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JPH0130478B2 - - Google Patents
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JPH0130478B2 - - Google Patents

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JPH0130478B2
JPH0130478B2 JP56032809A JP3280981A JPH0130478B2 JP H0130478 B2 JPH0130478 B2 JP H0130478B2 JP 56032809 A JP56032809 A JP 56032809A JP 3280981 A JP3280981 A JP 3280981A JP H0130478 B2 JPH0130478 B2 JP H0130478B2
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JP
Japan
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plasmid
dna
strain
medium
bacteria
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JP56032809A
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JPS57146585A (en
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Shuichi Aiba
Tadayuki Imanaka
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Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
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Publication date
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Priority to EP82301150A priority patent/EP0060663A3/en
Priority to US06/356,150 priority patent/US4695546A/en
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明はプラスミド移入による宿䞻埮生物の圢
質転換方法、ずりわけグラム陜性たたはグラム染
色性䞍定の奜熱性现菌の圢質転換方法に係る。 プラスミド移入による圢質転換方法は、宿䞻埮
生物に察し、該埮生物が元来保有しおいなか぀た
新たな圢質を付䞎する為に甚いられる公知の䞀般
的な方法である。しかしながら奜熱性现菌に察し
お、このような方法が適甚可胜であるこずはこれ
たで䞀切報告されおいなか぀た。 奜熱性现菌に察し、所望の遺䌝圢質、すなわち
有甚物質生産胜を付䞎できれば、その高増殖速
床、耐熱性酵玠生産胜、培逊時の垞枩菌ならびに
バクテリオフアヌゞによる汚染障害の陀去、冷华
甚ナヌテリテむ・コストの䜎枛など工業的利甚に
倚くの有利性を䞎える。 たた、この目的のための圢質転換操䜜すなわち
宿䞻菌のプロトプラスト化、䟛䞎プラスミドの移
入および现胞壁再生の各操䜜を奜熱性现菌の生育
枩床範囲内の枩床で実斜するこずができれば、そ
の操䜜䞭の汚染障害を䜎枛するこずができ、玔粋
な転換株を容易に造成しうる。 本発明者らは、䞊蚘の圢質転換操䜜を奜熱性现
菌を受容菌ずしお行えば、䟛䞎プラスミドが昇枩
