JPH0227328B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアンサトリエニン化合物を活性成分と
して含有する抗腫瘍剤に関する。 本発明者等はストレプトマイセス・リシリエン
シスに属する新菌株たるストレプトマイセス・リ
シリエンシスＴ−23株〔微工研条寄第243号
（FERMBP−243）〕の醗酵生産物について研究
した結果、その生産物の一つたるＴ−23−物質
が有望な抗腫瘍活性を有すること、そしてかかる
Ｔ−23−物質はこれまた前記の醗酵生産物の一
つであるＴ−23−物質を酸化条件に付すること
によつて化学的に容易に得られることを見出し
た。 本発明の対象たるＴ−23−−物質およびそれ
を化学的に製造するための出発物質たるＴ−23−
物質のそれぞれの物理化学的性質は次のとおり
である。 Ｔ−23−物質の物理化学的性質 (1) 外観性状 無定形黄色粉末 (2) 構造式 (3) 比旋光度〔α〕_D＝＋91.8（CHCl₃、Ｃ＝1.0％） (4) 融点 117℃（分解） (5) 元素分析（C₃₆H₄₈N₂O₈として） Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ Ｏ％ 理論値：67.92 7.55 4.40 20.13 実測値：67.72 7.68 4.28 19.74 (6) 紫外部吸収 λ_nax 分子吸光係数 262nｍ ε＝38500 272nｍ ε＝49600 282nｍ ε＝38800 383nｍ ε＝3400 (7) 赤外部吸収（第１図参照） 3330cm^-1 1410cm^-1 1100cm^-1 1730cm^-1 1376cm^-1 998cm^-1 1650cm^-1 1300cm^-1 849cm^-1 1535cm^-1 1202cm^-1 720cm^-1 (8) 13C−NMR（CDCl₃中）

【式】188.2、182.5

【式】176.6、169.4

【式】172.9 Ｃ＝ 145.4、137.9、129.3 CH＝ 139.9、133.7、133.6、133.2、 133.1、131.3、129.5、122.5、114.5 CH−Ｏ 79.2、75.2、68.0 −OCH₃ 56.6

【式】48.5

【式】44.9

【式】44.8 CH− 39.9 −CH₂− 33.0、29.4、29.4、29.3、25.6、 25.6、25.5、25.5 −CH₃ 20.5、17.4、9.6 (9) PMR（CDCl₃中） CH−CH₃ 0.90 3H、d1.41 3H、ｄ

【式】 1.80 3H、ｓ −OCH₃ 3.28 3H、ｓ −OCH 4.02 1H、dt 4.75 1H、bs 4.96 1H、dd

【式】 4.36 1H、dq アロマチツクＨ 6.50 1H、ｄ 7.51 1H、ｄ CONH 8.18 1H、ｓ (10) 呈色反応 ニンヒドリン （−） ビユレツト （−） アンスロン （−） フエーリング （−） (11) 溶媒に対する溶解性 メタノール、エタノール、アセトン、クロロ
ホルムおよび酢酸エチルに易溶 ベンゼンおよびエーテルに難溶 水、石油エーテルおよびヘキサンに不溶 Ｔ−23−物質の物理化学的性質 (1) 外観性状 白色無定形粉末 (2) 構造式 (3) 比旋光度〔α〕_D＝＋288（CH₃OH、Ｃ＝1.0
％） (4) 融点 151℃（分解） (5) 元素分析（C₃₆H₅₀N₂O₈として） Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ Ｏ％ 理論値：67.72 7.68 4.28 20.32 実測値：67.92 7.55 4.40 20.13 (6) 紫外部吸収 λ_nax 分子吸光係数 260 ε＝40800 270 ε＝52300 280 ε＝40500 310 ε＝5900 (7) 赤外部吸収（第２図参照） 3340（NH、OH）、1730、1200（エステル）、
1650、1535（アミド） (8) ¹³C−NMR（CDCl₃中）

【式】176.9、173.3

【式】179.7 Ｃ＝ 149.2、141.1、137.8、132.7、125.5 CH＝ 134.9、134.4、133.9、129.6、 129.5、129.1、124.3、115.8、107.5 CH−Ｏ 79.6、75.8、68.7 −OCH₃ 56.6

