【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
技術分野
本発明は高速液体クロマトグラフイー用親水性
ゲルの製造方法、特に、高速液体クロマトグラフ
イー用に適したスチレン系疎水性高分子ゲルに糖
類を導入することにより、水溶性高分子の高速液
体クロマトグラフイー分析に適した親水性ゲルを
製造する方法に関する。
従来技術
蛋白質や糖類に代表される水溶性生体高分子な
どを液体クロマトグラフイーで分析するときに
は、その充填剤として、多糖類を架橋したゲルが
用いられる。このゲルは、非特異的吸着のほとん
どない優れた充填剤であるが軟質ゲルであるた
め、耐圧限界が低い。それゆえ、高速液体クロマ
トグラフイーには利用できない。高速液体クロマ
トグラフイー用には、非特異的吸着を防止するた
めにシリカゲル基材にシラン表面処理をしたゲル
（化学結合型シリカゲル）が用いられる。特開昭
56−93043号公報には、シリカゲルなどの多孔性
無機粒子の表面をγ―グリシドキシプロピルトリ
メトキシシランのような末端にエポキシ基を有す
るシランカツプリング剤で処理し、これに糖鎖を
反応させて得られる親水性ゲルを蛋白質などのゲ
ル過クロマトグラフイー用充填剤として利用す
ることが開示されている。しかし、このような充
填剤はシリカゲルを基材としているため酸性側で
しか使用できる。PH８以上での連続使用は不可能
である。
酸性・アルカリ性のいずれにおいても優れた安
定性を示し、さらに物理的強度に優れ高速液体ク
ロマトグラフイーに使用できるゲルには、スチレ
ン―ジビニルベンゼン共重合体のポリスチレンゲ
ルがある。しかし、これは疎水性相互作用が強
く、蛋白質などにおいては非特異的吸着が起こ
る。そのため、イオン性の基を導入した誘導体に
よるイオン交換クロマトグラフイーの他は疎水系
のクロマトグラフイー用にしか利用されえない。
発明の目的
本発明の目的は生体内に存在する蛋白質や糖類
などの水溶性高分子を高速液体クロマトグラフイ
ーにより分析するための充填剤の製造方法を提供
することにある。本発明の他の目的は、使用する
PHに影響されずしかも非特異的吸着のおこらない
高速液体クロマトグラフイー用充填剤の製造方法
を提供することにある。
発明の要旨
本発明の高速液体クロマトグラフイー用親水性
ゲルの製造方法は、高速液体クロマトグラフイー
用に適したスチレン系疎水性高分子ゲルを、これ
に親水性基として分子内に多数の水酸基をもつ糖
類を導入することにより、親水性ゲルに変換する
方法であり、スチレン系疎水性高分子ゲルを形成
するスチレンのベンゼン環にヒドロキシメチル基
を導入する工程、およびそのヒドロキシメチル基
に糖類を反応させグリコシド結合を介してその糖
類を結合させる工程を含有する。そのことにより
上記目的が達成される。
スチレン系疎水性高分子ゲルとして汎用されて
いるポリスチレンはスチレン―ジビニルベンゼン
共重合体である。これに無水塩化第二スズの存在
下でクロルメチルメチルエーテルを反応させる
と、下記式で示すように、スチレンのベンゼン環
にクロルメチル基が導入される。さらに例えばテ
トラブチルアンモニウムのような相間移動触媒の
存在下でアルカリを作用させるとヒドロキシメチ
ル基に変換される。
このヒドロキシメチル化ポリスチレンゲルの水
酸基に無水塩化第二スズ存在下で糖類を作用させ
グリコシド化反応を行なう。例えば、β―Ｄ―グ
ルコースを導入するには、下記式で示すように、
ペンタアセチル―β―Ｄ―グルコースを作用させ
てグリコシド結合を形成する。
次いで、これにさらに、下記式で示すように、
アルカリを用いてケン化し、保護基であるアセチ
ル基を除去する。
実施例
以下に本発明を好適な実施例について説明す
る。
(A) スチレン系疎水性ゲルのヒドロキシメチル
化：１のセパラブルフラスコに一晩減圧乾燥
したポリスチレンゲル（スチレン―ジビニルベ
ンゼン共重合体；球形、平均粒径10μm）50ｇ
を仕込み乾燥クロロホルム300mlを加えて懸濁
させた。これを室温で２時間撹拌した。これを
０℃に冷却し、クロルメチルメチルエーテル25
mlを塩化第二スズ25mlと共に加えて１時間反応
させた。反応混合物を過し、別したゲルを
ジオキサン―水混液（３：1v／ｖ）、ジオキサ
ン―希塩酸混液（３：1v／ｖ）の順で洗浄し、
純水から徐々にジオキサンに置換した。取し
たクロルメチル化スチレンゲルを一晩60℃で減
圧乾燥させた。その収量は46.7ｇ、そして塩素
含量は5.6重量％（フラスコ燃焼法−硝酸銀滴
定法）であつた。得られたクロルメチル化スチ
レンゲル20ｇをｏ―ジクロルベンゼン150mlに
懸濁させた。酢酸カリウム28ｇおよび水酸化カ
リウム９ｇを含む水溶液（55ml）をこれに加
え、さらに、相間移動触媒として水酸化テトラ
ブチルアンモニウム６mlを添加した。これを80
℃で24時間激しく撹拌し反応させた。反応後、
ゲルを別し、メタノール、水、テトラヒドロ
フラン―水混液（３：1v／ｖ）、テトラヒドロ
フラン、アセトン、ジクロルメタン、メタノー
ルを順に用いて洗浄した。これを室温で一晩減
圧乾燥させた。その収量は18.2ｇであつた。
(B) スチレン系疎水性ゲルへの糖鎖の導入：(A)項
で得られたヒドロキシメチル化スチレンゲル10
ｇをジクロルメタン80mlに０℃で30分間懸濁さ
せた。別にペンタアセチル―β―Ｄ―グルコー
ス（東京化成(株)製）20ｇおよび無水塩化第二ス
ズ12ｇをジクロルメタン150mlに０℃で溶解さ
せ、これを、上記のスチレンゲルの懸濁液に加
え、０℃で４時間反応させた。ゲルを別し、
メタノール、水、希塩酸、蒸留水、メタノール
―水混液（１：１）を順に用いて洗浄した。得
られたゲルを一晩減圧乾燥させた。その収量は
10ｇであつた。赤外線スペクトル（KBrデイ
スク法）によりエステルの吸収（1750cm-1）を
確認した。得られたゲル10ｇをメタノール―水
混液（１：１）200mlに水酸化カリウム５ｇを
溶解させた液に加え、40℃で２時間処理した。
ゲルを別し、水、メタノールで順次洗浄し
た。次いで、水―メタノール（１：１）に懸濁
させ、超音波洗浄機で５分間にわたり分散させ
た。そして、静置し、沈澱しない部分をデカン
