【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は固定化酵母に関する。
さらに詳しくは酵母を固定化したゲル中にステ
ロール類又はステロール類と不飽和脂肪酸もしく
はその誘導体とを分散させた固定化酵母に関す
る。
本発明の目的は長期間安定なアルコール連続発
酵を可能とする点にある。
固定化酵母を用いるアルコール連続生産法に関
しては基礎的研究が報告されている〔Wada，Ｍ
etal European J.Appl.Microbiol.Biotechnol
10 275〜287（1980）〕。
これらの連続発酵においては、固定化された酵
母は原料糖液にのみ依存した増殖特性を示し、酵
母の増殖に必要な微量の酸素が不足し易い。この
ため酵母の増殖は低下し、固定化酵母の活性低下
が避け難く、固定化酵母の活性は漸減し、その寿
命が制限されていた。微量の酸素の必要性は多く
の研究者により検討され、エルゴステロールなど
のステロール類と不飽和脂肪酸の添加により酸素
の代替効果がみられることなどから、これらの化
合物の生合成に酸素の存在が必要と考えられてい
る。（J.Cell Comp.Physiol.43巻 271ページ
1954年）。
本発明者らは、アルコール発酵用固定化酵母の
活性を維持する方法について鋭意検討した。
まず、連続運転中の反応槽に少量の通気を行う
ことで、かなりの改善がみられたが十分とはいえ
なかつた。
エルゴステロール等のステロール類又はステロ
ール類と不飽和脂肪酸もしくはその誘導体とを溶
剤、例えば熱エタノールに溶解させるか、あるい
はマイクロカプセルに封入し、これらを固定化用
原料中に分散後、酵素を固定化して得た固定化酵
母を用いてアルコール連続発酵を行つてみたとこ
ろ、該酵母は長期間活性を維持できることがわか
つた。また、発酵中、発酵液中に酸素を含むガ
ス、例えば空気、酸素を供給することにより、上
記効果はさらに一層高められた。
次に本発明をさらに詳しく説明する。
本発明で使用するステロール類としてはエルゴ
ステロール、ステイグマステロール、７−デヒド
ロコレステロール、コレステロール等が例示さ
れ、これらは純品もしくはこれらを含有する天然
物、例えばラノリン、ステリン等の形で用いられ
る。
不飽和脂肪酸もしくはその誘導体としては炭素
物16−18の２重結合１個以上有する化合物、例え
ばオレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール
酸、リノレン酸など及びその塩、例えばアルカリ
金属塩、そのエステル、例えばツイーン類（ツイ
ーン80、85等）（花王アトラス社製品）、スパン類
（スパン60、80等）（アトラスパウダー社製品）な
どの化合物が用いられ、これらは純品もしくはこ
れらを含有する天然物、例えば大豆油等の油脂等
の形で用いられている。
ステロール類の効果は顕著であり、本発明の主
たる効果を与える。不飽和脂肪酸もしくはその誘
導体はステロール類と共用することでその効果を
助長する。これらの化合物は通常、水に難溶であ
り、ゲル中に分散させるには機械的方法では限界
がある。
したがつて、これらの化合物を溶剤、例えばエ
タノール等のアルコール類に溶解し、固定化用原
料例えばアルギン酸塩を含む水溶液と混合し、つ
いで、この混合液と酵母とを混合し、ついでアル
ギン酸を水不溶性塩とすることによつてゲル中に
ステロール類等を分散させる。又、公知の手法に
よりマイクロカプセル中にステロール類又はステ
ロール類および不飽和脂肪酸もしくはその誘導体
を封入した後、固定化用原料例えばアルギン酸塩
を含む水溶液と混合し、ついでこの混合液と酵母
とを混合し、ついでアルギン酸を水不溶性塩とす
ることによつてゲル中にステロール類等を分散さ
せることもできる。
マイクロカプセルを調製する方法としては相分
離法・界面重合法あるいは液中乾燥法、噴霧乾燥
法など多くの公知の方法（例えばマイクロカプセ
ル化の新技術とその用途開発・応用実例、経営開
発センター出版部）が使用できる。ステロール及
び不飽和脂肪酸の種類あるいは使用する壁物質、
溶媒等の選択により種々な徐放性を有するマイク
ロカプセルが調製できる。実施例に示すような有
孔性のマイクロカプセルにより更に適当な徐放性
が発揮できる。又ステロール化合物及び不飽和脂
肪酸類がコロジオン、エチルセルロース、ポリア
クリロニトリルなどの水中で半透膜を形成するポ
リマーを溶解する溶媒（メチルセロソルブアセテ
ート、メチレンクロライドなど）に溶解する特徴
を利用して水中乾燥又は水中硬化する事もでき
る。この際ポリマーの使用量、溶媒の選択により
徐放性を調節する事ができる。例えば少量の酢酸
セルロースをメチレンクロライド中に溶解し、更
にステロール化合物及び不飽和脂肪酸を溶解した
液を調製し、この溶液を界面活性剤を含む水中で
撹拌乳化分散し、そのまま液中に保持することで
ステロール及び不飽和脂肪酸を含有するマイクロ
カプセルを取得できる。
これらの方法により難溶性の状態でゲル中にス
テロール類等を分散でき、連続反応に際し、醪中
への溶解損失を低減できる。
固定化酵母を調製する原料としては各種の包括
固定化原料が使用できる。上記のアルギン酸など
のハイドロゲル素材を使用する場合は上記ステロ
ール類等を容易に包み込ませることができるので
特に好ましい。また常法によりアクリルアミドゲ
ル中に包含させてもよい。
ポリアクリルアミドゲルの調製法としてはモノ
マー例えばアクリルアミド、架橋剤例えばＮ，
N′−メチレンビスアクリルアミド、重合促進剤
例えばＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレン
ジアミン、β−ジメチルアミノプロピオニトリル
などを少量の保護剤例えばリン酸緩衝液等の緩衝
液中に溶解し、固定化に供する酵母菌体、ステロ
ール類及び不飽和脂肪酸もしくはその誘導体を氷
冷下分散し、脱気後、重合開始剤例えば過硫酸ア
ンモニウムの添加により溶液重合させる方法が一
般的である。
ステロール類及び不飽和脂肪酸もしくはその誘
導体は重合反応の際に多少変化する可能性があり
使用量を増加するかあるいはマイクロカプセルに
封入して使用することが有効である。
固定化酵母の径は小さくすると担体比表面積を
拡大させ得るので、酵母の増殖可能なゲル空間を
増加し、活性向上を期待できる。また通気効果も
表面積の増大により向上できる。すなわち固定化
酵母の径としては特に0.5〜３mmが好ましい。
固定化酵母の寿命は前記の如く通気により、さ
らに高めることができるが、通気条件としては溶