【式】48.7

【式】45.1

【式】43.1 CH− 39.0 −CH₂− 33.7、31.7、29.5、29.4、26.7、 26.6、25.7、25.6、 −CH₃ 20.3、17.7、9.7 (9) PMR（ピリジン中） CH−CH₃ 0.85 3H、ｄ 1.57 3H、ｄ

【式】 1.98 3H、ｓ −OCH₃ 3.27 3H、ｓ −Ｏ−CH 4.49 1H、dt 5.28 1H、bs 5.36 1H、dd

【式】 4.80 1H、dq

【式】5.53 1H、ｍ 5.70 1H、dd 6.06 1H、ｍ 6.23 1H、dd 6.37 1H、dd 6.53 1H、dd 6.64 1H、dd アロマチツクＨ 7.12 2H、ｓ CONH 8.78 1H、bs 9.01 1H、ｄ (10) 呈色反応 ニンヒドリン （−） ビユレツト （−） アンスロン （−） フエーリング （−） (11) 溶媒に対する溶解性 クロロホルム、メタノール、エタノール、ア
セトンおよび酢酸エチルに易溶 ベンゼン、エーテルに難溶 水、石油エーテルおよびヘキサンに不溶 本発明の新規物質たるＴ−23−物質は次に示
すような生物活性を示し、特に抗腫瘍剤として有
望なものである。 Ｔ−23−物質の生物活性 (1) 酵母およびカビに対する抗菌作用

【表】 供試菌株はすべてグルコース1.0％およびマ
ルトエキス0.2％を含有する培地で30℃におい
て72時間培養しそして菌の生育の有無を観察し
た。 (2) Ｌ−5178Y腫瘍細胞に対する生育阻害作用
（in vitro）

【表】 Ｌ−5178y細胞はイーグル・MEM培地（ニ
ツスイ製）に馬血清10.0％およびアスパラギン
100mg／mlの割合で補添した培養液で37℃にお
いて120時間培養されそして細胞の生育の有無
を判定した。Ｔ−23−物質はエタノールに溶
解させてアツセイ系に加えた。 (3) マウスＰ−388白血病腫瘍に対する阻害効果 第３表 投与量 延命率Ｔ／Ｃ（％） 24mg／Kg／日×２回投与 56.0 12mg／Kg／日×２回投与 123.3 ６mg／Kg／日×２回投与 120.2 ３mg／Kg／日×２回投与 105.7 1.5mg／Kg／日×２回投与 107.3 0.75mg／Kg／日×２回投与 105.7 ０mg／Kg／日×２回投与 100 CDF₁マウス（20ｇ±１ｇ〓）１群６尾に、
CDF₁マウスを用いて断代したＰ−388腹水腫瘍
細胞10⁶個を腹腔内に接種し、24時間後に第１
回目そして120時間後に第２回の薬物投与を行
つた。なお薬物はアラビアゴムに懸濁させて
0.2mlずつ投与した。上記第３表の延命率Ｔ／
Ｃ（％）は以下の式によつて求めた。 投与群の生存日数／対照群の生存在日数×100 なお、対照群はアラビアゴム懸濁液のみを投
与した場合である。 (4) 急性毒性 LD₅₀（マウス、ip）55.9mg／Kg 本明細書において言及されているストレプト
マイセス・リシリエンシスＴ−23株は微工研条
寄第243号（FERM BP−243）として微工研
に寄託されており、そしてその菌学的性質は次
のとおりである。 (a) 菌学的形態 栄養菌糸は分断または分節することなく分
岐しながら培地中に長く伸びている。空中菌
糸は主軸を長く伸ばし、胞子形成菌糸（胞子
柄）を単軸分枝し、その先端にループ状、曲
状または螺旋状（コイル状径15〜20μｍ、２
〜６回転）を呈し、10〜50個以上の長い胞子
鎖を着生する。胞子の表面構造は平滑（培地
によつて粗面状もみられる）で径0.5〜0.7μ
ｍ×長さ１〜1.5μｍの卵形である。菌核、鞭
毛胞子、胞子嚢等の特殊形態は観察されな
い。 (b) 各種培地における生育状態 次の各種培地における生育状態の観察は
International Streptomyces Projects編
「Methods Manual 1941」にしたがつた。
観察結果は要約し次表に示す。

