JPH07114703B2 - Ｄｎａベクター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡベクター、その産
生及び組換えＤＮＡ技術におけるその応用に関する。本
発明は又宿主生物の細胞中でのＤＮＡベクターの複製の
コントロールと遺伝子産物の産生に関する。

【０００２】

【従来の技術】プラスミッドのようなＤＮＡベクターは
通常環状てあり、宿主生物の細胞内で自律的に増殖する
染色体外ＤＮＡ分子である。多くの単細胞生物（いくつ
かの細菌が含まれる）の細胞は天然に存在する野生型の
プラスミッドを含有しており、このプラスミッドが宿主
細胞の抗生物質耐性や繁殖力などの種々の機能に影響を
与える。これら野生型プラスミッド及びその誘導体は組
換えＤＮＡ技術における基本的な道具であり、宿主生物
の細胞内での対応する外来のポリペプチドや蛋白産生の
遺伝子暗号を有する外来ＤＮＡ配列による宿主生物の細
胞の形質転換のためのビークルを供する。すなわち組換
えＤＮＡ技術においてプラスミッドはインビトロで制限
酵素を用いて特異的な部位で切り開かれ、目的の異種生
成物の遺伝暗号を有する遺伝子を含有する追加的ＤＮＡ
配列で再結合され、適当な宿主細胞を形質転換させるの
に用いられる組換えプラスミッドができる。

【０００３】それらが得られた親プラスミッドに類似し
た組換えプラスミッドは宿主細胞内で自律的増殖が可能
であり、複製時には親プラスミッドのＤＮＡ配列のみで
なく、外来遺伝子を含む挿入された追加ＤＮＡ配列も複
製する。蛋白合成時には、形質転換した宿主細胞中の組
換えプラスミッドのＤＮＡ配列の転写と翻訳により、特
にその挿入された外来遺伝子に対応する異種生成物が合
成される。

【０００４】合成された異種生成物の収率に影響を与え
る要因のひとつは、形質転換した細胞内に存在する外来
遺伝子のコピー数、すなわち宿主細胞内で組換えプラス
ミッドが維持されるコピー数であり、これはふつう宿主
ゲノム１個当たりのプラスミッドのコピーの数と定義さ
れる。一般に組換えプラスミッドのコピー数が多い程異
種生成物の収率が高い。コピー数の少ない（ふつう宿主
内でゲノム１個当たり約１−１０コピーが維持される）
プラスミッドもコピー数の多いプラスミッド（ふつうゲ
ノム１個当たり約１１から数百コピーが維持される）も
知られている。ある野生型のレプリコンのコピー数は、
複製開始点を規定するＤＮＡ配列付近、又はそれを含有
するＤＮＡ配列に支配される。従ってこれ以後大コピー
数複製開始点及び小コピー数複製開始点という。

【０００５】大コピー数プラスミッドは組換え系におい
て異種生成物の高収率を目的として使用されてきた。し
かし多くの大コピー数プラスミッドは形質転換した細胞
中で安定的に維持されにくく、又充分増殖して大量の異
種蛋白を生成するようになる前に細胞が消失することも
あるため、大コピー数プラスミッドを用いる方法では目
的の結果が得られない可能性もある。たとえば異種生成
物は形質転換細胞の増殖を阻害したり、大コピー数プラ
スミッド自身が本質的に不安定なこともある。

【０００６】あるプラスミッドのコピー数を蛋白合成の
阻害（たとえば発酵培地にクロラムフエニコールのよう
な蛋白合成阻害剤を添加すること）により通常レベル以
上に増幅させることが可能であることは公知である。し
かし多くの遺伝子産物の産生には蛋白合成が必要なた
め、外来遺伝子産物の合成が始まる前に阻害物を除去し
なければならない。この阻害物の除去には複雑な操作が
必要であり、必ずしも可能ではない。

【０００７】宿主細胞中での大コピー数プラスミッドの
安定な維持という問題を解決するために他の多くの溶液
が提唱されている。たとえば英国特許第１，５５７，７
７４号明細書では、温度依存性プラスミッドコピー数型
を示す突然変異プラスミッドの使用が提唱されている。
この温度依存性とは、プラスミッドを有する宿主細菌を
ある温度で培養するとプラスミッドコピー数が一定に保
たれ、別の温度で培養するとプラスミッドのコピー数型
が変化しはるかに多い数の、又は全くコントロールされ
ないコピー数が得られるというものである。こうしてプ
ラスミッドが少ないコピー数で複製し、その遺伝子産物
が細胞の増殖を有意に阻害しない温度で培養することに
より、細胞を目的とする生産規模に繁殖させることがで
きる。次に温度を変えプラスミッドのコピー数及びその
対応する遺伝子産物の産生を著しく増加させることもで
きる。しかしこのような突然変異プラスミッドでコピー
数温度依存性を導入することはプラスミッドに不安定要
因を導入することになり、このような突然変異プラスミ
ッドを有する細胞を長期間増殖させるとプラスミッドが
不安定になったり消失したりする。

【０００８】プラスミッドの複製はその全ＤＮＡ配列中
に含まれるヌクレオチド配列によりコントロールされ
る。この配列中にはＤＮＡ複製が開始される点である複
製開始点を規定する配列が含まれ、それに関連して複製
開始点での複製開始をコントロールする配列やプラスミ
ッドが維持されるコピー数をコントロールする配列もし
ばしば含まれている。たとえばある種のプラスミッド
（代表例はＣｏｌＥ１）は、いくつかの共通の特徴を有
するプラスミッド複製系を有している。これらの系は複
製開始点を規定するＤＮＡ配列と、その上流側に２つの
ＲＮＡ（ＲＮＡ IIとＲＮＡ I）の反対方向への転写の
遺伝暗号を有するＤＮＡ配列より成る。ＲＮＡ II はＤ
ＮＡ合成の開始される複製開始点又はその近くで複合体
を形成するプライマーとなり、ＲＮＡ Iはこのイニシエ
ーション複合体の形成を妨害する。この２つのＲＮＡの
転写は、その転写の遺伝暗号を有するＤＮＡ配列に関連
した異なるプロモーター配列によりコントロールされ
る。さらに小さいポリペプチド（ｒｏｐ蛋白）がありＲ
ＮＡ II のプロモーターと相互作用をすると考えられて
いる。このポリペプチドは複製に必須のものではなくそ
の役割は不明である。複製開始点、ＲＮＡの遺伝暗号配
列及び関連するプロモーターは一緒になって、内部的に
自己制御された系を与え、プラスミッドの複製の不和合
性とコピー数をコントロールしている。いくつかの他の
プラスミッド（ＲＩやいくつかのブドウ球菌プラスミッ
ドなど）も転写のレベルで複製開始をコントロールして
いるが、これはメッセンジャーＲＮＡによるコントロー
ルであり、その生成物はおそらくポリペプチドである開
始因子を与えＤＮＡ複製に関係している。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コン
トロール可能なコピー数型を有する新規のＤＮＡベクタ
ーを提供し、それにより大コピー数でのみ複製するベク
ターの安定的維持に関連する問題を解決し、これまでに
報告されている温度依存性コピー数型の突然変異プラス
ミッドの不安定性という問題がなく、さらにそのコピー
数が温度以外の因子（たとえば代謝物濃度）によりコン
トロール可能な新規のベクターを提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】従って第一の態様におい
て本発明は以下の２つの複製系より成るＤＮＡベクター
を供する。すなわち、小コピー数でベクターが安定に維
持される第一の複製開始点、そして第二の複製開始点に
おける複製をコントロールする天然のベクターの配列の
ＤＮＡ操作によりＤＮＡの置換又は変更により複製が直
接コントロール可能な、大コピー数の第二の複製開始
点。本発明の方法により、ベクターを含有している宿主
細胞が第一の条件で繁殖しているときは、主にそして好
ましく全面的に複製は小コピー数複製開始点から始ま
り、宿主細胞が別の条件で繁殖しているときは、複製は
大コピー数で第二の複製開始点でも始まり、そしてベク
ターの有する遺伝子の異種遺伝子産物の大量生産が誘導
される。