存酸素として0.50ppm以下、特に0.10ppm以下が
適当である。
ステロール類の使用量は通気賦活化を併用しな
い場合ゲル中に10〜2000mg／、不飽和脂肪酸10
mg〜10ｇ／が適当である。これらの使用量は厳
密には各種ステロール類及び不飽和脂肪酸の種
類、使用菌株、固定化素材によつて影響を受け
る。更に通気賦活性を併用することでステロール
類等の添加物の使用量が低減でき、高価な添加物
の使用を低減する経済的な効果も見い出された。
従つて通気賦活化を併用する場合の使用量はゲル
中にステロール10〜100mg／、不飽和脂肪酸10
〜5000mg／が好ましい使用量である。
本発明によれば長期に亘つてのアルコール連続
発酵が可能となるばかりでなく、又高濃度アルコ
ール発酵、発酵温度の向上も可能である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 １
エルゴステロール60mg及びツイーン80、２ｇを
エタノール８mlに溶解し、温浴中で加温溶解し
た。この溶液を殺菌した3.3％アルギン酸ソーダ
水溶液200mlに加えた。この混合液に協会２号ワ
イン酵母の麹汁培養液20mlを混合した。該混合液
をノズルより２％塩化カルシウム溶液中に滴下
し、３mmφの球状固定化酵母Ａを調製した。対照
として、エルゴステロール及びツイーン80を含有
しない固定化酵母Ｂを調製した。カラム１及び２
に固定化酵母Ａを各100ml、カラム３に固定化酵
母Ｂを100ml充填した。各カラム糖濃度150ｇ／
に溶解した廃糖蜜を上昇通塔させた。通塔量は40
ml／hrとした。カラム温度は30℃を保つた。カラ
ム２についてはカラム下部より450ml／hrの通気
を行つた。各カラムの発酵成績を第１表に記す。
The present invention relates to immobilized yeast. More specifically, the present invention relates to immobilized yeast in which sterols or sterols and unsaturated fatty acids or derivatives thereof are dispersed in a gel in which yeast is immobilized. An object of the present invention is to enable continuous alcoholic fermentation that is stable for a long period of time. Basic research has been reported on continuous alcohol production using immobilized yeast [Wada, M.
etal European J.Appl.Microbiol.Biotechnol
10 275-287 (1980)]. In these continuous fermentations, the immobilized yeast exhibits growth characteristics that are dependent only on the raw sugar solution, and the trace amount of oxygen necessary for yeast growth is likely to be insufficient. As a result, the growth of yeast decreases, and the activity of immobilized yeast inevitably decreases, and the activity of immobilized yeast gradually decreases, limiting its lifespan. Many researchers have investigated the necessity of small amounts of oxygen, and the addition of sterols such as ergosterol and unsaturated fatty acids has been shown to have an oxygen substitution effect, suggesting that the presence of oxygen is necessary for the biosynthesis of these compounds. considered necessary. (J.Cell Comp.Physiol.Volume 43, Page 271
(1954). The present inventors have intensively studied methods for maintaining the activity of immobilized yeast for alcohol fermentation. First, a considerable improvement was seen by aerating a small amount of air into the reactor during continuous operation, but it was not sufficient. Sterols such as ergosterol or sterols and unsaturated fatty acids or derivatives thereof are dissolved in a solvent such as hot ethanol or encapsulated in microcapsules, and after dispersing these in a raw material for immobilization, the enzyme is immobilized. When we carried out continuous alcoholic fermentation using the immobilized yeast obtained, we found that the yeast could maintain its activity for a long period of time. Furthermore, the above effects were further enhanced