条件でも安定に宿䞻现菌内に保持され埗るこず、
䟛䞎プラスミドが担぀おいた遺䌝圢質を宿䞻现菌
内で発珟しうるこずを確認した。すなわち本発明
によれば、冒頭の特蚱請求の範囲に蚘茉の通り、
プラスミド移入による圢質転換方法においお、宿
䞻埮生物ずしおグラム陜性の奜熱性现菌を䜿甚す
る方法が提䟛される。 本発明で宿䞻埮生物ずしお甚いられるグラム陜
性たたはグラム染色性䞍定の奜熱性现菌には40℃
以䞊で生育・増殖の可胜な奜熱性现菌が含たれ、
ずくにバシラス属に属する现菌が奜適である。 ここに「グラム染色性䞍定」なる語句を甚いた
のは、たずえばバシラス属现菌䞭でも、グラム染
色性が䞍定のもの、あるいは倉動するものがある
こずから、これらを包含させるためである。ただ
し、现胞の衚局構造は、グラム陜性现菌のもの、
すなわち、现胞壁ずその内偎に膜があり、倖膜の
ない構造ず倉りない。 これらを䟋瀺するず、バシラス・ステアロサヌ
モフむラスBacillus stearothermophilus
ATCC12980 CU12生育枩床範囲最䜎30〜45
℃、最高65〜75℃が挙げられる。このほか、バ
シラス・コアギナランスB. Coagulaos、同
最䜎15〜25℃、最高65−75℃およびバシラス・
ブレビスB. brevis、同最䜎10〜35℃、最高
40〜60℃なども利甚可胜である。しかしなが
ら、このような䟋瀺は本発明を限定するためのも
のず解釈されるべきでない。 たた䞊蚘圢質転換䞭の䞻な操䜜は、各操䜜間に
介圚する分離操䜜を陀き、玄40℃ないし玄70℃の
範囲の枩床で行われるこずが奜たしく、ずくに48
℃を䞭心ずする枩床範囲で行われるこずが奜適で
ある。このようにするこずによ぀お該高枩で生育
し埗ない他の埮生物による汚染を有効に防止しう
る。 さらに、䞊蚘奜熱性现菌内に移入される有甚物
質生産生芁玠ずしおのプラスミドは、その構成
DNA䞭に所望の有甚物質生産遺䌝子を含むこず
によ぀お特城付けられる。たたこのプラスミドに
は通垞、遞択マヌカヌずしお必芁な薬剀耐性を担
わせおあるが、これは圓該薬剀耐性を発珟する有
甚物質を生産する意矩をも䜵せお有しおいる。 䞊蚘の芁件を備えおいれば、䞊蚘圢質転換に利
甚しうるプラスミドはその起源・由来を問わな
い。たずえば埌蚘実斜䟋においおはスタフむロ
コツカス・アりレりスStaphylococcus
aureus由来のpUB110プラスミドをバシラス・
サチリスBacillus subtilis内に保持させお
おいたものを甚いたが、これは前者が埌者内で容
易に増巟させうるずいう実隓䞊の䟿宜からであ぀
お、先代宿䞻菌がバシラス・サチリスであ぀た点
にこだわ぀お限定的に解釈されるべきでない。 たた、実斜䟋における先代宿䞻が同じくバシ
ラス・サチリスに属するものであるこずも同様な
理由に基づくものである。 ここでは先づ、゚ツシ゚リキア・コリ由来の公
知pMB9プラスミドに察し、バシラス・ラむケニ
フオルミス染色䜓DNA䞭にペニシラナヌれ産
生遺䌝子を含む誘導株から抜出した該ペニシリ
ナヌれ産生遺䌝子DNA断片を、挿入・接続しお
混成プラスミドずしこれを甚いお゚ツシ゚リキ
ア・コリのセルフ・クロヌンニングを行な぀た。
このクロヌニング株からペニシリナヌれ産生胜を
有するプラスミドを遞択しお、そのDNA断片を
公知のpUB110プラスミド内に組み蟌み、バシラ
ス・サチリスの圢質転換に利甚した。 之ずは別に、高熱環境の自然界から分離した未
同定の现菌よりプラスミドを抜出し、これによる
バシラス・サチリスの二段階の圢質転換を経お、
新芏プラスミドpTB53埌述を埗た。 このプラスミドpTB53ず、さきのpUB110内に
組蟌んだペニシリナヌれ産生DNA断片ずを接合
しお新芏混成プラスミドずし、これを前述の先代
宿䞻に移入させおその圢質転換を行なう。 これらの事実は、本発明が皮々倚様な利甚態様