テーシヨンで除去した。沈澱したゲルを取
し、一晩減圧乾燥させた。その収量は9.0ｇで
あつた。赤外線スペクトルにより、エステルの
吸収が消失していることを確認した。水酸基に
もとづく吸収が3300cm-1に巾広く出現している
ことを確認した。
(C) ゲルのカラムへの充填および性能試験：(B)項
で得られた親水化ゲル20ｇを水―メタノール混
液（１：1v／ｖ）に懸濁させた。この懸濁液
を、送液モードを定圧送液（70Kg／cm2）とし、
水を圧送液として径7.9mm、長さ500mmのステン
レスカラムに充填した。圧送液300mlを流した
ところで充填機より取りはずし、分析用高速液
体クロマト装置に接続した。試料として、マル
トース、マルトヘキサノース、仔ウシ血清アル
ブミン（BSA）、ポリエチレングリコール
（MW600）の水溶液を用い、各試料の保持時間
を測定した。その結果を下表に示す。ポンプは
日本分光製Tri Rotar Ｖを用いた。溶離液は
PH８、0.1Mトリス−塩酸緩衝液を１ml／分の
流速で流した。検出器にはウオーターズ社製の
示差屈折計を用いた。
比較例
親水化ゲルの代わりにポリスチレンゲルを実施
例１(C)項と同様にしてカラムに充填し、以下同様
に各種試料の保持時間を測定した。その結果を下
表に示す。
Technical Field The present invention relates to a method for producing a hydrophilic gel for high-performance liquid chromatography, and in particular, a method for producing a water-soluble polymer at high speed by introducing saccharides into a styrene-based hydrophobic polymer gel suitable for high-performance liquid chromatography. The present invention relates to a method for producing a hydrophilic gel suitable for liquid chromatography analysis. Prior Art When water-soluble biopolymers such as proteins and saccharides are analyzed by liquid chromatography, a gel made of cross-linked polysaccharides is used as a packing material. This gel is an excellent filler with almost no non-specific adsorption, but since it is a soft gel, its pressure resistance limit is low. Therefore, it cannot be used in high performance liquid chromatography. For high-performance liquid chromatography, a gel (chemically bonded silica gel) in which a silica gel base material is surface-treated with silane is used to prevent non-specific adsorption. Tokukai Akira
Publication No. 56-93043 discloses that the surface of porous inorganic particles such as silica gel is treated with a silane coupling agent having an epoxy group at the end, such as γ-glycidoxypropyltrimethoxysilane, and a sugar chain is reacted with the silane coupling agent. It has been disclosed that the hydrophilic gel obtained by this method is used as a packing material for gel permeation chromatography of proteins and the like. However, since such fillers are based on silica gel, they can only be used on the acidic side. Continuous use at pH 8 or higher is impossible. A polystyrene gel made of styrene-divinylbenzene copolymer is a gel that exhibits excellent stability in both acidic and alkaline conditions and has excellent physical strength and can be used in high performance liquid chromatography. However, this has strong hydrophobic interactions, and nonspecific adsorption of proteins and the like occurs. Therefore, it can only be used for hydrophobic chromatography other than ion exchange chromatography using derivatives into which ionic groups have been introduced. OBJECTS OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for producing a packing material for analyzing water-soluble polymers such as proteins and saccharides existing in living organisms by high performance liquid chromatography. Another object of the invention is to use