by supplying an oxygen-containing gas, such as air or oxygen, to the fermentation liquid during fermentation. Next, the present invention will be explained in more detail. Examples of sterols used in the present invention include ergosterol, stigmasterol, 7-dehydrocholesterol, and cholesterol, which are used in the form of pure products or natural products containing them, such as lanolin and sterin. Unsaturated fatty acids or derivatives thereof include compounds having one or more carbon 16-18 double bonds, such as oleic acid, palmitooleic acid, linoleic acid, linolenic acid, etc., and salts thereof, such as alkali metal salts, esters thereof, For example, compounds such as Tweens (Tween 80, 85, etc.) (products of Kao Atlas Co., Ltd.) and spans (Span 60, 80, etc.) (products of Atlas Powder Co., Ltd.) are used, and these are pure products or natural products containing them. For example, it is used in the form of fats and oils such as soybean oil. The effect of sterols is significant and provides the main effect of the present invention. Unsaturated fatty acids or their derivatives enhance their effects when used together with sterols. These compounds are usually sparingly soluble in water, and mechanical methods have limitations in dispersing them in gels. Therefore, these compounds are dissolved in a solvent such as an alcohol such as ethanol, mixed with an aqueous solution containing a raw material for immobilization such as alginate, this mixture is then mixed with yeast, and then alginic acid is dissolved in water. Sterols and the like are dispersed in the gel by forming an insoluble salt. Alternatively, sterols or sterols and unsaturated fatty acids or derivatives thereof are encapsulated in microcapsules by a known method, and then mixed with an aqueous solution containing a raw material for immobilization, such as alginate, and then mixed with yeast. However, by subsequently converting alginic acid into a water-insoluble salt, sterols and the like can be dispersed in the gel. There are many known methods for preparing microcapsules, such as phase separation method, interfacial polymerization method, submerged drying method, and spray drying method. ) can be used. Types of sterols and unsaturated fatty acids or wall materials used,
Microcapsules with various sustained release properties can be prepared by selecting the solvent and the like. Porous microcapsules as shown in the Examples can provide more appropriate sustained release properties. In addition, sterol compounds and unsaturated fatty acids can be dried underwater or It can also be cured underwater. At this time, sustained release properties can be adjusted by selecting the amount of polymer used and the solvent. For example, a small amount of cellulose acetate is dissolved in methylene chloride, a sterol compound and an unsaturated fatty acid are further