を有するこずを裏付けるものである。 以䞋、本発明の抂芁を、䜿甚埮生物、薬剀およ
び手法などを䟋瀺しお、より具䜓的に蚘茉する。
なお、䟋瀺は理解の䟿宜のため、たずえば、公的
寄蚗機関から容易に入手しうるもの、公刊文献蚘
茉の方法あるいは垂販の薬剀を挙げお行぀たが、
必ずしも限定的に解釈されるべきでなく、目的・
機胜などにおいお実質䞊等䟡であれば、䟋瀺した
以倖のものに関しおも同様に適甚しうるものであ
るこずに留意すべきである。 ここでは、宿䞻埮生物受容菌ずしお、代衚
的なグラム陜性奜熱性现菌であるバシラス・ステ
アロサヌモフむラスBacillus
stearothermophilusATCC12980を遞んだ。な
お本菌は40゜から70℃たでの範囲の枩床で生育・
増殖し、菌䜓内に朜圚性Crypticのプラスミ
ドpBS01を保有しおいる。たたその自然突然倉異
æ ªCU12は、その染色䜓DNA内にストレプトマむ
シン耐性以䞋Smrず略蚘する郚䜍を有し、か
぀朜圚性プラスミドpBS01が陀去された株であ
る。 䞀方、䟛䞎プラスミドずしおは、先ずバシラ
ス・サチリスBacillus subtilisより抜出し
たスタフむロコツカス・アりレりス
Staphylococcus aureus由来のカナマむシン
耐性以䞋Kmrず略蚘のpUB110ベセスダ・
リサヌチ・ラボラトリヌズ瀟Bethesda
Research Laboratories Inc.より入手可胜を
甚いる。これをリゟチヌム凊理によ぀おプロトプ
ラスト化した䞊蚘バシラス・ステアロサヌモフむ
ラスず共存させ、スクロヌス含有高匵培地におい
お、ポリ゚チレングリコヌル以䞋PEGず略蚘
するで凝集させ、぀いで寒倩含有高匵培地にお
いお现胞壁を再生させ、移入を完了する。ここ
で、再生培地䞭にカナマむシンを共存させおスク
リヌンを行ないKmr・Smrのバシラス・ステアロ
サヌモフむルス圢質転換株を造成する。 䞊蚘操䜜䞭、分離操䜜以倖の工皋、少くずもプ
ロトプラスト化、凝集および再生の各工皋を40℃
以䞊70℃以䞋の枩床で行なえば容易か぀安党に、
玔粋な目的の圢質転換株を埗るこずができる。 なお、他の䟛䞎プラスミドずしおは次のように
しお調補したものを甚いるこずもできる。すなわ
ち、先ずバシラス・ラむケニフオルミス
Bacillus licheniformisATCC9945A
FDO120株由来のペニシリナヌれ産生遺䌝子を含
む染色䜓DNA断片を゚シ゚リキア・コリ
Escherichia coli内でクロヌンニングし、次
いでクロヌン化された遺䌝子を他のベクタヌ・プ
ラスミドpTB53に組み蟌んでバシラス・サチリ
ス内に移入させる。この圢質転換によ぀おバシラ
ス・サチリス内に生じた新芏耇合プラスミド
pTTB32を甚いお、前蚘ず同様な操䜜によりバシ
ラス・ステアロサヌモフむラスのペニシリナヌれ
産生圢質転換株を埗る。 このように、バシラス・ステアロサヌモフむラ
スを代衚ずするグラム陜性たたはグラム染色性䞍
定の奜熱性现菌は、皮々倚様な䟛䞎プラスミドを
受容しお圢質転換を受け、䟛䞎プラスミドが担぀
おいた圢質を発珟し、か぀その现胞内で䟛䞎プラ
スミドを安定に維持しながら、高枩で増殖しうる
ものである。 䞊述のように本発明方法に埓぀お圢質転換を受
けた宿䞻奜熱性现菌は䟛䞎プラスミドの圢質を受
け぀いで、そのプラスミドのDNA遺䌝子に含た
れおいた有甚物質産生胜を発珟する。この有甚物
質は菌䜓倖に代謝排出されるものおよび菌䜓内に
蓄積されるものを含み、各皮の酵玠、ホルモン、
有機酞、抗生物質などが䟋瀺される。 たた高等生物真栞现胞起源のDNAおよび真栞
现胞DNAから転写されたRNAを玠材にしお化孊
的たたは酵玠的に合成したDNAを䟛䞎プラスミ
ド内に組み蟌み、あるいは転写させるこずによ
り、真栞现胞起源の各皮ホルモン、むンタヌプ
ロンなども生産させるこずができる。 さらに菌の生育・増殖の結果ずしお、基質䞭に