【表】 (c) 生理的性質 生育温度範囲 10〜37℃ 生育最適温度 20〜30℃ ゼラチンの液化 ＋（陽性） スターチの加水分解 ＋ 脱脂牛乳の凝固 −（陰性） 脱脂牛乳のペプトン化 ＋ メラニン様色素の生成 チロシン寒天 ＋ ペプトン・イースト鉄寒天 ＋ トリプトン・イースト液体培地 ＋ (d) 炭素源の同化性（プリダム・ゴツトリーブ
寒天培地） Ｌ−アラビノス （良く生育） Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−フラクトース ＋（弱く生育） シユクロース イノシトール Ｌ−ラムノース ラフイノース Ｄ−マンニツト −（生育せず） 観察の結果、Ｔ−23菌株はストレプトミセス属
に含まれる放線菌で次のように特徴づけられる。
すなわち、(1)胞子鎖形態は螺旋状曲状およびルー
プ状であり、(2)胞子鎖の表面構造は平滑、(3)菌叢
色は灰色系列、(4)集落の裏面色は不鮮明色、(5)メ
ラニン様色素の産性は陽性であり、そして(6)炭素
源としてＤマンニツトを同化しない。これらの６
特性を基準にして「Bergey′sManual of
Determinative Bacteriology」第８版（1974）
および「J.Ferment.Technol.」第52巻第２号第
78〜92頁（1974）より検索した結果、この菌株の
特性はストレプトマイセス・リシリエンシス（Ｓ
rishiriensis）の特性によく一致する。したが
つてこの菌株はストレプトマイセス・リシリエン
シスに包含される一菌株であると同定し、ストレ
プトマイセス・リシリエンシスＴ−23株
（Streptmyces rishiriensis No.Ｔ−23）と命名し
た。 本菌株の培養には通常の放線菌培養法が適用さ
れ、炭素源としてグルコース、ラクトース、フラ
クトース等の炭糖類や澱粉あるいは澱粉加水分解
物を単独ないしは混合した形で用いることができ
る。特に澱粉、グルコースの混合物が最適であ
る。窒素源としては肉エキス、ポリペプトン、大
豆粉、コーンスチープリカーおよび各種無機窒素
源が用いられる。醗酵生産をより好適に行わしめ
るために微量の添加物すなわち乾燥酵母、酵母エ
キス、マルトエキス、その他に各種植物種子エキ
ス、ビタミン、各種無機塩類を添加してもよい。
必要に応じてシリコーン、植物油等の消泡剤が添
加される。菌株の培養は上記に示した栄養分を適
量配分して得られた培地でコルベン、ジヤー式醗
酵槽あるいはより大型の醗酵タンクを用いて行う
ことができる。培養温度は20〜35℃好ましくは25
〜30℃であり、深部培養方式がとられる。醗酵時
間は17〜96時間でよく、通常24時間前後にＴ−23
物質の生産はピークに達する。 Ｔ−23−物質およびＴ−23−物質を含む活
性物質は主として発酵固形分中の菌体に含まれ、
若干は液体中にも存在している。培養を終えた培
養液を直ちに冷却し、遠心分離法あるいはろ過法
により菌体および上清液に分ける。菌体より60〜
70％アセトン水で活性物質含有区分を抽出する。
一方上清液は、非イオン性交換樹脂に通してその
中に若干含まれる活性物質を吸着させ、次いでア
セトン、低級アルコール等の有機溶媒若しくは、
これらの有機溶媒を含む水溶液で活性物質を溶離
する。あるいは、非イオン性交換樹脂を通さず、
上清液から直接前記有機溶媒で抽出することも可
能である。 次に、活性物質を含む菌体から得られた前記液
と上清液から得られた前記液とを合わせ、PHを
5.0〜6.0に調整して、有機溶媒を減圧下に留去す
る。残留した活性物質を含む水溶液より、そのま
ま、又は、抽出率をたかめるために、食塩などの
工業的に利用可能な無機塩の存在下にクロロホル
ム、酢酸エチル、イソプロピルアルコール等の水
と混和しない溶媒で活性物質を抽出する。得られ
た抽出液は常法通り、芒硝を加えて、暫時放置
後、溶媒中に含まれる水分を脱水し、そして減圧
下に濃縮する。その後石油エーテル、ヘキサン等
を加えて活性物質を含む沈殿を得る。この中に、
Ｔ−23−物質およびＴ−23−物質が含まれ、