dissolved to prepare a solution, this solution is emulsified and dispersed by stirring in water containing a surfactant, and the solution is maintained as it is in the solution. can obtain microcapsules containing sterols and unsaturated fatty acids. By these methods, sterols etc. can be dispersed in the gel in a poorly soluble state, and dissolution loss in the moromi can be reduced during continuous reactions. Various comprehensive immobilization raw materials can be used as raw materials for preparing immobilized yeast. When using a hydrogel material such as the above-mentioned alginic acid, it is particularly preferable because the above-mentioned sterols etc. can be easily encapsulated. Alternatively, it may be incorporated into an acrylamide gel by a conventional method. The method for preparing polyacrylamide gels includes monomers such as acrylamide, crosslinkers such as N,
Dissolve N'-methylenebisacrylamide, a polymerization accelerator such as N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, β-dimethylaminopropionitrile, etc. in a small amount of a protective agent such as a phosphate buffer. However, a common method is to disperse the yeast cells, sterols, and unsaturated fatty acids or derivatives thereof to be immobilized under ice-cooling, deaerate them, and then carry out solution polymerization by adding a polymerization initiator such as ammonium persulfate. Sterols and unsaturated fatty acids or their derivatives may change to some extent during the polymerization reaction, so it is effective to increase the amount used or encapsulate them in microcapsules. If the diameter of the immobilized yeast is made smaller, the specific surface area of the carrier can be expanded, so that the gel space in which yeast can grow can be increased, and an improvement in activity can be expected. The ventilation effect can also be improved by increasing the surface area. That is, the diameter of the immobilized yeast is particularly preferably 0.5 to 3 mm. The lifespan of the immobilized yeast can be further increased by aeration as described above, but suitable aeration conditions include dissolved oxygen of 0.50 ppm or less, particularly 0.10 ppm or less. The amount of sterols used is 10 to 2000 mg/unsaturated fatty acid in the gel without air activation.
mg to 10 g/ is appropriate. Strictly speaking, the amounts used are influenced by the types of various sterols and unsaturated fatty acids, the bacterial strain used, and the immobilization material. Furthermore, it has been found that the amount of additives such as sterols used can be reduced by using aeration activation in combination, and an economical effect of reducing the use of expensive additives has also been found.
Therefore, when using air activation in combination, the amount used in the gel is 10 to 100 mg of sterol and 10 mg of unsaturated fatty acid.