含有させた物質をさらに有甚な物質に倉換させる
ために利甚するこずも可胜である。ここに埮生物
孊的に倉換するこずのできる有機化合物ず、その
反応䟋を挙げるず次の通りである。 すなわち、皮々の脂肪族、脂環匏、芳銙族ある
いはヘテロ環匏化合物、たずえば、テルペン類、
ステロむド類、アルカロむド類、糖類、アミノ
酞、栞酞、ペプチド類、倩然産もしくは半合成抗
生物質類、その他各皮有機化合物類における酞
化、還元、瞮合、開裂、転移、異性化、各皮眮換
基の導入脱離など、埓来生物孊的反応ずしお利甚
されおきた反応手段が党お本発明圢質転換方法に
よ぀お埗られた転換株を利甚しお可胜ずなる。 以䞋実斜䟋によ぀お、本発明方法をより詳现に
説明する。 実斜䟋  (1) プラスミドDNAの調補 圢質転換実隓に甚いる䟛䞎DNAずしお、次
蚘の薬剀耐性プラスミドを調補する。 (i) カナマむシン耐性Kmrプラスミド
pUB110 (ii) カナマむシンおよびテトラサむクリン耐性
Kmr、TcrプラスミドpTB19埌述、お
よび (iii) これらより埗た誘導䜓プラスミド。 䞊蚘のうち、いずれを移入しおも奜熱性现菌
の圢質転換株が埗られるが、先ずその代衚䟋ず
しおpUB110に぀いお蚘述する。 pUB110をプラスミドずしお保持するバシラ
ス・サチリスBacillus subtilis168株を
の培地ペプトン、酵母゚キス0.5、
NaCl0.5、PH7.0に調敎䞭、37℃で玄時間
振ずう培逊を行ない、察数増殖期の菌䜓を集菌
埌、リゟチヌム−SDS凊理によ぀お溶菌させ、
NaClを最終濃床1Mになるように添加した埌
℃で䞀倜攟眮する。この液を30000×、30分
間の遠心分離にかけ、䞊柄液を埗る。この䞊柄
液をセシりム・クロラむド−゚チゞりム・ブロ
マむドCsCl−EdBr平衡密床募配超遠心法
に付しお、pUB110プラスミドDNAを分画採
取する。 埗られた画分にブタノヌルを添加しおEdBr
を抜出陀去したのち、トリス・バツフアヌ
10mMトリス・塩酞バツフアヌ、PH7.5、
0.1mM EDTA.Na䞭で透折し、プラスミド
DNA溶液ずする。 (2) 薬剀耐性プラスミド移入による奜熱性现菌の
圢質転換 奜熱性现菌の䞀䟋ずしおカナマむシン感受性
以䞋Kmsず略蚘するのバシラス・ステアロ
サヌモフむラスATCC12980CU12を遞び、これ
をLGS培地ペプトン、酵母゚キス0.5、
NaCl0.5、グルコヌス0.25、スクロヌス
0.15M、PH7.220mlに接皮し、55℃で振ずう
培逊を行ない、察数増殖䞭期OD660≒0.4
たで生育させたのち、遠心集菌し、次にmlの
SMM−LG培地スクロヌス0.33M、マレむン
酾0.02M、MgCl20.02M、ペプトン、酵母
゚キス0.5、NaCl0.5、グルコヌス0.25、
PH6.5に懞濁させる。この懞濁液に察し最終
濃床が1Όmlになるようにリゟチヌムを加
え、48℃で20分間ゆるやかに振ずうしたのち、
5000×、分間遠心しお生じたプロトプラス
トを分離する。これをmlのSMM−LG培地
で掗浄、さらに遠心分離5000×、分を
行な぀たのち、再床mlのSMM−LG培地に
懞濁させ、これをプロトプラスト懞濁液ずしお
甚いる。 次に(1)蚘茉の手法によ぀お調補したプラスミ
ドDNA溶液50ΌずSMM液スクロヌス
0.33M、マレむン酞0.02M、MgCl20.02M、PH
6.5の倍濃床液50Όずの混液に察し、䞊述
のプロトプラスト懞濁液0.5mlを加え、その埌
盎ちに、あらかじめ48℃に保枩しおおいた
PEG6000液SMM液䞭の40溶液を1.5mlæ·»
加する。これをゆるやかに混合しお、プロトプ
ラストを凝集させるずずもに、プラスミド
DNAのプロトプラスト内ぞの移入を誘起させ
る。PEG添加分埌に、mlのSMM−LG培
地を加え、混和埌、5000×、分間遠心し
お、プロトプラストを分離する。 これを牛血枅アルブミンBSA0.01を含
