JPH0371111B2

JPH0371111B2 -

Info

Publication number: JPH0371111B2
Application number: JP7937887A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Iwakura; Tomokuni Kokubu; Kyotaka Furusawa; Shinichi Oohashi; Keishiro Tsuda
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1987-03-31
Publication date: 1991-11-12
Also published as: JPS63245680A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、成長ホルモン分泌抑制因子であるソ
マトスタチン（Ala−Gly−Gys−Lys−Asn−
Phe−Phe−Trp−Lys−Thr−Phe−Thy−Ser
−Cysの14個のアミノ酸配列よりなるペプチド、
以下、GIFと略す。）を生産可能とする新規組換
えプラスミドに関するものである。

GIFは、視床下部ペプチドの一種であり、成長
ホルモンなど下垂体前葉ホルモン、及びインシユ
リン、グルカゴンなど消化管で産生される多くの
ペプチドホルモンの分泌を抑制する。このような
作用を有することから、GIFは、巨人症、糖尿病
等の治療薬としての利用が期待されている。本発
明の新規組換えプラスミドpGIF1は、第１図にお
いて示されるDNA配列を有する。この新規組換
えプラスミドpGIF1及びpGIF1を含有するE.coli
C600株は、微生物工業、発酵工業、医薬品工業
等の分野に好適である。

従来の技術本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。GIF遺伝子を組込んだプラスミ
ド及びそのE.coliでの発現に関しては、板倉らの
成果が公知である（K.Itakura et al.
Science′vol.198，pp.1056−1063（1977））。一般
に、分子量１万以下のポリペプチドは、E.coliな
どの宿主中で産生させてもプロテアーゼなどによ
つて分解されるため安定に存在しない。これは、
分子として小さいため安定なコンフオメーシヨン
をとれないためであると考えられている。従つ
て、遺伝子操作技術を利用してGIFなどの短いポ
リペプチドを生産しようとした場合、融合遺伝子
を作成し、融合タンパクとして発現させることが
必要である。彼らの方法は、GIFを暗号化する遺
伝子を化学合成し、これをβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子と融合し、多コピープラスミドに組み込
み、組換えプラスミドをE.coliに導入し、融合タ
ンパクとして発現させたものである。融合タンパ
クは、β−ガラクトシダーゼとGIFとを、メチオ
ニン残基を介して結合している。このことから、
ブロムシアン処理によつて、融合タンパクから
GIFを特異的に切断分離することができる。

問題点しかしながら、上記の公知の方法の場合は、(1)
E.coliで発現した融合タンパクは不溶化している
こと、(2)β−ガラクトシダーゼはそれ自身活性測
定が容易であり、融合タンパクの分離精製の際、
酵素活性を指標に行うことが可能と考えらるれ
が、実際は、GIFと融合することによつてもはや
酵素活性を失つていること、などから、融合タン
パクの分離精製が問題となつている。

発明の目的本発明の目的は、上記問題点、すなわち、(1)
GIFを組み込んだ融合タンパクが不溶化するこ
と、及び、(2)融合タンパクに容易に測定可能な酵
素活性がないこと、を解消し、GIF生産技術を改
良することにある。

GIFは分子として小さいため安定なコンフオメ
ーシヨンをとれないため、E.coliなどの宿主中で
産生させてもプロテアーゼなどによつて分解され
るため安定に存在しない。従つて遺伝子操作技術
を利用してGIFを生産しようとした場合、融合遺
伝子を作成し、融合タンパクとして発現させるこ
とは避けることができない。よつて、GIF生産技
術の改良には、GIFと融合させるタンパクに関し
ての検討が重要であると考えられる。しかしなが
ら、これまで種々の研究が行われているが、融合
タンパクが可溶性で、かつ酵素活性を有するもの
はこれまで知られていなかつた。

本発明者らは、鋭意研究の結果、枯草菌のジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を用いることにより、上
記問題点が解消できることを見いだし、その知見
に従つて、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、
DHFRと略す。）とGIFの融合タンパクを暗号化
する遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドpGIF1
を作成し、本発明を完成させた。

