【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は新規な抗ウイルス剤および抗ウイルス
化合物に関する。
本発明によれば式（）：
で示されるｐ−デシルオキシ−ｍ−メトキシベン
ザルアセトン Ｎ−メチルアミジノヒドラゾンま
たはその酸付加塩からなることを特徴とする抗ウ
イルス剤が提供される。
抗ウイルス剤としてのアミジノヒドラゾン化合
物は例えば日本特許第711374号および第764292号
明細書、特公昭62−20981号公報、米国特許第
3761471号明細書、英国特許第1359523号明細書、
西独特許第2142494号明細書、フランス特許出願
第7130369号明細書等に記載されている。
しかるに本発明者らは抗菌物質を探究する目的
で多数の新規なＮ−アルキルおよびＮ−置換アリ
ールアミジノヒドラゾン類を合成し、その際、た
またま、前記式（）の化合物の抗ウイルス活性
を調べた結果、この化合物は従来見られなかつた
程のすぐれた抗ウイルス活性を示すことを知見し
たものである。
すなわち、前記特許明細書等に記載されるアル
コキシ−アセトフエノンおよびベンザルアセトン
などのＮ−非置換、Ｎ，Ｎ−テトラメチレンおよ
びＮ−置換アリールアミジノヒドラゾン類より
も、前記の式（）で示される対応するＮ−アル
キルアミジノヒドラゾンは強い抗ウイルス活性を
示し、とりわけこれまでに最も強い抗ウイルス剤
として期待された、後記試験例に示すごときＮ−
非置換アミジノヒドラゾンの抗ウイルス活性と比
較した場合、その活性は同等であるかまたはそれ
以上である。しかも今日、薬剤を考える場合に最
も問題となる毒性が非常に軽減している。本発明
はかかる知見に基づくものである。
本発明の抗ウイルス剤である式（）の化合物
は、式（）：
で表わされるｐ−デシルオキシ−ｍ−メトキシベ
ンザルアセトンと、式（）：
（式中、HXは無機酸または有機酸を表わす）
で示される１−アミノ−３−メチルグアニジン酸
付加塩、または、式（）：
（式中、HXは前記と同一の意義を有する）で
示されるアセトンＮ−メチルアミジノヒドラジン
酸付加塩とを、酸性下で反応させることにより容
易にかつ好収率で得ることができる。本発明にお
ける式（）の化合物は通常塩酸塩として得られ
るが、勿論、遊離塩基の形でも得ることができま
た、他の酸付加塩の形でも容易に得ることができ
る。
米国特許などで有力な抗ウイルス剤として期待
された化合物であるＰ−デシルオキシ−ｍ−メト
キシベンザルアセトンアミジノヒドラゾンに対応
する、本発明の式（）で示されるｐ−デシルオ
キシ−ｍ−メトキシベンザルアセトン Ｎ−モノ
メチルアミノヒドラゾンは新規化合物である。
次に本発明を製造例および試験例により詳細に
説明する。しかしながら本発明はこれらにより制
限されるものではない。
製造例
ｐ−デシルオキシ−ｍ−メトキシベンザルアセ
トンＮ−メチルアミジノヒドラゾン一塩酸塩の
製造
エタノール20mlのＰ−デシルオキシ−ｍ−メト
キシベンザルアセトン3.32ｇ（10ミリモル）およ
び１−アミノ−３−メチルグアニジン二塩酸塩
（融点170〜173℃）1.61ｇ（10ミリモル）の混合
物に、濃塩酸２〜３滴を加え、水浴上で90分間還
流した。次に減圧下で濃縮乾固し、残渣を再びエ
タノール５mlに溶解し、この溶液にエーテルを加
えて固体として析出させた。これを濾取し、エー
テルで洗浄し、減圧下で乾燥して融点70゜〜110゜
の橙色粉末3.69ｇ（84％）を得た。この物質をメ
タノール40mlから再結晶したところ融点107〜110
℃の淡黄色針状結晶3.30ｇ（75％）が得られた。
C23H41O3N4Clに対する分析値（％）：
計算値 Ｃ 60.44，Ｈ 9.04，Ｎ 12.26：
実測値 Ｃ 60.94，Ｈ 8.96，Ｎ 12.36
次に本発明による化合物の抗インフルエンザウ
イルス活性について述べる。
試験例 １
鶏卵漿尿膜培養法におけるインフルエンザウイ
ルスA2型足立株に対する殺ウイルス活性および
不活化活性試験の方法と結果（第１表参照）を以
下に示す。
(イ) 鶏卵漿尿膜に対する毒性試験
Hanks BSS，0.9mlの中に直径30mmの円形漿尿
膜１片を入れ（漿尿膜培養管）２倍階段希釈した
薬剤溶液0.1ml宛加えて36℃で48時間振盪培養す
る。培養後、漿尿膜をPBSで軽く洗浄しトリパ
ン青液に１分間浸漬する。ついでPBSで充分に
洗浄し、薬剤の各希釈階段あたり用いた４片の漿