【００１１】第二の態様において本発明は、複製開始点
とその関連するＤＮＡ配列（複製開始点又はその近辺で
複合体を形成することによりＤＮＡ複製を開始させるプ
ライマー又は開始因子を（たとえばポリペプチド）を与
える（ＲＮＡの遺伝暗号を有する）より成る複製系を含
有するＤＮＡベクターを与える。ただしここでＲＮＡの
転写は直接コントロール可能であり、このベクターを含
有する宿主細胞を選択した条件下で増殖させると複製開
始点から大コピー数の複製が始まり、ベクターにより暗
号化されている大量の異種遺伝子産物の産生が始まる。
本発明の第一の態様の第二の複製系は、本発明の第二の
態様に特定された系であることが好ましい。

【００１２】本発明は又、第二の複製系の遺伝暗号を有
するＤＮＡ配列に、第二の複製開始点での複製の直接の
コントロールを可能にさせるＤＮＡ配列を含有させるこ
とより成る、第一の態様のベクターの調製方法を含む。
本発明の第一の態様のベクターの調製方法は、第一の複
製開始点より成る複製系の遺伝暗号を有する最初のＤＮ
Ａ配列を、第二の複製系の遺伝暗号を有する第二のＤＮ
Ａ配列と結合させることより成る方法が適当である。第
二の複製開始点での複製の直接的なコントロールを可能
にするＤＮＡ配列の、第二のＤＮＡ配列への導入は、最
初のＤＮＡ配列との結合の前でも後でもよい。本発明は
さらに、ＲＮＡの転写をコントロールして第二の複製開
始点での複製のコントロールを可能にするＤＮＡ配列を
第二のＤＮＡ配列に含有させることより成る、本発明の
第二の態様ベクターの調製方法を供する。

【００１３】本発明はさらに、第二の態様のベクター
（ポリペプチド、蛋白又は他の遺伝子産物の産生のため
の遺伝暗号を有する遺伝子配列を含有する）で宿主細胞
を形質転換させ、形質転換した細胞を、主に及び好まし
くは全面的に第一の複製開始点から小コピー数で複製の
始まる第一の条件で増殖させ、次にこの形質転換した細
胞を第２の複製開始点からも（又は第二の複製開始点か
らのみ）大コピー数で複製の始まる第二の条件で増殖さ
せ、ポリペプチド、蛋白又は他の遺伝子産物の発現を誘
導することより成る、ポリペプチド、蛋白又は他の遺伝
子産物の産生方法を含有する。

【００１４】本発明の方法により、形質転換させた細胞
を、ベクターが小コピー数で複製した大コピー数ベクタ
ーに関連する不安定性の問題を避ける条件で増殖させ、
次にベクターが大コピー数で複製し同時にポリペプチ
ド、蛋白又は他の産物が高収率で産生される別の条件で
増殖させて、ポリペプチド、蛋白又は他の産物の経済的
生産に必要な大量培養が与えられる。特に遺伝子産物の
発現が細胞質レベルのリプレッサーにより制御されるプ
ロモーターにコントロールされている時、ベクターのコ
ピー数が増加するリプレッサーによるコントロールが除
かれ遺伝子産物が大量に発現されることが見出された。
これはリプレッサーの合成が自己制御されている時（た
とえばプロモーター／リプレッサー系がトリプトファン
オペロンのものである時）でさえ当てはまる。

【００１５】本発明のベクターのコピー数のコントロー
ルに用いるコントロール系は、組換えＤＮＡ技術におけ
る複製（及び／又は発現）のコントロールにつき公知の
コントロール系のいかなる方法を用いてもよい。特にコ
ントロール可能な複製開始点のコピー数は、温度又は１
つ又は２つ以上の代謝物又は代謝物類似化合物によりコ
ントロールし得る。使用可能な代謝物依存系の例として
は、トリプトファン、ラクトース、ガラクトース、アラ
ビノース又は他の任意の代謝物又は代謝物類似化合物が
あり、これらの存在、除去さらには代謝はあるプロモー
ターからの転写を活性化するのに使用し得る。

【００１６】本発明のベクターに使用されるコントロー
ル可能な複製系は、ＣｏｌＥ１様プラスミッド（たとえ
ばｐＡＴ１５３，ＮＴＰ１，ＣｌｏＤＦ１３，ＲＳＦ１
０３０又はＰ１５Ａ）などの大コピー数のクローニング
ベクターに由来し、これらは複製開始点又はその近辺で
複合体を形成することによりＤＮＡ複製を開始するプラ
イマーを与えるＲＮＡ II 又は類似のＲＮＡの転写を含
むコピー数コントロール系を有する。さらにその複製が
ｍＲＮＡ及び／又はその生成物によりコントロールされ
る他のプラスミッドの複製開始点は、本発明のベクター
に使用されるコントロール可能な複製系を与える。この
ような複製開始点はＲ１，Ｒ６，Ｒ１００，ｒｐ４など
のグラム陰性細菌、又はＰＵＢ１００，ＰＣ１９４など
のグラム陽性細菌、及びいくつかの他のブドウ球菌プラ
スミッドより得られる。さらにたとえばλ，Ｔ３，Ｔ
４，Ｔ７，Ｍ１３，φＸ１７４，ＳＰＰ１，ＳＰＯ２な
どのバクテリオファージの複製開始点を二次性コントロ
ール可能複製開始点として使うこともできる。

【００１７】本発明の重要な態様において、コントロー
ル可能な複製系はＲＮＡの転写を促進する天然のプロモ
ーターを、Ｐ_L プロモーター，Ｐ_R プロモーター，Ｐ_re
プロモーター，Ｐ' _R プロモーター，Ｔ₇ ｌａｔｅプロ
モーター，ｔｒｐプロモーター，ｔａｃプロモーター，
ｌａｃプロモーター，ｇａｌプロモーター，ａｒａプロ
モーター、又はｒｅｃＡプロモーターなどのコントロー
ル可能なプロモーターにより置換することにより、その
ような大コピー数クローニングベクターから調製される
（このような系の複製開始点は「ハイブリッド開始点」
と呼ばれる）。あるいは天然のプロモーターを使い、オ
ペレーター配列（たとえばｌａｃオペレーター、又はラ
ムダファージのＯ_L 又はＯ_R オペレーター）などの制御
機能を複製系に導入することにより、ＲＮＡの転写がコ
ントロール可能となる。

【００１８】プラスミッドｐＭＧ９（ケイ・タッチエル
（Ｋ Ｔａｔｃｈｅｌｌ）ら、「セル」ｃｅｌｌ，第２
７巻、２５−３５頁、１９８１年１１月号（第２部）に
記載の方法により挿入されたＸｈｏエリンカーＤＮＡ配
列を含有する）はＣｏｌ Ｅ１複製開始点に基づくコン
トロール可能な複製系の調製用の便利な出発物質を与え
る。このプラスミッドはＲＮＡ II の転写の遺伝暗号を
有する配列の出発点の近くにＸｈｏＩ制限部位を有して
おり、これはオペレーターやコントロール可能なプロモ
ーター配列（たとえばλＰ_L ）を挿入して直接コントロ
ール可能な複製系を得るのに用いることが可能であるこ
とを本発明者らは見出した。プラスミッドｐＭＧ９はナ
ショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー，
セントラル・パブリック・ヘルス・ラボラトリイ（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｕｂｌｉｃ
Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（Ｃｏｌｉｎｄ
ａｌｅ Ａｎｅｎｕｅ，Ｌｏｎｄｏｎ ＮＷ９ ５Ｈ
Ｔ）に１９８３年３月２４日に、プラスミッドｐＭＧ９
を含有する大腸菌Ｋ１２、ＤＨ１株の培養細胞としてＮ
ＣＴＣ１１５３９番で寄託した。

