JPH0139753B2 - - Google Patents
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- JPH0139753B2 JPH0139753B2 JP58038454A JP3845483A JPH0139753B2 JP H0139753 B2 JPH0139753 B2 JP H0139753B2 JP 58038454 A JP58038454 A JP 58038454A JP 3845483 A JP3845483 A JP 3845483A JP H0139753 B2 JPH0139753 B2 JP H0139753B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Description
本発明は新規なプラスミドに関するものであ
る。 近年、ベクターとして使用可能と思われるプラ
スミド（プラスミドDNA）の種々のものが知ら
れるようになつたが、広い用途に充分に対応する
ため更に多くの有用かつ安全なプラスミドの開発
が期待されている。 本発明者は、病原性に問題のないコリネバクテ
リウム・キセロシス（Corynebacterium
xerosis）に由来するプラスミドが枯草菌
（Bacillus subtilis）に安定に存在し、制限酵素
による切断点があり、かつ薬剤耐性を有している
ことを利用して本発明を完成した。 すなわち、コリネバクテリウム・キセロシスか
らプラスミド（pTP10）を分離し、これで枯草
菌を形質転換後再びプラスミド（pTP11）を分
離し、これを制限酵素XbaIで切断後ライゲーシ
ヨンすることにより分子量が約1.7メガダルトン
（Md）であるプラスミド（pTP12）が得られ、
また、プラスミドpTP11とプラスミドpNS1を制
限酵素Hindで切断した後ライゲイシヨンする
ことにより分子量が約4.3Mdであるプラスミド
pTP1101およびpTP1102が得られる。 これらの工程における処理手段は公知の一般的
方法を使用することができ、例えば次のような方
法が用いられる。 コリネバクテリウムの培養と溶菌はShillerら
の方法（Antimicrob.Agents Chemothef.18
814〜821（1980））に準じて行ない、アルカリ変性
法によるDNAの抽出はHansen及びOlsenの方法
（J.Bacteriol.135 227〜238（1978））に従つて行
なえばよい。 枯草菌の形質転換はChang及びCohenのプロト
プラスト法（Molec.gen.Genet.168 111〜115
（1979））に準じて行なえばよい。 プラスミドの分離にはアガロースゲル電気泳動
法や密度勾配遠心法のような一般的な方法を用い
ることができ、また、プラスミドDNAの制限酵
素による切断と、DNA鎖の連結酵素（リガーゼ）
による結合（ライゲイシヨン）も常法によつて行
なうことができる。 次に、本発明のプラスミドの製造法を実験例に
より詳述するが、使用したコリネバクテリウム・
キセロシスM82B株は、本発明者が分離した菌株
であり、分子量が30.4±2.7MdのＲプラスミドを
保有しており、このＲプラスミド上にエリスロマ
イシン、カナマイシン、クロラムフエニコール、
テトラサイクリン耐性遺伝子を持つている。ま
た、染色体上にもストレプトマイシン耐性遺伝子
を有している。 例 １ M82B株からのプラスミドDNAの分離 すなわち、トリプトソイブイヨン培地（トリプ
トン17ｇ、ソイペプトン３ｇ、ブドウ糖2.5ｇ、
リン酸一水素カリウム2.5ｇ、塩化ナトリウム５
ｇ、蒸留水１、PH7.3）によるM82B株の一夜
培養液を新鮮同培地に1/100量接種し、37℃で約
３時間振盪培養した後、ペニシリンＧを最終濃度
5μｇ／mlとなるように加え、さらに２時間振盪
培養した。この培養液を冷却遠心により集め、ペ
レツトをTEバツフア（10ｍＭトリスアミノメタ
ン、0.5ｍMEDTA、PH8.0）で２回洗浄後、TE
バツフアに溶かした0.5Mシユークロースに懸濁
した。この懸濁液にリゾチーム（シグマ）を最終
濃度10μｇ／mlとなるように加え37℃で２時間イ
ンキユベートした。この溶液に10％SDS（ドデジ
ル硫酸ナトリウム）溶液を最終濃度１％になるよ
うに加え、55℃で30分間静置した。次に新たに調
整した3N水酸化ナトリウム溶液を加えてPH12.1
〜12.3とし軽く混和後、2Mトリス溶液（PH7.0）
を水酸化ナトリウム溶液の２倍量加えた。さらに
5M塩化ナトリウム溶液を最終濃度1Mとなるよう
に加えた後４℃で一夜放置した。その後
10000rpm、30分の冷却遠心により上清を分取し、
TEバツフアで飽和した等量の再蒸留フエノール
を加えよく混和した。10000rpm20分の冷却遠心
により、水層を分離させた後、水層を分取し、−
20℃のエタノールを３倍量加えて、−20℃で一夜
放置した。10000rpm30分間の冷却遠心によりペ
レツトを集め、TEバツフアーに溶解し、DNA溶
液とした。 例 ２ M82B株より抽出されたプラスミド
pTP10DNAによる枯草菌の形質転換 すなわち、枯草菌168LMAH761222（leu-、
met-、ade-、hir-）株のバクト−ペンアツセイ
ブロス（デイフイコ：バクト−ビーフイクストラ
クト1.5ｇ、バクト−イーストイクストラクト1.5
ｇ、バクトペプトン５ｇ、バクト−デキストロー
ス１ｇ、塩化ナトリウム3.5ｇ、リン酸二カリウ
ム3.68ｇ、リン酸一カリウム1.32ｇ、蒸留水１
