JPH0358717B2 - - Google Patents
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- JPH0358717B2 JPH0358717B2 JP58171733A JP17173383A JPH0358717B2 JP H0358717 B2 JPH0358717 B2 JP H0358717B2 JP 58171733 A JP58171733 A JP 58171733A JP 17173383 A JP17173383 A JP 17173383A JP H0358717 B2 JPH0358717 B2 JP H0358717B2
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- interferon
- ascorbic acid
- medium
- cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明はインターフエロンを産生する哺乳動物
細胞をバナジン化合物を単独であるいはバナジン
化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導
体とを添加した細胞培養液中で培養することから
なるインターフエロンの大量生産方法に関するも
のである。 長野ら（Comnt.Rend.Soc.Biol.148巻、1700
頁、1954年）およびIsaccsら（Proc.Roy.Soc.
Ser.B.147巻、258頁、1957年）によつて発見され
たインターフエロンは、抗ウイルス作用以外に、
抗腫瘍効果を有することが報告され（Gressor.I
らB.B.A.，516巻、231頁、1978年）、医薬として
の可能性が注目されるようになつた。 インターフエロンは現在、大きく３種に分類さ
れており、それぞれインターフエロン−α（IFN
−α）、インターフエロン−β（IFN−β）、イン
ターフエロン−γ（IFN−γ）と命名されている
（Nature286巻、110頁、1980年）。IFN−αは主
に白血球をウイルスによつて刺激することによ
り、IFN−βは主に線維芽細胞を二重鎖RNAや
ウイルスによつて刺激することにより、またIFN
−γは主にリンパ球をマイトゲンで刺激すること
により生産されている。 インターフエロンの大量生産法の確立は、イン
ターフエロンの医薬としての価値を評価する上に
必須であり、これまでにもIFN−βを多量に生産
させる超誘発法（Antimicrob.Ag.Chemother.，
２巻476頁1972年）などの生産方法が報告されて
いる。また、IFN−αおよびIFN−βの大量生産
には生産細胞を予め少量のインターフエロンで処
理しておくと、より多量のインターフエロンが生
産されるいわゆるプライミング現象も実用に供さ
れている。 しかしながら、インターフエロンの大量生産方
法はこれらの方法によつても未だ十分ではなく、
更に優れた大量生産方法の開発が望まれている。 本発明者らはインターフエロンの大量生産方法
について研究を重ねた結果、インターフエロンを
産生する哺乳動物細胞をバナジン化合物を単独で
あるいはバナジン化合物とアスコルビン酸又はア
スコルビン酸誘導体とを添加した細胞培養液中で
培養することによりインターフエロンを大量生産
することが可能であることを見い出し、本発明を
完成した。 本発明はインターフエロンを産生する哺乳動物
細胞をバナジン化合物を単独であるいはバナジン
化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導
体とを添加した細胞培養液中で培養することを特
徴とするインターフエロンの大量生産方法であ
る。 本発明は一般的には次のように実施する。すな
わち、常法に従つて、インターフエロンを産生す
る細胞を増殖培地、プライミング培地、誘導時の
培地、又は生産培地中で培養する際に通常の培地
のバナジン化合物を単独であるいはバナジン化合
物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と
を添加した培地を使用する。 本発明で使用するアスコルビン酸はＬ−アスコ
ルビン酸であることが好ましい。アスコルビン酸
誘導体としてはＬ−アスコルビン酸の１価の金属
塩および２価の金属塩を使用することが可能であ
るが、１価の金属塩を使用することが好ましく、
１価の金属塩の中ではナトリウム塩が特に好まし
い。細胞培養液中の含有量は１〜500mg／、特
に、10〜100mg／が好ましい。 バナジン化合物としては硫酸バナジル、オルト
バナジン酸の１価の金属塩、メタバナジン酸の１
価の金属塩、メタバナジン酸アンモニウムおよび
デカバナジン酸の１価の金属塩が好ましく、特に
オルトバナジン酸の１価の金属塩が好ましい。１
価の金属塩としてはナトリウム塩が特に好まし