【００１９】第一の複製開始点より成る複製系は、任意
の適当な小コピー数のプラスミッドから得られる。たと
えばｐＳＣ１０１複製開始点より成る複製系を用いるこ
とも可能であり、プラスミッドｐＨＳＧ４１５（テイー
・ハシモトおよびゴトー（Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇ
ｏｔｏｈ）ら、「ジーン」Ｇｅｎｅ、第１６巻、１９８
１年、２２７−２３５頁）はそのような複製系の便利な
供給源を与える。ｐＨＳＧ４１５の複製開始点は温度感
受性であるが、これは温度に対して安定である野生型の
ｐＳＣ１０１の複製開始点で置換が可能である。しか
し、ｐＨＳＧ４１５は後述する実施例で使用するのに、
便利な温度感受性の複製開始点を与える。

【００２０】当業者に公知の技術を使って、コントロー
ル可能な機能を大コピー数複製系に導入し、大コピー数
複製系と小コピー数複製系を結合させ、ベクターに外来
遺伝子を導入することにより、本発明のベクターを作る
ことができる。次に得られたベクターを、標準的な方法
を用いて適当な宿主細胞を形質転換させるのに用い、異
種ポリペプチド、蛋白及び他の生産物を得ることができ
る。宿主細胞はＳ．セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅ ｖｉ
ｓｉａｅ）などの酵母を含む真核細胞、又はさらに一般
的には枯草菌（Ｂ．ｓｕｌｔｉｌｉｓ）又は特に大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌でもよい。

【００２１】

【実施例】以下の実施例（実施例１−７）において本発
明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は本発明の
複製開始点を２個有する具体的なプラスミッドの作成に
関し、又コピー数コントロール、不均一な遺伝子発現そ
してこれらのプラスミッドの安定性の研究に関する。し
かし、本発明はここに記載する具体的なプラスミッドや
方法に限定されるものではない。 実施例１ コピー数がＰｌにコントロールされている複製開始点を
２個有するプラスミッドの作成 （ａ）複製開始点を２個有するプラスミッドｐＭＧ４０
４の作成 プラスミッドｐＭＧ１５（第１）は、複製開始点領域
（表１）にＸｈｏ I リンカー（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）が
挿入（タッチエル（Ｔａｔｃｈｅｌｌ）ら、１９８１
年）されているため構成的に大コピー数（染色体１個当
り約３００コピー）のＲＳａ−１２（ｐＢＲ３２２レプ
リコン）の誘導体である。ＲＳａ−１２の作成中にｔｅ
ｔ遺伝子におけるＳａｌ Ｉ部位を越える消然消失によ
りｒｏｐ遺伝子は消失したがＢａｍ ＨＩ部位は保持さ
れた。ｐＭＧ１５の１．１ｋｂのＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ
ＨＩ ＤＮＡ断片をバクテリオファージＭ１３ｍｐ８に
挿入し、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らの方法（１９７７
年）によりＸｈｏ Ｉ部位からＤＮＡ配列を決定するこ
とにより、Ｘｈｏ I リンカーの位置を決定した。

【００２２】リンカーの挿入部位はＲＮＡ II の転写開
始部位から３０塩基分下流のところにあった（表１）。
このＸｈｏ I リンカーはＲＮＡ II 転写の５’末端に
近いユニークな切断部位を与え、ｐＭＧ１５から単離し
た１．１ｋｂのＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片はプロモ
ーターのないＲＮＡ II 配列を有していた（図１）。別
のプロモーターに結合させた時この配列がＤＮＡ複製の
プライマーとして機能するか否かを調べるため、この
１．１ｋｂ断片をプラスミッドｐＨＳＧ４１５のＫｍ耐
性遺伝子（Ｋｍ^R ）プロモーター（ハシモトおよびゴト
ーＨａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈら、１９８１年）の
下流に挿入した（図１）。ｐＨＳＧ４１５は安定な小コ
ピー数のＡｐ^R Ｋｍ^R Ｃｍ^R プラスミッドでありその複
製開始点はｐＳＣ１０１に由来する。このプラスミッド
は３０℃で複製するが４２℃では複製しない。

【００２３】

【表１】 表１ 複製開始点近くのＸｈｏ I リンカーの挿入部位

【００２４】制限酵素による消化、ＤＮＡの結合、及び
アガロースゲル電気泳動の条件はマニアテイス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）ら（１９８２年）が記載した方法を使用し
た。ｐＭＧ１５からのＸｈｏ I−Ｂａｍ ＨＩ断片の挿
入、Ｋｍ^R プロモーターへのプロモーターのないＲＮＡ
II 配列の結合により、複製開始点を２個有するプラス
ミッドｐＭＧ４０４が得られた（図１）。制限酵素消化
による解析によりプラスミッドｐＭＧ４０４の構造は証
明され（結果は示していない）、プラスミッドＤＮＡの
収率からそのコピー数はｐＨＳＧ４１５よりかなり多い
ことが証明された。さらにｐＭＧ４０４は細菌中で４２
℃で維持されたが、ｐＨＳＧ４１５はこの温度での複製
は不可能なため消失した。ハイブリッドである「Ｃｏｌ
Ｅ１」複製開始点はｐＭＧ４０４中で機能しておりＫ
ｍ^R 遺伝子プロモーターはＲＮＡII プロモーターに代
わり得ることを示していると結論された。ｐＭＧ４０４
をＢａｌ Ｉで消化し、ハイブリッド複製開始点のみを
含有する大きい方の断片を再び環状化させることによ
り、ハイブリッド複製開始点が機能していることを確認
した。これにより３０℃と４２℃の両方で自律複製が可
能なプラスミッドｐＭＧ４１０が得られ、ハイブリッド
複製開始点が機能していることが証明された。

【００２５】（ｂ）複製開始点を２個有するｐＭＧ４１
１の作成 プラスミッドｐＭＧ４０４は２個の複製開始点を有す
る：ｐＳＧ１０１の小コピー数複製開始点と「Ｃｏｌ
Ｅ１」ハイブリッド複製開始点・ｐＳＣ１０１の複製開
始点により３０℃におけるプラスミッドの安定な複製が
確保され（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈら、１９８
１年）、コントロール可能なプロモーターにより作動さ
れる「Ｃｏｌ Ｅ１」ハイブリッド複製開始点を有する
誘導体の作成が可能になる。バクテリオファージλのＰ
１プロモーターを有する０．５ｋｂのＳａｌ I−Ｅｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片をプラスミッドｐＣＴ１０５０（図
１）から単離し（図１）、ｐＭＧ４０４からの５．５ｋ
ｂのＥｃｏ ＲＩ−Ｘｈｏ I断片と結合させた。この結
合混液を用いて大腸菌ＱＹ７（λｃＩ₈₅₇ 欠陥溶原菌）
とＤＨ 1を３０℃で形質転換させ、Ａｐ^R 形質転換体を
Ｃｍ^s クローンについてスクリーニングした。このうち
の１つのｐＭＧ４１１を以後の研究に選んだ（図１）。
ＤＨ 1とＱＹ 7のプラスミッドｐＭＧ４１１の形質転換
体は選択された条件下で充分増殖し、種々の増殖温度で
コピー数の測定を行なった。