The object of the present invention is to provide a method for producing a packing material for high performance liquid chromatography that is not affected by pH and does not cause nonspecific adsorption. SUMMARY OF THE INVENTION The method for producing a hydrophilic gel for high performance liquid chromatography of the present invention comprises adding a styrene-based hydrophobic polymer gel suitable for high performance liquid chromatography to a styrene-based hydrophobic polymer gel having a large number of hydroxyl groups in the molecule as hydrophilic groups. This is a method of converting into a hydrophilic gel by introducing a saccharide with It includes a step of reacting and bonding the sugars through glycosidic bonds. This achieves the above objective. Polystyrene, which is widely used as a styrene-based hydrophobic polymer gel, is a styrene-divinylbenzene copolymer. When this is reacted with chloromethyl methyl ether in the presence of anhydrous stannic chloride, a chloromethyl group is introduced into the benzene ring of styrene, as shown in the following formula. Furthermore, it is converted into a hydroxymethyl group by the action of an alkali in the presence of a phase transfer catalyst such as tetrabutylammonium. The hydroxyl groups of this hydroxymethylated polystyrene gel are treated with sugars in the presence of anhydrous stannic chloride to carry out a glycosidation reaction. For example, to introduce β-D-glucose, as shown in the following formula,
A glycosidic bond is formed by the action of pentaacetyl-β-D-glucose. Next, as shown in the following formula,
Saponification is performed using an alkali to remove the acetyl group, which is a protective group. EXAMPLES The present invention will be described below with reference to preferred examples. (A) Hydroxymethylation of styrene-based hydrophobic gel: 50 g of polystyrene gel (styrene-divinylbenzene copolymer; spherical, average particle size 10 μm) dried under reduced pressure overnight in a separable flask from 1.
300 ml of dry chloroform was added and suspended. This was stirred at room temperature for 2 hours. This was cooled to 0°C and chloromethyl methyl ether 25
ml was added together with 25 ml of stannic chloride and reacted for 1 hour. The reaction mixture was filtered, and the separated gel was washed in the order of dioxane-water mixture (3:1 v/v) and dioxane-dilute hydrochloric acid mixture (3:1 v/v).