尿膜のうち２枚が濃青色に染まる薬剤濃度を50％
毒性濃度とした。
(ロ) 殺ウイルス試験
10倍又は２倍階段希釈した薬剤溶液0.5mlに等
量のインフルエンザA2型足立株（1000MID
100／ml）を加えて混和し、室温に120分間放置
後、Hank′sBSS 0.8ml入り漿尿膜培養管に混合
液の100倍希釈液を0.2mlづつ移し取り36℃で48時
間振盪培養した。各培養液について、鶏赤血球凝
集試験を行い凝集能の有無をしらべReed and
Muenchの方法により50％殺ウイルス濃度を算定
した。
(ハ) ウイルス増殖阻止試験
Hank′s BSS 0.8ml入り漿尿膜培養管に２倍階
段希釈した薬剤溶液を0.1ml宛添加後、インフル
エンザA2型足立株（100MID100／ml）を0.1ml接
種し、36℃で48時間振盪培養する。各培養液につ
いて殺ウイルス試験の場合と同様の方法で50％ウ
イルス増殖阻止濃度を算定した。
第１表の対照化合物１〜３は抗ウイルス剤とし
て既知の化合物であるが、本発明の化合物と比較
するために記載したものである。これらの化合物
についての試験結果を比較することによつても明
らかであるが、本発明の化合物はまずHeLa細胞
および鶏卵漿尿膜に対する毒性が軽減しており、
一方、抗ウイルス活性は殺ウイルス作用およびウ
イルス増殖阻止作用ともに増強し、且つ各々の化
学療法指数も大きく、従つて既知の化合物よりも
勝つている。特に本発明の化合物（ｐ−デシルオ
キシ−ｍ−メトキシベンザルアセトンＮ−メチル
アミジノヒドラゾン塩酸塩）は殺ウイルス指数が
3125以上、増殖阻止指数が13以上の最も期待しう
る結果を示している。
試験例 ２
第２表および第３表に孵化鶏卵による本発明の
化合物についての下記の諸特性の測定結果を示
す。
(イ) 孵化鶏卵に対するMTD0の測定
2000mcg／mlより２倍階段希釈にて62.5mcg／
mlまでの６段階を投与量とし、滅菌蒸溜水又は水
溶性でない薬剤については５％DMSOで調製し
た後、0.1ml／egg宛１群５個使用して11〜12日令
孵化鶏卵漿尿液腔内へ投与して37℃、湿温60％で
48時間培養した。培養後検卵して生死を判定し
MTD0（Maximum tolerated dose）を求めた。
(ロ) 50％孵化鶏卵ウイルス感染率の差（−
logEID50の差）の測定法
薬剤投与量はMTDより設定し、11〜12日令孵
化鶏卵漿尿液腔内に0.1ml／egg宛投与した。又、
投与30分後にインフルエンザＡ型PR−８株を
EID50の値の希釈倍数を中心に前後２段階づつ10
倍階段希釈し、１群10個使用して0.2ml／egg宛漿
尿液腔内に接種した。その後37℃、湿度60％で48
時間培養、−５℃で１夜冷却後各漿尿液の鶏赤血
球に対する凝集能を測定、Reed and Muenchの
方法によりEID50を算出しウイルス対照群との差
を求めた。
(ハ) ウイルス増殖阻止率の測定法
薬剤投与量はMTDおよび２倍階段希釈で以下
３段階調製して11〜12日令孵化鶏卵漿尿液腔内に
0.1ml／egg宛投与した。又投与30分後に100EID50
に希釈したインフルエンザＡ型PR−８株を0.2
ml／egg宛接種した。その後(ロ)と同様の条件で培
養して鶏赤血球凝集価（log2x）を測定し下記の
方法でウイルス増殖阻止率を算出した。
ウイルス増殖阻止率＝（１−薬剤投与群のHA価／ウイ
ルス対照群のHA価）×100（％）
The present invention relates to novel antiviral agents and antiviral compounds. According to the invention, the formula (): An antiviral agent comprising p-decyloxy-m-methoxybenzalacetone N-methylamidinohydrazone or an acid addition salt thereof is provided. Amidinohydrazone compounds as antiviral agents are described, for example, in Japanese Patent Nos. 711374 and 764292, Japanese Patent Publication No. 62-20981, and U.S. Patent No.