発明の構成本発明者らは、B.subtilisのDHFRについて、
(1)168個のアミノ酸より成り立つていること、(2)
遺伝子中に存在するEcoRI部位の下流の配列によ
つて暗号化されるＣ−末端側の６アミノ酸より成
るアミノ酸配列を他のアミノ酸配列と置き換えて
もDHFRの生産性及び活性に問題がないこと、
(3)Ｃ−末端側アミノ産配列が変化したDHFRは、
不溶化しないこと、を明らかにしている。この結
果を利用し、GIFを暗号化する遺伝子を読み取り
枠をあわせてB.subtilisDHFR遺伝子のEcoRI部
位下流に組込むことにより、酵素活性を保有する
DHFR−GIF融合タンパクの合成が可能であり、
前述の問題点を解消できると考えられる。

本発明の組換えプラスミドpGIF1は、(1)GIFを
暗号化するDNAの分子設計及び化学合成、及び
(2)化学合成DNAのB.subtilisのDHFR遺伝子の
EcoRI部位下流への組み込み、の結果得られたも
のであり、全く新規な化合物である。

GIFを暗号化するDNAとしては、以下に示す
配列のものをホスホアミダイト法により化学合成
し、それらを結合して用いているが、合成方法に
よつて本発明は制限されない。

１ 5′−AATTCTATGGCTGGTTGT−3′ ２ 5′−
AAGAACTTCTTTTGGAAGACTT
ＴＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＴＡＡＧ−3′ ３ 5′−
GATCCTTAACACCAAGTGAAAGT
ＣＴＴＣＣＡＡＡＡ−3′ ４ 5′−GAAGTTCTTACAACCAGCCATAG
−3′ 本発明のプラスミドpGIF1は、4789塩基対の大
きさを有し、宿主であるE.coliをトリメトプリム
およびアンピシリン耐性に形質転換することがで
き、第１図に示される塩基配列によつて確定され
る新規組換えプラスミドである。プラスミド
pGIF1は、制限酵素EcoRI，BamHI，Bgl，
BstE，Pst，Pvu，Salによつて、各々
１箇所切断され、Aat，Cla，Hind，Hpa
によつて各々２箇所切断される。

第１図は、pGIF1の全塩基配列を示す図であり
２本鎖DNAのうち片方の配列だけを示している。
第２図は、pGIF1中に存在するDHFR−GIF融合
タンパクを暗号化する部分の塩基配列及びタンパ
クのアミノ酸配列を示す図である。制限酵素
EcoRIの認識切断部位は、第１図においては、
676〜681塩基の所に、第２図においては、480〜
485塩基の所に存在する。制限酵素BamHIの認識
切断部位は、第１図において、731〜736塩基の所
に存在する。このEcoRIとBamHI切断によつて
得られる55ヌクレオチド長よりなる配列が、上記
合成DNAによつて導入された配列である。

DHFR−GIF融合タンパクは、第２図に示され
るように177個のアミノ酸より構成される。融合
タンパクのアミノ末端側から162番目までは、B.
subtilisのDHFRのアミノ酸配列と同一であり、
164〜177番目の配列がGIFの配列である。163番
目のアミノ酸はメチオニン（Met）であり、ブロ
ムシアンで融合タンパクを処理することにより
GIFを切り出すことが可能な構造である。融合タ
ンパクの分子量は20380である。pGIF1を含有す
るE.coliは、DHFR−GIF融合タンパクを細胞内
で作ることができる。すなわち、pGIF1を含有す
るE.coliを培養し、菌体を集め、これを超音波破
砕し、20000回転／分で一時間遠心分離して得ら
れる上清中に、DHFR−GIF融合タンパクのほと
んど全てが存在する。即ち、融合タンパクは不溶
性でなく可溶性の状態でE.coli細胞中に産生され
ている。また、この上清から、DHFR酵素活性
を目安に精製した融合タンパクは、エンザイムイ
ムノアツセイにより、GIFに対する抗体と反応す
る。即ち、DHFR−GIF融合タンパクは、DHFR
酵素活性を有し、これを指標に分離精製を行うこ
とができる。従つて、本発明のpGIF1を用いるこ
とにより、遺伝子操作技術を利用したGIF生産に
係わる上記問題点を解消することができるのであ
る。