【００２６】（ｃ）ｐＭＧ４１１のコピー数測定 ２種類の方法によりプラスミッドのコピー数を求めた。
１つの方法は塩化セシウム遠心分離による染色体ＤＮＡ
と超コイルＤＮＡの分離に依存する。第二の方法はアガ
ロースゲル電気泳動による染色体ＤＮＡとプラスミッド
ＤＮＡの分離に依存する。アンピシリンを含有するＬ−
ブロース中で細胞を一晩増殖させ、アンピシリンを含有
する最小Ｍ９塩中へ１００倍希釈した。ＯＤ₆₆₀ ＝０．
５のところで２−デオキシアデノシン（２００μｇ／m
l）チミジン（１μｇ／ml）、及び〔³ Ｈ〕−チミジン
（４μｇＣｉ／ml）を加え、インキュベーションを２時
間続けた。細胞を遠心分離し洗浄し、等量の５０ｍＭト
リスＨＣｌ pＨ７．５、１０％ショ糖（ｗ／ｖ）及びリ
ゾチーム（２００μｇ／ml）中に再浮遊させた。０℃で
１０分間インキュベーション後ＥＤＴＡを１０ｍＭにな
るように加え、インキュベーションを１０分間続け、最
後にサルコジル（０．４５ｗ／ｖ）を加えた。溶解液中
の染色体ＤＮＡを１９ゲージの針の中を６回通過させて
剪断変形させ、細胞破片を遠心分離で除去した。ＤＮＡ
調製液をさらに１回のフェノールとクロロホルムの抽出
及びエタノールの沈澱により精製した。この標識したＤ
ＮＡ調製液を用いて２つの方法によるコピー数の定量を
行なった。

【００２７】アガロースゲル法については、試料を０．
７％アガロースゲル（０．０４Ｎトリスアセテート、
０．００１ＭＥＤＴＡ、 pＨ７．９中）上で５０Ｖで１
２時間電気泳動を行なった。臭化エチジウムで染色して
ＤＮＡバンドを肉眼で見えるようにした。染色体ＤＮＡ
とプラスミッドＤＮＡバンドをゲルから切り取り、飽和
ヨウ化ナトリウムに溶解させ、１０％（ｗ／ｖ）トリク
ロロ酢酸（ＴＡＣ）を加えてＤＮＡを沈澱させた。沈澱
物をＧＦ／Ｃワットマン濾紙上に集め、１０％（ｗ／
ｖ）ＴＣＡ、エタノールで洗い風乾した。液体シンチレ
ーションカウンター中で放射能を計測定量した。塩化セ
シウム遠心分離法によるコピー数測定については、ＤＮ
Ａを塩化セシウム−臭化エチジウム中ベックマンＴＩ
５０ローター中で４８，０００ｒｐｍで２４時間遠心分
離し平衡化させた。この濃度勾配液を分別し、各画分を
ＴＣＡでＧＦ／Ｃワットマン濾紙上に沈澱させ、洗浄し
上記したように処理した。３０℃、３７℃及び４２℃で
ｐＭＧ１５，ｐＡＴ１５３，及びｐＭＧ４１１からプラ
スミッドコピー数を測定し、得られた結果を表２に示
す。

【００２８】

【表２】 表２ プラスミッドコピー数の温度による変化 プラスミッド 細 菌 株 全ＤＮＡの比率 染色体１個当 （発育温度） りのコピー数 ｐＭＧ１５ ＨＢ１０１（３７℃） ３３ ３０９ ｐＡＴ１５３ ＨＢ１０１（３７℃） ５．８ ５９ ｐＭＧ４１１ ＱＹ７（３０℃） ０．７ ４ ｐＭＧ４１１ ＱＹ７（３７℃） １３．５ ７８ ｐＭＧ４１１ ＱＹ７（４２℃） ２４．８ １４３

【００２９】種々の温度でのＱＹ７株（λ溶原菌）での
ｐＭＧ４１１のコピー数の測定によりλリプレッサーは
ｐＭＧ４１１コピー数をコントロールしていることが証
明された。３０℃での増殖後はコピー数は染色体１個当
り４であったが、３７℃では７８に増加し、４２℃では
染色体１個当り１４３に増加した（表２）。ｐＭＧ４１
１中のハイブリッド「Ｃｏｌ Ｅ１」複製開始点はλリ
プレッサーを不活性化することによりスイッチがはいる
ことを示すために、ＱＹ７の形質転換体を３０℃で増殖
させ、次に指数増殖中に温度を４２℃に上げた。プラス
ミッドコピー数の増加後培養菌１mlから単離したＤＮＡ
のアガロースゲル分析を行なった（図２）。試料は７時
間にわたって１時間毎に採取した。予想通り７時間にわ
たってｐＭＧ４１１のコピー数の増加が観察された。

【００３０】実施例２ Ｐｒにコントロールされる誘導可能なコピー数を有す
る、複製開始点を２個有するプラスミッドの作成 （ａ）複製開始点を２個有するプラスミッドｐＭＧ１５
９とｐＭＧ１６５の作成プラスミッドｐＭＧ４１１は小
コピー数の複製開始点ｐＳＣ１０１と、Ｐ１に作動され
るＣｏｌ Ｅ１複製開始点の２個の複製開始点を有す
る。コピー数コントロールにはリプレッサー遺伝子であ
るｃＩ₈₅₇ が必要なため、ｐＭＧの溶原性細菌株への使
用を制限している。この制限を克服するためｃＩ₈₅₇ を
有する複製開始点を２個持つプラスミッドを作成した。

【００３１】まず第一に外来遺伝子の以後のクローニン
グを容易にするためにＳａｌ IとＨｉｎｄ IIIの制限部
位より成るオリゴヌクレオチドを、ｐＭＧ４１１のハイ
ブリッド複製開始点のすぐ下流のＢａｍ ＨＩ部位に挿
入した。こうしてｐＭＧ１５３が得られた（図３）。ｐ
ＭＧ１５３の５．９ｋｂのＥｃｏ ＲＩ−Ｂａｍ ＨＩ
断片を精製し、ｐＣＱＶ２（クイーン（Ｑｕｅｅｎ）、
１９８３年）の１．１ｋｂのＥｃｏ ＲＩ−Ｂａｍ Ｈ
Ｉ断片に結合させてｐＭＧ１５９を得た。ｐＣＱＶ２の
Ｅｃｏ ＲＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片はＰｒ及びｃＩ₅₅₇ 遺
伝子共に有しており、ｐＭＧ１５３に挿入するとＰ１含
有断片と置き換わり、Ｃｏｌ Ｅ１複製開始調ＲＮＡ I
I 配列をＰｒと融合させる。リプレッサー遺伝子は複製
開始点から離れる方向へ転写されることに注意（図
３）。この複製開始点を２個有するベクターを３０℃に
維持したときのプラスミッドの安定化（下記参照）を増
加させるために、複製開始点、複製蛋白、及びｐａｒ配
列を有するｐＳＣ１０１の２．８５ｋｂ Ｈｉｎｃ II
断片をｐＭＧ１５９に導入し、３．２５ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ−Ｂａｌ I 断片を、一端にＥｃｏ ＲＩリンカーを
有するｐＳＣ１０１のＨｉｎｃ II 断片で置換した。こ
うしてｐＭＧ１６５が得られた。（図３）。