Specification No. 3761471, Specification British Patent No. 1359523,
It is described in West German Patent No. 2142494, French Patent Application No. 7130369, etc. However, the present inventors synthesized a number of new N-alkyl and N-substituted arylamidinohydrazones for the purpose of searching for antibacterial substances, and at that time happened to investigate the antiviral activity of the compound of formula () above. As a result, it was discovered that this compound exhibits excellent antiviral activity that has never been seen before. That is, the compound represented by the above formula ( The corresponding N-alkylamidinohydrazone exhibits strong antiviral activity, and in particular N-
When compared to the antiviral activity of unsubstituted amidinohydrazones, the activity is comparable or superior. Moreover, toxicity, which is the most problematic issue when considering drugs today, has been greatly reduced. The present invention is based on this knowledge. The compound of the formula () which is the antiviral agent of the present invention has the formula (): p-decyloxy-m-methoxybenzalacetone represented by the formula (): (In the formula, HX represents an inorganic acid or an organic acid)
1-amino-3-methylguanidic acid addition salt represented by or formula (): (wherein HX has the same meaning as above) can be easily obtained in a good yield by reacting it with an acetone N-methylamidinohydrazine acid addition salt in an acidic environment. The compound of formula () in the present invention is usually obtained as a hydrochloride, but of course it can also be obtained in the form of a free base, and can also be easily obtained in the form of other acid addition salts. p-decyloxy-m-methoxybenzal represented by the formula () of the present invention corresponds to P-decyloxy-m-methoxybenzalacetonamidinohydrazone, which is a compound expected to be a powerful antiviral agent in the US patent etc. Acetone N-monomethylaminohydrazone is a new compound. Next, the present invention will be explained in detail using production examples and test examples. However, the present invention is not limited thereto. Preparation Example Preparation of p-decyloxy-m-methoxybenzalacetone N-methylamidinohydrazone monohydrochloride 3.32 g (10 mmol) of P-decyloxy-m-methoxybenzalacetone and 1-amino-3-methylguanidine in 20 ml of ethanol. To a mixture of 1.61 g (10 mmol) of dihydrochloride (melting point 170-173°C) were added 2-3 drops of concentrated hydrochloric acid, and the mixture was refluxed on a water bath for 90 minutes. Next, it was concentrated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved again in 5 ml of ethanol, and ether was added to this solution to precipitate a solid. This was collected by filtration, washed with ether, and dried under reduced pressure to yield 3.69 g (84%) of an orange powder with a melting point of 70° to 110°. When this substance was recrystallized from 40 ml of methanol, it had a melting point of 107-110.
3.30 g (75%) of pale yellow needle-shaped crystals were obtained. Analytical values for C 23 H 41 O 3 N 4 Cl (%): Calculated values C 60.44, H 9.04, N 12.26: Actual values C 60.94, H 8.96, N 12.36 Next, the anti-influenza virus activity of the compound according to the present invention will be described. . Test Example 1 The method and results (see Table 1) of the virucidal activity and inactivation activity test against influenza virus A type 2 Adachi strain using the chicken egg chorioallantoic membrane culture method are shown below. (B) Toxicity test on chicken egg chorioallantoic membrane Place one circular piece of chorioallantoic membrane with a diameter of 30 mm in 0.9 ml of Hanks BSS (chorioallantoic membrane culture tube), add to 0.1 ml of a 2-fold stepwise diluted drug solution, and add to 0.1 ml of the drug solution at 36°C. Incubate with shaking for 48 hours. After culturing, the chorioallantoic membrane is gently washed with PBS and immersed in trypan blue solution for 1 minute. Then, wash thoroughly with PBS and adjust the drug concentration to 50%, at which two of the four chorioallantoic membranes used for each drug dilution step are stained deep blue.