、PH7.0±0.1）による一夜培養液を新しい同培
地に1/100量接種し37℃で0D0.4（600nｍ）まで振
盪培養した。菌体を遠心により集菌し、SMMP
バツフアー（0.5Mシユークロース、0.02Mマレ
イン酸二ナトリウム、1M塩化マグネシウムを２
倍濃度のバクト−ペンアツセイブロスに溶解）に
懸濁した後、最終濃度２mg／mlとなるようにリゾ
チームを加えた。37℃約１時間の培養の後
3000rpm15分の遠心により集菌し、SMMPバツ
フアーで一度洗浄後、菌体を６mlのSMMPバツ
フアーに懸濁し、プロトプラスト溶液とした。 例１で得たDNA溶液50μ（約DNA0.5μｇ）
に同量の２×SMMバツフアー（1Mシユークロ
ース、0.04Mマレイン酸二ナトリウム、2M塩化
マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプラス
ト溶液１mlを加えた。さらに40％ポリエチレング
リコール6000溶液３mlを加えて、０℃２分間静置
後５mlのSMMPバツフアーを加え3000rpm10分
間の遠心により集菌した。集めたプロトプラスト
ペレツトを１mlのSMMPバツフアーに懸濁し30
℃1.5時間培養後、その0.1mlをクロラムフエニコ
ール25μｇ／ml含有のDM−３再生培地（リン酸
二カリウム3.5ｇ、リン酸一カリウム1.5ｇ、カズ
アミノ酸５ｇ、塩化マグネシウム4.06ｇ、コハク
酸ナトリウム135ｇ、イーストイクストラクト５
ｇ、グルコース５ｇ、寒天８ｇ、牛血清アルブミ
ン0.05ｇ、蒸留水１、PH7.3）に塗抹し、37℃
で２〜３日間培養することにより109〜1010株に
１株の頻度で形質転換株を得た。 例 ３ 形質転換株からのプラスミドDNAの分離 得られたクロラムフエニコール耐性の形質転換
株をブレインハートインフユージヨン（BHI）
培地10mlに接種し、一夜静置培養した。この培養
液をCY培地（リン酸二カリウム0.7％、リン酸一
カリウム0.3％、硫酸アンモニウム0.1％、クエン
酸ナトリウム0.05％、デイフコカザミノ酸0.2％、
デイフコ酵母抽出物0.1ｇ、硫酸マグネシウム
0.025％、ブドウ糖0.5％、PH7.0）10mlに吸光度
0.1（600nｍ）になるように加えた。37℃で振盪培
養し、吸光度0.3（600nｍ）の時にデオキシアデノ
シンを最終濃度250μｇ／mlになるように加えた。
３分後トリチウムチミジンを最終濃度10μCi／ml
になるように加えた。 吸光度0.8（600nｍ）で氷にて発育を停止し、
10000×ｇで15分間４℃に於てブロスから菌体を
分離し、上澄を菌体ペレツトから傾斜で除いた。
ペレツトをTES緩衝液（0.05M塩化ナトリウム、
0.005M EDTA含有トリス−塩酸緩衝液（PH
8.0））によつて再懸濁した。次に、0.5M EDTA
液0.2ml、10mg／ml濃度のリゾチーム液0.1mlを加
え、混合物を10分間37℃で培養した。ブリジ−58
を最終濃度0.5％となるように加え、37℃、10分
間培養した。次にＮ−ラウロイルサルコシンナト
リウムを最終濃度2.5％になるように加え、50℃、
30分間培養し溶菌を行つた。溶菌液をピペツトに
て粘性をとり、軟化させたのち、塩化セシウム、
臭化エチジウムと混合し密度1.553の溶液とした。
この溶液を126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠
心した。 遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各分
画ごとに10μをワツトマンろ過GF／Ａに吸着さ
せ、このろ過に吸着されたトリチウムの放射活性
を液体シンチレーシヨンカウンター（パツカード
3300）にて測定し、cpmにて表わす。染色体
DNAに由来する高活性を示す分画の大きなピー
クとプラスミドDNAに由来する小さなピークの
２つを与える。この小さなピークを示した分画を
とり、ｎ−オクタノールで２回処理することによ
り、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層を
SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナ
トリウム、PH7.0）の10倍希釈液に対して透析し
てプラスミドを分離した。分離したプラスミド
DNAの分子量を電子顕微鏡により測定したとこ
ろ4.7Mdであつた。本プラスミドをpTP11とす
る。また本プラスミドを所有する菌株をLMAH
（pTP11）株と名付けた。本プラスミドのコピー
数は約20であつた。 例 ４ プラスミドpTP11の枯草菌RM125株への再形
質転換 LMAH（pTP11）株よりプラスミドDNAを下
記の方法により調整した。 枯草菌LMAH（pTP11）株をデイフイコ・ラボ
ラトリーズ製ブレインハートインフユージヨン
（BHI）培地100mlに接種する。この培地の組成
は次に示す。 カーフブレイン インフユージヨン 20.0 ％ ビーフハート インフユージヨン 25.0 ％ プロテオース ペプトン 1.0 ％ バクト−デキストロース 0.2 ％ 塩化ナトリウム 0.5 ％ リン酸二ナトリウム 0.25％ 蒸留水 1000ml PHが7.4±0.2であることを確認する。培地を
500ml坂口フラスコ中で予め滅菌する。接種後フ
ラスコを37℃、約18〜24時間振盪培養する。 この細胞懸濁液を１％の率で同培地の20本のフ
ラスコに接種するのに使用する。37℃で18〜24時
間振盪培養後、10000×ｇで約15分間４℃に於て
