JPH0139758B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） この発明は、クロストリジウム属に属する微生
物を用いてウラシルを製造する方法に関するもの
である、。ウラシルは医薬原料あるいは生化学試
薬として有用である。 （従来技術） ウラシルは化学的にはホルミル酢酸と尿素を縮
合させて合成する。 従来、微生物の培養液中に、ウラシル系化合物
が他の核酸成分と共に分泌されることについて
は、例えばブレビバクテリウム・リクエフアシエ
ンス（Breuibacterium liquefaciens）（ザ・ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（The Janal
of Bacteriolgy）84巻、１頁、1962年）、バチル
ス（Bacillus）属細菌（アグリカルチユラル・バ
イオロジカル・ケミストリー（Agricaltural
Biological Chemistry）、26巻、586頁、1962年）
またはその他の微生物（特公昭40−10957、52− 139786、53−38691）において知られている。微
生物がウラシルのみを生産する例としてブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）属の菌（特公昭
57−30476）、ミクロモノスポラ
（Micromonospor）属の菌（特公昭57−18873）
がある。しかし、嫌気性菌が培養液中にウラシル
を蓄積することは知られていない。 （発明が解決しようとする問題点） 上記のような方法が知られているもののウラシ
ルの化学合成法は強烈な条件下の反応を必要とす
る欠点がある。また微生物的には解決すべき課題
はまだ多く、ウラシルの生産速度、蓄積濃度の高
い菌、あるいはウラシルのみを培養液中に蓄積
し、他のリボ核酸成分を含まない菌などを得るこ
とは重要である。そのためには公知の菌種にもと
づいた育種改良とならんで、ウラシルを製造する
新菌種の創製がきわめて重要な手段となる。 本発明はこのようなな目的のもとに検討を重ね
た結果、クロストリジウム（Clostridium）属に
属する微生物がウラシルを培地中に蓄積すること
を見出し、本発明に到達した。 （問題点を解決するための手段） 本発明はクロストリジウム属に属しウラシルを
生産する能力のある菌株を培養し、生成蓄積され
たウラシルを回収する事を特徴とするウラシルの
製造方法である。 本発明で用いられる微生物はクロストリジウム
属に属しウラシルを生産する能力を有する微生物
であり、この様な微生物は本発明実施例記載のも
のがはじめてである。実施例で用いられた微生物
は、偏性嫌気性有胞子桿菌である点でクロストリ
ジウム属に属する菌と考えられるが、グラム染色
性、炭素源の資化性など後で詳しく記す諸性質に
おいて公知の同属菌と相違しており、新菌種であ
ると考えられる。正式の種名はまだ付されていな
いので、本発明ではクロストリジウム・エスピー
No.Ｓ−１と表示する。次にクロストリジウム・エ
スピーNo.Ｓ−１（以下本菌と略記する）の創製法
および菌学的性質を示す。 （創製法） 本菌は下記の方法により分離した。すなわち第
１表に示す液体培地にソルボース１ｇ／を加え
た培地５mlを試験管へ分注し滅菌後、嫌気グロー
ブボツクス中で給源を添加し、ブチルゴム栓で密
栓後、気相を嫌気ガスに置換し、30℃で静置培養
し、約10日毎に植え継ぎを行なつた。１回液体培
地で植え継いだのち、第１表の培地に寒天30ｇ／
、ソルボース１ｇ／を加えた寒天培地を用い
てロール・チユーブ法（メソツズ・イン・マイク
ロバイオロジー（Methods in Microbiolcgy）
３巻Ｂ、117頁（1969））を繰り返すことにより本
菌を得た。 （菌学的性質） 本発明の菌株の菌学的性質を示す、この菌学的
性質の検討には、「アンアエロブ・ラボラトリ
ー・マニユアル（Anaerobe Laboratory
Manual）第４版」（The V.I.P.Anaerobe
Laboratory Virginia Polytechnic Institute
and State University、Blacksburg（1972））お
よび「バージーズ・マニユアル・オブ・デターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー（Bergey′s
Manual of Determinative Bacteriology）第８
版」「微生物の分類と同定」（長谷川武治著、学会
出版センター）に記載されている方法、培地組成
を用いた。 （顕微鏡的所見） １ 細胞の形および大きさ：単独もしくは３〜４
連の直桿菌。幅0.4〜0.8μｍ、長さ３〜8μｍ ２ 鞭毛：周鞭毛を有する ３ 胞子：あり、ターミナル ４ グラム染色：陰性 （培地組成） 第１表に例示する。

