JPS6363193B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は各種菌体を培養する高濃度培養方法及
び装置に関するものである。 （従来の技術） 一般に各種菌体を培養する場合、その代謝産物
により増殖阻害を受けることが多い。 そこで培養槽とUF膜の濾過膜を組合せて培養
中に生産される代謝産物を除き高濃度培養を達成
しようとする試みは実験室レベルではすでに行わ
れている。 第２図のものは培養槽１と保持タンク２との間
に透析槽３を設け之等をポンプ４を通じて連結し
てあり、代謝産物が透析膜を通じて取り除かれる
ようになつていて菌体液は循環するようになつて
いる。 これはJournal the Society Dairy Tecnology
Vol 30 No.１ January 1979に掲載されている。
又The Australian Journal of Dairy
Tecnology March 1977には、次のようなことが
掲載されている。すなわち、第３図において第
1RO膜５、第2RO膜６をポンプ７と圧力制御弁
８とを通じて原料タンク９に連結してあり、各
RO膜で代謝産物を取り除き低分子栄養成分を回
収し、原料タンク９に還元されるようになつてい
る。 （発明が解決しようとする問題点） 以上のような従来の方法では透析膜より除去さ
れた低分子栄養成分を培養槽に直接供給し、培養
槽内の液レベルを一定に保持し、培養を継続して
いた。 しかしこの方法では培養経過に伴い、培養液の
高粘度化、膜面への菌体の目づまりにより液透過
速度は急激に低下し、培養槽内で生成した代謝物
を十分に除ききれず、したがつて槽内に代謝物が
蓄積され菌体の増殖が抑制されるという欠点があ
る。 （問題点を解決するための手段） したがつて本発明の技術的課題は連続的に代謝
物を除きながら培養を継続させ、連続的に高濃度
の菌体を培養させることのできる高濃度連続培養
方法及び装置をうることを目的とするものであ
る。 この技術的課題を解決する本発明の技術的手段
は、培養槽で各種菌体を培養するに当たつて、培
養中に生成される代謝産物を培養槽と共に循環回
路を構成する第１、２濾過膜を通して取り除き、
取り除いた代謝産物から低分子有効成分を回収し
てこれを新鮮培地と共に前記濾過膜を通して循環
回路に供給するに当たり、循環回路の正流方向で
は第２濾過膜に供給し、逆流方向では第１濾過膜
に供給して連続的に高濃度菌液をうるようにした
ことと、培養槽とUF膜等の濾過膜を使用した第
１、２濾過室とを配管装置を介して可逆循環回路
を構成する如く連結し、かつ第１、２濾過室は新
鮮培地と代謝産物から回収した低分子有効成分と
を供給できる供給タンクに切換自在に連結すると
共に代謝産物の回収装置に連結し、循環回路の正
流方向では第２濾過室を供給タンクに連結し、逆
流方向では第１濾過室を供給タンクに連結する如
く配管構成されたものである。 （発明の効果） 本発明では培養中に生産される代謝産物をUF
膜等の濾過膜を用いて系外に効率的に除去するこ
とができ、同伴して流出する低分子有効成分及び
新鮮培地を膜を通して補充しながら培養し、連続
的に高濃度菌液をうることができる。すなわち、
正流運転時には培養槽より菌体液を第１、２濾過
室の順に通過させ、代謝物を含む透過液を高圧側
の第１濾過室より系外に排出せしめ、一方低圧側
となる第２濾過室には代謝物を除いた低分子栄養
物及び新鮮培地を系外より押込んで培養槽内のタ
ンクレベルを一定に保持することができる。 そして逆流運転時には第１濾過室と第２濾過室
の高圧側と低圧側とが逆転し、これまで透過液を
系内から系外に排出していた第１濾過室では代謝
物を除いた低分子栄養物及び新鮮培地が系外から
系内へ押込まれる状態、すなわち逆洗滌状態に入
り膜面に付着した菌体等が除去され、次の正流運
転に備えて洗滌を兼ねながら低分子栄養分を補給
することができる。 このように第１、２濾過室の高圧、低圧側を切
換えることにより異なる機能を交互にもたせ透過
流速を低下させることなく連続的に代謝物を除き
ながら培養を継続させ、連続的に高濃度の菌体を
培養することができる。 したがつて本発明によれば培養により生成する
増殖阻害物質を除去しながら培養を行うので従来
のバツチ式を大きく上廻る高濃度培養が達成でき
る。 又菌体の高濃度化に伴い所定菌体を製造する場
合培養タンク容積は大巾に削減できるので小型で
コンパクトな設計ができる。 更に又培養により生産される代謝生産物を効果
的に除去しながら培養を行うので所要培地量は1/
５以下に削減でき、補給する培地は膜を通して系
内に入るため培地の滅菌は不要となり省エネルギ