【００３２】（ｂ）Ｐｒに作動される複製開始点を２個
有するプラスミッドのコピー数のコントロール Ｐｒによって作動される「Ｃｏｌ Ｅ１」ハイブリッド
複製開始点はクローン化したｃＩ₈₅₇ 遺伝子から発現さ
れる温度感受性リプレッサーによりコントロールされる
ことを証明するために、ｐＭＧ１５９とｐＭＧ１６５を
大腸菌Ｅ１０３（Ｓ）に導入した。３０℃におけるコピ
ー数の測定は前記した如く、³ Ｈ−チミジン標識細胞か
ら行なった（表３）。４２℃への温度変更後のコピー数
の誘導をアガロースゲル電気泳動で追跡した。Ｌ−ブロ
ース中のコピー数の変化と誘導の動力学を定量するため
に「スポット」ハイブリダイゼーション法を使用した。

【００３３】

【表３】 表３ プラスミッドコピー数の温度による変動 プラスミッド 細 菌 株 染色体１個当り （増殖温度） のコピー ｐＭＧ１５９ Ｅ１０３（Ｓ）（３０℃） ３−４ ｐＭＧ１６５ Ｅ１０３（Ｓ）（３０℃） ３−４ ｐＭＧ１５９ Ｅ１０３（Ｓ）（４２℃） 〜３２０ ｐＭＧ１６５ Ｅ１０３（Ｓ）（４２℃） 〜２４８

【００３４】「スポット」ハイブリダイゼーション用
に、ニックトランスレーション法（マニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年）により³²ｐ−標識プロ
ーブＤＮＡを調製した。温度変更後の種々の時間に採取
した１mlの培養菌からアルカリ溶解法（アイシュ−ホロ
ウィッツおよびバーク（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ａ
ｎｄ Ｂｕｒｋｅ）、１９８１年によりＤＮＡ試料を調
製した。ＤＮＡ調製試料をＲＮａｓｅで３７℃５分処理
した後、制限酵素Ｂａｍ ＨＩで３０分インキュベーシ
ョンし、１００℃で３分間熱変性させた。異なる量の消
化したＤＮＡ調製液をニトロセルロースフィルター上に
スポットし、これを７０℃で乾燥し次に２×ＳＳＣ／５
０％ホルムアミド中３７℃で変性したプローブＤＮＡと
一晩（１５時間）ハイブリダイズさせた。次に２×ＳＳ
Ｃ／５０％ホルムアミド中でフィルターを２回洗浄し、
２×ＳＳＣ中で１回洗浄した後風乾した。液体シンチレ
ーションカウンター中で放射能を測定した。得られた値
を誘導中の細胞増殖量により補正し、誘導しない時の値
に対するコピー数の変化の大きさを測定した。

【００３５】ｐＭＧ１５９及びｐＭＧ１６５共に４２℃
に温度変更し、続けて３７℃でインキュベーションした
とき、急速なコピー数の誘導を示した。誘導しないとき
染色体１個当り３−４コピーであっものが、２時間の誘
導後に９０−１００コピーに増加し、４−５時間後には
３００−４００コピーに増加しており、これはクローン
化ＰｒプロモーターとｃＩ₈₅₇ 遺伝子によりコピー数が
コントロールされていることを明白に証明している。

【００３６】実施例３ Ｐｔｒｐにコントロールされる誘導可能なコピー数を有
する複製開始点を２個有するプラスミッドの作成 コントロール可能なコピー数を有する複製開始点を２個
有するプラスミッドの上記２例では誘導に温度を使用し
たが、本例では代謝物を用いてコピー数をコントロール
している。ｐＭＧ４１１の６．２ｋｂのＨｉｎｄ III−
Ｂｇｌ II 断片を、標準緩衝液と標準方法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、１９８２年）を用いてｐＣＴ５４の０．６５
ｋｂ Ｈｉｎｄ III−Ｂａｍ ＨＩ断片と結合させた
（図５）。このプラスミッドはアンピシリンの選択下及
び培地にトリプトファンが存在（これはＰｔｒｐからの
転写を抑制するはずである）した場合も不安定であっ
た。この不安定性の原因はＰｔｒｐからの転写を完全に
抑制することができず大コピー数になると結論づけた。
複製開始点を通る転写を減少させるためにＰｔｒｐと
「Ｃａｌ Ｅ１」複製開始点配列の間に転写停止物質を
挿入した。このような転写停止物質は転写のレベルを約
１０倍減少させる。早期転写停止物質を有する、バクテ
リオファージＴ７ ＤＮＡからの１８０ｂｐ Ａｌｕ 1
をＤＮＡリンカーに結合させ、末端をＨｉｎｄ III認識
部位に変えた（エムタージイ（Ｅｍｔａｇｅ）ら、１９
８３年）。次にこの断片をＨｉｎｄ IIIで消化したｐＭ
Ｇ４２６ ＤＮＡに結合させてｐＭＧ４２７を得た（図
５）。ｐＭＧ４２７はｐＭＧ４２６よりも安定であり、
形質転換体をトリプトファン（１００μｇ／ml）を含有
する培地で増殖させたとき小コピー数を示した。この培
養菌をトリプトファン欠乏培地に移すとコピー数は急速
に増加した。これはＲＮＡ II 転写は代謝物又は外から
の培地中の化学物質の濃度によってコントロールし得る
ことを示しており、コピー数は温度以外の要因により変
化させ得ることを証明している。

【００３７】実施例４ 「ｔａｃ」プロモーターにコントロールされる誘導可能
なコピー数を有する複製開始点を２個有するプラスミッ
ドの作成 本例では、ＲＮＡ II プロモーターをｔａｃプロモータ
ー（Ｐｔａｃ）（ラッセルおよびベネット（Ｒｕｓｓｅ
ｌｌ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔ）、１９８２年）により置
換することによりコピー数がラクトース又はラクトース
類似化合物の添加又は除去によりコントロールされるよ
うにしたベクターを作成した。Ｐｔａｃを有する１２１
ｂｐ Ｂａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＩのＤＮＡ断片をｐＤ
Ｒ５４０より精製した。この断片をＢａｍ ＨＩ−Ｅｃ
ｏ ＲＩで消化したｐＭＧ４０４ＤＮＡに結合させ、大
腸菌ＤＨ 1のアンピリシン耐性、クロラムフェニコール
感受性形質転換体を単離した。このような形質転換体の
ひとつからプラスミッドＤＮＡを単離し制限酵素により
解析した結果、クロラムフェニコール耐性遺伝子中に１
２１ｂｐ断片が挿入されていることが証明された（ｐＭ
Ｇ４２１）（図６）。ｐＭＧ４２１ ＤＮＡをＢａｍ
ＨＩで消化し、子牛腸アルカリフォスファターゼで処理
し、ｐＭＧ４１１から単離した１．２ｋｂのＢａｍ Ｈ
Ｉのプロモーターのない複製開始点に結合させた。形質
転換混液を３０℃又は４２℃で広げると、大腸菌ＤＨ 1
のアンピシリン耐性形質転換体が得られた。４２℃では
小コピー数複製開始点は活性がなかった。この形質転換
体から２つのかけ離れたプラスミッド型が同定された
（ｐＭＧ４１５とｐＭＧ４１６）（図６）。ｐＭＧ４１
５は正しい方向に（Ｐｔａｃの下流に）単一のＢａｍ
ＨＩ複製開始点断片を有しており、一方ｐＭＧ４１６は
複製開始点断片が３つそのまま繰返しの形で、これもＰ
ｔａｃからの発現の方向を向いていた（図６）。

