【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はマツタケの菌糸を迅速かつ大量に培養
する培養基に関するものである。
マツタケは秋の代表的味覚として古くから日本
人に親しまれてきたキノコであるが、その収穫量
は年々減少の傾向にあり、一般庶民にとつてはな
かなか口に入りにくい非常に高価なキノコとなつ
てしまつた。マツタケは他のキノコと同様に菌糸
が充分に生育してから原基を形成して子実体に至
るのであるが、多くのキノコが死物寄生菌である
のに対してマツタケは活物寄生菌であり、菌糸の
生育も他のキノコに比べて非常に遅い。このよう
な理由のために、マツタケの人工栽培は非常に困
難を極めているというのが現状である。
マツタケの人工栽培の第一段階はマツタケ菌糸
の人工培養であるが、そのうち最も広く知られて
いる方法として、浜田の培地を用いる培養方法が
ある。この培地は炭素源としてブドウ糖、窒素源
としては乾燥酵母をそれぞれ主な栄養源としてお
り、マツタケ菌糸用培地としては非常に優れたも
のとされている。乾燥酵母の代りに酵母エキスを
用いている例もある。上記した浜田の培地以外に
も、窒素源として肉エキス、ペプトン、大豆等を
使用し、これに各種ビタミンミネラルや松葉抽出
液を添加した培地を用いる方法も知られている。
しかしこれらの培養法においてもマツタケ菌糸の
生育は他のキノコと比べてかなりの長期間を要
し、マツタケの人工栽培の大きな障害となつてい
る。
そこで本発明は、マツタケ菌糸の人工培養にお
いて従来使用されていた培養基よりも迅速かつ大
量に培養することができる新規かつ改良されたマ
ツタケ菌糸の培養基を提供することを目的として
なされたものであつて、即ち、本発明は、炭素源
として単糖類及び／又は二糖類と、六単糖糖アル
コール／又はイノシトールとを併用することを要
旨とするものである。
従来のマツタケ菌糸の人工培養においては、前
述したようにその炭素源として単糖類、二糖類を
単独で用いていたが、本発明者等は鎖状多価アル
コールあるいは環状多価アルコールにマツタケの
初期の成長速度を速める効果があることを発見
し、さらに単糖類又は二糖類と鎖状多価アルコー
ル又は環状多価アルコールとの併用により、それ
ぞれ単独で用いるよりも大巾に成長速度を速め、
かつ著しい菌体重量の増加をもたらすという全く
予期しえなかつた効果が得られることを見出した
のである。通常マツタケ培養の炭素源としてはグ
ルコースが最も良好とされているが、本発明では
グルコースは勿論のことマンノース、フラクトー
ス等の六単糖、二糖類のマルトース、リミツトデ
キストリン、可溶性でんぷん等も使用できる。鎖
状多価アルコールについてはソルビトール、マン
ニトール等の六単糖の糖アルコールが好ましく使
用でき、環状多価アルコールとしては六価アルコ
ールであるイノシトール等が生育に良好な結果を
与える。
本発明に従つて液体培養基を調製する場合は、
通常用いられるグルコース、マンノース、ラクト
ース、マルトース等の糖類と、鎖状多価アルコー
ル及び／又は環状多価アルコールとの使用量を両
者の合計重量として、一般的には１〜200ｇ／
好ましくは５〜100ｇ／の範囲とする。これら
の炭素源の他に窒素源の添加も不可欠である。窒
素源としては乾燥酵母、酵母エキス、大豆、蛋白
分解物、、コーンステイープ、リカーのアミノ酸
ないしアミノ態窒素が適しており、しかしながら
一般に無機窒素、肉エキス、ソイビーン・ミール
はマツタケ菌糸の培養には適さないとされてい
る。窒素源の使用量は一般的には0.1〜50ｇ／、
好ましくは１〜10ｇ／の範囲とする。その他必
要に応じて少量のビタミン、ミネラル、核酸塩
基、松葉抽出液、松根抽出液等を添加してもよ
い。マツタケ菌糸の生育可能なPHは3.0〜6.5の間
であるが、最適PHは5.0附近にあり、酸又はアル
カリを添加して培地のPH調整を行うことができ
る。かくして調製した液体培養基は滅菌又は除去
したのちマツタケ菌糸の培養に使用する。
寒天培養基を調整する場合には、上記組成の液
体培養基に寒天を必要量添加して溶解したのち固
化させる。又、固体培養基を調整する場合は、上
記組成の液体培養基と固体担体とを適当量混合
し、滅菌又は除菌したのち使用する。
次に、実験例を示して本発明の効果について具
体的に説明する。
マツタケ菌（トリコロマ、マツタケ
IFO6916：財団法人発酵研究所より分譲）をブド
ウ糖（0.4ｇ／20ml）と酵母エキス（60mg／20ml）
とを含む培養基を用いて23℃で25日間液体静置培
養したものを種菌とし、ホモジナイザーで
15000rpm、15秒間分散させて得た懸濁液をグル
コース２％、ソルビトール２％、グルコース１％
及びソルビトール１％を含む液体培養基に１ml宛
植菌した。培養基はすべてPH5.0とし、窒素源と
して酵母エキス60mg／20mlを添加した。液体培養
はすべて綿栓をして乾熱滅菌（160℃、２時間）
済みの100ml容三角フラスコに各々培養基20mlを
入れて、２気圧、120℃で20分間蒸気滅菌したも
のに植菌し、23℃で７日、14日、21日、28日、35
日、42日間培養した。培養後、菌体を紙（東洋
紙(株)製No.２）を用いて別し、紙上で蒸留水
にて洗浄後、105℃で５時間乾燥後デシケータ内
で30分放冷してから秤量した。結果は第１図（図
中、１はソルビトール２％を、２はグルコース２