ーが可能である。 （実施例） 以下図面に示す実施例について説明する。 第１図において、１０は培養槽であり、１１，
１２はフオローフアイバーUF膜を使用した第１、
２濾過室である。 培養槽１０と第１濾過室１１とはポンプ３７の
ある管１３で連結され、第１濾過室１１と第２濾
過室１２とは管３５で連結されている。 第２濾過室１２は又管１５を介して培養槽１０
に連結され、第１濾過室１１は管１３からバルブ
２０を介して分枝した管１４で培養槽１０に連結
されている。 管１３の途中には以上の外バルブ１９から分枝
した管３６がバルブ２１を介して管１５に連結さ
れている。 以上のようなことから実線で示す矢印の正流運
転時では培養槽１０からの菌体液は管１３から第
１濾過室１１、第２濾過室１２を経て管１５で培
養槽１０に還元されるようになつていて１つの循
環回路を構成している。 又鎖線で示す矢印の逆流運転時では管３６から
管１５を介して第２濾過室１２、第１濾過室１１
の順に通過し、管１４で培養槽１０に還元される
ようになついる。 第１、２濾過室には培地供給タンク２９からポ
ンプ３１を通じて培地が管３０に送られ、バルブ
３２を介して管３４，３３の何れかを通じて第
１、２濾過室に押込まれるようになつている。 又UF膜より除去された代謝物を含む低分子栄
養成分は第１、２濾過室１１，１２から管２２，
４０、バルブ２３、管２４、ポンプ２６を通じて
濾過室２７に導かれ、ここでRO膜を通じて代謝
物の除去後、管２８を通じて培地供給タンク２９
に還元されるようになつている。 その他管１３から管１６、ポンプ１８を通じて
濃縮菌液が濃縮菌液回収タンク１７に回収される
ようになつている。 さて第１図のフローシートにしたがつて具体的
に説明して行くと、まず培養槽１０で種菌を接種
し、培養を開始する。 数時間後に代謝産物が蓄積され始め、ある濃度
に達すると膜の運転を開始する。 実線矢印の正流運転時には培養槽１０よりポン
プ３７で引抜いた菌体液を第１、２濾過室の順に
通過させる。 第１、２濾過室におけるUF膜はフオローフア
イバーUF膜からなるものでこの場合第１濾過室
１１が高圧側となり、代謝物を含む透過液が管２
２、バルブ２３、管２４、ポンプ２６、管２５を
経て濾過室２７に導かれここでRO膜で代謝物が
除去され代謝物が除去された低分子栄養成分は管
２８を通じ培地供給タンク２９に戻され、培地の
有効利用が計れようになつている。 一方低圧側となる第22濾過室１２ではポンプ３
１により代謝物を除いた低分子栄養物及び新鮮培
地がタンク２９から管３０、バルブ３２、管３３
を通じて押込まれ培養槽１０内のタンクレベルを
一定に保持するように運転される。 以上のような運転状態を継続すると、第１濾過
室からの透過液速度が培養過程で菌数増加に伴う
高粘度化、膜の目づまりにより低下するのでこの
時三方電磁バルブ１９，２０，２１，２３，３２
を同時に切換え鎖線矢印で示す逆流運転に入る。 このバルブ切換により高圧側と低圧側とが逆転
し、これまで透過液を系内から系外に排出してい
た第１濾過室では系外から系内に液が押し込まれ
る状態すなわち、タンク２９、ポンプ３１、管３
０、バルブ３２、管３４を介して逆洗滌状態に入
り膜面に付着した菌体等が除去され、次の正流運
転に備えて洗滌を兼ねながら低分子栄養分を補強
する。 このように第１、２濾過室の高圧、低圧側を切
換えることにより異なる機能を交互にもたせ透過
流速を低下させることなく連続的に代謝物を除き
ながら培養を継続させ連続的に高濃度の菌体を培
養させることができる。 実施例のものでは第１、２濾過室を直列に配置
したものについて説明したが並列に配置したもの
でもよい。 又実施例のものでは連続式の場合を示している
が二次増殖期までバツチ式で運転を終了させても
よい。 以下ビヒダス菌の連続高濃度培養の実験につい
て説明する。 10容積培養タンクに酵母エキス1.0％、ペプ
トン1.0％、パーミエート粉3.0％、肉エキス0.5
％、K₂HPO₄0.5％、KH₂PO₄0.1％アスコルビン
酸Na0.1％、水93.8％からなる組成の培地６を
仕込み、120℃15分間の滅菌後冷却し、あらかじ
め前培養を行つたB.Longumの種菌を接種し、33
℃±0.5℃の温度条件で培養を行つた。 ここで接種前には培地中にN₂ガスを通気して
培地中に溶存しているO₂ガスを除去し、また培
養液面上にはN₂ガスを封入して培養中にO₂ガス
との接触を断つた。培養過程における生菌数、乳
糖含量及び代謝産物であるＬ−乳酸濃度の変化は
第４図に示す。 初発のPHは6.8であるが培養過程と共にPHは低
下して行き、ある値を越えると増殖が停止するの
で、本実験では2N−NH₄OHを用いて6.0の定PH