The preferred usage amount is ~5000mg/. According to the present invention, not only continuous alcohol fermentation over a long period of time is possible, but also high concentration alcohol fermentation and improvement of fermentation temperature are possible. Next, examples of the present invention will be shown. Example 1 60 mg of ergosterol and 2 g of Tween 80 were dissolved in 8 ml of ethanol and dissolved by heating in a hot bath. This solution was added to 200 ml of sterilized 3.3% sodium alginate aqueous solution. 20 ml of koji juice culture solution of Association No. 2 wine yeast was mixed with this mixture. The mixed solution was dropped into a 2% calcium chloride solution through a nozzle to prepare a spherical immobilized yeast A having a diameter of 3 mm. As a control, immobilized yeast B containing neither ergosterol nor Tween 80 was prepared. Columns 1 and 2
Each column was filled with 100 ml of immobilized yeast A, and column 3 was filled with 100 ml of immobilized yeast B. Each column sugar concentration 150g/
The molasses dissolved in the molasses was allowed to rise through the column. The amount of traffic is 40
It was set as ml/hr. Column temperature was maintained at 30°C. For column 2, aeration was performed from the bottom of the column at a rate of 450 ml/hr. The fermentation results for each column are shown in Table 1.
【表】
カラム３に比しカラム１での添加効果、カラム
２での添加物及び通気併用効果の著しいことが認
められる。
実施例 ２
大豆ステリン30ｇ及び大豆油30ｇをホモジナイ
ザー（1000rpm）を用いてよく混合させた。この
混合物に８％ゼラチン水溶液100mlを混合しホモ
ジナイザー（5000rpm）を用いて均一に混合させ
た。別に、不飽和ポリエステル（住友化学 スミ
アツプ MG−１）150ｇ及びメチルエチルケト
ンパーオキサイド1.5ｇ、ナフテン酸コバルト
0.75ｇの混合液を用意し、この溶液中に上記のゼ
ラチン−大豆ステリン−大豆油混合液を混合し、
ホモジナイザー（500rpm）を用いて均一に混合
させた。この乳化液を予め用意した３のゼラチ
ン保護コロイド液中に再分散させた。液温を60℃
に昇温し、反応を完結させ多孔質有孔マイクロカ
プセルを得た。
篩別、水洗後のマイクロカプセル100ｇを3.3％
アルギン酸ソーダ水溶液１中に懸濁し、120℃
にて加熱殺菌后、別途調製した協会２号ワイン酵
母麹汁培養液100mlを混合后、２％塩化カルシウ
ム液中に滴下し、マイクロカプセルを含有する固
定化酵母Ａを調製した。対照として、マイクロカ
プセルを含有しない、すなわちステロール、脂肪
酸を含有しない固定化酵母Ｂを調製した。固定化
酵母Ａ及びＢを各１秤取し、２容の反応槽に
充填した。各反応槽に200ｇ／の糖濃度に加水
した糖蜜を300ml／ｈにて上昇通塔した。その結
果を第２表に示す。
第２表 もろみアルコール分析結果
通塔時間 Ａ Ｂ
(ｇ/) (ｇ/)
600 83 75
1200 85 70
1800 84 55
2400 85 40
実施例 ３
エルゴステロール60mgをエタノール８mlに溶解
し、殺菌した3.3％アルギン酸ソーダ水溶液に混
合した。別に協会２号ワイン酵母の麹汁培養液20
mlを加え混合后２％塩化カルシウム中に滴下し、
固定化酵母Ａを調製した。上記エタノール溶液を
次に示すように変更し固定化酵母Ｂ〜Ｄを同様に
調製した。固定化酵母Ｂではエルゴステロール60
mgとオレイン酸0.5ｇをエタノール８mlに溶解し
た液を用いた。固定化酵母Ｃではオレイン酸0.5
ｇをエタノール８mlに溶解した液を用いた。固定
化酵母Ｄはエタノール溶液の使用を省いた。それ
ぞれに調製したＡ〜Ｄの固定化酵母各100mlを容
量200mlの30℃に保温したカラム１〜６に充填し
た。各カラムには150ｇ／の糖濃度に加水した
糖蜜を50ml／hrの速度で上昇通塔した。カラム１
には固定化酵母Ａ、カラム２、３には固定化酵母
Ｂ、カラム４には固定化酵母Ｃ、カラム５、６に
は固定化酵母Ｄを充填した。カラム３及び５には
塔下部より10ml／分の通気を行つた。第３表にも
ろみ中のアルコール分析結果を示す。添加物の効
果としては、エルゴステロールの効果が著しく、
単独では効果のないオレイン酸はエルゴステロー
ルの効果を助長した。通気による改善効果はカラ
ム５にて確認されたが添加物との併用により相乗
的な改善効果がカラム３にて認められ、長期的な
アルコール連続発酵が可能であつた。[Table] Compared to Column 3, it is recognized that the effect of addition in Column 1 and the combined effect of additives and aeration in Column 2 are significant. Example 2 30 g of soybean sterine and 30 g of soybean oil were thoroughly mixed using a homogenizer (1000 rpm). This mixture was mixed with 100 ml of 8% gelatin aqueous solution and mixed uniformly using a homogenizer (5000 rpm). Separately, 150 g of unsaturated polyester (Sumito Chemical Smearp MG-1), 1.5 g of methyl ethyl ketone peroxide, and cobalt naphthenate.