％を、３はグルコース１％とソルビトール１％と
の混合液を含む場合の生成曲線を示す。）に示す
ように、炭素源としてグルコース単独を添加した
場合は培養35日で最大の菌体重量に達している。
ソルビトールを単独で使用した場合増殖期におけ
る生長速度がグルコースの場合よりも速く培養21
日で最大の菌体重量に達している。一方グルコー
スとソルビトールを併用した場合は、従来最も良
好な炭素源とされていたグルコース単独の場合よ
り成長速度が著しく速く、又、最大の菌体重量に
達する期間も14日間短縮ができ、かつ得られる菌
体重量も大巾に増加している。これはグルコース
とソルビトールを併用とすると、グルコース使用
時の菌体重量の多さとソルビトール使用時の成長
速度の速さという両方の相乗効果により得られた
結果であるものと推考される。なお、別の実験結
果からグルコースの代りにマンノースあるいはフ
ラクトースを、又はソルビトールの代りにマンニ
トールあるいはイノシトールを使用しても、第１
図と同様の効果が得られることが判明している。
以上のように、本発明は培養基の組成において
主な炭素源として単糖類及び／又は二糖類と鎖状
多価アルコール及び／又は環状多価アルコールと
を併用することによりマツタケ菌糸の生長速度及
び得られる菌体重量がそれぞれ単独使用する場合
に比べて著しく向上するために、マツタケの人工
栽培において非常に長時間要していた菌糸の培養
期間を大巾に短縮でき、その意義は極めて大きい
ものである。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例 １
予め綿栓をして乾熱滅菌しておいた100ml容三
角フラスコに表−１に示した炭素源と酵母エキス
を含むPH5.0の培地をそれぞれ20ml宛入れて２気
圧、120℃で20分間蒸気滅菌を行なつた。マツタ
ケ菌（トリコロマ、マツタケIFO 6916）の液体
培養物（23℃、28日間培養）をホモジナイザーで
15000rpm、20秒間分散させて得た菌糸懸濁液を
前記の滅菌処理した三角フラスコの各々に1.0ml
宛植菌した。
The present invention relates to a culture medium for culturing matsutake mycelia rapidly and in large quantities. Matsutake is a mushroom that has been loved by Japanese people for a long time as a representative taste of autumn, but its harvest has been decreasing year by year, and it has become a very expensive mushroom that is difficult for the average person to eat. I'm getting old. Matsutake, like other mushrooms, grows enough hyphae to form primordia and develop into fruiting bodies, but while most mushrooms are dead parasitic fungi, Matsutake is a living parasitic fungus. The growth of mycelium is also very slow compared to other mushrooms. For these reasons, the artificial cultivation of matsutake is currently extremely difficult. The first stage of artificial cultivation of Matsutake is the artificial cultivation of Matsutake mycelia, and the most widely known method is the cultivation method using Hamada's culture medium. This medium uses glucose as a carbon source and dry yeast as a nitrogen source as its main nutritional sources, and is considered to be an excellent medium for Matsutake mycelia. In some cases, yeast extract is used instead of dry yeast. In addition to Hamada's medium described above, a method is also known in which a medium is used in which meat extract, peptone, soybean, etc. are used as a nitrogen source, and various vitamins and minerals and pine needle extract are added thereto.