ブロスから分離し、上澄を菌体ペレツトから傾斜
で除く。上澄を捨てペレツトをTES緩衝液によ
つて２回洗浄後、100mlの25％蔗糖含有TES緩衝
液に再懸濁する。次に0.5M−EDTA溶液40ml、
10mg／ml濃度のリゾチーム溶液20mlを加え混合物
を30分間37℃で培養する。次に50mg／ml濃度のブ
リジ−58 20mlを加え、混合物を37℃、10分間培
養する。さらに250mg／ml濃度のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウム20mlを加え、50℃で10〜30
分間培養する（細胞破壊）。溶解物を26000×ｇ、
30分間冷却遠心後、上澄に5M濃度の塩化ナトリ
ウム溶液50mlを加え一夜放置後、ポリエチレング
リコール6000を最終濃度10％となるように加え、
さらに一夜４℃にて放置した。この混合物を
10000×ｇ、15分間遠心し、ペレツトをTES緩衝
液に溶解した。この溶液を塩化セシウム、臭化エ
チジウムと混合し、密度1.553の溶液を与える。
この溶液を126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠
心する。紫外線照射下で（365nｍ）線状染色体
及びプラスミドDNAは強い螢光を発するバンド
として遠心機チユーブの中に見られる。このプラ
スミドDNAを密度勾配から取り出し、ｎ−オク
タノールで２回抽出することにより臭化エチジウ
ムを除き、次に水層を10倍希釈SSC緩衝液
（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリ
ウム、PH7.0）に対して透析してpTP11を得た。
得られたpTP11DNAを前述のプロトプラスト法
により枯草菌の制限欠損＝修飾欠損株である
RM125株へ形質転換した。得られたクロラムフ
エニコール耐性コロニーのひとつを使い、チミジ
ンラベル法によりプラスミドの検出を行つたとこ
ろpTP11と全く同じ分子量のプラスミドを検出
することが出来た。本実験よりプラスミド
pTP11上にはクロラムフエニコール耐性遺伝子
が存在していることが確認された。 例 ５ プラスミドpTP11の制限酵素解裂地図の作成 制限酵素によるプラスミドDNAの消化は次の
条件により行つた。また、２種の制限酵素を組み
合わせて反応させる場合は、一方の酵素反応をフ
エノールで停止させ、さらにフエノールをエーテ
ル抽出した後に２培量のエタノールを加え、析出
したDNAを遠心によつて集めTEバツフアーに溶
解した後、次に酵素反応を行つた。 EcoR 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）、
５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭメルカ
プトエタノール、50ｍＭ塩化ナトリウ
ム、37℃ Hpa 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオ
スレイトール（DTT）、37℃ Xba ６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
100ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マ
グネシウム、37℃ Bcl 12ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
12ｍＭ塩化マグネシウム、12ｍＭ塩化ナ
トリウム、0.5ｍＭ DTT、50℃ Hind 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、60ｍＭ塩化ナ
トリウム、37℃ 消化混合物はシヤープ等によつてつくられた１
％アガロースゲル中で分析した（J.Sharp et al、
Biochemistry、12 3055〜3063（1973））。EcoR
消化λDNAを分子量対照として使用した
（Thomasら、J.Mol.Biol.、91 315〜328
（1975））。 pTP11の制限酵素開裂点の数および開裂断片
の分子量を表に示し、開裂地図は図１に示した。
る。 近年、ベクターとして使用可能と思われるプラ
スミド（プラスミドDNA）の種々のものが知ら
れるようになつたが、広い用途に充分に対応する
ため更に多くの有用かつ安全なプラスミドの開発
が期待されている。 本発明者は、病原性に問題のないコリネバクテ
リウム・キセロシス（Corynebacterium
xerosis）に由来するプラスミドが枯草菌
（Bacillus subtilis）に安定に存在し、制限酵素
による切断点があり、かつ薬剤耐性を有している
ことを利用して本発明を完成した。 すなわち、コリネバクテリウム・キセロシスか
らプラスミド（pTP10）を分離し、これで枯草
菌を形質転換後再びプラスミド（pTP11）を分
離し、これを制限酵素XbaIで切断後ライゲーシ
ヨンすることにより分子量が約1.7メガダルトン
（Md）であるプラスミド（pTP12）が得られ、
また、プラスミドpTP11とプラスミドpNS1を制
限酵素Hindで切断した後ライゲイシヨンする
ことにより分子量が約4.3Mdであるプラスミド
pTP1101およびpTP1102が得られる。 これらの工程における処理手段は公知の一般的
方法を使用することができ、例えば次のような方
法が用いられる。 コリネバクテリウムの培養と溶菌はShillerら
の方法（Antimicrob.Agents Chemothef.18