い。細胞培養液中のバナジン化合物の含量は0.01
〜100mg／が好ましく、0.1〜10mg／が特に好
ましい。 バナジン化合物は単独で培養液に添加してもよ
いが、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体
と併用すれば、その効果はより大きくなる。 バナジン化合物を単独であるいはバナジン化合
物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と
を添加した培養液は増殖培地、プライミング培
地、誘起時の培地又は生産培地のいずれでもよ
く、また、これらの培地の２種以上に含有させて
も良い。 アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体およ
び／又はバナジン化合物を含有させる培養液とし
てはイーグルMEM培地、RPMI1640培地が一般
的に使用されるが、他の培地、例えば199培地、
ハムF12培地、L15培地、ダルベツコー変法培地
などを使用することも可能である。 アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体および
バナジン化合物は市販品として入手可能であり、
例えば和光純薬工業株式会社のＬ−アスコルビン
酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、オルトバナ
ジン酸ナトリウムおよびメタバナジン酸ナトリウ
ムを使用することができる。 インターフエロン産生細胞としては、MRC−
５細胞、WI−38細胞、Flow1000細胞、
Flow4000細胞等のヒト二倍体細胞やヒト末梢白
血球を使用することができる。更に、Namalwa
細胞、MG−63細胞、CCRF−SB細胞、CCRF−
CEM細胞等のヒト由来の異数体細胞や、他の動
物由来の細胞、例えばRK−13（ウサギ由来）、
MDCK細胞（イヌ由来）、L929細胞（マウス由
来）および種々の動物初代培養細胞等も使用する
ことが可能である。 これらの細胞は例えばアメリカン タイプ カ
ルチヤー コレクシヨン（American Type
Culture Collection）あるいは大日本製薬株式会
社より入手することができる。 インターフエロン産生細胞を培養した後、イン
ターフエロンを誘導させるための誘起剤としては
通常の誘起剤例えば、ポリ(I)・ポリ(C)、センダイ
ウイルス、ニユーカツスル病ウイルス、コンカナ
バリンＡの他、グラミジア、リケツチア、マイト
ゲン、リボ多糖等の誘起剤を使用することができ
る。 次に実験例及び実施例により本発明を具体的に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるも
のではない。 実施例 １ ヒト二倍体細胞であるMRC−５細胞を10％仔
牛血清含有イーグルMEM培地（増殖培地）10ml
とともに６cm径のプラスチツクシヤーレに３×
104個／cm2で植え込み、37℃、５％CO2下で培養
した。細胞がコンフルエントに達した後に培地を
100単位／mlのインターフエロン−βを含有する
0.1％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン含有イーグ
ルMEM培地（プライミング培地）５mlと交換
し、一晩培養した。 次いで、ポリ(I)・ポリ(C)およびサイクロヘキシ
ミドを終濃度それぞれ30mg／および２mg／と
なるように添加して５時間培養し、更にアクチノ
マイシンＤを終濃度１mg／になるように添加し
て２時間培養した。次にこの細胞をPBS-で２度
洗浄後、0.1％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン含
有イーグルMEM培地（生産培地）５mlに交換し
た。一晩培養後、培地中のインターフエロン力価
を測定した。インターフエロンの力価はFL細胞
およびシンドビスウイルスを用いたCPE法で測
定し、インターフエロンの国際標準品（G023−
902−527）を基準として表示した。 増殖培地、プライミング培地、誘導時の培地お
よび／または生産培地へオルトバナジン酸ナトリ
ウムを１mg／又はオルトバナジン酸ナトリウム
１mg／とＬ−アスコルビン酸ナトリウム20mg／
を併用して添加した場合のインターフエロン生
産量におよぼす影響を調べた結果を第１表に示し
た。
細胞をバナジン化合物を単独であるいはバナジン
化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導
体とを添加した細胞培養液中で培養することから
なるインターフエロンの大量生産方法に関するも
のである。 長野ら（Comnt.Rend.Soc.Biol.148巻、1700
頁、1954年）およびIsaccsら（Proc.Roy.Soc.