コントロールを行つた。 培養10時間後には、制限基質となる乳糖濃度は
２ｇ／以下となり、Ｌ−乳酸濃度は10ｇ／を
越えて増殖は停止するので、この時期より、本発
明で明示した膜システムの運転を開始する。実験
に使用した膜は、旭化成工業(株)製のフオローフア
イバー膜SEP1013（分画分子量6000、膜面積0.2
m²、耐熱温度90℃）二本である。膜内及び配管系
内の無菌化は、80℃温水を１時間循環後、次亜塩
素酸液200ppm、浸漬３時間後、無菌水を用いて
次亜塩素酸液を排除し、10培養タンクと無菌的
に接合し、実験に供した。 培養開始後10時間よりペリスタポンプを作動さ
せて膜運転を開始する。正逆の流路切換えはタイ
マーを用いて30分間隔で行つた。 供給する培地は酵母エキス1.0％、ペプトン1.0
％、パーミエート粉3.0％、肉エキス0.5％、
K₂HPO₄0.5％、KH₂PO₄0.1％、アスコルビン酸
Na0.1％、水93.8％組成の培地をあらかじめ
SEP1013膜を通したものを用いた。 また培養槽液レベルは６一定になるように保
持した。 その結果、膜を通して透過する液速度は第５，
６図に示すように菌の増殖と共に低下するが、あ
る目標濃度［10¹¹（−／ml）］に達してから菌液を
定常的に排出しはじめると、液透過速度の低下は
認められず、連続的な菌液の取得が可能であつ
た。 定常運転に至るまでの菌の比増殖速度μ
（Hr^-1）は、一次比増殖速度μ₁、（培養槽のみの
運転時）は0.23（Hr^-1）であり、二次比増殖速度
μ₂（膜運転を行いながら培養運転を行つた時）は
0.10（Hr^-1）となる。 以上の結果を用いて系内の基質、生菌、生産物
の収支を取る事により、連続運転時の菌生産速
度、濃縮菌液抜き出し速度、基質消費速度、代謝
産物速度等の決定を行うことができる。 このように一次増殖期間（10時間）、二次増殖
期間（８時間）を経た後、菌体濃度10¹¹（−／ml）
の液、0.6／Hr×36Hr＝21.6を安定的に取得
する事ができた。 槽内残留液及び配管内液量6.8を回収すると
21.6＋6.8＝28.4となつた。この間に使用した培
地量は100である。また総運転時間は54時間で
ある。 従来、この種の菌の高濃度培養液の取得には定
PH培養法を用いて菌液を得た後、遠心分離法でス
ラツジ状菌を集菌し、分散液を用いて10¹¹（−／
ml）の菌液を得ている。この従来法と、本実験結
果を比較すると、

【表】 以上のように本発明を用いると所定菌数の高濃
度液を等量得る際従来法にくらべて培養槽容積は
大巾に縮小でき、かつ使用培地量も削減できる。 本実験例では透過液中の有効成分の回収は行つ
ていないが、これを行うと、さらに使用培地量の
削減を行うことは可能になる。 なお、本実験例ではビヒダス菌の高濃度培養例
を示したが、好気性菌の培養等にも十分利用でき
る。 又本実施例では分画分子量6000のUF膜を使用
したが除菌効果を有する0.1〜0.45μ程度のマイク
ロフイルターの使用により効果的な代謝物除去が
可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置のフローシート、第２，３
図は従来の培養装置を示すフローシート、第４図
は培養タイムコート図、第５図は膜よりの透過流
速変化図、第６図は膜１本当りの透過液流速の経
時変化図、第７図は正流運転時におけるUF膜前
後の圧力分布図である。 １０……培養槽、１１……第１濾過室、１２…
…第２濾過室、２９……培地供給タンク。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 培養槽で各種菌体を培養するに当たつて、培
   養中に生成される代謝産物を培養槽と共に循環回
   路を構成する第１、２濾過膜を通して取り除き、
   取り除いた代謝産物から低分子有効成分を回収し
   てこれを新鮮培地と共に前記濾過膜を通して循環
   回路に供給するに当たり、循環回路の正流方向で
   は第２濾過膜に供給し、逆流方向では第１濾過膜
   に供給して連続的に高濃度菌液をうるようにした
   ことを特徴とする高濃度連続培養方法。 ２ 培養槽とUF膜等の濾過膜を使用した第１、
   ２濾過室とを配管装置を介して可逆循環回路を構
   成する如く連結し、かつ第１、２濾過室は新鮮培
   地と代謝産物から回収した低分子有効成分とを供
   給できる供給タンクに切換自在に連結すると共に
   代謝産物の回収装置に連結し、循環回路の正流方
   向では第２濾過室を供給タンクに連結し、逆流方
   向では第１濾過室を供給タンクに連結する如く配
   管構成されたことを特徴とする高濃度連結培養装
   置。