシジルアクリレートなども使用出来る。

本発明においては上述の如く、重合性モノマー
(A)５〜90重量％、架橋重合性モノマー(B)10〜95重
量％からなるモノマー混合物若しくは必要に応じ
て前記モノマー(C)が85重量％まで加えられたモノ
マー混合物が共重合されるのであるが、得られた
共重合体はアミノ基を有する重合性モノマー(A)が
分子中に存在することによりそれ自体イオン交換
作用を示すイオン交換体となる。そしてモノマー
混合物において、アミノ基を有する１官能性のモ
ノマー(A)が少なすぎるとイオン交換能が低下する
のでモノマー(A)は５重量％以上が必要とされるの
であり、又、２個以上の重合性２重結合を有する
架橋重合性モノマー(B)の量が少なすぎると共重合
体中の架橋結合の密度が減じ、とくに高速液体ク
ロマトグラフ用充填剤として用いられた際、高圧
に対坑するための機械的強度に問題が生じるので
該モノマー(B)は10重量％以上が必要とされるので
ある。又、前記重合性モノマー(A)以外の重合性２
重結合を有するモノマー(C)は、重合性モノマー(A)
及び架橋重合性モノマー(B)の使用割合が必要量よ
り少くならない範囲で混合モノマー中に含まれる
ことが出来る。

本発明に用いられる親水性イオン交換体を共重
合により生成するモノマー混合物中に含まれるモ
ノマー(B)，(C)は疎水性パラメーターが2.3以下と
なされるのであるが、これは、上記モノマー混合
物が共重合されたイオン交換体からなる充填剤が
異化ヘモグロビンの分析においてすぐれた分離能
を示すという本発明の知見にもとずくものであ
り、例えば従来からイオン交換体を製造するため
に架橋重合性モノマーとして常用されて来たジビ
ニルベンゼンは疎水性パラメーターが3.8と高い
ので、これが共重合成分として含まれるイオン交
換体を充填剤として用いても本発明の効果を奏し
得ないのである。

又、前記重合性モノマー(A)、架橋重合性モノマ
ー(B)及び必要に応じて加えられるモノマー(C)の疎
水性パラメーターが０以下かマイナス側にあるの
が本発明における分析時に分析物質の充填剤への
吸着を防止する点で好ましい。

上記親水性イオン交換体は常法によりカラムに
充填されて、液体クロマトグラフによる本発明の
分離に用いられるのであり、その際にはイオン交
換機構にもとずく分析挙動を示す。

本発明による分離は、上記親水性イオン交換体
が充填されたカラムを液体クロマトグラフ好まし
くは高速液体クロマトグラフに接続し、それ以後
は液体クロマトグラフによる分離、定量の手法に
従つて試料である血液をクロマトグラフに注入
し、溶離液を流す等の操作により行うことが出来
る。分離の対象となる異化ヘモグロビンの種類や
使用するカラム充填剤の種類によつて最適な溶離
条件が決定さるべきであるが、一般に溶離液とし
てPH5.0〜10.0、イオン強度0.01の水溶液が用いら
れるのが好ましく、又、分離操作中にPHやイオン
強度を変化させる手法によつて種々の異化ヘモグ
ロビンを良好に分離、定量することが出来る。
又、検出は波長415nmの可視光を用いて行うのが
好ましい。

又、異化ヘモグロビンの溶出順序は一般に殆ん
ど変動しないが、溶離操作において溶離条件を変
化させることによつて、特定の異化ヘモグロビン
を良好なクロマトグラフピークとして出現させ、
他の異化ヘモグロビンや正常ヘモグロビンは分離
が良好でないまとまつたピークとして出現させて
目的とする異化ヘモグロビンの定量を短時間で効
果的に行うことも可能である。

本発明は上述の通りの異化ヘモグロビンの分離
法であり、とくに特定組成のモノマー混合物が共
重合されてなる親水性イオン交換体が固定相とし
て用いられ、該固定相は分離性能と共に強度的に
もすぐれているので高速液体クロマトグラフ用充
填剤として用いることが可能であり、本発明によ
れば異化ヘモグロビンを精度よくしかも短時間に
分離、定量することが出来るというすぐれた効果
を奏するのである。