Ser.B.147巻、258頁、1957年）によつて発見され
たインターフエロンは、抗ウイルス作用以外に、
抗腫瘍効果を有することが報告され（Gressor.I
らB.B.A.，516巻、231頁、1978年）、医薬として
の可能性が注目されるようになつた。 インターフエロンは現在、大きく３種に分類さ
れており、それぞれインターフエロン−α（IFN
−α）、インターフエロン−β（IFN−β）、イン
ターフエロン−γ（IFN−γ）と命名されている
（Nature286巻、110頁、1980年）。IFN−αは主
に白血球をウイルスによつて刺激することによ
り、IFN−βは主に線維芽細胞を二重鎖RNAや
ウイルスによつて刺激することにより、またIFN
−γは主にリンパ球をマイトゲンで刺激すること
により生産されている。 インターフエロンの大量生産法の確立は、イン
ターフエロンの医薬としての価値を評価する上に
必須であり、これまでにもIFN−βを多量に生産
させる超誘発法（Antimicrob.Ag.Chemother.，
２巻476頁1972年）などの生産方法が報告されて
いる。また、IFN−αおよびIFN−βの大量生産
には生産細胞を予め少量のインターフエロンで処
理しておくと、より多量のインターフエロンが生
産されるいわゆるプライミング現象も実用に供さ
れている。 しかしながら、インターフエロンの大量生産方
法はこれらの方法によつても未だ十分ではなく、
更に優れた大量生産方法の開発が望まれている。 本発明者らはインターフエロンの大量生産方法
について研究を重ねた結果、インターフエロンを
産生する哺乳動物細胞をバナジン化合物を単独で
あるいはバナジン化合物とアスコルビン酸又はア
スコルビン酸誘導体とを添加した細胞培養液中で
培養することによりインターフエロンを大量生産
することが可能であることを見い出し、本発明を
完成した。 本発明はインターフエロンを産生する哺乳動物
細胞をバナジン化合物を単独であるいはバナジン
化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導
体とを添加した細胞培養液中で培養することを特
徴とするインターフエロンの大量生産方法であ
る。 本発明は一般的には次のように実施する。すな
わち、常法に従つて、インターフエロンを産生す
る細胞を増殖培地、プライミング培地、誘導時の
培地、又は生産培地中で培養する際に通常の培地
のバナジン化合物を単独であるいはバナジン化合
物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と
を添加した培地を使用する。 本発明で使用するアスコルビン酸はＬ−アスコ
ルビン酸であることが好ましい。アスコルビン酸
誘導体としてはＬ−アスコルビン酸の１価の金属
塩および２価の金属塩を使用することが可能であ
るが、１価の金属塩を使用することが好ましく、
１価の金属塩の中ではナトリウム塩が特に好まし
い。細胞培養液中の含有量は１〜500mg／、特
に、10〜100mg／が好ましい。 バナジン化合物としては硫酸バナジル、オルト
バナジン酸の１価の金属塩、メタバナジン酸の１
価の金属塩、メタバナジン酸アンモニウムおよび
デカバナジン酸の１価の金属塩が好ましく、特に
オルトバナジン酸の１価の金属塩が好ましい。１
価の金属塩としてはナトリウム塩が特に好まし
い。細胞培養液中のバナジン化合物の含量は0.01
〜100mg／が好ましく、0.1〜10mg／が特に好
ましい。 バナジン化合物は単独で培養液に添加してもよ
いが、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体
と併用すれば、その効果はより大きくなる。 バナジン化合物を単独であるいはバナジン化合
物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と
を添加した培養液は増殖培地、プライミング培
地、誘起時の培地又は生産培地のいずれでもよ
く、また、これらの培地の２種以上に含有させて
も良い。 アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体およ
び／又はバナジン化合物を含有させる培養液とし