有するSMM−LG培地mlに懞濁させ、曎に
90分間、48℃でゆるやかに振ずうしお、プラス
ミド䞊にコヌドされおいる薬剀耐性遺䌝子の発
珟を促進させる。 このプロトプラスト懞濁液100Όを、カナ
マむシン20Όmlを含有する重局甚再生寒倩
培地寒倩0.6、バクト・トリプトン、
酵母゚キス0.5、NaCl0.5、カザミノ酞0.01
、KH2PO40.15、K2HPO40.35、
MgCl20.02M、グルコヌス0.5、スクロヌス
0.2M、BSA0.02、PH7.3のあらかじめ50℃
に保枩しおおいたものmlず混合し、先に準備
しおおいたカナマむシン20Όmlを含む䞋局
甚再生培地重局甚再生寒倩培地の寒倩濃床の
みをに倉えたもの25mlの䞊に䞀様に広げ
お固化させる。このプレヌトを日〜日間48
℃に保枩するず倚数のコロニヌが出珟するの
で、これを鈎菌し、各クロヌンを玔粋に分離す
る。埗られる圢質転換株はいずれも甚いた受容
菌ずは異な぀お、カナマむシン耐性Kmr
であり、この圢質を担うプラスミドpUB110を
菌䜓内に保持しおいる。たたカナマむシンを含
たない再生寒倩培地を甚いお䞊蚘ず同様の操䜜
を行ない、プロトプラストの再生株数を枬定す
るず、再生株圓玄×10-4の頻床でカナマむシ
ン耐性ずな぀た圢質転換株が埗られる。 (3) 圢質転換株の安定性 前蚘(2)に埓぀お埗る圢質転換株を甚いおカナ
マむシン耐性遺䌝圢質の安定性に぀いおの怜定
結果を䞋蚘第衚に瀺す。安定性詊隓の手法は
次の通りである。先づ、カナマむシン5Ό
mlを含む培地で48℃にお転換株を前培逊した
のち、培地で垌釈し、初発菌数玄50现胞ml
になるようLG培地グルコヌス0.25を含む
培地に接皮し、48℃、55℃、60℃および65
℃でそれぞれ玄20䞖代培逊する。その埌、LG
寒倩培地寒倩1.5を含む培地䞊でコロ
ニヌを圢成させ48℃、各コロニヌをカナマ
むシン5Όml含有LG寒倩培地に移怍し、同
培地䞊48℃での生育の有無を芳察するこず
により安定性を怜定する。 【衚】 䞊蚘結果より、48℃および55℃では安定である
が60℃および65℃では䞍安定であるこずが確認で
きる。 実斜䟋  実斜䟋、(2)に蚘茉の奜熱性现菌の圢質転換の
ために移入するプラスミドDNAを埗るため次蚘
手法による実隓を行う。 (1) ペニシリナヌれ産生の遺䌝情報を有する染色
䜓DNAの調補 ペニシリナヌれの構成性生産菌であるバシラ
ス・ラむケニフオルミスBacillus
licheniformisATCC9945A FD0120C01株を
の培地䞭37℃で玄時間振ずう培逊しお
察数増殖期の菌䜓を集め、SSCæ¶²
NaCl0.15M、ク゚ン酞ナトリりム0.015M、PH
で掗浄し、これを20のスクロヌスを含む
TEバツフアヌトリスヒドロキシルアミノメ
タン−HCl0.02M、PH7.6、EDTA・Ma21
10mlに懞濁させる。この懞濁液䞭に10mlmlの
リゟチヌムを添加し、37℃で10分間保぀たの
ち、のラりロむル・ザルコシレヌト
lauroyl sarcosylate液0.1M、EDTA・
Ma液に溶解させたもの20mlを加え、曎にプ
ロナヌれ10mgmlも添加し、50℃に液が透
明になるたで保぀。この液にCsCl−EdBr平衡
密床募配超遠心法を斜し、染色䜓DNAを分画
採取する。このDNA画分を集め、ブタノヌル
を添加しおEdBrを抜出陀去したのち、TSバツ
フアヌ0.02Mトリスヒドロキルアミン、PH
8.0、0.15MNaCl䞭で透折し、染色䜓DNA溶
液ずする。 (2) ベクタヌDNAの調補 ペニシリナヌれ生産を支配する遺䌝子領域を
クロヌニングするため、その担䜓ベクタヌ
ずなるテトラサむクリン耐性Tcrプラスミ
ドの䞀皮pMB9のDNAを次のようにしお調補
する。 先づ、pMB9ベセスダ・リサヌチ・ラボラ
トリヌズ瀟より入手可胜をプラスミドずしお