【００３８】プラスミッドｐＭＧ４１５とｐＭＧ４１６
を導入して大腸菌Ｄ９００（ｌａｃＩｓｑ）とした。こ
れはＰｔａｃプロモーターのコントロール要素であるｌ
ａｃリプレッサーを過剰に産生する。ラクトース類似化
合物であるＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）
を添加することによりＰｔａｃを誘導し得る。Ｌ−ブロ
ース中で増殖させたＤ９００のｐＭＧ４１５形質転換体
はアガロースゲル電気泳動で測定すると小コピー数であ
ったが、これはＩＰＩＧを添加しても増加しなかった。
Ｌ−ブロース中で増殖させたＤ９００のｐＭＧ４１６形
質転換体は小コピー数であり、これは培養液にＩＰＩＧ
を添加すると急速に増加し、ＰｔａｃからのｐＭＧ４１
６のコピー数誘導がコントロール可能であることを示し
ている。

【００３９】実施例５ 複製開始点を２個有するプラスミッドにクローン化した
子牛の胃のｍｅｔプロキモシン遺伝子の発現 （ａ）ｐＭＧ１６８の作成 複製開始点を２個有するプラスミッドが大腸菌中のクロ
ーン化した不均一遺伝子の発現に有用であることを証明
するため、子牛のｍｅｔ−プロキモシン遺伝子を有する
プラスミッドを作成した。ｐＣＴ７０（Ｅｍｔａｇｅ
ら、１９８３年）をＨｉｎｄ IIIとＳａｌＩで消化し、
Ｐｔｒｐにコントロールされるｍｅｔ−プロキモシン遺
伝子を有する〜２．４ｋｂ断片を単離した。この断片を
ｐＭＧ１６５より単離した２つのＤＮＡ断片（５．６ｋ
ｂのＳａｌ I−Ｐｓｔ I 断片と１ｋｂのＨｉｎｄ III
−Ｐｓｔ I 断片）に結合させた（図３）。こうして大
腸菌ＤＨ 1の形質転換体より単離したプラスミッド（ｐ
ＭＧ１６８）は複製開始点の下流にクローン化した遺伝
子を有しており、Ｐｒを通過するいかなる転写もｍｅｔ
−プロキモシン遺伝子を追加転写することになる（図
３）。

【００４０】（ｂ）ｐＭＧ１６８からのｍｅｔ−プロキ
モシン蛋白の発現 ｐＭＧ１６８を大腸菌Ｅ１０３（Ｓ）に導入し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法によりｍｅｔ−プロキモシ
ンの発現を調べた。大腸菌Ｅ１０３（Ｓ）形質転換体を
Ｌ−ブロース中３０℃でＯＤ₆₀₀ ＝０．４になるまで増
殖させ４２℃に温度を変更した。次に培養菌を３７℃で
撹拌しながらインキュベートし、１時間毎に試料を採取
してコピー数と蛋白の発現を調べた。ＤＮＡコピー数は
ｐＭＧ１５９及びｐＭＧ１６５に記載した方法と同じ方
法で測定した。蛋白の分析用に、各培養試料を遠心分離
し、ペレットを集め停止緩衝液（１％ＳＤＳ、１０ｍＭ
トリスＨＣｌ、 pＨ７．５）と、等量の試料緩衝液
（０．１２％トリスＨＣｌ、 pＨ６．８、２０％グリセ
ロール、１．２Ｍβ−メルカプトエタノール、６％ＳＤ
Ｓ）に再浮遊させ、３分間沸騰させた。ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、染色及び脱色法は基本的にＭａｎｉ
ａｔｉｓら（１９８２年）が記載した方法と同じであ
る。ジョイス・レーベル（Ｊｏｙｃｅ Ｌｏｅｂｌ）社
のクロモスキャン（Ｃｈｒｏｍｏｓｃａｎ）を用いて５
３０mmで、染色したポリアクリルアミドゲルをスキャン
した。温度を３０℃から４２℃に変更するとプラスミッ
ドコピー数とｍｅｔ−プロキモシン蛋白濃度も著しく増
加した（表４、図４と図７）。

【００４１】３７℃でのインキュベーション後の９０分
間にコピー数は急速に増加したが、ｍｅｔ−プロキモシ
ンの蓄積はもっとゆるやかであった。ポリアクリルアミ
ドゲルのスキャンから、温度変更後４−５時間までに組
換え遺伝子産物は全抽出可能蛋白の少なくとも１０％ま
で蓄積した。ｐＭＧ１６８の誘導されたコピー数は、複
製開始点を２個有する親のプラスミッド（ｐＭＧ１６
５）より少なかったが、それでも染色体１個当り３−４
から１２０−１５０まで増加した。ｐＭＧ１６８は誘導
後細胞生存率が低下したがｐＭＧ１６５では変化はなか
った。この生存率の減少は組換え遺伝子産物が毒性が出
る量まで蓄積したためであると結論づけた。

【００４２】

【表４】 表４ ｍｅｔ−プロキモシン遺伝子発現の増加 ３７℃で誘導後の時間 ｍｅｔ−プロキモシンとして （ｈｒｓ） の総蛋白中の割合 ０ ＜０．５ ３ ７．０８^a ４ ９．０９^a ５ １０．２５^a ａ）これらはゲルのスキャンからの測定値である。誘導
しない場合の蛋白の量はこの方法では正確に測定できな
い。

【００４３】実施例６ 複製開始点を２個有するプラスミッドにクローン化させ
たクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子の発現 （ａ）ｐＭＧ１６０の作成 ポリアクリルアミドゲル上の染色した蛋白を正確に測定
することは限界があるため、複製開始点を２個有するベ
クター上のクローン化遺伝子の発現を、プラスミッドｐ
ＭＧ１６９のコピー数誘導後のクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ活性の増加を測定することに
より、さらに定量した。精製したＨｉｎｄ IV −Ｓａｌ
Ｉ断片はＰｔｒｐ（図３）にコントロールされるクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの構造遺伝
子を有していることを除いては、ｐＭＧ１６８（実施例
５）の作成と同様の方法でｐＭＧ１６５よりプラスミッ
ドｐＭＧ１６９を作った。

【００４４】（ｂ）クローン化したクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼの発現ｐＭＧ１６９を大
腸菌Ｅ１０３（Ｓ）に導入し、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ濃度をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法と酵素定量法（ショー（Ｓｈａｗ），１９
７５年）で測定した。実施例５のｐＭＧ１６８形質転換
体について記載したように、大腸菌Ｅ１０３（Ｓ）形質
変換体を増殖させ４２℃に温度を変更して誘導し、３７
℃でインキュベーションを続けた。一時間毎に試料を採
取しプラスミッドコピー数を定量し（図４，図８）、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの比活
性を定量し（Ｓｈａｗ，１９７５年、「リード・アンド
・ノルソコート」Ｒｅａｄ ａｎｄ Ｎｏｒｔｈｏｃｏ
ｔｅ，１９８１年）（図８，表５）、そして試料をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた（図９）。このプ
ラスミッドコピー数はｐＭＧ１６８と類似の動力学的変
化を示し、類似の絶対値を有していた（図４）。クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性は、コ
ピー数誘導の結果粗抽出液中の酵素の比活性は約８０倍
増加したことを証明していた（図３）。クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼとして存在している
抽出可能な蛋白の比率は、純粋な蛋白の比活性から計算
した（表５）。ｐＭＧ１６９からの誘導されないときの
発現した量は０．２５％抽出蛋白であり、６時間の誘導
後はこれが２１．９％に増加した。

【００４５】

【表５】 表５ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ 比活性の上昇 ３７℃で誘導後の時間 クロラムフェニコールアセチルトランス （ｈｒｓ） フェラーゼとしての総蛋白中の割合 ^a) ０ ０．２５ １ ５．６ ２ １５．５ ３ １８．１ ４ １８．５ ５ ２１．４ ６ ２１．９ ７ ２０．９ ａ）これらの値は純粋なクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼの既知の比活性（１９５単位／mg蛋
白）から計算した。