てはイーグルMEM培地、RPMI1640培地が一般
的に使用されるが、他の培地、例えば199培地、
ハムF12培地、L15培地、ダルベツコー変法培地
などを使用することも可能である。 アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体および
バナジン化合物は市販品として入手可能であり、
例えば和光純薬工業株式会社のＬ−アスコルビン
酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、オルトバナ
ジン酸ナトリウムおよびメタバナジン酸ナトリウ
ムを使用することができる。 インターフエロン産生細胞としては、MRC−
５細胞、WI−38細胞、Flow1000細胞、
Flow4000細胞等のヒト二倍体細胞やヒト末梢白
血球を使用することができる。更に、Namalwa
細胞、MG−63細胞、CCRF−SB細胞、CCRF−
CEM細胞等のヒト由来の異数体細胞や、他の動
物由来の細胞、例えばRK−13（ウサギ由来）、
MDCK細胞（イヌ由来）、L929細胞（マウス由
来）および種々の動物初代培養細胞等も使用する
ことが可能である。 これらの細胞は例えばアメリカン タイプ カ
ルチヤー コレクシヨン（American Type
Culture Collection）あるいは大日本製薬株式会
社より入手することができる。 インターフエロン産生細胞を培養した後、イン
ターフエロンを誘導させるための誘起剤としては
通常の誘起剤例えば、ポリ(I)・ポリ(C)、センダイ
ウイルス、ニユーカツスル病ウイルス、コンカナ
バリンＡの他、グラミジア、リケツチア、マイト
ゲン、リボ多糖等の誘起剤を使用することができ
る。 次に実験例及び実施例により本発明を具体的に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるも
のではない。 実施例 １ ヒト二倍体細胞であるMRC−５細胞を10％仔
牛血清含有イーグルMEM培地（増殖培地）10ml
とともに６cm径のプラスチツクシヤーレに３×
104個／cm2で植え込み、37℃、５％CO2下で培養
した。細胞がコンフルエントに達した後に培地を
100単位／mlのインターフエロン−βを含有する
0.1％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン含有イーグ
ルMEM培地（プライミング培地）５mlと交換
し、一晩培養した。 次いで、ポリ(I)・ポリ(C)およびサイクロヘキシ
ミドを終濃度それぞれ30mg／および２mg／と
なるように添加して５時間培養し、更にアクチノ
マイシンＤを終濃度１mg／になるように添加し
て２時間培養した。次にこの細胞をPBS-で２度
洗浄後、0.1％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン含
有イーグルMEM培地（生産培地）５mlに交換し
た。一晩培養後、培地中のインターフエロン力価
を測定した。インターフエロンの力価はFL細胞
およびシンドビスウイルスを用いたCPE法で測
定し、インターフエロンの国際標準品（G023−
902−527）を基準として表示した。 増殖培地、プライミング培地、誘導時の培地お
よび／または生産培地へオルトバナジン酸ナトリ
ウムを１mg／又はオルトバナジン酸ナトリウム
１mg／とＬ−アスコルビン酸ナトリウム20mg／
を併用して添加した場合のインターフエロン生
産量におよぼす影響を調べた結果を第１表に示し
た。
【表】
ナトリウム
ナトリウム
【表】
酸ナトリウム 〓 酸ナトリウム 〓 酸ナトリウ
ム 〓 酸ナトリウム 〓
実施例 ２ ５×104個／mlのNamalwa細胞を５％仔牛血清
含有RPMI1640培地（増殖培地）200mlとともに
スピナーフラスコに植込んだ。３日間の増殖の後
100単位／mlのインターフエロン−αおよび0.1％
（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含有する200mlの
RPMI1640培地（プライミング培地）を用いて一
晩プライミングし、その後センダイウイルスを
100HAU／mlの終濃度で添加した。一晩培養後