814〜821（1980））に準じて行ない、アルカリ変性
法によるDNAの抽出はHansen及びOlsenの方法
（J.Bacteriol.135 227〜238（1978））に従つて行
なえばよい。 枯草菌の形質転換はChang及びCohenのプロト
プラスト法（Molec.gen.Genet.168 111〜115
（1979））に準じて行なえばよい。 プラスミドの分離にはアガロースゲル電気泳動
法や密度勾配遠心法のような一般的な方法を用い
ることができ、また、プラスミドDNAの制限酵
素による切断と、DNA鎖の連結酵素（リガーゼ）
による結合（ライゲイシヨン）も常法によつて行
なうことができる。 次に、本発明のプラスミドの製造法を実験例に
より詳述するが、使用したコリネバクテリウム・
キセロシスM82B株は、本発明者が分離した菌株
であり、分子量が30.4±2.7MdのＲプラスミドを
保有しており、このＲプラスミド上にエリスロマ
イシン、カナマイシン、クロラムフエニコール、
テトラサイクリン耐性遺伝子を持つている。ま
た、染色体上にもストレプトマイシン耐性遺伝子
を有している。 例 １ M82B株からのプラスミドDNAの分離 すなわち、トリプトソイブイヨン培地（トリプ
トン17ｇ、ソイペプトン３ｇ、ブドウ糖2.5ｇ、
リン酸一水素カリウム2.5ｇ、塩化ナトリウム５
ｇ、蒸留水１、PH7.3）によるM82B株の一夜
培養液を新鮮同培地に1/100量接種し、37℃で約
３時間振盪培養した後、ペニシリンＧを最終濃度
5μｇ／mlとなるように加え、さらに２時間振盪
培養した。この培養液を冷却遠心により集め、ペ
レツトをTEバツフア（10ｍＭトリスアミノメタ
ン、0.5ｍMEDTA、PH8.0）で２回洗浄後、TE
バツフアに溶かした0.5Mシユークロースに懸濁
した。この懸濁液にリゾチーム（シグマ）を最終
濃度10μｇ／mlとなるように加え37℃で２時間イ
ンキユベートした。この溶液に10％SDS（ドデジ
ル硫酸ナトリウム）溶液を最終濃度１％になるよ
うに加え、55℃で30分間静置した。次に新たに調
整した3N水酸化ナトリウム溶液を加えてPH12.1
〜12.3とし軽く混和後、2Mトリス溶液（PH7.0）
を水酸化ナトリウム溶液の２倍量加えた。さらに
5M塩化ナトリウム溶液を最終濃度1Mとなるよう
に加えた後４℃で一夜放置した。その後
10000rpm、30分の冷却遠心により上清を分取し、
TEバツフアで飽和した等量の再蒸留フエノール
を加えよく混和した。10000rpm20分の冷却遠心
により、水層を分離させた後、水層を分取し、−
20℃のエタノールを３倍量加えて、−20℃で一夜
放置した。10000rpm30分間の冷却遠心によりペ
レツトを集め、TEバツフアーに溶解し、DNA溶
液とした。 例 ２ M82B株より抽出されたプラスミド
pTP10DNAによる枯草菌の形質転換 すなわち、枯草菌168LMAH761222（leu-、
met-、ade-、hir-）株のバクト−ペンアツセイ
ブロス（デイフイコ：バクト−ビーフイクストラ
クト1.5ｇ、バクト−イーストイクストラクト1.5
ｇ、バクトペプトン５ｇ、バクト−デキストロー
ス１ｇ、塩化ナトリウム3.5ｇ、リン酸二カリウ
ム3.68ｇ、リン酸一カリウム1.32ｇ、蒸留水１
、PH7.0±0.1）による一夜培養液を新しい同培
地に1/100量接種し37℃で0D0.4（600nｍ）まで振
盪培養した。菌体を遠心により集菌し、SMMP
バツフアー（0.5Mシユークロース、0.02Mマレ
イン酸二ナトリウム、1M塩化マグネシウムを２
倍濃度のバクト−ペンアツセイブロスに溶解）に
懸濁した後、最終濃度２mg／mlとなるようにリゾ
チームを加えた。37℃約１時間の培養の後
3000rpm15分の遠心により集菌し、SMMPバツ
フアーで一度洗浄後、菌体を６mlのSMMPバツ
フアーに懸濁し、プロトプラスト溶液とした。 例１で得たDNA溶液50μ（約DNA0.5μｇ）
に同量の２×SMMバツフアー（1Mシユークロ
ース、0.04Mマレイン酸二ナトリウム、2M塩化
マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプラス
ト溶液１mlを加えた。さらに40％ポリエチレング
リコール6000溶液３mlを加えて、０℃２分間静置
後５mlのSMMPバツフアーを加え3000rpm10分
間の遠心により集菌した。集めたプロトプラスト
ペレツトを１mlのSMMPバツフアーに懸濁し30
℃1.5時間培養後、その0.1mlをクロラムフエニコ
ール25μｇ／ml含有のDM−３再生培地（リン酸
二カリウム3.5ｇ、リン酸一カリウム1.5ｇ、カズ
アミノ酸５ｇ、塩化マグネシウム4.06ｇ、コハク
酸ナトリウム135ｇ、イーストイクストラクト５
ｇ、グルコース５ｇ、寒天８ｇ、牛血清アルブミ
ン0.05ｇ、蒸留水１、PH7.3）に塗抹し、37℃
で２〜３日間培養することにより109〜1010株に
１株の頻度で形質転換株を得た。 例 ３ 形質転換株からのプラスミドDNAの分離 得られたクロラムフエニコール耐性の形質転換
株をブレインハートインフユージヨン（BHI）
培地10mlに接種し、一夜静置培養した。この培養
液をCY培地（リン酸二カリウム0.7％、リン酸一
カリウム0.3％、硫酸アンモニウム0.1％、クエン
酸ナトリウム0.05％、デイフコカザミノ酸0.2％、
デイフコ酵母抽出物0.1ｇ、硫酸マグネシウム
0.025％、ブドウ糖0.5％、PH7.0）10mlに吸光度
0.1（600nｍ）になるように加えた。37℃で振盪培