【表】

【表】 （生育状態） 第１表の組成に30ｇ／寒天、１ｇ／ソルボ
ースを加えた寒天培地での生育は次の通りであ
る。 形 状：円形 周 縁：円滑 隆 起：わずかに盛上る 表 面：円滑 色 調：白 （生理的性質） 酸素に対する態度：偏性嫌気性 インドールの生産性：− ゼラチンの液化：− カタラーゼの生産性：− デンプンの加水分解：− エスクリンの加水分解：＋ 色素の生成：− 硫酸塩の還元性：− ミルク：凝固、ペプトン化共に− ウレアーゼ：− ビタミンの要求性：なし 生育範囲：温度25〜40℃、最適温度35℃ PH
5.5〜9.0、最適PH7.0 （炭素源の質化性） 第１表の基本培地に下記炭素源（10ｇ／）を
含む液体倍地５mlを直径18mmの試験管に加え、無
菌培地を作成し本菌を80μ植菌し、気相を窒素
（67％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに
置換し、30℃で14日間静置培養した。生育は
600nｍの濁度を分光計（スペクトロニツク20、
島津製作所製）で測定した。600nｍの濁度が炭
素源を含まないコントロールとの差が0.1未満の
ものを「資化しない」、0.1以上0.2未満のものを
「わずかに資化する」0.2以上のものを「資化す
る」とした。 質化するもの：ラフイノース、ガラクトース、ラ
ムノース、グリコーゲン、トレハロース、マン
ノース、グルコース、アミグダリン、ソルボー
ス 資化しないもの：フルクトース、キシロース、リ
ボース、アラビノース、マルトース、シユクロ
ース、ラクトース、メリビオース、セロビオー
ス、メレジトース、マンニトール、デンプン、
アドニトール、エリスリトール、イノシトー
ル、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノー
ル、エチレングリコール、グリセロール、ギ
酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸 （糖などからの生産物） 第１表の基本培地に上記の試験で資化すること
が確かめられた糖を10ｇ／添加し、気相を窒素
（67％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに
置換し、本菌を植菌、30℃で静置培養した。すべ
ての炭素源において培地中には、主生産物として
酢酸、エタノールが生産された。 （従来の類似種との比較） 上記の菌学的性質から、このクロストリジウ
ム・エスピーNo.Ｓ−１は偏性嫌気性のグラム陰性
有胞子桿菌で、その主要醗酵代謝産物が酢酸、エ
タノールである菌株である。また、硫酸塩の還元
性もない。このようなことから、本菌はクロスト
リジウム（Clostridium）に属する菌株であると
考えられる。グラム陰性のクロストリジウムには
クロストリジウム・セロビオパルム
（Clostridium cellobioparum）、クロストリジウ
ム・サーモサツカロリテイカム（Costridium
thermosaccharolyticum）、クロストリジウム・
ブレビフアシエンス（Clostridium
brevifaciens）、クロストリジウム・クルイベリ
（Clostridium kluyveri）クロストリジウム・マ
ラコサム（Clostridium malacosomae）クロス
トリジウム・サーモセラム（Clostridium
thermocellum）がある。このうち、クロストリ
ジウム・サーモサツカロリテイカム、クロストリ
ジウム・サーモセラムは高温菌という点で本菌と
区別できる。クロストリジウム・ブレビフアシエ
ンス、クロストリジウム・マラコサムはアルカリ
菌という点で本菌と区別できる。そして、クロス
トリジウム・セロビオパルムは生産物が、酢酸の
みであり、エタノールを生産しないという点で、
クロストリジウム・クルイベリは生産物がカプロ
ン酸のみであるという点で区別できる。 以上のことから、本菌株はクロストリジウム属
に属する新菌種であると考えられるので、クロス
トリジウム・エスピーNo.Ｓ−１と命名した。さら
にこの菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
「微工研菌寄第8852号（FERM Ｐ−8852）」とし
て寄託した。 （培養方法） 培養方法は原則的には、一般の微生物の場合と
同様であるが、酸素の混入を防ぐことが必要であ
り、実験室的には、ゴム栓等で密栓した培養器中
で、静置あるいは振盪する方法が用いられる。や
や大きい規模では、通常用いられる醗酵槽がその
まま利用でき、装置内の酸素は、窒素などの不活
性気体などで置換することにより嫌気的な雰囲気
をつくることが可能である。醗酵槽の型式は特に