However, even with these cultivation methods, the growth of Matsutake mycelia takes a considerably longer time than that of other mushrooms, which is a major obstacle to the artificial cultivation of Matsutake. Therefore, the present invention was made for the purpose of providing a new and improved culture medium for Matsutake mycelia that can be cultured more quickly and in large quantities than the culture medium conventionally used for artificially culturing Matsutake mycelia. That is, the gist of the present invention is to use monosaccharides and/or disaccharides and hexasaccharide sugar alcohols/or inositol in combination as carbon sources. In the conventional artificial culture of Matsutake mycelium, monosaccharides and disaccharides were used alone as carbon sources, as described above, but the present inventors used chain polyhydric alcohols or cyclic polyhydric alcohols in the initial stage of Matsutake fungi. discovered that it has the effect of increasing the growth rate of
They also discovered that the completely unexpected effect of bringing about a significant increase in bacterial weight was obtained. Glucose is generally considered to be the best carbon source for matsutake culture, but in the present invention, not only glucose but also hexasaccharides such as mannose and fructose, disaccharides such as maltose, limitodextrin, and soluble starch can be used. . As the chain polyhydric alcohol, hexamonosaccharide sugar alcohols such as sorbitol and mannitol are preferably used, and as the cyclic polyhydric alcohol, hexahydric alcohols such as inositol give good results for growth. When preparing a liquid culture medium according to the invention,
The amount of commonly used saccharides such as glucose, mannose, lactose, maltose, and chain polyhydric alcohol and/or cyclic polyhydric alcohol is generally 1 to 200 g /
Preferably it is in the range of 5 to 100 g/. In addition to these carbon sources, it is also essential to add a nitrogen source. Dried yeast, yeast extract, soybeans, protein digests, corn staples, and amino acids or amino nitrogen from liquor are suitable as nitrogen sources; however, inorganic nitrogen, meat extracts, and soybean meal are generally suitable for culturing Matsutake mycelia. is considered unsuitable. The amount of nitrogen source used is generally 0.1 to 50g/,
Preferably it is in the range of 1 to 10 g/. In addition, small amounts of vitamins, minerals, nucleobases, pine needle extract, pine root extract, etc. may be added as necessary. The pH at which matsutake mycelia can grow is between 3.0 and 6.5, but the optimum pH is around 5.0, and the pH of the medium can be adjusted by adding acid or alkali. The liquid culture medium thus prepared is used for culturing Matsutake mycelia after being sterilized or removed. When preparing an agar culture medium, a required amount of agar is added to a liquid culture medium having the above composition, dissolved, and then solidified. In addition, when preparing a solid culture medium, an appropriate amount of a liquid culture medium having the above composition and a solid carrier are mixed, and the mixture is sterilized or sterilized before use. Next, the effects of the present invention will be specifically explained using experimental examples. Matsutake fungus (Tricholoma, Matsutake)
IFO6916: Provided by Fermentation Research Institute), glucose (0.4g/20ml) and yeast extract (60mg/20ml)
Use a culture medium containing liquid static culture at 23℃ for 25 days as a seed culture, and use a homogenizer to
The suspension obtained by dispersing at 15000 rpm for 15 seconds was mixed with 2% glucose, 2% sorbitol, and 1% glucose.
Then, 1 ml of the cells was inoculated into a liquid culture medium containing 1% sorbitol. All culture media had a pH of 5.0, and 60 mg/20 ml of yeast extract was added as a nitrogen source. All liquid cultures were sealed with cotton plugs and sterilized by dry heat (160℃, 2 hours).