It was taken as a toxic concentration. (b) Viricidal test Add an equivalent amount of influenza A type 2 Adachi strain (1000 MID
After stirring at room temperature for 120 minutes, 0.2 ml of the 100-fold dilution of the mixture was transferred to chorioallantoic membrane culture tubes containing 0.8 ml of Hank'sBSS and cultured with shaking at 36°C for 48 hours. . Each culture solution was subjected to a chicken red blood cell agglutination test to determine the presence or absence of agglutination ability.
The 50% virucidal concentration was calculated by Muench's method. (c) Virus multiplication inhibition test After adding 0.1 ml of a 2-fold stepwise diluted drug solution to a Hank's BSS 0.8 ml chorioallantoic membrane culture tube, 0.1 ml of influenza A type 2 Adachi strain (100 MID 100/ml) was inoculated. , incubate with shaking at 36 °C for 48 h. For each culture solution, the 50% virus growth inhibition concentration was calculated in the same manner as in the virucidal test. Comparative compounds 1 to 3 in Table 1 are compounds known as antiviral agents, and are listed for comparison with the compounds of the present invention. As is clear from comparing the test results for these compounds, the compound of the present invention has reduced toxicity to HeLa cells and chicken egg chorioallantoic membrane;
On the other hand, the antiviral activity is enhanced in terms of both virucidal and virus growth inhibiting effects, and the chemotherapeutic index of each is also large, so it is superior to known compounds. In particular, the compound of the present invention (p-decyloxy-m-methoxybenzalacetone N-methylamidinohydrazone hydrochloride) has a virucidal index.
3125 or higher, with a growth inhibition index of 13 or higher, showing the most promising results. Test Example 2 Tables 2 and 3 show the measurement results of the following properties of the compound of the present invention using hatched chicken eggs. (b) Measurement of MTD 0 for hatched chicken eggs 62.5mcg/ by 2-fold stepwise dilution from 2000mcg/ml
The dosage is in 6 levels up to ml, and after preparing with sterile distilled water or 5% DMSO for drugs that are not water-soluble, use chorioallantoic fluid from 11-12-day-old chicken eggs using 5 eggs per group at 0.1 ml/egg. Administer intracavitally at 37℃ and 60% humidity.
Cultured for 48 hours. After culturing, examine the eggs to determine whether they are alive or dead.
MTD 0 (Maximum tolerated dose) was determined. (b) 50% difference in hatched chicken egg virus infection rate (-
Measuring method of logEID 50 difference) The drug dose was set based on the MTD, and was administered at 0.1 ml/egg into the chorioallantoic cavity of 11- to 12-day-old hatched chicken eggs. or,
30 minutes after administration, influenza A PR-8 strain was detected.
10 in two steps before and after the dilution factor of the EID 50 value
The mixture was serially diluted and inoculated into the chorioallantoic cavity at 0.2 ml/egg using 10 per group. Then 48 at 37℃ and 60% humidity
After culturing for a period of time and cooling at -5°C overnight, the agglutination ability of each chorioallantoic fluid to chicken red blood cells was measured, EID 50 was calculated by the method of Reed and Muench, and the difference from the virus control group was determined. (c) Measurement method for virus multiplication inhibition rate The drug dose was prepared in the following 3 stages using MTD and 2-fold serial dilution, and administered into the chorioallantoic cavity of 11- to 12-day-old hatched chicken eggs.
The dose was 0.1ml/egg. 100EID 50 30 minutes after administration
Influenza A PR-8 strain diluted to 0.2
ml/egg was inoculated. Thereafter, it was cultured under the same conditions as in (b), the chicken hemagglutination titer (log2 x ) was measured, and the virus growth inhibition rate was calculated using the method described below. Viral growth inhibition rate = (1 - HA titer of drug administration group/HA titer of virus control group) x 100 (%)
【表】【table】
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