養し、吸光度0.3（600nｍ）の時にデオキシアデノ
シンを最終濃度250μｇ／mlになるように加えた。
３分後トリチウムチミジンを最終濃度10μCi／ml
になるように加えた。 吸光度0.8（600nｍ）で氷にて発育を停止し、
10000×ｇで15分間４℃に於てブロスから菌体を
分離し、上澄を菌体ペレツトから傾斜で除いた。
ペレツトをTES緩衝液（0.05M塩化ナトリウム、
0.005M EDTA含有トリス−塩酸緩衝液（PH
8.0））によつて再懸濁した。次に、0.5M EDTA
液0.2ml、10mg／ml濃度のリゾチーム液0.1mlを加
え、混合物を10分間37℃で培養した。ブリジ−58
を最終濃度0.5％となるように加え、37℃、10分
間培養した。次にＮ−ラウロイルサルコシンナト
リウムを最終濃度2.5％になるように加え、50℃、
30分間培養し溶菌を行つた。溶菌液をピペツトに
て粘性をとり、軟化させたのち、塩化セシウム、
臭化エチジウムと混合し密度1.553の溶液とした。
この溶液を126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠
心した。 遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各分
画ごとに10μをワツトマンろ過GF／Ａに吸着さ
せ、このろ過に吸着されたトリチウムの放射活性
を液体シンチレーシヨンカウンター（パツカード
3300）にて測定し、cpmにて表わす。染色体
DNAに由来する高活性を示す分画の大きなピー
クとプラスミドDNAに由来する小さなピークの
２つを与える。この小さなピークを示した分画を
とり、ｎ−オクタノールで２回処理することによ
り、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層を
SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナ
トリウム、PH7.0）の10倍希釈液に対して透析し
てプラスミドを分離した。分離したプラスミド
DNAの分子量を電子顕微鏡により測定したとこ
ろ4.7Mdであつた。本プラスミドをpTP11とす
る。また本プラスミドを所有する菌株をLMAH
（pTP11）株と名付けた。本プラスミドのコピー
数は約20であつた。 例 ４ プラスミドpTP11の枯草菌RM125株への再形
質転換 LMAH（pTP11）株よりプラスミドDNAを下
記の方法により調整した。 枯草菌LMAH（pTP11）株をデイフイコ・ラボ
ラトリーズ製ブレインハートインフユージヨン
（BHI）培地100mlに接種する。この培地の組成
は次に示す。 カーフブレイン インフユージヨン 20.0 ％ ビーフハート インフユージヨン 25.0 ％ プロテオース ペプトン 1.0 ％ バクト−デキストロース 0.2 ％ 塩化ナトリウム 0.5 ％ リン酸二ナトリウム 0.25％ 蒸留水 1000ml PHが7.4±0.2であることを確認する。培地を
500ml坂口フラスコ中で予め滅菌する。接種後フ
ラスコを37℃、約18〜24時間振盪培養する。 この細胞懸濁液を１％の率で同培地の20本のフ
ラスコに接種するのに使用する。37℃で18〜24時
間振盪培養後、10000×ｇで約15分間４℃に於て
ブロスから分離し、上澄を菌体ペレツトから傾斜
で除く。上澄を捨てペレツトをTES緩衝液によ
つて２回洗浄後、100mlの25％蔗糖含有TES緩衝
液に再懸濁する。次に0.5M−EDTA溶液40ml、
10mg／ml濃度のリゾチーム溶液20mlを加え混合物
を30分間37℃で培養する。次に50mg／ml濃度のブ
リジ−58 20mlを加え、混合物を37℃、10分間培
養する。さらに250mg／ml濃度のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウム20mlを加え、50℃で10〜30
分間培養する（細胞破壊）。溶解物を26000×ｇ、
30分間冷却遠心後、上澄に5M濃度の塩化ナトリ
ウム溶液50mlを加え一夜放置後、ポリエチレング
リコール6000を最終濃度10％となるように加え、
さらに一夜４℃にて放置した。この混合物を
10000×ｇ、15分間遠心し、ペレツトをTES緩衝
液に溶解した。この溶液を塩化セシウム、臭化エ
チジウムと混合し、密度1.553の溶液を与える。
この溶液を126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠
心する。紫外線照射下で（365nｍ）線状染色体
及びプラスミドDNAは強い螢光を発するバンド
として遠心機チユーブの中に見られる。このプラ
スミドDNAを密度勾配から取り出し、ｎ−オク
タノールで２回抽出することにより臭化エチジウ
ムを除き、次に水層を10倍希釈SSC緩衝液
（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリ
ウム、PH7.0）に対して透析してpTP11を得た。
得られたpTP11DNAを前述のプロトプラスト法
により枯草菌の制限欠損＝修飾欠損株である
RM125株へ形質転換した。得られたクロラムフ
エニコール耐性コロニーのひとつを使い、チミジ
ンラベル法によりプラスミドの検出を行つたとこ
ろpTP11と全く同じ分子量のプラスミドを検出
することが出来た。本実験よりプラスミド
pTP11上にはクロラムフエニコール耐性遺伝子
が存在していることが確認された。 例 ５ プラスミドpTP11の制限酵素解裂地図の作成 制限酵素によるプラスミドDNAの消化は次の