Prepare 0.75g of a mixed solution, mix the above gelatin-soybean sterin-soybean oil mixture into this solution,
It was mixed uniformly using a homogenizer (500 rpm). This emulsion was redispersed in the gelatin protective colloid solution prepared in advance. Liquid temperature 60℃
The reaction was completed and porous microcapsules were obtained. 100g of microcapsules after sieving and washing with water at 3.3%
Suspended in sodium alginate aqueous solution 1, heated to 120°C.
After heat sterilization, 100 ml of a separately prepared Japan Association No. 2 wine yeast koji broth culture solution was mixed and then dropped into a 2% calcium chloride solution to prepare immobilized yeast A containing microcapsules. As a control, immobilized yeast B containing no microcapsules, ie, no sterols or fatty acids, was prepared. One each of immobilized yeast A and B was weighed and filled into a 2-volume reaction tank. Molasses added with water to a sugar concentration of 200 g/h was passed upward into each reaction tank at a rate of 300 ml/h. The results are shown in Table 2. Table 2 Results of mash alcohol analysis Tower passage time A B (g/) (g/) 600 83 75 1200 85 70 1800 84 55 2400 85 40 Example 3 3.3% alginic acid with 60 mg of ergosterol dissolved in 8 ml of ethanol and sterilized Mixed with aqueous soda solution. Separately, Association No. 2 Wine Yeast Koji Juice Culture Solution 20
ml and after mixing, drop it into 2% calcium chloride,
Immobilized yeast A was prepared. Immobilized yeast B to D were similarly prepared by changing the above ethanol solution as shown below. In immobilized yeast B, ergosterol 60
A solution prepared by dissolving 0.5 g of oleic acid and 0.5 g of oleic acid in 8 ml of ethanol was used. For immobilized yeast C, oleic acid 0.5
A solution obtained by dissolving g in 8 ml of ethanol was used. For immobilized yeast D, the use of ethanol solution was omitted. 100 ml each of the immobilized yeast A to D prepared respectively was packed into columns 1 to 6 having a volume of 200 ml and kept at 30°C. Molasses added to a sugar concentration of 150 g/hr was passed upward through each column at a rate of 50 ml/hr. Column 1
was filled with immobilized yeast A, columns 2 and 3 with immobilized yeast B, column 4 with immobilized yeast C, and columns 5 and 6 with immobilized yeast D. Columns 3 and 5 were vented at 10 ml/min from the bottom of the column. Table 3 shows the results of alcohol analysis in the mash. As for the effects of additives, the effect of ergosterol is remarkable;
Oleic acid, which had no effect alone, enhanced the effect of ergosterol. An improvement effect due to aeration was confirmed in column 5, but a synergistic improvement effect was observed in column 3 when used in combination with additives, and long-term continuous alcohol fermentation was possible.