以下本発明の実施例について説明する。

実施例１冷却機、撹拌機、温度計および滴下ロートの設
置された２のセパラブルフラスコに４重量％の
ポリビニルアルコール水溶液400ml、テトラエチ
レングリコールジメタクリレート）40ｇ、テトラ
メチロールメタントリアクリレート10ｇ、ジエチ
ルアミノエチルメタクリレート50ｇ、トルエン40
ｇおよびベンゾイルパーオキサイド1.5ｇよりな
る混合液を供給した。次に400rpmの撹拌速度で
撹拌しながら80℃に昇温し10時間反応を行つて冷
却した。冷却後重合生成を母液分離した後、熱水
およびアセトンで洗浄して粒子径が５〜20ミクロ
ンの球状ポリマーを得た。そのうち微粒子および
粗粒子を取除いて得られた８〜12ミクロンの粒子
を80mlのイオン交換水に分散し、ステンレスカラ
ム（直径7.9mm、長さ30cm）に高圧定流量ポンプ
により上記イオン交換水を1.6ml／分の速度で圧
送することにより充填した。

得られた充填カラムを高速液体クロマトグラフ
（商品名：島津デユポン高速液体クロマトグラフ
830型）に接続して以下の分析操作を行つた。

試料として正常人及び糖尿病患者のそれぞれの
血液50μを１c.c.のイオン交換水と混合して溶血
させたヘモグロビン溶液10μをミクロシリンジ
により注入して分析を行つた。溶離液としては
0.05Mトリス塩酸と0.01M塩化ナトリウム水溶液
との混合液をＡ液（PH7.8）とし、Ｂ液としてＡ
液にNaClを加えて0.05Mになるように調整した
水溶液を用いた。

Ａ液100％で溶離を開始し、Ｂ液を２％／１分
の割合で増加させる様にした。得られたクロマト
グラムを第１図に示す。なお検出は415nmの可視
光検出機を用いた。

次に、この分野でよく知られている液体クロマ
トグラフイー用充填剤（Biorex―70、バイオラ
ツド社（米）製）を用いるイオン交換カラムクロ
マトグラフイーによつて、A₁c、A₀成分を約２時
間以上かけて分画し、それぞれの分画成分につい
て前記条件で本発明による高速液体クロマトグラ
フ分析を行つて、第１図のクロマトグラムのピー
ク１，２の同定を行つたところ、A₁c及びA₀はそ
れぞれ、２及び１のピークに一致することが分つ
た。ベースライン法で求めたHbA₁cの量は正常
人血で3.5％、糖尿病患者血で6.2％であつた。

実施例２モノマーとしてノナエチレングリコールジメタ
クリレート36ｇ、テトラメチロールメタントリア
クリレート５ｇ及びジメチルアミノエチルメタク
リレート50ｇを用い、有機溶媒としてトルエン40
ｇを用いた以外は実施例１と同様にして充填剤及
び充填カラムを用意し、実施例１と同じ試料を用
い、同様にして分析を行つたところ、第１図と同
様なクロマトグラムが得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた人血のクロマトグ
ラムを示す。Ａ……正常人血のクロマトグラム、Ｂ……糖尿
病患者血のクロマトグラム、１……HbA₀のピー
ク、２……HbA₁cのピーク。

Claims

【特許請求の範囲】

１分子中に１個の重合性２重結合と１個以上の
アミノ基を有する重合性モノマー(A)５〜90重量
％、分子中に２個以上の重合性２重結合を有しか
つ疎水性パラメーターが2.3以下の架橋重合性モ
ノマー(B)10〜95重量％、分子中に１個の重合性２
重結合を有し疎水性パラメーターが2.3以下にし
て上記重合性モノマー(A)とは異なるモノマー(C)０
〜85重量％からなるモノマー混合物が共重合され
てなる親水性イオン交換体を固定相とする液体ク
ロマトグラフイーによつて行われることを特徴と
する異化ヘモグロビンの分離方法。