センダイウイルスをPH2.0で不活化し、液中のイ
ンターフエロン−α力価を測定した。力価は
CPE法で測定し、インターフエロンの国際標準
品（G023−901−527）を基準として表示した。 増殖培地へ各種濃度で含有させたメタバナジン
酸ナトリウムのインターフエロン−α生産量へお
よぼす影響を調べた結果を第２表に示した。
ム 〓 酸ナトリウム 〓
実施例 ２ ５×104個／mlのNamalwa細胞を５％仔牛血清
含有RPMI1640培地（増殖培地）200mlとともに
スピナーフラスコに植込んだ。３日間の増殖の後
100単位／mlのインターフエロン−αおよび0.1％
（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含有する200mlの
RPMI1640培地（プライミング培地）を用いて一
晩プライミングし、その後センダイウイルスを
100HAU／mlの終濃度で添加した。一晩培養後
センダイウイルスをPH2.0で不活化し、液中のイ
ンターフエロン−α力価を測定した。力価は
CPE法で測定し、インターフエロンの国際標準
品（G023−901−527）を基準として表示した。 増殖培地へ各種濃度で含有させたメタバナジン
酸ナトリウムのインターフエロン−α生産量へお
よぼす影響を調べた結果を第２表に示した。
【表】
【表】
実験例 ３
３×106個のL929細胞を10％（ｖ／ｖ）の牛胎
児血清含有199培地（増殖培地）50mlとともに150
cm2の培養面積を有するプラスチツクフラスコに植
込み、４日間増殖させコンフルエントにした。
100mg／のポリ(I)・ポリ(C)および0.01％（ｗ／
ｖ）のヒト血清アルブミンを含有する199培地50
mlに交換し、５時間後に0.01％（ｗ／ｖ）のヒト
血清アルブミンを含有する199培地（生産培地）
25mlに交換した。18時間培養後に生産培地のイン
ターフエロン力価を測定した。 増殖培地へ添加した各種のバナジン化合物のイ
ンターフエロン生産量へおよぼす影響を調べた結
果を第４表に示した。
児血清含有199培地（増殖培地）50mlとともに150
cm2の培養面積を有するプラスチツクフラスコに植
込み、４日間増殖させコンフルエントにした。
100mg／のポリ(I)・ポリ(C)および0.01％（ｗ／
ｖ）のヒト血清アルブミンを含有する199培地50
mlに交換し、５時間後に0.01％（ｗ／ｖ）のヒト
血清アルブミンを含有する199培地（生産培地）
25mlに交換した。18時間培養後に生産培地のイン
ターフエロン力価を測定した。 増殖培地へ添加した各種のバナジン化合物のイ
ンターフエロン生産量へおよぼす影響を調べた結
果を第４表に示した。
【表】
実施例 １
インターフエロン−αの生産
Namalwa細胞を３×105個／mlの細胞濃度でＬ
−アスコルビン酸40mg／およびメタバナジン酸
ナトリウム３mg／を含む５％（ｖ／ｖ）仔牛血
清添加RPMI1640培地に植え込んだ。この細胞と
スピナ−フラスコ中で37℃で、３日間培養後、遠
心分離により細胞を集めた。この細胞を0.1％
（ｗ／ｖ）ヒト血清アルミブン、40mg／のＬ−
アスコルビン酸、３mg／のメタバナジン酸ナト
リウムおよび100単位／mlのインターフエロン−
αを含むRPMI1640培地に懸濁し、一晩培養し
た。センダイウイルスを終濃度100HAU／mlに
添加してさらに一晩培養した。遠心分離により細
胞を除いた上清液をPH2.0に調整し一晩４℃に静
置することによりセンダイウイルスを不活化し
た。液中のインターフエロン−αの力価は3340単
位／mlであつた。Ｌ−アスコルビン酸およびメタ
バナジン酸ナトリウムを含有しない培養液を使用
した場合のインターフエロン−αの力価は1820単
位／mlであつた。 実施例 ２ インターフエロン−βの生産 二倍体細胞MRC−５細胞を、10％（ｖ／ｖ）
の仔牛血清、20mg／のＬ−アスコルビン酸ナト
リウムおよび１mg／のオルトバナジン酸ナトリ
ウムを含むイーグルMEM培地に４×104／mlで
植え込み、37℃で４日間培養した。培養液を0.1
％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルミブン、20mg／のＬ