条件により行つた。また、２種の制限酵素を組み
合わせて反応させる場合は、一方の酵素反応をフ
エノールで停止させ、さらにフエノールをエーテ
ル抽出した後に２培量のエタノールを加え、析出
したDNAを遠心によつて集めTEバツフアーに溶
解した後、次に酵素反応を行つた。 EcoR 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）、
５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭメルカ
プトエタノール、50ｍＭ塩化ナトリウ
ム、37℃ Hpa 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオ
スレイトール（DTT）、37℃ Xba ６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
100ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マ
グネシウム、37℃ Bcl 12ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
12ｍＭ塩化マグネシウム、12ｍＭ塩化ナ
トリウム、0.5ｍＭ DTT、50℃ Hind 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、60ｍＭ塩化ナ
トリウム、37℃ 消化混合物はシヤープ等によつてつくられた１
％アガロースゲル中で分析した（J.Sharp et al、
Biochemistry、12 3055〜3063（1973））。EcoR
消化λDNAを分子量対照として使用した
（Thomasら、J.Mol.Biol.、91 315〜328
（1975））。 pTP11の制限酵素開裂点の数および開裂断片
の分子量を表に示し、開裂地図は図１に示した。
【表】
例 ６
プラスミドpTP11からのDNA断片欠損プラス
ミドの分離 プラスミドpTP11DNAを前述の条件でXba
またはHindで切断後T4DNAリガーゼにより
ライゲイシヨン反応を行つた。反応条件は66ｍＭ
−トリス塩酸緩衝液（PH6.5）、6.6ｍＭ塩化マグ
ネシウム、10ｍＭジチオスレイトール、0.4ｍＭ
ATP存在下で15℃20時間行つた。反応後前述
のプロトプラスト法により枯草菌RM125株へ形
質転換を行つた。得られたクロラムフエニコール
耐性コロニーについて調べたところ、Xba−
T4リガーゼの組み合せから得られたコロニーか
らは1.7MdのプラスミドpTP12が得られた。ま
た、Hind−T4リガーゼの組み合せからは
2.8MdのpTP13が得られた。 例 ７ プラスミドpTP12、pTP13の制限酵素解裂地
図の作成並びに分子量、コピー数の測定 プラスミドpTP12および13に関し 3H−チミヂ
ンラベル法によりコピー数を測定するとともに
DNAをとり正確に分子量の測定を電子顕微鏡に
より行つた。また、制限酵素解裂地図は前述と全
く同じ方法で行つた。その結果、プラスミド
pTP12は分子量が1.7Mdと小さく、Hpaに対し
２つの解裂点をもつていたが、Xbaに関する解
裂点はなくなつていた。本プラスミドはコピー数
が約200と多く、本プラスミドを所有している枯
草菌を液体培養すると培地中からクロラムフエニ
コール アセチルトランスフエラーゼの活性が認
められた。pTP13はpTP11のHindの大きな断
片（2.8Md）が環状化したものであることがわか
つた。本プラスミドのコピー数は約70であつた。 pTP12とpTP13の制限酵素解裂点地図を図２
及び図３に示す。 例 ８ プラスミドpTP5からDNA欠損プラスミド
pNS1の分離 pNS1の分離に関してはGene21：105〜112
（1983）に報告されている。すなわち枯草菌プラ
スミドpTP5DNA（M.Kono et al Microbios
Letters5：55〜59（1978））を枯草菌
168LMAH761222（pTP5）より例４に記載された
方法により抽出した。このpTP5DNA2μｇを20
ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.4）、７ｍＭ塩化マグ
ネシウム、60ｍＭ塩化ナトリウム、Hind10単
位含有溶液中で37℃、１時間の反応により切断す
る。反応をフエノールを加えることにより停止さ
せ、エーテル抽出によりフエノールを除去後２倍
量のエタノールを加え、DNAを沈殿させた。 沈殿したDNAペレツトを66ｍＭトリス塩酸緩
衝液（PH7.6）、6.6ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍ
Ｍジチオスレイトール、４ｍＭアデノシン三リン
酸溶液100μに溶解後、T4DNAリガーゼ0.01単
位を加え16℃、16時間の反応によつてDNAを連
結させた。フエノールにより反応を停止させ、エ
ーテル抽出により、フエノールを除去後、２倍量
のエタノールを加えDNAを沈殿させた。沈殿し
たDNAを滅菌蒸留水50μに溶解し、形質転換
用DNA試料として用いた。 形質転換は例２に記載したプロトプラスト法に
より行つた。受容菌には枯草菌GSY908株を用い
た。得られたTc耐性コロニーを溶菌用緩衝液
（リゾチーム2μｇ／ml、RNase0.1mg／ml、25％シ
ユークロースをTEバツフアーに溶解）40μに
懸濁し37℃、２時間反応させた。この溶液に５％