これは更にシリカゲル、非イオン性交換樹脂、セ
フデツクスLH−20等を用いたクロマトグラフ操
作により、更に精製される。一例として、シリカ
ゲルクロマトグラフイーを用いた高純度Ｔ−23−
、及び／又はＴ−23−物質の単離法を次に延
べる。 シリカゲルをベンゼンを用いてカラムに充填
し、Ｔ−23−物質およびＴ−23−物質を含む
前記沈殿を仕込む。最初にベンゼンを通塔させて
溶出される区分を除く。ついでベンゼン／アセト
ン（＝４：１）よりなる混合溶媒で活性区分を溶
出させる。得られた活性区分を減圧濃縮しそして
石油エーテル、ヘキサン等の非極性溶媒を用いて
沈殿させる。得られた沈殿物は、必要があれば更
にクロマトグラフイーによる精製、又は再結晶す
ることによつて高純度のＴ−23−物質を得る。
次いでおなじカラムにベンゼン／アセトン（＝
７：３）を通塔させるとＴ−23−物質を含む活
性区分が溶出して来る。これを同様の後処理によ
り、高純度のＴ−23−が得られる。 参考までに、本発明のアンサトリエニン化合物
の製造例を以下に示す。 製造例 １ 可溶性澱粉1.0％、酵母エキス0.2％および寒天
1.5％の組成よりなる試験管斜面培地に継代保存
してあるストレプトマイセスＴ−23株より１白金
耳をとり、これを可溶性澱粉1.0％、廃糖密1.0
％、肉エキス1.0％およびポリペプトン1.0％（PH
7.0）の組成よりなる種培地100mlを含有する坂口
フラスコに接種する。30℃で48時間振盪培養を行
ない、得られた培養物を種菌として同じ培地を
100ml含有する坂口フラスコに0.5mlずつ接種し
た。30℃で24時間振盪培養を行ないジヤー式醗酵
槽による本培養の種菌とした。 本培養はグルコース1.0％、可溶性澱粉1.5％、
大豆粉1.5％、乾燥酵母0.2％、硫安0.2％、
NaCl0.5％、沈降性炭酸カルシウム0.4％および消
泡剤（東芝シリコンYMA6509）0.33％よりなる
培地（PH7.0）を15.0含む30容のステンレス
製ジヤー式醗酵槽６基を用いて実施した。すなわ
ち上記した種菌を4.0％の割合で接種しそして30
℃で24時間通気撹拌培養（通気量15.0／分、撹
拌回転数200rpm）を行なつた。 培養終了後直ちに、培養液を4.0N硫酸でPH5.8
に調整した。大型連続遠心分離機により、菌体を
分離後、60％アセトン水溶液20に菌体を浸漬
し、しばらく撹拌操作を行つた後、３時間放置し
た。次いで菌体をろ過した。同じ処理を２回繰り
返し得られたろ液を合わせて、40の抽出液とし
た。次いで、この抽出液よりアセトンを減圧留去
して水溶液18を得た。得られた水溶液18.0
に、並塩（日本専売公社の塩の銘柄）6.5Kgを加
えて溶解させ、酢酸エチル9.0で２回抽出を行
つた。得られた酢酸エチル溶液に芒硝1.0Kgを加
え、しばらく放置して脱水後減圧下に濃縮し、次
いでヘキサンを加えて活性物質を含す沈殿を得
た。更にヘキサンで洗浄後、乾燥させて、Ｔ−23
−物質、Ｔ−23−物質の粗混合物42ｇを得
た。得られた粗混合物をクロロホルム100mlに溶
解させ、シリカゲルカラム（シリカゲル400ｇを
充填）に吸着させ、最初にベンゼンを通過させ、
次に、ベンゼン／アセトン（４：１）でＴ−23−
物質を溶出させ次に、ベンゼン／アセトン
（７：３）でＴ−23−物質を溶出させた。得ら
れた前記各区分を減圧下に濃縮し、それぞれヘキ
サンを加えて結晶を析出させＴ−23−物質の粉
末1.5ｇおよびＴ−23−物質の粉末11.7ｇを得
た。 製造例 ２ 製造例１で示したようにストレプトマイセスＴ
−23株を培養し、得られた培養物より遠心分離機
によつて上清液10.0を非イオン性交換樹脂HP
−20を詰めたカラムに通過させ、水洗後50％アセ
トン水2.0で活性物質を含む区分を抽出した。
減圧下でアセトンを留去して水溶液として、酢酸
エチルで２回抽出し、この抽出液を芒硝で脱水後
酢酸エチルを減圧留去して黒褐色油状物質2.0ｇ
を得た。得られた油状物質を10mlのクロロホルム
に溶解し、シリカゲルカラムに吸着させ、最初に