【表】
実施例 ４
実施例３の方法を用いて固定化酵母Ｂ及びＤを
調製した。固定化酵母Ｂを200ml容カラム１、２
に各100mlずつ充填した。固定化酵母Ｄを同様に
カラム３、４に各100mlずつ充填した。カラム１
及び３には、下部より10ml／分の速度で通気を行
つた。カラム温度はすべて30℃に保つた。200
ｇ／の糖濃度に加水した糖蜜を30ml／hrの速度
で下部より通塔した。もろみ中のアルコール分析
結果を第４表に示す。[Table] Example 4 Immobilized yeast B and D were prepared using the method of Example 3. Add immobilized yeast B to 200 ml columns 1 and 2.
100 ml each was filled. Immobilized yeast D was similarly filled into columns 3 and 4 in an amount of 100 ml each. Column 1
and 3, ventilation was performed from the bottom at a rate of 10 ml/min. All column temperatures were kept at 30°C. 200
Molasses added with water to a sugar concentration of 1 g/hr was passed through the column from the bottom at a rate of 30 ml/hr. Table 4 shows the alcohol analysis results in the mash.
【表】
以上のように、カラム４の対照区に比し、カラ
ム３の通気効果により小程度の改善がみられた
が、活性の持続効果が弱かつた。カラム２では添
加物の効果により中程度の改善がみられたが、長
時間后に急激な低下が認められた。カラム１で
は、添加物と通気賦活化の併用により高濃度のア
ルコール生産が、ほぼ安定して継続できた。
実施例 ５
アクリルアミドモノマー12ｇ、Ｎ，N′メチレ
ンビスアクリルアミド0.6ｇ、Ｎ，Ｎ，N′，N′テ
トラメチルエチレンジアミン0.2ｇ及び市販パン
酵母（協和醗酵工業(株)ダイヤイースト）（水分66
％含有）10ｇをこの順番に氷冷した0.1Mリン酸
緩衝液200ml中に混合した。更に実施例２にて調
製したマイクロカプセル20ｇを混合後、氷冷下、
窒素ガスを混合液に100ml／分で20分間通じた後
に過硫酸アンモニウム0.5ｇを添加し、溶液重合
させた。固化したゲルを水洗後２mm角に細断し固
定化酵母Ａを調製した。対照として上の例に従い
マイクロカプセル混合工程のみを省略した固定化
酵母Ｂを調製した。反応時間はいずれも約30分間
で終了した。各固定化酵母30mlを100ml容の30℃
保温可能なカラムに充填し下部より殺菌した培地
を通塔した。培地の組成はグルコース150ｇ／、
リン酸一カリ５ｇ／、硫酸マグネシウム0.5
ｇ／、リン酸二アンモン１ｇ／及びコーンス
チーブリカー10ｇ／である。培地の供給は各々
15ml／hrとした。通塔開始後600HR、1200HR、
1800HRでの醪中のアルコール分析結果を第５表
に示す。ポリアクリルアミドゲル包括法にても添
加物の効果が確認された。
第５表 もろみ中のアルコール分析結果
通塔時間 Ａ Ｂ
ｇ／ ｇ／
600 65 40
1200 65 35
1800 63 30
実施例 ６
オレイン酸１ｇ及びエルゴステロール120mgを
エタノール20mlに溶解し、この溶液各10mlを殺菌
した５％ロウメトキシペクチン（Uni Pectin
社 Red Ribbon 3G）200ml又は3.3％アルギン
酸ソーダ200mlに各々混合した。また上記エタノ
ール溶解液を混合しないロウメトキシペクチン又
はアルギン酸ソーダ水溶液を対照区として調製し
た。４種の液に対し各々、釀像協会７号の漬酒酵
母の麹汁培養液の1000倍希釈液0.2mlを混合した。
各混合液をノズルより２％CaCl2水溶液中に滴下
し２mmφの球状固定化酵母を調製した。30℃に保
温した100ml容カラムに固定化酵母を各50ml充填
し下部より150ｇ／の糖濃度に溶解した廃糖蜜
を30ml／hrの割合で通塔した。各カラムでの発酵
成績を第６表に示す。エルゴステロール及びオレ
イン酸の添加効果は、いずれのゲルにも認められ
た。アルギン酸の実施例は、実施例３カラム２及
び６に比し、固定化酵母径の縮少による活性増大
が認められた。特に添加物により、その効果が顕
著なことが明らかであつた。[Table] As described above, compared to the control group in column 4, a small improvement was observed due to the aeration effect in column 3, but the effect of sustaining activity was weak. In column 2, a moderate improvement was observed due to the effect of the additive, but a rapid decrease was observed after a long period of time. In Column 1, high-concentration alcohol production could be continued almost stably through the combined use of additives and aeration activation. Example 5 12 g of acrylamide monomer, 0.6 g of N,N'methylenebisacrylamide, 0.2 g of N,N,N',N'tetramethylethylenediamine, and commercially available baker's yeast (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dia Yeast) (moisture 66