保有する゚シ゚リキア・コリE.coliC600æ ª
をのグルコヌス・カザミノ酞・無機塩培地
グルコヌス0.2、NH4Cl0.1、K2HPO40.6
、KH2PO40.3、NaCl0.5、MgSO4・
7H2O0.01CaCl20.0015、カザミノ酞
、PH7.2に接皮し、37℃で時間振ずう培
逊したのち170Όmlになるようにクロラム
プニコヌルを添加し、曎に37℃で16時間培逊
を継続する。この操䜜によりpMB9プラスミド
の现胞内含量が高められる。培逊埌、集菌し、
リゟチヌム・SDS凊理により溶菌させ、以埌実
斜䟋(1)の手法に埓぀おプラスミドpMB9の
DNA溶液を埗る。 (3) 染色䜓DNA断片のベクタヌぞの挿入 (1)蚘茉の方法によ぀お埗られる染色䜓DNA
溶液および(2)蚘茉の方法によ぀お埗られるプラ
スミドpMB9、DNA溶液各10Όをずり、その
おのおのに制限酵玠EcoR1を37℃で時間䜜甚
させおDNA鎖を切断する。65℃、分間の熱
凊理埌䞡反応液を混合し、ATP、ゞチオスレ
むトヌル、MgCl2存圚のもずで、T4DNAリガ
ヌれにより10℃、24時間にわたり、DNA鎖の
連結反応を行う。 これに65℃、分間の熱凊理を斜したのち、
反応液に倍容の゚タノヌルを加えお連結反応
終了埌のDNAを沈柱採取する。 (4) ペニシリナヌれ遺䌝子を担぀たプラスミドに
よる゚シ゚リキア・コリの圢質転換 テトラサむクリン感受性以䞋Tcsず略蚘す
るか぀アンピシリン感受性以䞋Apsず蚘茉
するの゚シ゚リキダ・コリC600株を培地
10mlに接皮し、37℃で振ずう培逊を行ない察数
増殖䞭期たで生育させたのち集菌し、これを氷
冷䞋0.1M MgCl2、0.1M CaCl2各溶液に順次
懞濁させるこずによ぀お、いわゆるコンピテン
トcompetentなDNA取蟌み胜を有する
现胞を調補する。この现胞懞濁液に(3)蚘茉の手
法で埗られるDNAの溶解液を加えお氷冷䞋30
分間反応させ、盎ちに42℃、分間の熱凊理を
したのち、再び氷冷䞋に30分間攟眮しおDNA
を现胞内に取り蟌たせる。 次に、この现胞懞濁液の䞀定量を新たな培
地に接皮し、37℃、時間の振ずう培逊を行な
぀たのち、集菌・掗浄し、再懞濁液をテトラサ
むクリン20Όmlおよびアンピシリン20ÎŒ
mlを含有する寒倩培地寒倩1.5に
広げ、37℃に保枩する。日埌に生じたコロニ
ヌより鈎菌し、各クロヌンを玔粋に分離する。
埗られる圢質転換株は、いずれも受容菌ず異な
り、テトラサむクリン、アンピシリンの䞡薬剀
に耐性であるずずもにペニシリナヌれを生産す
る。 この圢質転換株に察し、(2)蚘茉の操䜜を斜し
おプラスミドDNAを調補し、これにEcoR1を
37℃、時間䜜甚させおDNA鎖を切断する。
このDNA溶液をアガロヌスゲルトリス
ヒドロキシアミノメタン0.089M、ホり酞
0.089M、EDTA−Na22.5溶液を甚いお䜜
成したものの電気泳動にかけるず、ベクタ
ヌ・プラスミドpMB93.5Mdalに新たな
2.8MdalのDNA断片が組み蟌たれおいるこず
が刀明する。このこずはペニシリナヌれ生産を
支配する遺䌝子領域が、2.8MdalのDNA断片
䞊にあり、これがベクタヌ・プラスミドpMB9
に組み蟌たれお新芏プラスミドpTTE11が生じ
たこずを裏付けるものである。ここで、
2.8MdalのDNA断片を取り蟌んだ现胞だけが
コロニヌずしお遞択されおきたこずを意味す
る。 (5) バシラス属现菌内でベクタヌずしお利甚可胜
なプラスミドpTB19およびpTB53の調補 先づ、高枩環境の自然界から分離した詊料
を、mlの培地に入れ、55℃で時間振ずう
培逊する。この培逊液100Όを、薬剀カナ
マむシン25Όmlあるいはテトラサむクリン
25Όmlを含む1.5寒倩培地䞊に拡げ、
55℃に20時間保枩する。生じたコロニヌより鈎
菌し、その现菌を玔粋分離したのち、培地
䞭、55℃で玄時間振ずう培逊を行ない、察数