問わないが、普通に使用される撹拌混合槽のほ
か、一段あるいは多段の気泡塔型、ドラフトチユ
ーブ型の醗酵槽も利用できる。 培養に用いる炭素源は、資化する炭素源であれ
ばよく窒素源は塩化アンモニウムのごときアンモ
ニウム塩や硝酸ソーダのような硝酸塩のごとく、
通常の醗酵に用いうる各種の窒素化合物を用いる
ことができる。 その他必要に応じ、リン酸二水素カリ、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫
酸鉄、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜
鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、硼酸
などの無機化合物、あるいはビオチンや酵母エキ
スなどのビタミン類を添加することは、通常行な
われる通りでである。 本菌株は休止菌体として使用し資化することが
できない二酸化炭素を原料としてウラシルを生産
する方法に使用することもできる。この場合には
培養で得られた菌体を遠心分離、膜濾過等通常用
いられる方法で培養液から分離し通常用いられる
培養液から炭素源を除いた培養液に懸濁させ、資
化する炭素源の代りに二酸化炭素ガスを供給し反
応させる。二酸化炭素ガガスの代りに、反応液中
に溶解二酸化炭素あるいは炭酸塩、炭酸水素塩と
して加えることもできる。培養とは異なり、反応
中酸素が存在してもウラシルを生産させることが
できる。 培地中に蓄積されたウラシルは、公知の技術に
より回収することができる。 以下具体例により本発明を説明する。 実施例 １ クロストリジウム・エスピーNo.Ｓ−１株を以下
のように培養した。第１表に示す培地に10ｇ／
のソルボースを加え試験管へ５ml分注滅菌後、同
培地であらかじめ該菌株を前培養した培養液80μ
を嫌気グローブボツクス中で添加し、ブチルゴ
ム栓で密栓したのち気相を窒素（67％）と二酸化
炭素（33％）を含む除菌ガスに置換した。30℃で
10日間で静置培養を行なつたところ、培養液中に
ウラシル1.5mg／を得た。（ウラシルは培養液か
ら高速液クロで分散した後、質量分析、紫外線吸
収スペクトルおよびNMRスペクトルにより標品
と一致することを確認した）。 実施例 ２ 第１表の基本培地に10ｇ／のアミグダリンを
加え実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で2.5mg／のウラシルを生産した。 実施例 ３ 第１表の基本培地に10ｇ／のグルコースを加
え実施例１と同様に培養を行なつた。静成培養14
日間で1.9mg／ウラシルを生産した。 実施例 ４ 第１表の基本培地に10ｇ／のフルクトースを
加え実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で2.2mg／のウラシルを生産した。 実施例 ５ 第１表の基本培地に10ｇ／のグルコースを加
え実施例と同様に培養を行なつた。静置培養14日
間で1.1mg／ウラシルを生産した。 実施例 ６ 第１表の基本培地に10ｇ／のガラクトースを
加え実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.3mg／のウラシルを生産した。 実施例 ７ 第１表の基本培地に10ｇ／のトレハロースを
加え実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.7mg／のウラシルを生産した。 実施例 ８ 第１表の基本培地に10ｇ／のラフイノースを
加え実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.5mg／のウラシルを生産した。 実施例 ９ 第１表に示す培地で10ｇ／のソルボースを炭
素源として培養を行なつた菌体（乾燥重量６mg）
を遠心分離し、第１表に示す培地５mlに懸濁さ
せ、ブチルゴム栓で密栓した後、気相を窒素（67
％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに置換
し、35℃で４日間反応させた。反応液中に30mg／
のウラシルを生成した。 実施例 10 実施例９と同様に菌体（乾燥重量1.6mg）を第
１表に示す培地５mlに懸濁させ、ブチルゴム栓で
密栓した後、気相を窒素（33％）、と二酸化炭素
（33％）空気（33％）を含む除菌ガスに置換し、
35℃で３日間反応させた。反応液中に5.2mg／
のウラシルを生成した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ クロストリジウム属に属しウラシルを生産す
   る能力のある菌株を培養し、生成蓄積されたウラ
   シルを回収する事を特徴とするウラシルの製造方
   法。