Pour 20 ml of the culture medium into each prepared 100 ml Erlenmeyer flask, steam sterilize it at 2 atm and 120°C for 20 minutes, then inoculate it at 23°C for 7 days, 14 days, 21 days, 28 days, 35 days.
The cells were cultured for 42 days. After culturing, the bacterial cells were separated using paper (No. 2 manufactured by Toyo Paper Co., Ltd.), washed on the paper with distilled water, dried at 105°C for 5 hours, and left to cool in a desiccator for 30 minutes. Weighed. The results are shown in Figure 1 (in the figure, 1 is sorbitol 2%, 2 is glucose 2%).
%, 3 shows the production curve when a mixture of 1% glucose and 1% sorbitol is included. ), when glucose alone was added as a carbon source, the maximum bacterial weight was reached after 35 days of culture.
When using sorbitol alone, the growth rate during the growth phase was faster than when using glucose21
The maximum bacterial weight is reached in a day. On the other hand, when glucose and sorbitol are used together, the growth rate is significantly faster than when glucose is used alone, which has traditionally been considered the best carbon source, and the time required to reach the maximum bacterial weight can be shortened by 14 days. The weight of bacteria produced has also increased significantly. This is thought to be due to the synergistic effect of the combination of glucose and sorbitol, which results in a higher bacterial weight when glucose is used and a faster growth rate when sorbitol is used. In addition, from the results of another experiment, even if mannose or fructose is used instead of glucose, or mannitol or inositol instead of sorbitol, the first
It has been found that the same effect as shown in the figure can be obtained. As described above, the present invention improves the growth rate of Matsutake mycelia by using monosaccharides and/or disaccharides together with chain polyhydric alcohols and/or cyclic polyhydric alcohols as main carbon sources in the composition of the culture medium. The weight of mycelia produced by these methods is significantly improved compared to when each is used alone, so the mycelium cultivation period, which used to take an extremely long time in artificial cultivation of matsutake, can be greatly shortened, and this is extremely significant. be. The present invention will be described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples. Example 1 20 ml of a pH 5.0 culture medium containing the carbon source and yeast extract shown in Table 1 was poured into 100 ml Erlenmeyer flasks that had been previously sealed with cotton plugs and dry heat sterilized, and the flasks were heated at 2 atm and 120°C. Steam sterilization was performed for 20 minutes. A liquid culture of Matsutake fungus (Tricholoma, Matsutake IFO 6916) (cultivated at 23℃ for 28 days) was prepared using a homogenizer.
Add 1.0 ml of the mycelial suspension obtained by dispersing at 15,000 rpm for 20 seconds to each of the sterilized Erlenmeyer flasks.
I inoculated it.
【表】
23℃で14日間培養後、菌体を紙（東洋紙(株)
製No.２）を用いて別し、紙上で蒸留水で洗浄
したものを105℃で５時間乾燥したのち、デシケ
ーター内で30分放冷してから秤量した。結果は第
２図のように、14日間及び21日間培養の場合とも
マンノース、ソルビトールを夫々単独で使用した
ものに比べ、両者を併用した場合には菌体重量は
増加し、マンノース、ソルビトールを１：１前後
の割合で併用したときに最も生育が良好であつ
た。尚、第２図中、４は培養14日の菌体重量を、
５は培養21日の菌体重量を示す。
実施例 ２
予め綿栓をして乾燥滅菌をしておいた100ml容
三角フラスコに、表−２に示した各種炭素源を含
む２気圧、120℃の蒸気滅菌済みの液体培養基を
20ml宛入れ、実施例１と同様な方法で得たマツタ
ケ（トリコロママツタケ IFO6916）菌糸懸濁液
を1.0ml宛植菌した。培養基はすべてPH5.0とし、
窒素源として酵母エキス60mg／20mlを添加した。
23℃で22日間培養後、菌体を紙（東洋紙(株)製
No.２）を用いて別し、紙上で蒸留水にて洗浄
したものを105℃で５時間乾燥したのち、、デシケ
ーター内で30分放冷してから秤量した。表−２に
示した結果から、グルコース、マンノース、フラ
クトース単独の場合よりもソルビトールあるいは
イノシトールを併用したときの方が生育は良好で
あつた。[Table] After culturing at 23℃ for 14 days, the bacterial cells were transferred to paper (Toyo Paper Co., Ltd.).