SDS溶液10μを加え、完全に溶菌後、フエノー
ル50μを加え10000rpm10分間の遠心後、水層を
分取した。 この水層についてアガロースゲル電気泳動法に
より、プラスミドDNAの確認を行い、分子量が
最も小さいプラスミドDNAを持つているいくつ
かの形質転換株についてさらに詳しく調べた。す
なわち、各形質転換株より前述の方法により、プ
ラスミドDNAを調整し、やはり前述の方法によ
りHind切断を行い、アガロースゲル電気泳動
を行つた結果、プラスミドpTP5のHind−Ｃ断
片（0.35Md）の欠損したプラスミドpNS1の存在
が確認された。 このプラスミドpNS1DNAを抽出し、枯草菌
RM125株にプロトプラスト法により形質転換し、
プラスミドpNS1上にTc耐性遺伝子が存在してい
ることを確認した。以後の実験には枯草菌
RM125（pNS1）株を用いた。 pNS1の制限酵素開裂地図を図７に示す。 例 ９ プラスミドpTP1101とpTP1102の分離と方向
性の確認 枯草菌RM125（pNS1）株よりプラスミド
pNS1DNAを前述の方法により抽出し、プラス
ミドpTP11DNAと混合後、前述の方法（例８）
に従いHindで切断後、T4リガーゼにより結合
させ、プロトプラスト法によりRM125株へ形質
転換した。 得られたクロラムフエニコール、テトラサイク
リン両耐性を持つコロニーについてプラスミド
DNAの検索を行つた。得られたコロニーを（例
８）のごとく溶菌させアガロースゲル電気泳動を
行い、プラスミドDNAの分子量が最も小さいも
の数株を選択した。これらの形質転換株よりプラ
スミドDNAを調整し、EcoR、Hind、Kpn
に関する制限酵素開裂点地図を作成した。制限
酵素開裂地図の作成にはEcoR、Hindの他に
Kpnを使用した。Kpnの反応条件は６ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（PH7.5）、６ｍＭ塩化ナトリウ
ム、６ｍＭ塩化マグネシウム、６ｍM2−メルカ
プトエタノール、37℃である。 この結果、pNS1由来のHind−Ａ断片
（1.5Md）がpTP11由来の2.8Mdの断片と正方向
及び逆方向に結合した２種類のプラスミド
pTP1101とpTP1102をそれぞれ持つ２種の形質
転換株が存在することが確認された。 pTP1101とpTP1102の制限酵素開裂地図を図
４と図５及び図６に示した。また、コピー数はお
のおの約100コピーであつた。 以上の例で用いた微生物は工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されており、次の番号を有し
ている。 コリネバクテリウム・キセロシスM82B
FERM Ｐ−6971 枯草菌168LMAH761222 FERM P6972 枯草菌RM125 FERM Ｐ−6973 枯草菌168LMAH761222（pTP5）
FERM Ｐ−6974
ミドの分離 プラスミドpTP11DNAを前述の条件でXba
またはHindで切断後T4DNAリガーゼにより
ライゲイシヨン反応を行つた。反応条件は66ｍＭ
−トリス塩酸緩衝液（PH6.5）、6.6ｍＭ塩化マグ
ネシウム、10ｍＭジチオスレイトール、0.4ｍＭ
ATP存在下で15℃20時間行つた。反応後前述
のプロトプラスト法により枯草菌RM125株へ形
質転換を行つた。得られたクロラムフエニコール
耐性コロニーについて調べたところ、Xba−
T4リガーゼの組み合せから得られたコロニーか
らは1.7MdのプラスミドpTP12が得られた。ま
た、Hind−T4リガーゼの組み合せからは
2.8MdのpTP13が得られた。 例 ７ プラスミドpTP12、pTP13の制限酵素解裂地
図の作成並びに分子量、コピー数の測定 プラスミドpTP12および13に関し 3H−チミヂ
ンラベル法によりコピー数を測定するとともに
DNAをとり正確に分子量の測定を電子顕微鏡に
より行つた。また、制限酵素解裂地図は前述と全
く同じ方法で行つた。その結果、プラスミド
pTP12は分子量が1.7Mdと小さく、Hpaに対し
２つの解裂点をもつていたが、Xbaに関する解
裂点はなくなつていた。本プラスミドはコピー数
が約200と多く、本プラスミドを所有している枯
草菌を液体培養すると培地中からクロラムフエニ
コール アセチルトランスフエラーゼの活性が認
められた。pTP13はpTP11のHindの大きな断
片（2.8Md）が環状化したものであることがわか
つた。本プラスミドのコピー数は約70であつた。 pTP12とpTP13の制限酵素解裂点地図を図２
及び図３に示す。 例 ８ プラスミドpTP5からDNA欠損プラスミド
pNS1の分離 pNS1の分離に関してはGene21：105〜112
（1983）に報告されている。すなわち枯草菌プラ
スミドpTP5DNA（M.Kono et al Microbios
Letters5：55〜59（1978））を枯草菌
168LMAH761222（pTP5）より例４に記載された
方法により抽出した。このpTP5DNA2μｇを20
ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.4）、７ｍＭ塩化マグ
ネシウム、60ｍＭ塩化ナトリウム、Hind10単
位含有溶液中で37℃、１時間の反応により切断す
る。反応をフエノールを加えることにより停止さ
せ、エーテル抽出によりフエノールを除去後２倍
量のエタノールを加え、DNAを沈殿させた。 沈殿したDNAペレツトを66ｍＭトリス塩酸緩