−アスコルビン酸ナトリウム、１mg／のオルト
バナジン酸ナトリウムおよび100単位／mlのイン
ターフエロン−βを含むイーグルMEM培地に代
え、一晩培養した。30mg／のポリ(I)・ポリ(C)お
よび２mg／のサイクロヘキシミドを添加して５
時間培養後２mg／のアクチノマイシンＤを加
え、さらに２時間培養した。 PBS-で２回洗浄後、0.1％（ｗ／ｖ）のヒト血
清アルミブン添加イーグルMEM培地を加え一晩
培養した。培養液中のインターフエロン−βの力
価は、35300単位／mlであつた。Ｌ−アスコルビ
ン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウ
ムを含有しない培養液を使用した場合のインター
フエロン−βの力価は10200単位／mlであつた。 実施例 ３ インターフエロン−γの生産 健康成人より得た末梢血からフイコール−ヒパ
ツク（Ficoll−Hypaque）グラジエント法により
リンパ球を含有する分画を採取し、それらの細胞
をプラスチツクシヤーレ中で培養後、非付着細胞
を分取した。分取した細胞を、20mg／のＬ−ア
スコルビン酸ナトリウムおよび２mg／のメタバ
ナジン酸ナトリウムを含有する0.1％（ｗ／ｖ）
ヒト血清アルミブン添加RPMI1640培地中に２×
106個／mlに浮遊した。この浮遊液にコンカナバ
リンＡを5μｇ／mlの濃度で添加し48時間培養し
た。培養後終了後、細胞を遠心分離により除去
し、培養液中のインターフエロン−γの力価を、
インターフエロン−αの国際標準品（G023−901
−527）を基準としてCPE法で測定した。その結
果、培養液中のインターフエロン−γの力価は
2930単位／mlであつた。また、Ｌ−アスコルビン
酸ナトリウムおよびメタバナジン酸ナトリウムを
含有しない培養液を使用した場合のインターフエ
ロン−γの力価は680単位／mlであつた。
−アスコルビン酸40mg／およびメタバナジン酸
ナトリウム３mg／を含む５％（ｖ／ｖ）仔牛血
清添加RPMI1640培地に植え込んだ。この細胞と
スピナ−フラスコ中で37℃で、３日間培養後、遠
心分離により細胞を集めた。この細胞を0.1％
（ｗ／ｖ）ヒト血清アルミブン、40mg／のＬ−
アスコルビン酸、３mg／のメタバナジン酸ナト
リウムおよび100単位／mlのインターフエロン−
αを含むRPMI1640培地に懸濁し、一晩培養し
た。センダイウイルスを終濃度100HAU／mlに
添加してさらに一晩培養した。遠心分離により細
胞を除いた上清液をPH2.0に調整し一晩４℃に静
置することによりセンダイウイルスを不活化し
た。液中のインターフエロン−αの力価は3340単
位／mlであつた。Ｌ−アスコルビン酸およびメタ
バナジン酸ナトリウムを含有しない培養液を使用
した場合のインターフエロン−αの力価は1820単
位／mlであつた。 実施例 ２ インターフエロン−βの生産 二倍体細胞MRC−５細胞を、10％（ｖ／ｖ）
の仔牛血清、20mg／のＬ−アスコルビン酸ナト
リウムおよび１mg／のオルトバナジン酸ナトリ
ウムを含むイーグルMEM培地に４×104／mlで
植え込み、37℃で４日間培養した。培養液を0.1
％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルミブン、20mg／のＬ
−アスコルビン酸ナトリウム、１mg／のオルト
バナジン酸ナトリウムおよび100単位／mlのイン
ターフエロン−βを含むイーグルMEM培地に代
え、一晩培養した。30mg／のポリ(I)・ポリ(C)お
よび２mg／のサイクロヘキシミドを添加して５
時間培養後２mg／のアクチノマイシンＤを加
え、さらに２時間培養した。 PBS-で２回洗浄後、0.1％（ｗ／ｖ）のヒト血
清アルミブン添加イーグルMEM培地を加え一晩
培養した。培養液中のインターフエロン−βの力
価は、35300単位／mlであつた。Ｌ−アスコルビ
ン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウ
ムを含有しない培養液を使用した場合のインター
フエロン−βの力価は10200単位／mlであつた。 実施例 ３ インターフエロン−γの生産 健康成人より得た末梢血からフイコール−ヒパ