ベンゼンを通過させ、次に、ベンゼン／アセトン
（４：１）でまずＴ−23−物質を溶出させ、次
にベンゼン／アセトン（７：３）でＴ−23−物
質を溶出させた。得られた前記各区分を減圧下に
濃縮し、それぞれヘキサンを加えて、沈殿を集め
ヘキサンで洗浄後減圧乾燥してＴ−23−物質の
粉末48mgおよびＴ−23−物質の粉末0.63ｇを得
た。 製造例 ３ Ｔ−23−物質1.25ｇを予め塩化第２鉄0.1ｇ
を溶解させてあるメタノール100ml中に加え、氷
冷化で撹拌溶解させそして15分間放置した。次い
で減圧下にメタノールを留去させ、得られる乾固
物に酢酸エチル100mlを加え、得られる溶液をガ
ラスフイルターで過し、液を採取しそして再
び減圧下に酢酸エチルを留去した。かくして黄色
のＴ−23−物質の粉末1.05ｇを得た。 本発明の製薬組成物は、通常薬学的製剤の形態
で経口的または非経口的に投与されうる。薬学的
製剤の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、注射剤、懸濁剤等がある。また他の薬
剤とともに二重層錠、多層錠とすることができ
る。さらに錠剤は、必要に応じて通常の剤皮を施
した錠剤、例えば糖衣錠、腸溶被錠、フイルムコ
ート錠とすることもできる。 固体製剤とする場合は、添加剤、例えば、乳
糖、白糖、結晶セルロース、トウモロコシデンプ
ン、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシ
ン、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴ
ム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル
セルロース、グリセリン、ポリエチレングリコー
ル、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、
タルク等が用いられる。 液体製剤とする場合は、添加剤、例えば、塩化
ナトリウム、ソルビトール、グリセリン、オリブ
油、アーモンド油、プロピレングリコール、エチ
ルアルコール等が用いられる。 これらの製剤の有効成分の量は製剤の0.01〜50
重量％であり、適当には経口投与のための製剤の
場合には0.1〜20重量％であり、そして注射用製
剤の場合には0.05〜10重量％である。 本発明の抗潰瘍剤の投与方法および投与量には
とくに制限はなく、各種製剤形態、投与経路、患
者の年齢、性別、疾患の程度などにより適宜選択
されるが、有効成分の１日あたりの投与量は0.01
〜100mgである。 製剤例 １ 注射液 Ｔ−23−化合物 １mg 塩化ナトリウム 10mg蒸留水 適量 全量1.0ml 塩化ナトリウムおよび有効成分を蒸留水を加え
て溶解し、全量を1.0mlとする。 製剤例 ２ 錠剤（１錠） Ｔ−23−化合物 ５mg 乳 糖 72mg 結晶セルロース 15mg トウモロコシデンプン ７mgステアリン酸マグネシウム １mg 100mg 各成分を均一に混合し直打用粉末とする。これ
をロータリー式打錠機で直径６mm、重量100mgの
錠剤に成型する。 製剤例 ３ 顆粒剤（１分包） Ｔ−23−化合物 乳 糖 トウモロコシデンプン 結晶セルロース ５mg 85mg 50mg 50mgＡ ヒドロキシプロピルセルロース エタノール 10mg 90mgＢ Ａの成分を均一に混合した後、Ｂの溶液を加え
て練合し、押出造粒法で整粒し、次いで50℃の乾
燥機で乾燥する。乾燥上がり顆粒を粒度297μｍ
〜1460μｍにふるい分けたものを顆粒剤とする。
１分包量を200mgとする。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれＴ−23−物質
およびＴ−23−物質の赤外吸収スペクトルであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 活性成分として下記構造式のアンサトリエニ
   ン化合物を含有する抗腫瘍剤。