本発明に係わる新規組換えプラスミドpGIF1
は、pBSFOLEK1（特開昭63−87981号公報）及
び化学合成したDNAをもちいて、実施例１に記
す方法に従つて作成することができるが、プラス
ミドの作成方法によつて本発明が制限されるもの
ではない。

本発明のプラスミドpGIF1は、E.coli C600株
に導入されて安定状態に保たれ、また、本発明の
pGIF1を含有するE.coli C600株は微工研に
FERM Ｐ−9301として寄託されている。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１組換えプラスミドpGIF1の作成 0.001mgのプラスミドpBSFOEK1（特開昭63−
87981号公報）を制限酵素EcoRI及びBamHIを用
いて切断後、１％アガロースゲル電気泳動法によ
り分離した。約4.7キロ塩基対のDNA断片を切り
出し透析チユーブに入れ１mlの50mM Tris−
HCl，pH8.0を加えシールし、電気溶出法
（electroelution法、T.Maniatisら、Molecular
Cloning Ａ Loboratory Manual，p.164，Cold
Spring Harbor Laboratory（1982），文献１）に
より、ゲルからDNAを回収し、エタノールで
DNAを沈殿後、減圧下に沈殿を乾燥した（DNA
−１と呼ぶ）。このDNA配列は、第１図の１〜
677番目と731〜4789番目の配列である。（第１図
は、環状構造の配列を便宜上直鎖上配列で表わし
ているため、4789番目の塩基と１番目の塩基は隣
り合つてつながつている。） GIFを暗号化するDNAとしては、以下に示す
配列のものをホスホアミダイト法により化学合成
して用いた。この配列の設計指針としては、(1)
pBSFOLEK1のEcoRI及びBamHI切断部位に導
入できること、その際、(2)EcoRI切断部位が
DHFRの160〜162番目を暗号化することから、
遺伝子の読み取り枠をあわせること、(3)DHFR
とGIFとをメチオニンを介して融合させ、ブロム
シアン処理によつてGIFを切り出せる構造にする
こと、を検討した。

１ 5′−AATTCTATGGCTGGTTGT−3′ ２ 5′−
AAGAACTTCTTTTGGAAGACTT
ＴＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＴＡＡＧ−3′ ３ 5′−
GATCCTTAACACGAAGTGAAAGT
ＣＴＴＣＣＡＡＡＡ−3′ ４ 5′−GAAGTTCTTACAACCAGCCATAG
−3′ の４本のDNAをホスホアミダイト法に従つて化
学合成し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼで
5′−末端をリン酸化した後、各々を約0.1ml（約
0.0001mgのDNAを含んでいる）ずつ取り、これ
を60℃でインキユベートすることによりアニール
させた（これをDNA−２と呼ぶ）。