【００４６】実施例７ 複製開始点を２個有するプラスミッドのプラスミッド安
定性試験 プラスミッドｐＭＧ１６５とｐＭＧ１６８を大腸菌ＲＶ
３０８に導入し、ｐＭＧ１６８は大腸菌Ｅ１０３（Ｓ）
に導入し、抗生物質は添加せずケモスタット（ｃｈｅｍ
ｏｓｔａｔ）増殖条件下で３０℃で安定性の試験をし
た。全ての実験は、抗生物質含有寒天平板から採取し、
金属製のバネの邪魔板のついた２５０ml用の円錐フラス
コ中の１００mlのＬ−ブロース中に植菌した適当な大腸
菌株の単一コロニーから出発した。静止期に達するまで
培養菌を回転（ｏｒｂｉｔａｌ）シェーカー（３７℃，
２４０ｒｐｍ）中で培養した。細胞を集め、無菌の合成
培地（グルコースを抜いてある）中に浮遊し、発酵容器
中に植菌した。合成培地の組成はグルコース４ｇ／リッ
トル；〔ＮＨ₄ ／₂ ＳＯ₄ ５ｇ／リットル；Ｎａ₂ ＨＰ
Ｏ₄ ７ｇ／リットル；ＫＨ₂ ＰＯ₄ ３ｇ／リットル；プ
ロリン２００mg／リットル；ロイシン，１００mg／リッ
トル；チアミン１０mg／リットル；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ２００mg／リットル，ＣａＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ，５mg／
リットル，ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２０mg／リットル，Ｍ
ｎＳＯ₄ ・４Ｈ₂ Ｏ２mg／リットル；ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ
₂ Ｏ，５mg／リットル，ＣｏＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ，０．５
mg／リットル；ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ１００mg／リット
ル；ＮａＣｌ ２００mg／リットル；ＥＤＴＡ Ｎａ₂
６００mg／リットル；ＮａＯＨ１５０mg／リットル〕。

【００４７】特に明記してない場合はこの培地にトリプ
トファンを１００mg／リットルを捕促した。培地中泡消
剤（ポリプロピレン−グリコール２０００）は０．００
１５ｖ／ｖで存在した。発酵槽の細胞密度は、菌体量が
培地で維持できる量の少なくとも６０％になるまで閉鎖
系として増殖させた。次にポンプのスイッチを入れ、系
をケモスタット（ｃｈｅｍｏｓｔａｔ）として培養し
た。発酵槽中の全菌体量が一定になったとき、初期の遷
移増殖期は止まったと仮定し、次に式ｎ（世代数）＝μ
ｔ／ｌｎ２（式中μ＝増殖速度であり、定常状態での希
釈速度に等しく、ｔ＝時間である）から定常状態での世
代数を計算した。

【００４８】連続培養から試料を採取し、希釈しＬ−寒
天培地に広げた。１００個の単一コロニーを取り、抗生
物質を捕促した寒天培地とコントロールとしてのＬ−寒
天培地に移した。抗生物質に対し耐性のコロニー数を、
Ｌ−寒天平板に増殖している数のパーセントとして表わ
し、これをプラスミッドを有する集団の比率と考えた。
周期的に試料を取り、プラスミッドＤＮＡ調製液を作
り、大きな変化があるか否か調べた。大腸菌ＲＶ３０８
中のｐＭＧ１６５とｐＭＧ１６８の安定性のケモスタッ
トによる解析から、これらのプラスミッドはトリプトフ
ァンを加えた培地中で少なくとも６８世代（表６）安定
であることが証明された。これらの条件下ではｐＭＧ１
６８上のｍｅｔ−プロキモシン遺伝子の転写は抑制され
ていた。

【００４９】

【表６】 表６ プラスミッド安定性 大腸菌株 プラスミッド 安定性 世 代 数 ％ ＋Ｔｒｐ −Ｔｒｐ ＲＶ３０８ ｐＭＧ１６５ １００ ７２．５ ３０ ＲＶ３０８ ｐＭＧ１６８ １００ ６８ ３０ Ｅ１０３（Ｓ） ｐＭＧ１６８ １００ ２０ −

【００５０】トリプトファンがない場合の増殖の安定性
解析はまだ進行中であるが、３０世代後もプラスミッド
の消失は認められない。大腸菌Ｅ１０３（Ｓ）中のｐＭ
Ｇ１６８の安定性解析も進行中であるが、２０世代後も
プラスミッドの消失は認められなかった。複製開始点を
２個有するプラスミッドは、小コピー数でＤＮＡ複製が
ｐａｒ⁺ ，ｐＳＣ１０１複製開始点から指示される条件
下では安定なようである。

【００５１】文献 エムタージィ・ジェイ・エス，アルガル，エス・ドエ
ル，エム・ティー・ハリス，ティー・ジェイ・アール，
ジェンキンス，ビー・リリー・ジィーおよびロウ・ピー
・エイ（Ｅｍｔａｇｅ，Ｊ．Ｓ，Ａｎｇａｌ，Ｓ，Ｄｏ
ｅｌ，Ｍ．Ｔ，Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｊ．Ｒ，Ｊｅｎｋｉ
ｎｓ，Ｂ．Ｌｉｌｌｅｙ，Ｇ ａｎｄ Ｌｏｗｅ，Ｐ．
Ａ．），プロシーディング・ナチュラル・アキャミディ
・サイアンス（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ）ＵＳＡ第８０巻（１９８３年）３６７１−３６７５
頁。ハシモト−ゴトー，ティー・フランクリン，エフ・
シィー・エイチ・ノードハイム．エイおよびチミス・ケ
イ・エヌ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ，Ｆｒ
ａｎｋｌｉｎ，Ｆ．Ｃ．Ｈ，Ｎｏｒｄｈｅｉｍ，Ａ ａ
ｎｄ Ｔｉｍｍｉｓ，Ｋ．Ｎ．）「ジーン」Ｇｅｎｅ
第１６巻（１９８１年）２２７−２３５頁。アイシュ−
ホロウィッツ・ディーおよびバーク・ジェイ・エフ（Ｉ
ｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｄ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，
Ｊ．Ｆ．），「ニュークレイック アシッド リサー
チ」Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ 第９巻（１９８１
年）２９８９−２９９８頁。マニアティス・ティー，フ
リッチ・イー・エフおよびサンブルック・ジェイ（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、Ｔ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ ａｎｄ
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．），「モレキュラー クローニ
ング コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ィ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（１９８２年）。

【００５２】クイーン・シィー（Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．）
「ジャーナル・モレキュラー・アンド・アプライド・ジ
ーン」Ｊ Ｍｏｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅ
第２巻（１９８３年）１−１０頁。リード・エス・エ
ムおよびノースコート・ディー・エイチ（Ｒｅａｄ，
Ｓ．Ｍａｎｄ Ｎｏｒｔｈｃｏｔｅ，Ｄ．Ｈ．）「アナ
リティカル バイオケミストリー」Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ 第１１６巻（１９８１年）５３−
６４頁。ラッセル・ディー・アールおよびベネット・ジ
ィー・エヌ（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｒ ａｎｄ Ｂｅｎ
ｎｅｔｔ，Ｇ．Ｎ．）「ジーン」Ｇｅｎｅ 第２０巻
（１９８２年）２３１−２４３頁。サンガー・エフ，ニ
クルン・エスおよびカルスン・エイ・アール（Ｓａｎｇ
ｅｒ，Ｆ，Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｅ
ｎ，Ａ．Ｒ．），「プロシーディング・ナチュラル・ア
キャデミ・サイアンス」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ 第７４巻（１９７７年），５４６３
−５４６７頁。ショー・ダブリュー・ブイ（Ｓｈａｗ，
Ｗ．Ｖ．），「メソッド・イン・エンザイモロジィー」
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第４３
巻（１９７５年）７３７−７５５頁。タッチェル・ケ
イ，ナスミス・ケイ・エイおよびホール・ビー・ディー
（Ｔａｔｃｈｅｌｌ，Ｋ，Ｎａｓｍｙｔｈ，Ｋ，Ａ ａ
ｎｄ Ｈａｌｌ，Ｂ Ｄ），「セル」Ｃｅｌｌ 第２７
巻（１９８１年）２５−３５頁。