ツク（Ficoll−Hypaque）グラジエント法により
リンパ球を含有する分画を採取し、それらの細胞
をプラスチツクシヤーレ中で培養後、非付着細胞
を分取した。分取した細胞を、20mg／のＬ−ア
スコルビン酸ナトリウムおよび２mg／のメタバ
ナジン酸ナトリウムを含有する0.1％（ｗ／ｖ）
ヒト血清アルミブン添加RPMI1640培地中に２×
106個／mlに浮遊した。この浮遊液にコンカナバ
リンＡを5μｇ／mlの濃度で添加し48時間培養し
た。培養後終了後、細胞を遠心分離により除去
し、培養液中のインターフエロン−γの力価を、
インターフエロン−αの国際標準品（G023−901
−527）を基準としてCPE法で測定した。その結
果、培養液中のインターフエロン−γの力価は
2930単位／mlであつた。また、Ｌ−アスコルビン
酸ナトリウムおよびメタバナジン酸ナトリウムを
含有しない培養液を使用した場合のインターフエ
ロン−γの力価は680単位／mlであつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ インターフエロンを生産する哺乳動物細胞を
バナジン化合物を単独であるいはバナジン化合物
をアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と併
用して添加した細胞培養液中で培養することを特
徴とするインターフエロンの大量生産方法。 ２ アスコルビン酸が、Ｌ−アスコルビン酸であ
る特許請求の範囲第１項記載の生産方法。 ３ アスコルビン酸誘導体がＬ−アスコルビン酸
の１価の金属塩である特許請求の範囲第１項記載
の生産方法。 ４ アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の
含量が１〜500mg／である特許請求の範囲第１
項ないし第３項のいずれか一項記載の生産方法。 ５ バナジン化合物が硫酸バナジルである特許請
求の範囲第１項記載の生産方法。 ６ バナジン化合物がオルトバナジン酸の１価の
金属塩である特許請求の範囲第１項記載の生産方
法。 ７ バナジン化合物がオルトバナジン酸のナトリ
ウム塩である特許請求の範囲第１項記載の生産方
法。 ８ バナジン化合物がメタバナジン酸の１価の金
属塩である特許請求の範囲第１項記載の生産方
法。 ９ バナジン化合物がメタバナジン酸アンモニウ
ムである特許請求の範囲第１項記載の生産方法。 １０ バナジン化合物がデカバナジン酸の１価の
金属塩である特許請求の範囲第１項記載の生産方
法。 １１ バナジン化合物の含量が0.01〜100mg／
である特許請求の範囲第１項、第５項ないし第１
０項のいずれか一項記載の生産方法。 １２ 細胞培養液が増殖培地、プライミング培
地、誘起の培地および生産培地からなる群から選
ばれた少なくとも１種である特許請求の範囲第１
項記載の生産方法。 １３ インターフエロンを産生する細胞が、ヒト
由来の細胞である特許請求の範囲第１項記載の生
産方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58171733A JPS6062997A (ja) | 1983-09-17 | 1983-09-17 | インタ−フエロンの生産方法 |
| US06/645,761 US4680261A (en) | 1983-09-17 | 1984-08-30 | Process for producing interferon |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP58171733A JPS6062997A (ja) | 1983-09-17 | 1983-09-17 | インタ−フエロンの生産方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6062997A JPS6062997A (ja) | 1985-04-11 |
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Family Applications (1)
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