%) were mixed in this order into 200 ml of ice-cold 0.1M phosphate buffer. Furthermore, after mixing 20 g of microcapsules prepared in Example 2, under ice cooling,
After passing nitrogen gas through the mixture at 100 ml/min for 20 minutes, 0.5 g of ammonium persulfate was added to carry out solution polymerization. After washing the solidified gel with water, it was chopped into 2 mm square pieces to prepare immobilized yeast A. As a control, immobilized yeast B was prepared according to the above example except that only the microcapsule mixing step was omitted. The reaction time was approximately 30 minutes. 30 ml of each immobilized yeast in a 100 ml volume at 30°C.
The column was packed in a heat-retainable column, and the sterilized medium was passed through the column from the bottom. The composition of the medium is glucose 150g/,
Monopotassium phosphate 5g/, magnesium sulfate 0.5
g/, diammonium phosphate 1 g/ and corn stew liquor 10 g/. The supply of medium is each
It was set to 15ml/hr. 600HR after starting the tower, 1200HR,
Table 5 shows the alcohol analysis results in the moromi at 1800HR. The effect of the additive was also confirmed using the polyacrylamide gel entrapment method. Table 5 Results of alcohol analysis in mash A B g/ g/ 600 65 40 1200 65 35 1800 63 30 Example 6 Dissolve 1 g of oleic acid and 120 mg of ergosterol in 20 ml of ethanol, and sterilize each 10 ml of this solution. 5% wax methoxy pectin (Uni Pectin)
Red Ribbon 3G) or 200 ml of 3.3% sodium alginate. In addition, an aqueous solution of wax methoxy pectin or sodium alginate that was not mixed with the above ethanol solution was prepared as a control. For each of the four types of liquids, 0.2 ml of a 1000-fold dilution of a koji juice culture solution of pickled sake yeast No. 7 manufactured by Tsutsuzo Kyokai was mixed.
Each mixed solution was dropped into a 2% CaCl 2 aqueous solution through a nozzle to prepare spherical immobilized yeast with a diameter of 2 mm. Each 100 ml column kept at 30°C was filled with 50 ml of immobilized yeast, and blackstrap molasses dissolved at a sugar concentration of 150 g/hr was passed through the column from the bottom at a rate of 30 ml/hr. Table 6 shows the fermentation results for each column. The effects of adding ergosterol and oleic acid were observed in all gels. In the alginic acid example, compared to Example 3 columns 2 and 6, an increase in activity was observed due to a reduction in the diameter of the immobilized yeast. In particular, it was clear that the effects of additives were significant.
【表】【table】