DNA−１を0.05mlのリガーゼ用反応液
（10mM Tris−HCl，pH7.4，5mM MgC12，
10mMジチオトレイトール，0.5mM ATP）に溶
解した後、0.05mlのDNA−２及び、0.5ユニツト
のT4−DNAリガーゼを加え、37℃、１時間、
DNAの連結反応を行なわせた。この反応を、形
質転換法（transformation method，上記文献
１，pp.250）に従つて、E.colC600株に取り込ま
せた。この処理をした菌体を、50mg／のアンピ
シリンナトリウム及び 10mg／のトリメトプリ
ムを含む栄養寒天培地（１中に、1gのグルコ
ース、1gのリン酸２カリウム、５ｇのポリペプ
トン、及び15ｇの寒天を含む寒天培地）上に塗布
し、37℃で24時間培養することにより、30個のコ
ロニーを得ることができた。これらのコロニーか
ら、適当に８個選び、1.5mlのYT＋Ap培地（１
中に、５ｇのNaCl、８ｇのトリプトン、５ｇ
のイーストエキス、及び50mgのアンピシリンナト
リウムを含む液体培地）で37℃で、一晩菌体を培
養した。培養液をそれぞれ、エツペンドルフ遠心
管にとり、12000回転／分で10分間遠心し、菌体
を集めた。上清を捨て、これに0.1mlの電気泳動
サンプル調製液（0.0625MのTris−HCl，pH6.8，
２％のラウリル硫酸ナトリウム（SDSと略す。）、
10％グリセリン、５％の２−メルカプトエタノー
ル、及び0.001％ブロムフエノールブルーを含
む。）を加え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に
５分間保つことにより菌体を溶かした。この処理
をしたサンプルをSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動法（U.K.Lammli，Nature，vol.227，
pp.680−685（1970））に従つて分析した。標準サ
ンプルとしてpBSFOLEK1を含有するE.coliに同
様な処理をしたもの及び分子量マーカーサンプル
としてラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセロアルデヒド−３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
含むサンプルを泳動した。その結果、８個のコロ
ニーのうち、６個のコロニーでは、
pBSFOLEK1を含有するE.coliが作るDHFR−ロ
イシンエンケフアリン融合タンパクが消失し、新
たに、それより約1000ダルトン大きいタンパクが
作られていることが明らかとなつた。また、新た
に得られたタンパクバンドの量は、
pBSFOLEK1を含有するE.coliが作るDHFR−ロ
イシンエンケフアリン融合タンパクのバンドの量
と大差がないことから、遺伝子発現の効率は変化
していないものと考えられた。この６個から適当
に１個選び、これをYT＋Ap培地で培養し、
TanakaとWeisblumの方法（T.Tanaka，B.
Weisblum；J.Bacteriology，vol121，pp.354
（1975）にしたがつてプラスミドを調製した。得
られたプラスミドを制限酵素EcoRI，BamHI，
Bgl，BstE，Pst，Sal，Aat，Cla，
Hind，Hpaによつて切断を試みたところ、
各々１，１，１，１，１，１，２，２，２，２箇
所切断されることが明らかとなつた。得られたプ
ラスミドをpGIF1と称した。pGIF1の全塩基配列
を、ジデオキシ法に従つて決定した。その結果、
第１図に示す塩基配列が明らかとなり、プラスミ
ドpGIF1は4789塩基対より成り立つていることが
明らかとなつた。

実施例２組換えプラスミドpGIF1を含有するE.coliC600
株からのDHFR−GIF融合タンパクの精製。

プラスミドpGIF1を含有するE.coli C600株を
３のYA＋Ap培地中で37℃で一晩培養後、菌
体を遠心分離により集めた。湿重量約14gの菌体
が得られた。菌体を28mlの1mMのジチオトレイ
トール（DTT）及び0.1mMのエチレンジアミン
４酢酸２ナトリウム（EDTA）を含む10mMリン
酸カリウム緩衝液pH7.0に懸濁し、超音波破砕に
より細胞を破砕した後、20000回転／分、１時間
の遠心分離により上清30mlを得た。えられた上清
のDHFRの酵素活性を測定したところ、144ユニ
ツト／ml（全活性4320ユニツト、全タンパク量
1200mg、比活性3.6ユニツト／mgタンパク）とい
う値であつた。上清を、DEAE−トヨパール
650Mカラム（250mm×1500mm、約75cm³）吸着さ
せ、0Mから50mMのKC1濃度勾配をかけ溶出し
た。約６mlずつフラクシヨンを集め、DHFRの
酵素活性を測定し、酵素活性を有する画分を集め
た。82mlの酵素液が得られた（回収活性1830ユニ
ツト（42％）、回収タンパク量20.0mg、比活性
9.06ユニツト／mgタンパク）。これを限外ろ過装
置を用いて約１mlにまで濃縮し、これをトヨパー
ルHW55カラムクロマトグラフイーにより分画し
た。約2.8mlずつフラクシヨンを集め、DHFRの
酵素活性を測定し、酵素活性のピーク画分を集め
た（約8.4ml、回収活性462ユニツト（10.7％）、
回収タンパク量1.9mg、比活性243ユニツト／mgタ
ンパク）。得られた酵素タンパクをSDS電気泳動
法により分析したところ、均一であり、ラクトア
ルブミン、トリプシンインヒビター、トリプシノ
ーゲン、カーボニツクアンヒドラーゼ、グリセリ
ろアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、卵ア
ルブミン、及び牛血清アルブミンを分子量マーカ
ーとして精製ジヒドロ葉酸還元酵素の分子量を推
定したところ21000であり、塩基配列から予想さ
れる分子量20380とほぼ一致した値であつた。