No. 2) and washed with distilled water on paper, dried at 105°C for 5 hours, left to cool in a desiccator for 30 minutes, and then weighed. The results are shown in Figure 2, in both 14-day and 21-day cultures, the bacterial weight increased when mannose and sorbitol were used together, compared to when mannose and sorbitol were used alone. : The best growth was achieved when used in combination at a ratio of around 1. In addition, in Figure 2, 4 represents the bacterial weight on the 14th day of culture.
5 indicates the bacterial weight on day 21 of culture. Example 2 A steam sterilized liquid culture medium at 2 atmospheres and 120°C containing the various carbon sources shown in Table 2 was placed in a 100 ml Erlenmeyer flask that had been previously sealed with a cotton plug and sterilized by drying.
A 20 ml volume was inoculated with 1.0 ml of the mycelial suspension of Matsutake (Tricholoma matsutake IFO6916) obtained in the same manner as in Example 1. All culture media should be PH5.0.
Yeast extract 60 mg/20 ml was added as a nitrogen source.
After culturing at 23℃ for 22 days, the bacterial cells were transferred to paper (manufactured by Toyo Paper Co., Ltd.).
No. 2) and washed with distilled water on paper, dried at 105°C for 5 hours, left to cool in a desiccator for 30 minutes, and then weighed. From the results shown in Table 2, growth was better when sorbitol or inositol was used in combination than when glucose, mannose, or fructose were used alone.
【表】
実施例 ３
グルコース２％と酵母エキス0.3％を、グルコ
ール１％、マンニトール１％と酵母エキス0.3％
を含むPH5.0の二種類の液体培養基を調製し、
夫々に寒天２％を加熱溶解させ120℃、２気圧で
蒸気滅菌を行なつた後、乾熱滅菌（160℃、２時
間）済みの９cm径シヤーレに流し込み平板培養基
を調製した。実施例１と同様な方法で得たマツタ
ケ（トリコロママツタケIFO 6915）菌糸懸濁液
をシヤーレ１枚当りのコロニー発生数が３〜６個
となるように希釈し、平板培養基に0.5ml宛塗布
植菌した。23℃で培養し、培養28日から35日の間
の１日当りのコロニー直径の増加量を求めたとこ
ろ、グルコース単独で使用した場合は0.6mm／日
の直径増加であつたが、グルコースとマルチトー
ルを併用したときは、1.0mm／日の直径増加であ
つた。[Table] Example 3 2% glucose and 0.3% yeast extract, 1% glucose, 1% mannitol and 0.3% yeast extract
Prepare two types of liquid culture media with pH5.0 containing
After heating and dissolving 2% agar in each, steam sterilization was performed at 120°C and 2 atmospheres, and the mixture was poured into a 9 cm diameter shear dish that had been dry heat sterilized (160°C, 2 hours) to prepare a plate culture medium. Matsutake (Tricholoma matsutake IFO 6915) mycelial suspension obtained in the same manner as in Example 1 was diluted so that the number of colonies generated per sheet was 3 to 6, and applied to a plate culture medium in an amount of 0.5 ml. Inoculated. When cultured at 23°C and the increase in colony diameter per day between 28 and 35 days of culture was determined, the diameter increase was 0.6 mm/day when glucose was used alone, but when glucose and multi When Thor was used in combination, the diameter increased by 1.0 mm/day.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図はグルコース、ソルビトール、グルコー
スとソルビトールを炭素源としたときのマツタケ
の生長曲線（実験例の結果）を第２図はマンノー
スとソルビトールの使用割合の菌体重量への影響
（実施例１の結果）を示すものである。
Figure 1 shows the growth curve of matsutake when glucose, sorbitol, and glucose and sorbitol are used as carbon sources (results of experimental examples). Figure 2 shows the influence of the usage ratio of mannose and sorbitol on bacterial weight (Example 1). results).