Pure water was gradually replaced with dioxane. The collected chloromethylated styrene gel was dried under reduced pressure at 60°C overnight. The yield was 46.7 g, and the chlorine content was 5.6% by weight (flask combustion method - silver nitrate titration method). 20 g of the obtained chloromethylated styrene gel was suspended in 150 ml of o-dichlorobenzene. An aqueous solution (55 ml) containing 28 g of potassium acetate and 9 g of potassium hydroxide was added thereto, and further, 6 ml of tetrabutylammonium hydroxide was added as a phase transfer catalyst. This is 80
The mixture was vigorously stirred and reacted at ℃ for 24 hours. After the reaction,
The gel was separated and washed with methanol, water, a tetrahydrofuran-water mixture (3:1 v/v), tetrahydrofuran, acetone, dichloromethane, and methanol in this order. This was dried under reduced pressure at room temperature overnight. The yield was 18.2g. (B) Introduction of sugar chains into styrene-based hydrophobic gel: Hydroxymethylated styrene gel obtained in section (A) 10
g was suspended in 80 ml of dichloromethane at 0°C for 30 minutes. Separately, 20 g of pentaacetyl-β-D-glucose (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.) and 12 g of anhydrous stannic chloride were dissolved in 150 ml of dichloromethane at 0°C, and this was added to the above styrene gel suspension. The reaction was carried out at ℃ for 4 hours. Separate the gel
Washing was performed using methanol, water, dilute hydrochloric acid, distilled water, and a methanol-water mixture (1:1) in this order. The resulting gel was dried under reduced pressure overnight. The yield is
It was 10g. Absorption (1750 cm -1 ) of the ester was confirmed by infrared spectrum (KBr disk method). 10 g of the obtained gel was added to a solution in which 5 g of potassium hydroxide was dissolved in 200 ml of a methanol-water mixture (1:1), and the mixture was treated at 40° C. for 2 hours.
The gel was separated and washed sequentially with water and methanol. Then, it was suspended in water-methanol (1:1) and dispersed in an ultrasonic cleaner for 5 minutes. Then, the mixture was allowed to stand still, and the portion that did not precipitate was removed by decantation. The precipitated gel was collected and dried under reduced pressure overnight. The yield was 9.0g. It was confirmed by infrared spectrum that the absorption of ester had disappeared. It was confirmed that absorption based on hydroxyl groups appeared widely at 3300 cm -1 . (C) Filling of gel into column and performance test: 20 g of the hydrophilized gel obtained in section (B) was suspended in a water-methanol mixture (1:1 v/v). This suspension was fed using a constant pressure feeding mode (70Kg/cm 2 ).
Water was used as a pumping liquid and was packed into a stainless steel column with a diameter of 7.9 mm and a length of 500 mm. After 300 ml of the pumped liquid had flowed, it was removed from the filling machine and connected to a high performance liquid chromatography device for analysis. Aqueous solutions of maltose, maltohexanose, bovine serum albumin (BSA), and polyethylene glycol (MW600) were used as samples, and the retention time of each sample was measured. The results are shown in the table below. The pump used was Tri Rotar V manufactured by JASCO Corporation. The eluent is
PH8, 0.1M Tris-HCl buffer was flowed at a flow rate of 1 ml/min. A differential refractometer manufactured by Waters was used as a detector. Comparative Example A column was filled with polystyrene gel instead of the hydrophilized gel in the same manner as in Example 1 (C), and the retention times of various samples were measured in the same manner. The results are shown in the table below.
【表】
発明の効果
本発明の方法によれば、疎水性スチレン系高分
子ゲルが、これに親水性基として複数の水酸基を
有する糖類が導入され親水性ゲルに変わる。その
ため、生体内に存在する蛋白質や糖類などの水溶
性高分子の高速液体クロマトグラフイーでの分析
が可能となる。変性前のゲルがゲルパーミエーシ
ヨンクロマトグラフイー用の排除限界の大きいゲ
ルであれば、親水性基を導入することにより水系
ゲルパーミエーシヨンクロマトグラフイー用のゲ
ルにすることが可能である。
さらにこの方法により製造される親水性高分子
ゲルは試料溶液の液性にかかわりなく広いPHの範
囲で使用されえ、試料の非特異的吸着がおこらな
いという利点を有する。[Table] Effects of the Invention According to the method of the present invention, a hydrophobic styrene polymer gel is transformed into a hydrophilic gel by introducing a saccharide having a plurality of hydroxyl groups as hydrophilic groups therein. Therefore, it becomes possible to analyze water-soluble polymers such as proteins and saccharides existing in living organisms using high performance liquid chromatography. If the gel before modification has a large exclusion limit for gel permeation chromatography, it can be made into a gel for aqueous gel permeation chromatography by introducing hydrophilic groups. Furthermore, the hydrophilic polymer gel produced by this method can be used in a wide pH range regardless of the liquid nature of the sample solution, and has the advantage that nonspecific adsorption of the sample does not occur.