衝液（PH7.6）、6.6ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍ
Ｍジチオスレイトール、４ｍＭアデノシン三リン
酸溶液100μに溶解後、T4DNAリガーゼ0.01単
位を加え16℃、16時間の反応によつてDNAを連
結させた。フエノールにより反応を停止させ、エ
ーテル抽出により、フエノールを除去後、２倍量
のエタノールを加えDNAを沈殿させた。沈殿し
たDNAを滅菌蒸留水50μに溶解し、形質転換
用DNA試料として用いた。 形質転換は例２に記載したプロトプラスト法に
より行つた。受容菌には枯草菌GSY908株を用い
た。得られたTc耐性コロニーを溶菌用緩衝液
（リゾチーム2μｇ／ml、RNase0.1mg／ml、25％シ
ユークロースをTEバツフアーに溶解）40μに
懸濁し37℃、２時間反応させた。この溶液に５％
SDS溶液10μを加え、完全に溶菌後、フエノー
ル50μを加え10000rpm10分間の遠心後、水層を
分取した。 この水層についてアガロースゲル電気泳動法に
より、プラスミドDNAの確認を行い、分子量が
最も小さいプラスミドDNAを持つているいくつ
かの形質転換株についてさらに詳しく調べた。す
なわち、各形質転換株より前述の方法により、プ
ラスミドDNAを調整し、やはり前述の方法によ
りHind切断を行い、アガロースゲル電気泳動
を行つた結果、プラスミドpTP5のHind−Ｃ断
片（0.35Md）の欠損したプラスミドpNS1の存在
が確認された。 このプラスミドpNS1DNAを抽出し、枯草菌
RM125株にプロトプラスト法により形質転換し、
プラスミドpNS1上にTc耐性遺伝子が存在してい
ることを確認した。以後の実験には枯草菌
RM125（pNS1）株を用いた。 pNS1の制限酵素開裂地図を図７に示す。 例 ９ プラスミドpTP1101とpTP1102の分離と方向
性の確認 枯草菌RM125（pNS1）株よりプラスミド
pNS1DNAを前述の方法により抽出し、プラス
ミドpTP11DNAと混合後、前述の方法（例８）
に従いHindで切断後、T4リガーゼにより結合
させ、プロトプラスト法によりRM125株へ形質
転換した。 得られたクロラムフエニコール、テトラサイク
リン両耐性を持つコロニーについてプラスミド
DNAの検索を行つた。得られたコロニーを（例
８）のごとく溶菌させアガロースゲル電気泳動を
行い、プラスミドDNAの分子量が最も小さいも
の数株を選択した。これらの形質転換株よりプラ
スミドDNAを調整し、EcoR、Hind、Kpn
に関する制限酵素開裂点地図を作成した。制限
酵素開裂地図の作成にはEcoR、Hindの他に
Kpnを使用した。Kpnの反応条件は６ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（PH7.5）、６ｍＭ塩化ナトリウ
ム、６ｍＭ塩化マグネシウム、６ｍM2−メルカ
プトエタノール、37℃である。 この結果、pNS1由来のHind−Ａ断片
（1.5Md）がpTP11由来の2.8Mdの断片と正方向
及び逆方向に結合した２種類のプラスミド
pTP1101とpTP1102をそれぞれ持つ２種の形質
転換株が存在することが確認された。 pTP1101とpTP1102の制限酵素開裂地図を図
４と図５及び図６に示した。また、コピー数はお
のおの約100コピーであつた。 以上の例で用いた微生物は工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されており、次の番号を有し
ている。 コリネバクテリウム・キセロシスM82B
FERM Ｐ−6971 枯草菌168LMAH761222 FERM P6972 枯草菌RM125 FERM Ｐ−6973 枯草菌168LMAH761222（pTP5）
FERM Ｐ−6974
図１乃至図７は、プラスミドの制限酵素開裂地
図である。
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量が約1.7メガダルトンであり、制限酵
素開裂地図が、 で表わされるものであるプラスミドpTP12。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038454A JPS59166087A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038454A JPS59166087A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59166087A JPS59166087A (ja) | 1984-09-19 |
| JPH0139753B2 true JPH0139753B2 (ja) | 1989-08-23 |
Family
ID=12525716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58038454A Granted JPS59166087A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59166087A (ja) |
-
1983
- 1983-03-09 JP JP58038454A patent/JPS59166087A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59166087A (ja) | 1984-09-19 |
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