【００５３】

【表７】実施例に記載した大腸菌株のリスト ａ） ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー・フ
レクション Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの意味である。

【００５４】本発明は、コピー数がＰ_L やＰ_R などの制
御可能なプロモーターにより意図的にコントロール可能
な新しい種類のプラスミッドの創製を可能にする。ＲＮ
Ａ II の５′末端からＸｈｏＩリンカーの３０塩基対の
存在により、ＲＮＡ II の天然のプロモーターを他のプ
ロモーターで置換することが可能となる。たとえばプラ
スミッドｐＭＧ４０４ではＲＮＡ II はプラスミッドＰ
ＨＳＧ４１５上のカナマイシン耐性遺伝子プロモーター
のコントロールを受けており、ｐＭＧ４０４上の２個の
複製開始点（ｐＨＳＧ４１５からの温度感受性ｐＳＣ１
０１複製開始点と

【外１】 プロモーターのコントロール下にあるＣｏｌ Ｅ１複製
開始点）ともに機能していると考えられる。これらのプ
ラスミッドにおける正確なＤＮＡ複製開始点は不明であ
るが、ハイブリッド複製開始点が機能していることは、
ｐＨＳＧ４１５よりｐＭＧ４０４の方がコピー数が多い
こと、そしてｐＭＧ４０４は４２℃で複製することから
わかる。ハイブリッド複製開始点を有するがｐＳＣ１０
１温度感受性複製開始点は持たない、再環状化させたＢ
ａｌ I断片であるｐＭＧ４１０が作成できるということ
は、ハイブリッド複製開始点が機能していることの別の
証拠である。

【００５５】ｐＭＧ４０４の性質は、ＲＮＡ II のＲＮ
Ａ II プロモーターと最初の３０塩基は、ＤＮＡ複製開
始をなくすことなく別のプロモーターで置換できること
を示している。しかし

【外２】 プロモーターは構成的に発現されているため、ｐＭＧ４
０４のコピー数の変更は不可能である。大腸菌内で働く
いくつかの充分規定されたコントロール可能なプロモー
ターが存在する。バクテリオフアージλからのＰ_L プロ
モーターは、直接コントロールされるＣｏｌ Ｅ１ハイ
ブリッド複製開始点を有するプラスミッドｐＭＧ４１１
を作成するのに用いられた。ｐＭＧ４１１はｐＨＳＧ４
１５からの複製開始点を保持しており、λリプレッサー
遺伝子（ＱＹ７）を有する株の中で３０℃で小コピー数
で維持された。λリプレッサーを４２℃で不活性化する
とコピー数が上昇し、これはＣｏｌ Ｅ１複製開始点の
複製Ｐ_L により作動されていることを示している。従っ
てプラスミッドのコピー数は制御されたプロモーターか
ら意図的にコントロールすることが可能であることは明
白であり、これは温度（たとえばｐＭＧ４１１中の
Ｐ_L ）や、又は、さらに重要であるが、トリプトファン
やラクトースなどの代謝物の濃度を変えることによりコ
ピー数がコントロールされるプラスミッド作成への道を
開くものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミッドの制限地図を示し、本発明の複製
開始点を２個有するプラスミッド、ｐＭＧ４１１、の調
製に使用するＤＮＡ操作を示す。

【図２】３０℃から４２℃へ温度を変更した後１時間毎
に採取した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＱＹ７のｐＭＧ４
１１による形質転換体の培養菌から単離したＤＮＡをア
ガロースゲルで電気泳動したものである（１−７は０−
６時間に対応）。

【図３】プラスミッドの制限地図を示し、本発明の複製
開始点を２個有するさらに２つのプラスミッド、ｐＭＧ
１５９とｐＭＧ１６５、の調製に使用するＤＮＡ操作を
示す。

【図４】ｐＭＧ１５９，ｐＭＧ１６５，ｐＭＧ１６８及
びｐＭＧ１６９を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形
質転換体の温度変化（３０℃から４２℃に変化させ、以
後３７℃で培養した）後のコピー数の誘導のグラフであ
る。

【図５】プラスミッドの制限地図を示し、本発明の代謝
物によりコントロール可能な複製開始点を２個有するベ
クター、ｐＭＧ４２７、の調製に使用するＤＮＡ操作を
示す。

【図６】プラスミッドの制限地図を示し、本発明の代謝
物によりコントロール可能な複製開始点を２個有するさ
らに２つのベクター、ｐＭＧ４１５とｐＭＧ４１６の調
製に使用するＤＮＡ操作を示す。

【図７】温度変更の処理のあとに１時間毎に採取した、
ｐＭＧ１６９により形質転換させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｅ１０３（Ｓ）から調製した全細胞抽出液からの蛋
白を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動したもの
である（１−８は０−７時間に対応）。

【図８】ｐＭＧ１６９で形質転換させた大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）Ｅ１０３（Ｓ）の培養菌の温度ショック処理後
のプラスミッドのコピー数とクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ活性の増加を示すグラフであ
る。

【図９】温度変更の処理の後に５時間にわたって１時間
毎に採取した、ｐＭＧ１６９により形質転換させた大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ１０３（Ｓ）の培養菌から調製し
た全細胞抽出液からの蛋白を１０％ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動したものである（６−１は０−５時間に
対応）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ロビンソン，マーチン キム イギリス国 エスエル６，４アールエツチ バークシヤー，メイドンヘツド，ヒーバ ー クロース，９ (72)発明者 カウルコツト，セリア アン イギリス国 エスエル６ １ピーエイ，バ ークシヤー，メイドンヘツド，ハイ タウ ン ロード，15 (72)発明者 ライト，エドウイナ メリー イギリス国 エスエル６ ０エルテイー, バークシヤー，タツプロウ，ハギル ライ ズ，59

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 小コピー数でベクターが安定に維持され
   る第一の複製開始点および大コピー数の第二の複製開始
   点の２つの複製系より成るＤＮＡベクターであって、第
   二の複製開始点における複製が、直接コントロール可能
   なプロモーターの制御下にＤＮＡ複製を開始させるプラ
   イマーをコードするＤＮＡ配列を置くことによって、直
   接コントロール可能であり、第二の複製開始点はＤＮＡ
   複製を開始させるプライマーをコードするＤＮＡ配列を
   含むＣｏｌＥｌのＲＮＡ ＩＩ配列由来のものである、
   ＤＮＡベクター。
2. 【請求項２】 直接コントロール可能なプロモーター
   が、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｐｒｅプロ
   モーター、Ｐｒｍプロモーター、Ｐ’_Ｒプロモーター、
   Ｔ_７ｌａｔｅプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａ
   ｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｇａｌプロモー
   ター、ａｒａプロモーター、又はｒｅｃＡプロモーター
   である、請求項１記載のベクター。
3. 【請求項３】 遺伝子産物の産生のための遺伝暗号を有
   する遺伝子配列を含有する請求項１又は２記載のベクタ
   ー。