精製したDHFR活性を有するタンパクをエン
ザイムイムノアツセイにより測定したところ、
GIFによつて抗原−抗体反応が競争てきに阻害さ
れることが明らかとなつた。また、精製した
DHFR活性を有するタンパクのカルボキシ末端
側の配列をカルボキシペプツターゼ法を用いて検
討したところ、−Trp−Lys−（Thr，Phe，Thr）
−Ser−（カルボキシ末端）であることが判明し
た。DHFR−GIFのカルボキシ末端のアミノ酸は
Cys（システイン）であるが、このアミノ酸は本
発明者らが用いた方法では検出できないので、さ
らに、Ellmanの方法を用いて、５，5′−ジチオ
ビス２−ニトロ安息香酸を用いてDHFR−GIF融
合タンパクのチオール（SH）基の含量を測定し
たところ、4.2〜4.6残基／分子という値が得られ
た。第２図に示したDHFR−GIFのCys含量は、
５残基／分子であり、この値とほぼ一致した。ま
た、カルボキシ末端側を変化させていない
DHFR（１−168）のSH基の含量を同様に測定し
た結果は、2.4〜2.7残基／分子という値であつ
た。以上の結果は、組換えプラスミド pGIF1を
含有するE.coliC600株から得られたDHFR−GIF
融合タンパクが、確かにGIFを含んでいることを
示している。

発明の効果上記のように、組換えプラスミドpGIF1は、
DHFR−GIF融合タンパクを暗号化しており、か
つpGIF1を含有するE.coliC600株は、DHFR−
GIF融合タンパクを可溶性の状態で生産する。さ
らに、産生したDHFR−GIF融合タンパクは
DHFR酵素活性を示し、精製を容易に行うこと
ができる。このような性質を有することから、本
発明の新規組換えプラスミドpGIF1及びそれを含
有するE.coliC600は、DHFR−GIF融合タンパク
の生産、及びそれを利用したGIFの生産に有益で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pGIF1の全塩基配列を示した図であ
り、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、5′末端の方向に記述している。図中符号は、
核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシン
を、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示している。
図中番号はpGIF1に２箇所存在する制限酵素ClaI
切断認識部位のうち制限酵素Hind切断部位に
近い方のClaI切断認識部位の、ATCGATの最初
の“Ａ”を１番として数えた番号を示している。第２図は、pGIF1中存在するDHFR−GIF融合
タンパクを暗号化する部分の塩基配列及びタンパ
クのアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、
核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、
Alaはアラニンを、Agrはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cys
はシステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグ
ルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチ
ジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、Phe
はフエニルアラニンを、Proはプロリンを、Ser
はセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプ
トフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを
示している。図中番号は、一番目のアミノ酸であ
るメチオニンを暗号化するATGコドンの“Ａ”
を１番として数えた番号を示している。

Claims

【特許請求の範囲】１ E.coliにおいて安定に複製され、宿主である
E.coliにトリメトプリム耐性及びアンピリシン耐
性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子の3′末端側が一部改変されたこと
によりジヒドロ葉酸還元酵素−ソマトスタチン融
合タンパクを暗号化し、4789塩基対の大きさを有
し、下記に示されるDNA配列を有する新規組換
えプラスミドpGIF1。【表】【表】【表】【表】【表】２ E.coliにおいて安定に複製され、宿主である
E.coliにトリメトプリム耐性及びアンピリシン耐
性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子の3′末端側が一部改変されたこと
によりジヒドロ葉酸還元酵素−ソマトスタチン融
合タンパクを暗号化し、4789塩基対の大きさを有
し、下記に示されるDNA配列を有する新規組換
えプラスミドpGIF1を含有するE.coli C600株。【表】【表】【表】【表】【表】