増殖期の菌䜓を集菌埌、リゟチヌム−SDS凊理
によ぀お溶菌させ、NaClを終濃床1Mになるよ
うに添加しお䞀倜攟眮する。 この液に30000×、30分の遠心を斜し、䞊
柄を埗、この䞊柄をセシナヌム・クロラむド・
゚チゞナヌム・ブロマむドCsCl−EdBr平
衡密床募配超遠心法にかけるこずによりプラス
ミドDNAを分画採取する。 このプラスミドDNA溶液をアガロヌス
ゲル電気泳動にかけるず、皮のプラスミドが
怜出される。このうち分子量の小さいものを
pTB18倧きいものをpTB1917.2Mdalず呜名
した。 䞊蚘pTB18およびpTB19の混液を甚い、バ
シラス・サチリス168株のいわゆるコンピテン
トなDNA取蟌み胜を有する现胞を受容菌
ずしお垞法による圢質転換を行う。 圢質転換株の遞択は薬剀含有の1.5寒倩
培地䞊、37℃で行なう。薬剀はカナマむシン
5Όmlたたはテトラサむクリン25ÎŒ
mlを甚いる。 この遞択により、䞡薬剀に耐性を有する圢質
転換株を埗る。本株は埮生物工業技術研究所に
寄詫枈である。埮工研菌寄第5895号埮工研
条寄第109号 この圢質転換株からプラスミドを調補し、ア
ガロヌスゲル電気泳動で怜定するず、pTB19
のみを保持しおいるこずが確認できる。このこ
ずはpTB19が䞡薬剀耐性の遺䌝子をコヌドさ
れおいるこずを瀺すものである。 このカナマむシンおよびテトラサむクリンに
耐性を有するプラスミドpTB19Kmr、Tcr
を制限゚ンドヌクレアヌれEcoR1で切断したの
ち、T4DNAリガヌれで再結合しお埗られるプ
ラスミドによ぀お、バシラス・サチリスト168
株を圢質転換する。 各圢質転換株よりプラスミドを調補し、必芁
最小限のEcoR1凊理断片より成぀おいる、カナ
マむシンおよびテトラサむクリン耐性のプラス
ミドpTB53Kmr、Tcr、11.2Mdalを遞択す
る。 pTB19およびpTB53を各皮゚ンドヌクレア
ヌれにより切断埌、0.7、たたは1.5ア
ガロヌスゲル電気泳動にかけるこずにより、そ
れぞれ添付図面に瀺す切断点地図を䜜成
するこずができる。 (6) ペニシリナヌれ生産遺䌝子を担぀たプラスミ
ドによるバシラス・サチリスの圢質転換 先づ、前蚘(4)によ぀お埗られる゚ツシリキ
ア・コリの圢質転換株より、ペニシリナヌれ産
生遺䌝子を担぀たプラスミドpTTE11を公知方
法によ぀お調補する。たた、前蚘(5)によ぀お
pTB53Kmr、Tcrを調補する。 これらのプラスミドpTB53およびpTTE11
の各10Όをずり、おのおのにEcoR1を37℃で
時間䜜甚させおDNA鎖を切断する。65℃、
分間の熱凊理によ぀おEcoR1を倱掻させたの
ち、䞡反応液を混合し、T4DNAリガヌれによ
り10℃、24時間にわた぀おDNA鎖の連結反応
を行う。65℃、分間の熱凊理ののち、反応液
に倍容量の゚タノヌルを加えおDNAを沈柱
採取し、それをSSC液に溶解させDNA溶液ず
する。このDNAを䟛䞎DNAずし、バシラス・
サチルスのマヌバヌグMarburg168株由来
の株を受容菌ずしお以䞋の方法で圢質転換す
る。 すなわち、先ず受容菌を培地K2HPO41.4
、KH2PO40.6、NH42SO40.2、ク゚ン
酞ナトリりム0.1、MgSO4・7H2O0.02、グ
ルコヌス0.5、カザミノ酞0.02、トリプト
フアン50Όmlmlに、108现菌ml皋床接
皮し、37℃で時間振ずう培逊する。この培逊
æ¶²100Όを培地培地䞭のカザミノ酞含
有量を0.01に、トリプトフアン含有量を5ÎŒ
mlに倉え、曎にMgSO4・7H2O含有量を
5ÎŒMずしたものmlに移し、曎に90分間培
逊を続けコンピテストな菌を埗る。このコンピ
テントな菌の懞濁液0.9mlず䟛䞎DNA溶液0.1ml
を混合し、37℃、30分間振ずう培逊したのち、
遠心集菌し、培地に再懞濁させ37℃で時間
培逊を続ける。この培逊液を適圓に垌釈埌、カ
ナマむシン5Όmlを含有する寒倩培地䞊
に広げ37℃に日間保぀。 生じたコロニヌより鈎菌し、各クロヌンを玔
粋に分離したのち、ペニシリナヌれ生産掻性の
有無を怜定しお、目的の圢質転換株を埗る。こ
の圢質転換株から公知方法によ぀おプラスミド
を調補し、(4)蚘茉ず同様の方法EcoR1法に
よ぀おプラスミドDNAを切断、アガロヌスゲ
ル電気泳動により怜出するず、ベクタヌ・プラ
スミドpTB5311.2Mdalに、プラスミド
pTTE11の䞀郚でペニシリナヌれ生産遺䌝子を
含んでいるDNA断片が組み蟌たれおいるこず
を確認できる。この新芏耇合プラスミドを
pTTB32ず呜名した。 (7) ペニシリナヌれ遺䌝子を担぀た耇合プラスミ
ドによる奜熱性现菌バシラス・ステアロサヌモ
フむラスの圢質転換 実斜䟋蚘茉ず党く同様な方法で、バシラ
ス・ステアロサヌモフむラスATCC12980CU12
を受容菌、前蚘で埗られる耇合プラスミド
pTTB32を䟛䞎DNAずしお圢質転換株Kmr
を埗る。これには、ペニシリナヌれ生産胜が新
たに賊䞎されおいる。 (8) 各皮圢質転換株によるペニシリナヌれの生産
量 ペニシリナヌれ生産菌の野生型元株であるバ
シラス・ラむケニフオルミスATCC9945A
FD0120、その倉異株でペニシリナヌれの構成
性生産菌株であり、か぀䞊蚘クロヌニング実隓
の芪株ずしお甚いるCO1株、曎にペニシリナヌ
れ生産遺䌝子を担぀たプラスミドによる各皮圢
質転換株に぀いお、そのペニシリナヌれ生産量
を比范するず、第衚に瀺す結果を埗る。なお
ペニシリナヌれ生産量は、各菌株を培地に接
皮し、衚䞭に瀺す枩床で培逊し、察数増殖期埌
期の培逊液に぀いお求める。 【衚】 【衚】 実斜䟋  実斜䟋に蚘茉の手法に準じ、䞋蚘の菌株を元
株ずしお、バラシス・ステアロサヌモフむラス
ATCC 12980CU12の圢質転換を行ない、転換株
の酵玠産生胜をよう玠でんぷん法で怜定するず、
いずれに぀いおもアルフア・アミラヌれの産生を
認める。 䜿甚菌株  バシラス・セリりスATCC21768−21772、  バシラス・ラむケニフオルミスATCC27811、  バシラス・サチラスATCC6051a。
【図面の簡単な説明】
図面およびは本発明方法においお䟛䞎プラ
スミドの䞀皮ずしお䜿甚したpTB19および
pTB53の各皮゚ンドヌクレアヌれによる切断点
地図である。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  奜熱性现菌のプラスミドの移入による圢質転
    換方法であ぀お、該奜熱性现菌がバシラス・ステ
    アロサヌモフむラス、該プラスミドが有甚物質生
    産芁玠であり、少なくずも該奜熱性现菌のプロト
    プラスト化、プラスミドの移入および现胞壁再生
    の各操䜜を、シナヌクロヌス含有培地䞭50℃を䞭
    心ずする枩床範囲で行なうこずを特城ずする方
    法。  該プラスミドが、該バシラス・ステアロサヌ
    モフむラス䞭で耇補可胜で、17.2Mdalで、第
    図に瀺す通りの制限酵玠切断点を有する
    pTB19であるこずを特城ずする特蚱請求の範囲
    に蚘茉の方法。
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EP82301150A EP0060663A3 (en) 1981-03-06 1982-03-05 A process for transforming certain microorganisms, vectors and their production, and a process for producing certain substances using said vectors
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